JP2019533436A - 腺毛状突起（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｔｒｉｃｈｏｍｅ）におけるカンナビノイドおよび他の化合物のマニピュレーションのための毛状突起特異的プロモーター - Google Patents

腺毛状突起（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｔｒｉｃｈｏｍｅ）におけるカンナビノイドおよび他の化合物のマニピュレーションのための毛状突起特異的プロモーター Download PDF

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Abstract

本技術は、カンナビス由来カンナビノイド生合成酵素遺伝子の毛状突起特異的プロモーター、毛状突起特異的プロモーターのヌクレオチド配列ならびに生物におけるカンナビノイドおよび他の化合物の産生を調節するためのプロモーターの使用を提供する。本技術は、毛状突起特異的プロモーターを含むキメラ遺伝子、ベクターならびに植物細胞および植物を含むトランスジェニック細胞および生物も提供する。同様に、細胞および生物において毛状突起特異的プロモーターを使用して核酸配列を発現させるための方法も提供される。【選択図】 図１

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第62/397,212号、２０１６年９月２０日出願の優先権を主張する。
（技術分野）
本技術は、カンナビス由来カンナビノイド生合成酵素遺伝子の毛状突起特異的プロモーター、毛状突起特異的プロモーターのヌクレオチド配列、および生物におけるカンナビノイド産生を調節するためのまたは生化学物質の他の毛状突起特異的産生を調節するためのプロモーターの使用に一般に関する。本技術は、毛状突起特異的プロモーターを含む、植物細胞および植物を含むトランスジェニック細胞および生物にも関する。
次の記載は、読者の理解を助けるために提供される。提供される情報または引用される参考文献は、先行技術であるとして承認されない。
植物毛状突起は、分枝状および非分枝状の毛、小胞、フック、とげならびに、葉、苞葉および茎を覆う刺毛を含む表皮隆起である。二次代謝物を産生し分泌するまたは貯蔵するそれらの能力に基づいて識別され得る２つの主な種類の毛状突起、すなわち腺毛状突起および非腺毛状突起がある。非腺毛状突起は、低い代謝活性を示し、主に物理的手段を通じて植物に防護を提供する。対照的に、一部のｓｏｌａｎａｃｅｏｕｓ種（例えば、タバコ、トマト）およびカンナビスも含む多数の植物種の葉（foliage）に存在する腺毛状突起は、高度に代謝的に活性であり、葉の乾燥重量の１０〜１５％にも達する場合がある代謝物を蓄積する（Wagner et al., Ann. Bot. 93:3-11 (2004)）。腺毛状突起は、防護機構として二次代謝物を分泌（または貯蔵）できる。
Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ Ｌ．（カンナビス、大麻、マリファナ）は、数千年にわたって栽培されてきた一年生草本であり、テルペノフェノール類群を構成するカンナビノイドと称される一連の固有の二次代謝物を含有する。カンナビノイドは、植物Ｃ．ｓａｔｉｖａの雌花上に高密度で、雄花上に低密度で存在する腺毛状突起において主に合成され、蓄積される。毛状突起の貯蔵腔（storage cavity）中のカンナビノイドの蓄積は、カンナビノイドが他の植物細胞に細胞傷害性であることが周知であり、大麻およびタバコ細胞懸濁培養物の両方でアポトーシスを誘導することが示されていることから植物に有益である（Sirikantaramas et al., Plant Cell Physiol. 46:1578-1582 (2005)）。カンナビノイドは、３ステップ生合成工程：ポリケタイド形成、芳香族プレニル化および環化によって形成される（図１）。カンナビノイド経路は、ヘキサノイル−ＣｏＡによって供給され、その形成は、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素によって触媒される。カンナビノイド生合成における第１の酵素的ステップは、テトラケタイド（tetraketide）シンターゼ酵素（ＴＫＳ）、オリベトール酸シンターゼ（ＯＬＳ１）と呼ばれる、による３，５，７−トリオキソドデカノイル−ＣｏＡの形成である。カンナビノイド生合成における第２の酵素的ステップは、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）によるオリベトール酸の形成である。次のステップは、芳香族プレニルトランスフェラーゼによってカンナビゲロール酸（cannabigerolic acid）（ＣＢＧＡ）を形成するためのオリベトール酸のプレニル化である。ＣＢＧＡは、カンナビノイドの主要なさまざまな種類の生合成のための重要な分岐点中間体である。ＣＢＧＡのプレニル側鎖の代替的環化は、Δ９テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）またはその異性体カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）もしくはカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）をもたらす。ＴＨＣＡおよびＣＢＤＡは、後に保存または喫煙の際に非酵素的反応によって脱炭酸され、それぞれΔ９テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）またはカンナビジオール（ＣＢＤ）をもたらす（図１）。
カンナビノイドは、価値のある植物由来天然産物である。マリファナおよびハシッシュなどのカンナビス調製物は、それらの公知の精神賦活性効果のために何世紀にもわたって使用されてきた。カンナビノイドは、哺乳動物のカンナビノイド受容体を通じて作用するそれの能力による医学的応用のために新たな関心を引きつけている。主なカンナビノイドとして、Δ９テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、マリファナ消費の精神賦活性および治療効果に関与している化合物、およびカンナビジオール（ＣＢＤ）、神経防護作用を有する、が挙げられる。（Gaoni & Mechoulam, J. Am. Chem. Soc. 86:1646-1647 (1964); Mechoulam et al., J. Clin. Pharmacol. 42:11S-19S (2002)）。ＴＨＣＡは、カンナビスの薬物株中の主なカンナビノイドであり、一方ＣＢＤＡは、繊維または種子用に生育される大麻形態における主要なカンナビノイドである。現在カンナビノイドは、多発性硬化症またはてんかんを罹患している患者における慢性疼痛、悪心の処置、痙攣および振戦の管理が挙げられる治療目的、ならびに関節炎に対する治療について探究されている。毛状突起におけるカンナビノイド産生を方向付ける可能性は、植物の代謝経路およびパフォーマンスへの妨害を回避する。したがって、トランスジェニック植物、トランスジェニック細胞およびそれらの派生物が挙げられる生物におけるカンナビノイドの合成を調節するための毛状突起特異的プロモーターを同定する必要性があり、それは毛状突起での特異的な遺伝子発現を標的化できるようにする。
本明細書において、コードされた核酸配列の植物毛状突起における発現を方向付けるための毛状突起特異的プロモーターおよびこれらのプロモーターの使用が開示される。
一態様では、本開示は、（ａ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列；および（ｂ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺（trichome gland）特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子であって、ヌクレオチド配列が異種性核酸に作動可能に連結されている、合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている合成ＤＮＡ分子を含む発現ベクターを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、発現ベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ細胞である。
一部の実施形態では、本開示は、合成ＤＮＡ分子を含むキメラ核酸構築物を含む細胞を含む遺伝子操作された植物を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された植物は、Ｓｏｌａｎａｃｅａ科に属する。一部の実施形態では、操作された植物Ｓｏｌａｎａｃｅａは、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物である。一部の実施形態では、遺伝子操作された植物は、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ科に属する。一部の実施形態では、操作されたＣａｎｎａｂａｃｅａｅ植物は、Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物である。一部の実施形態では、本開示は、遺伝子操作された植物に由来する種子であって、キメラ核酸構築物を含む種子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号３に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号８に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号９に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１２に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１３に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１４に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１７に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１７のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１８に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１９に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２１に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２２に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２２のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２３に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２４に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２４のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２５に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２６に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２６のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２８に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２９に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２９のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号３１に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号３１のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号３２に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号３３に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ分子を提供する。
一態様では、本開示は、キメラ遺伝子がゲノム中に組み込まれている遺伝子操作された植物または植物細胞であって、キメラ遺伝子が、相同性または異種性核酸配列に作動可能に連結されている毛状突起特異的プロモーターを含み、プロモーターが、（ａ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列；および（ｂ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、遺伝子操作された植物または植物細胞を提供する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された植物または植物細胞は、Ｓｏｌａｎａｃｅａ科に属する。一部の実施形態では、Ｓｏｌａｎａｃｅａ植物はＮ．ｔａｂａｃｕｍである。一部の実施形態では、遺伝子操作された植物は、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ科に属する。一部の実施形態では、操作されたＣａｎｎａｂａｃｅａｅ植物はＣ．ｓａｔｉｖａである。
一態様では、本開示は、植物毛状突起においてポリペプチドを発現させるための方法であって、宿主細胞中に、（ａ）（ｉ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列；および（ｉｉ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するステップであって、（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列が、ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている、ステップ；ならびに（ｂ）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で植物を生育させるステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、宿主植物毛状突起においてカンナビノイドを増加させる方法であって、（ａ）宿主細胞中に、（ｉ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列；および（ｉｉ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するステップであって、（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列が、カンナビノイド生合成経路の酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている、ステップ；ならびに（ｂ）カンナビノイド生合成経路酵素の発現を可能にする条件下で植物を生育させるステップであって、カンナビノイド生合成経路酵素の発現により、植物は、同様の条件下で生育された対照植物と比較してカンナビノイド含有量が増加している、ステップを含む方法を提供する。
方法の一部の実施形態では、カンナビノイド生合成経路酵素は、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）シンターゼ、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）シンターゼまたはΔ９テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）シンターゼである。
一部の実施形態では、方法は、植物にカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を提供することをさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、対照植物と比較してΔ９テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビクロメン（cannabichromene）（ＣＢＣ）、および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）含有量が増加している遺伝子操作された植物を産生するための方法を提供する。
本明細書で記され、特許請求される技術は、これだけに限らないが、本簡潔な概要に記載されるまたは記されるまたは参照されるものを含む多数の特性および実施形態を有する。それは、包括的であることが意図されず、本明細書で記され、特許請求される本発明は、例示のみの目的のためにかつ、限定ではなく含まれる、本簡潔な概要において規定される特性または実施形態に、またはそれによって限定されない。追加的実施形態は、下の詳細な記載において開示され得る。
一態様では、本開示は、（ａ）配列番号３１、３２または３３のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列；および（ｂ）配列番号３１、３２または３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子であって、ヌクレオチド配列が異種性核酸に作動可能に連結されている、合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている合成ＤＮＡ分子を含む発現ベクターを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、発現ベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ細胞である。
一部の実施形態では、本開示は、合成ＤＮＡ分子を含むキメラ核酸構築物を含む細胞を含む遺伝子操作された植物を提供する。一部の実施形態では、操作された植物は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物である。一部の実施形態では、操作された植物はＣ．ｓａｔｉｖａ植物である。
一部の実施形態では、本開示は、５つの内のいずれか１つの操作された植物に由来する種子であって、キメラ核酸構築物を含む種子を提供する。
一態様では、本開示は、配列番号３３に記載されているヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている合成ＤＮＡ分子を含む発現ベクターを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、発現ベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ細胞である。
一部の実施形態では、本開示は、合成ＤＮＡ分子を含むキメラ核酸構築物を含む細胞を含む遺伝子操作された植物を提供する。一部の実施形態では、操作された植物は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物である。一部の実施形態では、操作された植物は、Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物である。
一部の実施形態では、本開示は、操作された植物に由来する種子であって、キメラ核酸構築物を含む種子を提供する。
Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａにおける主なカンナビノイド、Δ９−テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）およびカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）の形成をもたらすカンナビノイド生合成経路を示す図である。 本明細書に記される実験において利用されたプロモーター：レポーター遺伝子設計を示す図である。各プロモーターは、ＧＵＳレポーター遺伝子に融合され、プロモーター活性は、染色において青色で示されている（図２Ａ）。 タバコ毛状突起におけるカンナビノイド生合成酵素遺伝子プロモーターの毛状突起特異的発現の葉の全体像である。代表的なプロモーター（ＣＢＤＡシンターゼ２０８００遺伝子プロモーター）からの結果が示されている。カンナビノイド生合成経路における他のプロモーターからの結果は、定性的に同一である（図示せず）。図２Ｂは、レポーター遺伝子の発現が毛状突起に限定されていることを示している。 タバコ毛状突起における完全カンナビノイド生合成経路由来のプロモーターの毛状突起特異的発現を示す図である。プロモーター活性は、ＧＵＳレポーター遺伝子の活性によって生じる青色によって示されている。経路におけるそれぞれの遺伝子由来の代表的なプロモーターは、毛状突起特異的発現を示しており、したがって経路における遺伝子由来のすべてのプロモーターが発現を毛状突起に方向付けている。 本技術の４×カンナビノイドオン（Cannabinoid On）（ＣＡＮＯＮ）断片合成プロモーターの設計を示す図である。 本技術の４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーターの毛状突起特異的発現を示している。合成プロモーターの活性は、ＧＵＳレポーター遺伝子の活性によって生じる青色によって示されている。
Ｉ．導入
本技術は、カンナビノイド生合成経路に関与する酵素の２３個の毛状突起特異的プロモーター：（１）オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ；テトラケタイドシンターゼとも称される）プロモーター；（２）ＯＬＳ１プロモーター；（３）ＯＬＳ２プロモーター；（４）オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）プロモーター；（５）ＯＡＣ１プロモーター；（６）芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）プロモーター；（７）ＰＴ１プロモーター；（８）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１）プロモーター；（９）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１’）プロモーター；（１０）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ３）プロモーター；（１１）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１２）プロモーター；（１２）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）プロモーター；（１３）ＣＢＤＡシンターゼ１（ＣＢＤＡＳ１）プロモーター；（１４）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）２０８００プロモーター；（１５）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）２０８００’プロモーター；（１６）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１９６０３プロモーター；（１７）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１９６０３’プロモーター；（１８）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）５０３２０プロモーター；（１９）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）５０３２０’プロモーター；（２０）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１３３０プロモーター；（２１）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１３３０’プロモーター；（２２）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）３４９８プロモーター；および（２３）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）３４９８’プロモーターについての核酸配列の発見に関する。
各プロモーターについての核酸配列は決定されている。（ｉ）オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）プロモーター、（ｉｉ）ＯＬＳ１プロモーターおよび（ｉｉｉ）ＯＬＳ２プロモーターの核酸配列は、配列番号１、２および３にそれぞれ記載され、ＯＬＳの翻訳領域（ＯＲＦ）は、配列番号４に記載されている。オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）プロモーターの核酸配列は、配列番号５に記載され、ＯＡＣ１プロモーターの核酸配列は、配列番号６に記載され、ＯＡＣのＯＲＦは、配列番号７に記載されている。芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）プロモーターの核酸配列は、配列番号８に記載され、ＰＴ１プロモーターの核酸配列は、配列番号９に記載され、ＰＴのＯＲＦは、配列番号１０に記載されている。（ｉ）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１）プロモーター、（ｉｉ）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１’）プロモーター；（ｉｉｉ）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ３）プロモーターおよび（ｉｖ）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１２）プロモーターの核酸配列は、配列番号１１、１２、１３および１４にそれぞれ記載され、ヘキサノイル−ＣｏＡ（ＡＡＥ−１）のＯＲＦは、配列番号１５に記載されている。（ｉ）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）プロモーター、（ｉｉ）ＣＢＤＡＳシンターゼ１（ＣＢＤＡＳ１）プロモーター、（ｉｉｉ）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）２０８００プロモーターおよび（ｉｖ）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）２０８００’プロモーターの核酸配列は、配列番号１６、１７、１８および１９にそれぞれ記載され、ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）のＯＲＦの核酸配列は、配列番号２０に記載されている。（ｉ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１９６０３プロモーター、（ｉｉ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１９６０３’プロモーター、（ｉｉｉ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）５０３２０プロモーター、（ｉｖ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）５０３２０’プロモーター、（ｖ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１３３０プロモーターおよび（ｖｉ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１３３０’プロモーターの核酸配列は、配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６にそれぞれ記載され、ＴＨＣＡＳのＯＲＦは、配列番号２７に記載されている。ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）３４９８プロモーターの核酸配列は、配列番号２８に記載され、ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）３４９８’プロモーターの核酸配列は、配列番号２９に記載され、ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）のＯＲＦは、配列番号３０に記載されている。
本技術は、毛状突起特異的発現を方向付けるために十分である「カンナビノイドオン」または「ＣＡＮＯＮ」プロモーター断片についての核酸配列の発見にも関する。腺毛状突起における毛状突起特異的発現を方向付けるために十分であるＣＡＮＯＮ断片についての核酸配列は、配列番号３１に記載されている。コンセンサスＣＡＮＯＮ断片の４個のコピーを含む４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーターについての核酸配列は、配列番号３３に記載されている。
植物細胞でのＴＨＣなどの、カンナビノイドの周知の細胞傷害性効果を考慮すると、Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓなどの強いユビキタスプロモーター下でそれらの産生を駆動する遺伝子の発現は、植物全体の代謝経路の攪乱をもたらす可能性があり、植物の発達および生理機能に有害な事象を有する可能性がある。そのため植物の他の部分との情報伝達が限定されている別の実体としての毛状突起は、代謝工学のための有望な標的である。
したがって、一部の実施形態では本技術は、宿主植物、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ科の植物Ｃ．ｓａｔｉｖａなどならびに、天然でカンナビノイドを産生しない他の植物科および種、においてカンナビノイド（例えば、ＴＨＣ、ＣＢＤ、ＣＢＣ、ＣＢＧ）の合成を遺伝子的にマニピュレートするために使用され得る、カンナビノイド生合成遺伝子由来のいまだ発見されていない毛状突起特異的プロモーターまたはその生物学的に活性な断片を提供する。
ＩＩ．定義
本明細書において使用されるすべての技術用語は、生化学、分子生物学および農業において一般に使用され；それにより、それらは本技術が属する分野の当業者によって理解される。これらの技術用語は、例えば：Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook and Russel (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)；Current Protocols In Molecular Biology, ed. Ausubel et al. (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988)（定期的な更新を含む）；Short Protocols In Molecular Biology: A Compendium Of Methods From Current Protocols In Molecular Biology 5th ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al. (John Wiley & Sons, Inc., 2002)；Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, ed. Green et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997)において見出すことができる。植物生物学の技術に関与する方法は、本明細書に記されており、Methods In Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, ed. Maliga et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995)などの論文にも詳細に記されている。
「キメラ核酸」は、コード配列が天然で存在する細胞において関連しているヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列に連結されているコード配列またはその断片を含む。
用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」は、遺伝子が、転写および翻訳の機構を通じて、活性酵素を産生するように一連のアミノ酸が特定のアミノ酸配列に会合され得る細胞に情報を提供する工程を指す。遺伝子コードの縮重のために、ＤＮＡ配列中のある特定の塩基変化は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない。
「内在性核酸」または「内在性配列」は、遺伝子操作される植物または生物に「ネイティブ」である、すなわち元からある。それは、遺伝子操作される植物または生物のゲノムに存在する核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を指す。
「外来性核酸」は、ヒトの操作によって細胞（または細胞の祖先）に導入された核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。そのような外来性核酸は、それが導入された細胞において天然で見出される配列のコピーまたはその断片であってよい。
本明細書において使用される「発現」は、遺伝子の転写を通じたＲＮＡ産物の産生、またはヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド産物の産生を意味する。「過剰発現」または「上方制御」は、それに由来するすべての後代植物を含む細胞または植物における具体的な遺伝子配列またはその変種の発現が、対照細胞または植物と比較して、遺伝子操作によって増加されたことを示して使用される。
「遺伝子操作」は、核酸または特定の変異を宿主生物に導入するための任意の方法を包含する。例えば植物は、標的遺伝子の発現が対照植物と比較して低減されるように、遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド配列を用いて形質転換される場合に遺伝子操作される。この文脈において「遺伝子操作」は、トランスジェニック植物および植物細胞を含む。遺伝子操作された植物または植物細胞は、宿主植物種に由来する、または生殖的に適合性の植物種に由来する核酸配列だけを導入することによって実行される、任意の天然の手法（すなわち、外来性ヌクレオチド配列を含まない）の産物であってよい。例えば、米国特許出願第2004／0107455号を参照されたい。
「異種性核酸」または「相同性核酸」は、特にトランスジェニック生物の内容では、核酸またはアミノ酸配列とその宿主細胞またはその生物との関係を指す。相同性配列は、宿主種において天然で見出される（例えば、カンナビス遺伝子を用いて形質転換されたカンナビス植物）、一方で異種性配列は宿主細胞において天然では見出されない（例えば、カンナビス植物由来の配列を用いて形質転換されたタバコ植物）。そのような異種性核酸は、それが導入される細胞において天然で見出される配列のコピーであるセグメントまたはその断片を含んでよい。内容に応じて、用語「ホモログ」または「相同性」は、共通の祖先配列からの子孫である配列を代替的に指す場合がある（例えば、それらはオルソログであってよい）。
「増加する」、「減少する」、「調節する」、「変更する」などは、同様の条件下で生育されたが、増加、減少、調節または変更を生じる改変を含まない同様の変種、株または細胞との比較を指す。一部の場合では、これは、非形質転換対照、偽形質転換対照またはベクター形質転換対照であってよい。
「単離された核酸分子」によって、その天然での環境から離された、核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ＤＮＡ構築物中に含有される組換えＤＮＡ分子は、本技術の目的のために単離されたと見なされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種性宿主細胞において維持されている組換えＤＮＡ分子または溶液中で部分的にもしくは実質的に精製されているＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本技術のＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写物を含む。単離された核酸分子は、本技術により、合成的に産生されたそのような分子をさらに含む。
「植物」は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、分化したまたは未分化の植物細胞および同物の後代を包含する用語である。植物材料として、非限定的に種子、懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、シュート、茎、果実、配偶子、胞子体、花粉および小胞子が挙げられる。
「植物細胞培養物」は、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合子および発達の種々の段階にある胚などの植物単位の培養物を意味する。本技術の一部の実施形態では、トランスジェニック組織培養物またはトランスジェニック植物細胞培養物が提供され、ここでトランスジェニック組織または細胞培養物は、本技術の核酸分子を含む。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始するための他のタンパク質の認識および結合に関与する、転写開始から上流のＤＮＡの領域を含む。「構成的プロモーター」は、植物の一生を通じて、ほとんどの環境条件下で活性であるものである。組織特異的、組織優先、細胞型特異的および誘導性プロモーターは、「非構成的プロモーター」の種類を構成する。「毛状突起特異的プロモーター」は、植物の根、葉、茎または他の組織における発現と比較して、毛状突起組織において作動可能に連結されている遺伝子の発現を優先的に方向付けるプロモーターである。「作動可能に連結されている」は、プロモーター配列が第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する場合の、プロモーターと第２の配列との間の機能的連鎖を指す。一般に「作動可能に連結されている」は、連結される核酸配列が近接であることを意味する。
２つのポリヌクレオチド（核酸）またはポリペプチド配列の内容では「配列同一性」または「同一性」は、特定の領域にわたって最大一致でアラインされた場合に同じである２つの配列中の残基への言及を含む。タンパク質への言及において配列同一性百分率が使用される場合、同一でない残基位置が、アミノ酸残基が電荷および疎水性などの同様の化学的特性を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって分子の機能的特性が変化しない保存的アミノ酸置換によって、しばしば異なっていることが認識される。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するために上方に調整されてよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると称される。この調整を行うための手段は、当業者に公知である。典型的にはこれは、完全なミスマッチよりむしろ部分的であるとして保存的置換をスコア化することを含み、それにより、配列同一性百分率を増加させる。したがって例えば同一のアミノ酸がスコア１を与えられる場合、非保存的置換はスコアゼロを与えられ、保存的置換はゼロと１との間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）において実行されるMeyers & Miller,Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988)のアルゴリズムに従って算出される。
配列同一性百分率の本記載における使用は、２つの最適にアラインされた配列を比較ウインドウにわたって比較することによって決定される値を示し、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列部分は、２つの配列の最適なアライメントのために基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。百分率は、合致位置の数を得るために、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がある位置の数を決定し、合致位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数によって割り、配列同一性百分率を得るために結果に１００を掛けることによって算出される。
用語「抑制」または「下方制御」は、それに由来するすべての後代植物を含む、細胞または植物中におけるその具体的な遺伝子配列変種の発現が、対照細胞または植物と比較して遺伝子操作によって低減されたことを示して同意語として使用される。
「毛状突起」は、さまざまな種類の毛状突起、腺毛状突起および／または非腺毛状突起の両方を包含する。
「毛状突起細胞」は、腺または分泌細胞、ベース細胞（base cell）およびストークまたはストライプ細胞、細胞外腔および角質細胞などの毛状突起構造を形成している細胞を指す。毛状突起は、１種の単一細胞からなっていてもよい。
「カンナビス」または「カンナビス植物」は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａおよびその種間ハイブリッドなどのカンナビノイドを産生するカンナビス属の任意の種を指す。
「変種」は、具体的な遺伝子またはポリペプチドの標準的なまたは所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列から逸脱しているヌクレオチドまたはアミノ酸配列である。用語「アイソフォーム」「アイソタイプ」および「類似体」もヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「変種」形態を指す。１つまたは複数のアミノ酸の付加、除去もしくは置換、またはヌクレオチド配列における変化によって変更されたアミノ酸配列は、変種配列と見なされてよい。ポリペプチド変種は、「保存的」変化を有する場合があり、ここで置換アミノ酸は類似した構造的または化学的特性を有する、例えば、イソロイシンによるロイシンの置き換え。ポリペプチド変種は、「非保存的」変化を有する場合がある、例えば、トリプトファンによるグリシンの置き換え。類似体のわずかな変動として、アミノ酸欠失または挿入または両方も挙げられる。どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失され得るかを決定する指針は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ、ＭＤ）ソフトウェアなどの当技術分野において公知のコンピュータープログラムを使用して見出すことができる。変種は、Ｍａｘｙｇｅｎに与えられた特許（例えば、米国特許第6,602,986号を参照されたい）に記されるものなどの「シャッフル遺伝子」を指す場合もある。
本明細書において使用される、用語「約」は、当業者によって理解され、それが使用される内容に応じてある程度変動する。それが使用される内容を考慮して当業者に明らかでない用語の使用がある場合、「約」は、具体的な用語の１０％プラスまたはマイナスまでを意味する。
用語「生物学的に活性な断片」または「機能性断片」または「プロモーター活性を有する断片」は、１つまたは複数の異なる種類の植物組織および器官において見出される１つもしくは複数の毛状突起の種類および／または１つもしくは複数の毛状突起細胞において転写を付与することができる、核酸断片を指す。生物学的に活性な断片は、毛状突起特異的および／または少なくとも毛状突起優先的発現を付与し、それらは、配列番号１、３、５、７、９または１１〜１５のプロモーターと少なくとも同様の強度（またはさらに高い強度）を好ましくは有する。このことは、植物をそのような断片、好ましくはレポーター遺伝子に作動可能に連結して用いて植物を形質転換し、毛状突起においてプロモーター活性を定性的（時空間転写）および／または定量的にアッセイすることによって検査され得る。一部の実施形態では、本技術のプロモーターおよび／またはプロモーター断片の強度は、腺毛状突起において測定された場合、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのものと定量的に同一、またはそれより高い。一部の実施形態では、本明細書に記される毛状突起プロモーターの生物学的に活性な断片は、プロモーターについての全長配列核酸配列の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％であってよい。他の実施形態では、本明細書に記される毛状突起プロモーターの生物学的に活性な核酸断片は、例えば、少なくとも約１０近接核酸であってよい。さらに他の実施形態では、本明細書に記される毛状突起プロモーターの生物学的に活性な核酸断片は、（１）ＯＬＳプロモーター（例えば、配列番号１）についての約１０近接核酸から約５５４近接核酸まで；（２）ＯＬＳ１プロモーター（配列番号２）についての約１０近接核酸から約５５０近接核酸まで；（３）ＯＬＳ２プロモーター（配列番号３）についての約１０近接核酸から約５５８近接核酸まで；（４）ＯＡＣプロモーター（例えば、配列番号５）についての約１０近接核酸から約９９６近接核酸まで；（５）ＯＡＣ１プロモーター（例えば、配列番号６）についての約１０近接核酸から約９９２近接核酸まで；（６）ＰＴプロモーター（例えば、配列番号８）についての約１０近接核酸から約１３６１近接核酸まで；（７）ＰＴ１プロモーター（例えば、配列番号９）についての約１０近接核酸から約１３５７近接核酸まで；（８）ＡＡＥ１−１プロモーター（例えば、配列番号１１）についての約１０近接核酸から約８０５近接核酸まで；（９）ＡＡＥ１−１’プロモーター（例えば、配列番号１２）についての約１０近接核酸から約８００近接核酸まで；（１０）ＡＡＥ３プロモーター（例えば、配列番号１３）についての約１０近接核酸から約１０００近接核酸まで；（１１）ＡＡＥ１２プロモーター（例えば、配列番号１４）についての約１０近接核酸から約８６９近接核酸まで；（１２）ＣＢＤＡシンターゼプロモーター（例えば、配列番号１６）についての約１０近接核酸から約４２０近接核酸まで；（１３）ＣＢＤＡＳ１プロモーター（例えば、配列番号１７）についての約１０近接核酸から約４１６近接核酸まで；（１４）ＣＢＤＡＳ ２０８００プロモーター（例えば、配列番号１８）についての約１０近接核酸から約５３５近接核酸まで；（１５）ＣＢＤＡＳ ２０８００’プロモーター（例えば、配列番号１９）についての約１０近接核酸から約５３１近接核酸まで；（１６）ＴＨＣＡＳ １９６０３プロモーター（例えば、配列番号２１）についての約１０近接核酸から約８００近接核酸まで；（１７）ＴＨＣＡＳ １９６０３’プロモーター（例えば、配列番号２２）についての約１０近接核酸から約７９６近接核酸まで；（１８）ＴＨＣＡＳ ５０３２０プロモーター（例えば、配列番号２３）についての約１０近接核酸から約７９６近接核酸まで；（１９）ＴＨＣＡＳ ５０３２０’プロモーター（例えば、配列番号２４）についての約１０近接核酸から約７９２近接核酸まで；（２０）ＴＨＣＡＳ １３３０プロモーター（例えば、配列番号２５）についての約１０近接核酸から約７２０近接核酸まで；（２１）ＴＨＣＡＳ １３３０’プロモーター（例えば、配列番号２６）についての約１０近接核酸から約７１６近接核酸まで；（２２）ＣＢＣＡＳ ３４９８プロモーター（例えば、配列番号２８）についての約１０近接核酸から約８０４近接核酸まで；または（２３）ＣＢＣＡＳ ３４９８’プロモーター（例えば、配列番号２９）についての約１０近接核酸から約８００近接核酸まで、であってよい。さらに他の実施形態では、毛状突起プロモーターの生物学的に活性な断片は、これだけに限らないが約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１０５０、約１１００、約１１５０、約１２００、約１２５０または約１３００近接核酸などのこれらの２つの値の間の任意の値の近接核酸であってよい。
ＩＩＩ．毛状突起特異的プロモーターを使用する宿主細胞および生物の遺伝子操作
Ａ．毛状突起特異的プロモーター
本技術の開示は、毛状突起細胞においてそれに作動可能に連結されているコード核酸配列の転写を制御できる、２３個のプロモーターの同定に関する。
したがって、本技術は、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３のいずれかに記される核酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一である核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチドであって、核酸配列が毛状突起細胞においてそれに作動可能に連結されているコード核酸配列の転写を制御できる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。２つの核酸配列間の差異は、基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置にまたはこれらの末端位置の間の任意の位置に生じる場合があり、基準配列中のヌクレオチド内に個々にまたは基準配列内の１つもしくは複数の近接群中に散在されている。
本技術は、１つまたは複数の塩基の欠失、置換、挿入または付加を含む配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３の生物学的に活性な「変種」であって、核酸配列が毛状突起細胞においてそれに作動可能に連結されているコード核酸配列の転写を制御できる、変種も含む。配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３の変種として、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３に少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える核酸配列同一性を有し、それらの活性が毛状突起特異的である、核酸配列が挙げられる。
本技術の一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（プロモーター）は、ＰＣＲに基づくＤＮＡ改変または標準的変異導入技術、または改変ポリヌクレオチドを化学的に合成することによってなどの当技術分野において周知の方法を使用して、それらのプロモーター活性を増強するように分子配列中に多様性を創出するように改変される。
したがって、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３に記載されている配列は、短縮または欠失されてよく、毛状突起において作動可能に連結されている核酸配列の転写を方向付ける能力をいまだ維持していてよい。プロモーター領域の最短長は、これだけに限らないが制限酵素断片の除去またはヌクレアーゼを用いる消化が挙げられる当技術分野において周知の標準的技術によって単離されたポリヌクレオチドの５’および３’末端から配列を、体系的に除去することによって決定できる。
本技術の毛状突起特異的プロモーターは、植物においてネイティブ遺伝子の発現を減少させるまたは阻害する核酸を発現するために使用されてもよい。そのような核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム、センス抑制剤（sense suppression agent）またはネイティブ遺伝子の発現を阻害する他の産物をコードできる。
本技術の毛状突起特異的プロモーターは、「分子農業」応用においてタンパク質またはペプチドを発現するために使用されてもよい。そのようなタンパク質またはペプチドとして、これだけに限らないが、産業用酵素、抗体、治療剤および栄養製品が挙げられる。
一部の実施形態では、新規ハイブリッドプロモーターは、多数の方法によって設計または操作され得る。多数のプロモーターは、プロモーターの強度および／または特異性を活性化、増強または規定する上流配列を含有する。例えば、Atchison,Ann.Rev.Cell Biol.4:127 (1988)を参照されたい。例えばＴ−ＤＮＡ遺伝子は、転写開始の部位を規定する「ＴＡＴＡ」ボックスを含有し、転写開始部位の上流に位置付けられる他の上流エレメントは、転写レベルを調節する。
Ｂ．毛状突起特異的発現のためのカンナビノイドオン（ＣＡＮＯＮ）断片
一部の実施形態では本技術の開示は、それに作動可能に連結されているコード核酸配列の毛状突起特異的発現を方向付けるために十分である、「カンナビノイドオン」または「ＣＡＮＯＮ」断片と名付けられた核酸分子の同定にも関する。
１７１塩基対ＣＡＮＯＮ断片（配列番号３１）は、表１に示されている。コンセンサスＣＡＮＯＮ断片（表示）は、推定ＴＡＴＡボックス（太字下線付き）、５’ＵＴＲおよび開始コドン（太字下線付き「ａｔｇ」）と共に表１において配列番号３２として示されている。コンセンサスは、ＴＨＣＡシンターゼ１９６０３、１３３０および５０３２０、ＣＢＣＡシンターゼ３４９８ならびにＣＢＤＡシンターゼ２０８００からの毛状突起特異的プロモーター由来である。１７１塩基対ＣＡＮＯＮ断片（配列番号３１）は、タバコ（およびカンナビス）の腺毛状突起において毛状突起特異的発現を方向付けるために十分である。
「４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーター」と名付けられるミニマルプロモーター（すなわち、ＴＡＴＡボックス、転写の開始および第１のＡＴＧ）の１つのコピーの前にＣＡＮＯＮ断片の４つのコピーを含む核酸配列も表１において配列番号３３として示されている。配列番号３３の第１のＣＡＮＯＮ断片は、太字で示され、下線付きで示される第２の断片が続き、太字の第３の断片および下線付きの第４の断片が続く。
ＣＡＮＯＮ断片は、機能獲得型プロモーターにおいて毛状突起特異的発現を方向付けるために十分である。理論に束縛されることなく、ＣＡＮＯＮ断片がＴＨＣＡ、ＣＢＤＡおよびＣＢＣＡシンターゼを含む多数のカンナビノイド生合成酵素遺伝子の毛状突起特異的発現に関与していると考えられる。
Ｃ．核酸構築物
一部の実施形態では、毛状突起特異的プロモーター配列および本技術のＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片は、発現構築物（すなわち、発現ベクター）などの核酸構築物中に組み込まれてよく、それは、植物毛状突起細胞などの宿主細胞に導入され、複製されてよい。そのような核酸構築物として、本技術のプロモーター配列またはＣＡＮＯＮ断片のいずれかに作動可能に連結されている異種性核酸が挙げられる。それにより一部の実施形態では、本技術は、植物細胞または植物などの組換え細胞または生物における相同性または異種性核酸配列の発現のための、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３に記載されているプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれかの使用を提供する。一部の実施形態では、この使用は、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３に記載されているプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれかを、核酸構築物を形成するように相同性または異種性核酸配列に作動可能に連結すること、ならびに植物または植物細胞などの宿主を形質転換することを含む。一部の実施形態では、カンナビノイドの産生のための生合成経路に関与する酵素をコードする種々の遺伝子（例えば、配列番号４、７、１０、１５、２０、２７または３０に記載されている少なくとも１つの核酸配列）は、本技術の毛状突起特異的プロモーターまたはＣＡＮＯＮ断片に作動可能に連結され得る導入遺伝子として好適であり得る。一部の実施形態では、本技術の核酸構築物は、カンナビノイド生合成を制御する１つまたは複数のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、本技術の核酸構築物は、毛状突起細胞におけるカンナビノイドまたは他の化合物（例えば、テルペン）の発現を調節するために使用できる。
一部の実施形態では、発現ベクターは、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族ピレニルトランスフェラーゼ（pyrenyltransferase）（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＥＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼおよびＴＨＣＡシンターゼの１つまたは複数などのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されている、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３からなる群から選択される核酸配列を含むプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。別の実施形態では、植物細胞株は、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族ピレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＥＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼおよびＴＨＣＡシンターゼの１つまたは複数などのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されている、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３からなる群から選択される核酸配列を含むプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片を含む発現ベクターを含む。別の実施形態では、トランスジェニック植物は、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族ピレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＥＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼおよびＴＨＣＡシンターゼの１つまたは複数などのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されている、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３からなる群から選択される核酸配列を含むプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片を含む発現ベクターを含む。別の実施形態では、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族ピレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＥＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼおよびＴＨＣＡシンターゼの１つまたは複数などのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されている、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３からなる群から選択される核酸配列を含むプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片を含む発現ベクターを導入することを含む、カンナビノイドの産生を遺伝子的に調節するための方法が提供される。
別の実施形態では、発現ベクターは、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族ピレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＥＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼ、およびＴＨＣＡシンターゼの１つまたは複数などのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されている、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３からなる群から選択される核酸配列を含む１つもしくは複数のプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。別の実施形態では、植物細胞株は、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族ピレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＥＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼおよびＴＨＣＡシンターゼの１つまたは複数などのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されている、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３からなる群から選択される核酸配列を含む１つまたは複数のプロモーターまたはそれらの生物学的に活性な断片を含む。別の実施形態では、トランスジェニック植物は、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族ピレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＥＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼおよびＴＨＣＡシンターゼの１つまたは複数などのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されている、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３からなる群から選択される核酸配列を含む１つまたは複数のプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。別の実施形態では、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族ピレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＥＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼおよびＴＨＣＡシンターゼの１つまたは複数などのポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されている、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３からなる群から選択される核酸配列を含む１つまたは複数のプロモーターもしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することを含む、カンナビノイドの産生レベルを遺伝子的に調節するための方法が提供される。
構築物は、適切な宿主（植物）細胞における発現のために適合された発現ベクターなどのベクター内に含まれてよい。導入されたＤＮＡ配列を含む植物を産生できる任意のベクターが十分であることは理解される。
好適なベクターは、当業者に公知であり、Pouwels et al., Cloning Vectors, A Laboratory Manual, Elsevier, Amsterdam (1986)などの技術参考文献に一般に記されている。植物形質転換のためのベクターは、記されている（例えば、Schardl et al., Gene 61:1-14 (1987)を参照されたい）。一部の実施形態では、核酸構築物は、プラスミドベクターまたはバイナリーベクターである。好適なベクターの例として、Ｔｉプラスミドベクターが挙げられる。
毛状突起特異的制御配列（例えば、プロモーター、ＣＡＮＯＮ断片）の調節下にヌクレオチド配列またはキメラ遺伝子を導入することができる組換え核酸構築物（例えば、発現ベクター）は、当技術分野において一般に周知の標準的技術を使用して作製できる。キメラ遺伝子を生成するために、発現ベクターは、５’から３’の方向で作動可能に連結されている、下流相同性または異種性核酸配列の転写を方向付ける毛状突起特異的プロモーター配列またはＣＡＮＯＮ配列、ならびに続いて任意選択で、転写の終結およびタンパク質をコードするｍＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるように植物細胞において機能するポリアデニル化シグナルをコードする、３’非翻訳核酸領域（３’−ＵＴＲ）を一般に含む。相同性または異種性核酸配列は、タンパク質もしくはペプチドをコードする配列であってよく、あるいは宿主細胞もしくは生物において遺伝子もしくは遺伝子ファミリーをサイレンシングするために好適なセンスおよび／またはアンチセンスＲＮＡなどの活性ＲＮＡ分子に転写される配列であってよい。発現ベクターは、一般に選択可能マーカーも含有する。典型的な５’から３’への制御配列として、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位および／またはポリアデニル化シグナルが挙げられる。
一部の実施形態では、本技術の発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写が終結され、ポリＡ配列が付加されるように、本技術の核酸分子の下流に位置付けられている終結配列を含んでよい。例示的ターミネーターとして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼターミネーター（Ｔｎｏｓ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓマンノピンシンターゼターミネーター（Ｔｍａｓ）およびＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）が挙げられる。終結領域として、エンドウマメリブロース二リン酸カルボキシラーゼスモールサブユニット終結領域（ＴｒｂｃＳ）またはＴｎｏｓ終結領域が挙げられる。発現ベクターは、エンハンサー、開始コドン、スプライシングシグナル配列および標的化配列も含有してよい。
一部の実施形態では、本技術の発現ベクターは、それにより形質転換細胞を培養物中で同定できる、選択マーカーを含有してよい。マーカーは、異種性核酸分子、すなわちプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子を伴っていてよい。本明細書において使用される場合、用語「マーカー」は、マーカーを含有している植物または細胞の選択またはスクリーニングを可能にする形質または表現型をコードする遺伝子を指す。植物では、例えばマーカー遺伝子は、抗菌薬または除草剤耐性をコードする。これは、形質転換またはトランスフェクトされていない細胞からの形質転換細胞の選択を可能にする。
好適な選択可能マーカーの例として、これだけに限らないが、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン−グアニンホスホ−リボシルトランスフェラーゼ、グリホサートおよびグルホシネート耐性ならびにアミノ−グリコシド３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼ（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８耐性）が挙げられる。これらのマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシンへの耐性を含み得る。構築物は、除草剤ホスフィノトリシン類似体様アンモニウムグルホシネート（gluphosinate）への耐性を付与する選択可能マーカー遺伝子ｂａｒも含んでよい。例えば、Thompson et al., EMBO J. 9:2519-23 (1987)）を参照されたい。当技術分野において周知の他の好適な選択マーカーも使用されてよい。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの可視マーカーは使用されてよい。細胞分裂の調節に基づく形質転換植物を同定するまたは選択するための方法も記されている。例えば、WO2000/052168およびWO2001/059086を参照されたい。
細菌またはウイルス起源の複製配列も、ベクターが細菌またはファージ宿主中にクローニングされるように、含まれてよい。好ましくは広範な宿主範囲の原核生物複製開始点が使用される。細菌のための選択可能マーカーは、所望の構築物を保有する細菌細胞の選択を可能にするように含まれてよい。好適な原核生物選択可能マーカーとして、カナマイシンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質への耐性も挙げられる。
追加的機能をコードする他の核酸配列も当技術分野において周知であるとおり、ベクター中に存在してよい。例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが宿主である場合、Ｔ−ＤＮＡ配列は、植物染色体への続く移行または組込みを促進するために含まれてよい。
本技術の核酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片が毛状突起における転写特異性を付与できるかどうか、および活性化が「強い」かどうかは、種々の方法を使用して決定され得る。定性方法（例えば、組織学的ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）染色）は、プロモーターまたはＣＡＮＯＮ断片の時空間活性を決定するために使用される（すなわち、プロモーターまたはＣＡＮＯＮ断片がある特定の組織または器官（例えば、毛状突起またはある特定の環境的／発生上の状態）において活性であるかどうか）。定量的方法（例えば、蛍光定量的ＧＵＳアッセイ）は、対照と比較した活性のレベルも定量する。好適な対照として、これだけに限らないが、空ベクターを用いて形質転換された（陰性対照）またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの表皮および毛状突起において活性であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣＥＲ６プロモーターなどの他のプロモーターを含む構築物を用いて形質転換された植物、が挙げられる。
本技術のプロモーターまたはＣＡＮＯＮ断片の活性を検査または定量するために、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９もしくは３１〜３３に記載されている核酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片は、周知の核酸配列（例えばｇｕｓＡなどのレポーター遺伝子、または特定のタンパク質をコードする任意の遺伝子）に作動可能に連結されてよく、周知の方法を使用して植物細胞を形質転換するために使用されてよい。プロモーターまたはＣＡＮＯＮ断片の活性は、定量的ＲＴ−ＰＣＲまたは他のＰＣＲに基づく方法によって、毛状突起細胞における下流核酸配列のＲＮＡ転写物のレベルを検出することによって例えばアッセイ（および任意選択で定量）され得る。代替的にレポータータンパク質またはレポータータンパク質の活性は、例えばレポーター遺伝子がｇｕｓ遺伝子である場合は蛍光定量的ＧＵＳアッセイによってアッセイおよび定量され得る。
一部の実施形態では、本技術のプロモーターは、毛状突起細胞において目的の異種性核酸の発現を駆動するために使用され得る。異種性核酸は、配列番号４、７、１０、１５、２０、２７および３０にそれぞれ記載されているカンナビノイド生合成経路酵素オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼまたはＣＢＣＡシンターゼなどの任意の人工組換えまたは天然に存在するタンパク質をコードできる。
Ｄ．宿主植物および細胞ならびに植物再生
本技術の核酸構築物は、植物細胞などの宿主細胞を形質転換するために利用され得る。一部の実施形態では、本技術の核酸構築物は、植物の少なくとも一部の細胞を形質転換するために使用される。これらの発現ベクターは、宿主植物細胞に一過性に導入されてもよく、または当業者に周知の種々の方法によってトランスジェニック植物を作出するように宿主植物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれてもよい。
細胞または植物に核酸構築物を導入するための方法は、当技術分野において公知である。トランスジェニック植物を作出するために植物毛状突起中に核酸構築物（例えば、発現ベクター）を導入するための好適な方法として、これだけに限らないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、パーティクルガン送達、微量注入、電気穿孔法、ポリエチレングリコール支援プロトプラスト形質転換（polyethylene glycol-assisted protoplast transformation）およびリポソーム媒介形質転換が挙げられる。双子葉植物を形質転換するための方法は、主にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、例えばGuillon et al., Curr. Opin. Plant Biol. 9:341-6 (2006)によって記されるとおり、カンナビスおよびタバコが挙げられる植物のトランスジェニック毛状根培養物を産生するために使用され得る。「タバコ毛状根」は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡがゲノム中に組み込まれており、オーキシンおよび他の植物ホルモンの補充を伴わない培養において生育されるタバコ根を指す。
追加的に植物はＲｈｉｚｏｂｉｕｍ、ＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍまたはＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ形質転換によって形質転換されてよい（Broothaerts et al., Nature 433: 629-633 (2005)）。
植物細胞または植物の形質転換後、所望のＤＮＡが組み込まれたこれらの植物細胞または植物は、抗菌薬耐性、除草剤耐性、アミノ酸類似物への許容度または表現型マーカーを使用することなどの方法によって選択され得る。
トランスジェニック植物は、導入遺伝子を含有する追加的トランスジェニック植物を産生するために、交雑、自家受粉または戻し交配などの従来の植物育種スキームにおいて使用されてよい。
好適な宿主細胞として、植物細胞が挙げられる。例えばトウモロコシ／コーン（Ｚｅａ種、例えばＺ．ｍａｙｓ、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ（チャプール（chapule））、Ｚｅａ ｌｕｘｕｒｉａｎｓ（グアテマラテオシント（Guatemalan teosinte））、Ｚｅａ ｍａｙｓ亜種ｈｕｅｈｕｅｔｅｎａｎｇｅｎｓｉｓ（サンアントニオウイスタテオシント（San Antonio Huista teosinte））、Ｚ．ｍａｙｓ亜種ｍｅｘｉｃａｎａ（メキシカンテオシント（Mexican teosinte））、Ｚ．ｍａｙｓ亜種ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（バルサステオシント（Balsas teosinte））、Ｚ．ｐｅｒｅｎｎｉｓ（多年生テオシント）およびＺ．ｒａｍｏｓａ、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種）、オオムギ（例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、カラスムギ（例えば、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ種、例えばＧ．ｍａｘ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ種、例えば、Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、アブラナ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂ．ｒａｐａなど）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ種、例えば、Ｏ．ｓａｔｉｖａインディカ栽培品種群またはジャポニカ栽培品種群）、飼料草（forage grasses）、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ種、例えば、Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ）、樹種、野菜種、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ種（近年Ｓｏｌａｎｕｍ属に属するとして再分類された）、例えば、トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、異名Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、例えばチェリートマト、変種ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅもしくは現在のトマト、変種ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）またはツリートマト（Ｓ．ｂｅｔａｃｅｕｍ、異名Ｃｙｐｈｏｍａｎｄｒａ ｂｅｔａｃｅａｅ）など、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）および、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）などの他のＳｏｌａｎｕｍ種、ペピーノ（Ｓ．ｍｕｒｉｃａｔｕｍ）、ココナ（cocona）（Ｓ．ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒｕｍ）およびナランジラ（Ｓ．ｑｕｉｔｏｅｎｓｅ）；コショウ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、エンドウマメ（例えば、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、マメ（例えば、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ種）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｎａ）、レタス種（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ、Ｌａｃｔｕｃａ ｉｎｄｉｃａ、Ｌａｃｔｕｃａ ｐｅｒｅｎｎｉｓなど）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ズッキーニ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ）、カボチャ（squash）（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｉｘｔａ）、カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ 異名Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、新鮮果実種（ブドウ、モモ、セイヨウスモモ、イチゴ、マンゴー、メロン）、観賞植物種（例えば、バラ、ペチュニア、キク、ユリ、チューリップ、ガーベラ種）、樹木（例えば、ポプラ、ヤナギ、カシ、ユーカリ種）、繊維種、例えば亜麻（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）ならびに大麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）などの単子葉植物または双子葉植物が挙げられる、任意の植物が好適な宿主であり得る。一部の実施形態では植物は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａである。一部の実施形態では植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍである。
したがって一部の実施形態では本技術は、宿主植物、Ｃ．ｓａｔｉｖａなど、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍなどのＳｏｌａｎａｃｅａｅ科の植物およびカンナビノイドを天然で産生しない他の植物科および種におけるカンナビノイド（例えば、ＴＨＣ、ＣＢＤ、ＣＢＣ）または他の分子の合成を遺伝子的にマニピュレートするための、配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９および３１〜３３に記載されている核酸配列を含む毛状突起特異的プロモーターおよび／もしくはＣＡＮＯＮ断片またはそれらの生物学的に活性な断片の使用を企図する。
本技術は、本明細書に記される核酸分子を用いて形質転換された遺伝子操作された細胞を含む、細胞培養系（例えば、植物細胞培養、細菌または真菌細胞培養、ヒトまたは哺乳動物細胞培養、昆虫細胞培養）も企図する。一部の実施形態では、本技術のプロモーターまたはＣＡＮＯＮ断片を含む細胞を含む細胞培養が提供される。
種々のアッセイが、植物細胞が遺伝子発現における変化を示すかどうかを決定するために使用されてよい、例えば、ノーザンブロット法または定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）。トランスジェニック植物全体は、従来の方法によって形質転換細胞から再生され得る。そのようなトランスジェニック植物は、ホモ接合株を産生するために増殖および自家受粉されてよい。そのような植物は、導入された形質に関する遺伝子を含有する種子を産生し、選択された表現型を産生する植物を産生するように生育されてよい。
毛状突起細胞における目的の分子の発現および／もしくは蓄積を増強するため、ならびに／または毛状突起細胞からの分子の精製を促進するために、少なくとも１つの内在性分子を下方制御するための植物毛状突起への方法が使用され得る。毛状突起は、毛状突起細胞における他の分子の産生を妨害する多数の化合物および代謝物を含有することが周知である。これらの化合物および代謝物として、例えば、プロテアーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）、ポリフェノール、ケトン、テルペノイドおよびアルカロイドが挙げられる。そのような毛状突起構成成分の下方制御は記されている。例えば米国特許第7,498,428号を参照されたい。
次の例は、例示のために示したにすぎず、限定するためのものではない。当業者は、本質的に同じまたは同様の結果をもたらすように変更または改変することができるさまざまな決定的ではないパラメーターを容易に認識する。例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本技術の範囲を限定するものとして何ら解釈されるべきでない。
例１：毛状突起特異的プロモーターの同定
（ｉ）オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）プロモーター、（ｉｉ）ＯＬＳ１プロモーターおよび（ｉｉｉ）ＯＬＳ２プロモーターの核酸配列を、それぞれ配列番号１、２および３に記載し、ＯＬＳの翻訳領域（ＯＲＦ）を配列番号４に記載する。オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）プロモーターの核酸配列を配列番号５に記載し、ＯＡＣ１プロモーターの核酸配列を配列番号６に記載し、ＯＡＣのＯＲＦを配列番号７に記載する。芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）プロモーターの核酸配列を配列番号８に記載し、ＰＴ１プロモーターの核酸配列を配列番号９に記載し、ＰＴのＯＲＦを配列番号１０に記載する。（ｉ）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１）プロモーター、（ｉｉ）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１’）プロモーター；（ｉｉｉ）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ３）プロモーターおよび（ｉｖ）ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１２）プロモーターの核酸配列を、それぞれ配列番号１１、１２、１３および１４に記載し、ヘキサノイル−ＣｏＡ（ＡＡＥ−１）のＯＲＦを配列番号１５に記載する。（ｉ）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）プロモーター、（ｉｉ）ＣＢＤＡＳシンターゼ１（ＣＢＤＡＳ１）プロモーター、（ｉｉｉ）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）２０８００プロモーターおよび（ｉｖ）ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）２０８００’プロモーターの核酸配列を、それぞれ配列番号１６、１７、１８および１９に記載し、ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）のＯＲＦの核酸配列を配列番号２０に記載する。（ｉ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１９６０３プロモーター、（ｉｉ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１９６０３’プロモーター、（ｉｉｉ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）５０３２０プロモーター、（ｉｖ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）５０３２０’プロモーター、（ｖ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１３３０プロモーターおよび（ｖｉ）ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１３３０’プロモーターの核酸配列を、それぞれ配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６に記載し、ＴＨＣＡＳのＯＲＦを配列番号２７に記載する。ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）３４９８プロモーターの核酸配列を配列番号２８に記載し、ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）３４９８’プロモーターの核酸配列を配列番号２９に記載し、ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）のＯＲＦを配列番号３０に記載する。
毛状突起特異的プロモーターは、カンナビノイド生合成経路中の生合成酵素遺伝子のコード領域を用いて、ＢＬＡＴ検索機能を使用してｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａのドラフトゲノム配列を検索することによって同定した。各ゲノム配列ヒットについて、第１のＡＴＧを確定するために遺伝子予測プログラムを実行した（ＦＧＥＮＥＳＨプログラムを使用する）。次いで転写の開始を、ゲノム配列をＮＣＢＩ ＮＲデータベースにおける最長有効（longest available）ｃＤＮＡ配列と比較することによって確定した。複数配列アライメント（ＣＢＤＡおよびＴＨＣＡシンターゼ遺伝子について）ならびにＰＬＡＣＥデータベースを検索することの両方がＴＡＴＡボックス領域を確定した。確定された開始コドン、転写の開始およびＴＡＴＡボックスを用いて、プロモーターの位置および配列を検証した。
例２：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいてカンナビノイド産生を方向付けるための毛状突起特異的プロモーター
カンナビノイドは、カンナビス毛状突起において合成され、蓄積される。オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）、芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１）、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼおよびＴＨＣＡシンターゼは、カンナビノイド生合成経路の酵素である。したがって、これらの酵素それぞれのためのプロモーターは、毛状突起細胞においてコード核酸の発現を方向付けることが期待される。本例は、天然ではカンナビノイドを産生しない植物および植物細胞においてカンナビノイド生合成酵素を発現させるための、本技術の毛状突起特異的プロモーターまたはそれらの生物学的に活性な断片の使用を実証する。
方法
ベクター構築物 プロモーター配列（配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３）を、Ｔｉ プラスミドベクターなどのＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ細胞における発現のために適合されたベクターにおいてＧＵＳ−Ａマーカーの前に位置付ける。構築物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓに組み込み、当技術分野において周知の方法によりＮ．ｔａｂａｃｕｍを形質転換するために使用する。構築物を形質転換し、カナマイシン選択下で再生し、初代再生体（Ｔ０）を種子に生育させる。
対照として、タバコＮｔＣＰＳ２プロモーターを含有する構築物を、タバコに形質転換する。ＮｔＣＰＳ２プロモーターは、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍにおいて毛状突起特異的発現を方向付けることに高度に有効であることが示されている（Sallaud et al., The Plant Journal 72:1-17 (2012)）。
発現分析 定量的および定性的β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性分析をＴ１植物において実施する。プロモーター活性の定性分析を組織学的ＧＵＳアッセイを使用し、蛍光顕微鏡を使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の可視化によって実行する。ＧＵＳアッセイのために、種々の植物の一部をリン酸緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ、Ｋ２ＨＰＯ４、１０μＭ、ｐＨ７．２、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中のＸｇｌｕｅ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドシクロヘキシルアミン塩）基質を用いて大気酸素の存在下、一晩、３７℃でインキュベートする。試料をエタノールを用いる反復洗浄によって脱色する。非トランスジェニック植物を陰性対照として使用する。ＯＬＳ：ＧＵＳ、ＯＡＣ：ＧＵＳ、ＰＴ：ＧＵＳ、ＡＡＥＥ１−１：ＧＵＳ、ＣＢＤＡＳ：ＧＵＳ、ＣＢＣＡＳ：ＧＵＳおよびＴＨＣＡＳ：ＧＵＳを有するトランスジェニック植物の毛状突起が明るい青色の毛状突起を示す一方で、これらのトランスジェニック植物の毛状突起以外の組織および非トランスジェニック対照植物の毛状突起は着色されないことが予測される。
プロモーター活性の定量的分析を蛍光定量的ＧＵＳアッセイを使用して実行する。全タンパク質試料を若い葉の材料から調製する；試料をプールした葉片から調製する。新鮮葉材料を金属ビーズを使用してＰＢＳ中で挽き、遠心分離および上清の回収が続く。
結果
本技術のプロモーターまたはそれらの生物学的に活性な断片を含む発現ベクターを用いて遺伝子操作された植物および植物細胞は、毛状突起特異的転写活性を示す。図２Ｂに示すとおり、ＣＢＤＡＳ ２０８００：ＧＵＳを用いて形質転換したトランスジェニック植物の毛状突起は、明るい青色の毛状突起を示す一方で、植物の毛状突起以外の組織は着色されていない。カンナビノイド生合成経路における他のプロモーターについての毛状突起特異的発現は、定性的に同様である（図３）。図３の結果は、タバコ毛状突起での完全なカンナビノイド生合成経路からのプロモーターの毛状突起特異的発現を実証している。これにより、これらの結果は、本明細書に記される完全なカンナビノイド生合成経路由来のプロモーターが、根、葉、茎または植物の他の組織における発現と比較して、毛状突起組織において作動可能に連結されている遺伝子の発現を優先的に方向付けるために有用であることを実証している。この毛状突起特異的発現は、細胞傷害性カンナビノイドなどの毛状突起特異的生化学化合物の生合成のマニピュレーションのための重要なツールである。加えてこれらのプロモーターは、特定の生化学化合物の管理された産生のためのバイオ工場としてタバコまたはカンナビス毛状突起を使用することを目的とする戦略に重要である。
例３：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて毛状突起特異的発現を方向付けるための「カンナビノイドオン」（「ＣＡＮＯＮ」）断片の同定
「カンナビノイドオン」（「ＣＡＮＯＮ」）断片の核酸配列を配列番号３１に記載する。ＣＡＮＯＮ断片の核酸配列を推定ＴＡＴＡボックス、５’ＵＴＲおよび開始コドンと共に配列番号３２に記載する。４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーターの核酸配列を配列番号３３に記載する。コンセンサスＣＡＮＯＮ断片は、ＴＨＣＡシンターゼ１９６０３、１３３０、５０３２０、ＣＢＣＡシンターゼ３４９８およびＣＢＤＡシンターゼ２０８００からの毛状突起特異的プロモーター由来である。
方法
ＣＡＮＯＮ断片をＢＬＡＴ検索機能を使用してパープルクッシュゲノム配列を検索することによって同定した。ＴＨＣＡシンターゼ遺伝子を使用するパープルクッシュゲノム配列のＢＬＡＴ検索は、次の結果をもたらした：
下線のプロモーターをさらなる分析のために選択し、５個のプロモーターの配列を比較した。５個のプロモーターは、翻訳開始から推定ＴＡＴＡボックスの上流約１６０塩基対まで高い配列類似性を示したが、ＴＡＴＡボックスの上流では配列類似性をほとんど示さなかった。
コンセンサス配列は、５個のプロモーターに由来し、配列を「４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーター」と名付けた合成プロモーターを使用して、タバコ毛状突起における毛状突起特異的プロモーター活性について検査するために使用した。４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーターは、天然で見出されない４コピーのコンセンサスＣＡＮＯＮ断片を、１コピーのミニマルプロモーター（ＴＡＴＡボックス、転写の開始および第１のＡＴＧ）の前に含む。例２に記されるとおり、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍをＧＵＳ−Ａマーカーの前に位置付けられた４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーターを用いて形質転換し、ＧＵＳ発現分析を実施した。
結果
図４Ｂに示すとおり、４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーターは、毛状突起における発現を方向付ける。したがって、これらの結果は、ＣＡＮＯＮ断片が機能獲得型プロモーターにおいて毛状突起特異的発現を方向付けるために十分であり、それによりＴＨＣＡ、ＣＢＤＡおよびＣＢＣＡシンターゼを含む多数のカンナビノイド生合成酵素遺伝子の毛状突起特異的発現に関与することを実証している。
等価物
本技術は、本技術の個々の態様の単一の例示として意図される、本出願に記される具体的な実施形態に関して限定されない。当業者に明らかであるとおり、本技術の多数の改変および変動が、その精神および範囲から逸脱することなく作製され得る。本明細書に列挙されるものに加えて、本技術の範囲内の機能的に等価な方法および装置は、前述の記載から当業者に明らかである。そのような改変および変動は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本技術は、特許請求の範囲が権利を与られる等価物の範囲全体と併せて、添付の特許請求の範囲の条項によってのみ限定される。当然のことながら変化する場合がある、具体的な方法、試薬、化合物組成または生物学的系に本技術が限定されないことは理解される。本明細書において使用される用語は、具体的な実施形態を記載する目的のためだけであり、限定を意図しないことも理解される。
追加的に、本開示の特性または態様がマーカッシュ群の観点から記される場合、当業者は、それにより本開示が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはサブグループのメンバーの観点からも記されていることを認識する。
当業者によって理解されるとおり、任意のおよびすべての目的のために、具体的には書面の記載を提供する観点において、本明細書に開示されるすべての範囲は、任意のおよびすべての可能な部分的範囲ならびにそれらの部分的範囲の組合せも包含する。任意の列挙された範囲は、十分に記載されているとして容易に認識されてよく、同範囲は少なくとも等分、三分割、四分割、五分割、十分割などに分割されてよい。非限定的例として、本明細書において考察される各範囲は、下部三分の一、中部三分の一、上部三分の一などに容易に分割されてよい。同様に当業者によって理解されるとおり、「まで」、「少なくとも」。「超える」、「未満」などのすべての語は、引用された数を含み、上に考察したとおり部分的な範囲に続いて分割されてよい範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるとおり、範囲は個々のメンバーそれぞれを含む。したがって、例えば１〜３個の細胞を有する群は、１、２または３個の細胞を有する群を指す。同様に１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４または５個の細胞を有する群を指すなど。
特許、特許出願、仮出願および、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号を含む刊行物など、本明細書に参照または引用されるすべての公表された文書は、それらが本明細書の明確な教示に矛盾しない程度まで、すべての図および表を含んでその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
他の実施形態は、続く特許請求の範囲において記載される。
配列表
配列番号１（５５４ｂｐ）
テトラケタイドシンターゼ／オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）プロモーター
AAAAATAAAATTAATAAATTTTTAATTATTAATATCATTTTATTTTTTAA
TAAATAAATATCATTTTTATATTATTATAATATGTATAAAGTTTTAATTG
TATACAAGAAGTCTTATAGTAAGAGTATACACCTTACATCATAATAACTA
CTCGATCTGAAATCAATGGTCAAGAAAAGTTCCCTACCGGTAGGAAACTT
TTGCTAGATCCTACCATAGTCTTCCCTTATATTTATTATGTAGAATCTAT
TATTATATCTAATAATTAACAAATATTAACAAATCATTTTGAAAAATTAT
ATTAAAAAAAAAACTTGAAAAGTCAAAGATTAACCATCAATTTGCCAAAT
CAAATTAGTGAGAAAGTAGGTATTATATACCTAACACTCATTTTACATAT
GTCTAGACGTTTATATGTATAGCGTTGTTGTGTGTAATAAGTTCACTTGT
AGTATCTTGTACATACATAATATATATATATAGGTGTGTTTGTGAACAAT
TATATTATCACACATACACAACTCATTATTATCATAATAATAATAATACC
ATGG
配列番号２（５５０ｂｐ）
テトラケタイドシンターゼ／オリベトールシンターゼ１（ＯＬＳ１）プロモーター
AAAAATAAAATTAATAAATTTTTAATTATTAATATCATTTTATTTTTTAA
TAAATAAATATCATTTTTATATTATTATAATATGTATAAAGTTTTAATTG
TATACAAGAAGTCTTATAGTAAGAGTATACACCTTACATCATAATAACTA
CTCGATCTGAAATCAATGGTCAAGAAAAGTTCCCTACCGGTAGGAAACTT
TTGCTAGATCCTACCATAGTCTTCCCTTATATTTATTATGTAGAATCTAT
TATTATATCTAATAATTAACAAATATTAACAAATCATTTTGAAAAATTAT
ATTAAAAAAAAAACTTGAAAAGTCAAAGATTAACCATCAATTTGCCAAAT
CAAATTAGTGAGAAAGTAGGTATTATATACCTAACACTCATTTTACATAT
GTCTAGACGTTTATATGTATAGCGTTGTTGTGTGTAATAAGTTCACTTGT
AGTATCTTGTACATACATAATATATATATATAGGTGTGTTTGTGAACAAT
TATATTATCACACATACACAACTCATTATTATCATAATAATAATAATAAT
配列番号３（５５８ｂｐ）
テトラケタイドシンターゼ／オリベトールシンターゼ２（ＯＬＳ２）プロモーター
AAAAATAAAATTAATAAATTTTTAATTATTAATATCATTTTATTTTTTAA
TAAATAAATATCATTTTTATATTATTATAATATGTATAAAGTTTTAATTG
TATACAAGAAGTCTTATAGTAAGAGTATACACCTTACATCATAATAACTA
CTCGATCTGAAATCAATGGTCAAGAAAAGTTCCCTACCGGTAGGAAACTT
TTGCTAGATCCTACCATAGTCTTCCCTTATATTTATTATGTAGAATCTAT
TATTATATCTAATAATTAACAAATATTAACAAATCATTTTGAAAAATTAT
ATTAAAAAAAAAACTTGAAAAGTCAAAGATTAACCATCAATTTGCCAAAT
CAAATTAGTGAGAAAGTAGGTATTATATACCTAACACTCATTTTACATAT
GTCTAGACGTTTATATGTATAGCGTTGTTGTGTGTAATAAGTTCACTTGT
AGTATCTTGTACATACATAATATATATATATATAGGTGTGTTTGTGAACA
ATTATATTATCACACATACACAACTCATTATTATTAGCATAATAATAATA
ATAATAAT
配列番号４（１１５８ｂｐ）
オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）ＯＲＦ
1 atgaatcatc ttcgtgctga gggtccggcc tccgttctcg ccattggcac cgccaatccg
61 gagaacattt tattacaaga tgagtttcct gactactatt ttcgcgtcac caaaagtgaa
121 cacatgactc aactcaaaga aaagtttcga aaaatatgtg acaaaagtat gataaggaaa
181 cgtaactgtt tcttaaatga agaacaccta aagcaaaacc caagattggt ggagcacgag
241 atgcaaactc tggatgcacg tcaagacatg ttggtagttg aggttccaaa acttgggaag
301 gatgcttgtg caaaggccat caaagaatgg ggtcaaccca agtctaaaat cactcattta
361 atcttcacta gcgcatcaac cactgacatg cccggtgcag actaccattg cgctaagctt
421 ctcggactga gtccctcagt gaagcgtgtg atgatgtatc aactaggctg ttatggtggt
481 ggaaccgttc tacgcattgc caaggacata gcagagaata acaaaggcgc acgagttctc
541 gccgtgtgtt gtgacataat ggcttgcttg tttcgtgggc cttcagagtc tgacctcgaa
601 ttactagtgg gacaagctat ctttggtgat ggggctgctg cggtgattgt tggagctgaa
661 cccgatgagt cagttgggga aaggccgata tttgagttgg tgtcaactgg gcaaacaatc
721 ttaccaaact cggaaggaac tattggggga catataaggg aagcaggact gatatttgat
781 ttacataagg atgtgcctat gttgatctct aataatattg agaaatgttt gattgaggca
841 tttactccta ttgggattag tgattggaac tccatatttt ggattacaca cccaggtggg
901 aaagctattt tggacaaagt ggaggagaag ttgcatctaa agagtgataa gtttgtggat
961 tcacgtcatg tgctgagtga gcatgggaat atgtctagct caactgtctt gtttgttatg
1021 gatgagttga ggaagaggtc gttggaggaa gggaagtcta ccactggaga tggatttgag
1081 tggggtgttc tttttgggtt tggaccaggt ttgactgtcg aaagagtggt cgtgcgtagt
1141 gttcccatca aatattaa
配列番号５（９９６ｂｐ）
オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）プロモーター
AATTTTTGACAATTTTTTTTAATATAACTAACTTGAAGATAATTCCTAAT
ACGAATAAATACAGAAAATATAAACAGTTTTGTTATAACACTTTTAGATC
AGATTATAATTAAATTTTATATTTTTGATAAAAAAATCAATTGAGGGTCC
TATTTGTACCATTTTAGAAAATATAGTGTCCATTTTTATTATTTAGTAAA
ACAGAGAGTCTAATGCGTAACTTTTACAAAAATACATGGTCCAAAATAGT
ATTTACCCTTTAATTTTATTAGCAACTGTCCCAAAAAAAATATGTTTTGA
TGACTGACGTACGGGAATGTAAAGTTTTGTAATAGTGTATTGATTCAAAG
ACAACATAAAGACATCAATCTGAAATCGATTTCAATGTCCCAAAAACACA
TTAATGAGCCTTAATTGCATCCGATAATCATTTTCCATTGGTTTTATTAC
TTCTCATATATATAGACATCACATATATGATAGGATTTCTTGAGAATAAT
GTTAACATTGAGATTTTTATTACAACTGATATATTGATTATGCTTAGATG
GCTTGAATTTGAGCGACATATATAGAAAGAGTATAGAATGATATATATGC
ACATCCAAAATATGTACCAAAATATTAGGTGACAATTTAGATAAATGGAA
GAGAAAATTATAGAAAAATGAGGGTTTATATTTTTGTGGTTATTTAATTT
TAGACATAGTGTGATCCAATAATTTTAGGATGTATAATTGTTAGGCACAT
GGATTACTTGTTTTTTTATTAAGTATAACCTTACAAAGTAGATGGTAGTA
ATTAATGTAGAAGGTTCCAATAATGTATTTATATAAATTGTTAGGCATGC
AAAGCCTAATTAATTAATAAATGAGGGTGGCCAATGGCCACTATATATAT
CAAGGCATCGACTGTATGTAGCATAATGTGATTTATATAATTATCAAAAA
AAAAAAATAAAAATAAGAAGAAGAAGAAAGTTGAGAAAGACCATGG
配列番号６（９９２ｂｐ）
オリベトール酸環化酵素１（ＯＡＣ１）プロモーター
AATTTTTGACAATTTTTTTTAATATAACTAACTTGAAGATAATTCCTAAT
ACGAATAAATACAGAAAATATAAACAGTTTTGTTATAACACTTTTAGATC
AGATTATAATTAAATTTTATATTTTTGATAAAAAAATCAATTGAGGGTCC
TATTTGTACCATTTTAGAAAATATAGTGTCCATTTTTATTATTTAGTAAA
ACAGAGAGTCTAATGCGTAACTTTTACAAAAATACATGGTCCAAAATAGT
ATTTACCCTTTAATTTTATTAGCAACTGTCCCAAAAAAAATATGTTTTGA
TGACTGACGTACGGGAATGTAAAGTTTTGTAATAGTGTATTGATTCAAAG
ACAACATAAAGACATCAATCTGAAATCGATTTCAATGTCCCAAAAACACA
TTAATGAGCCTTAATTGCATCCGATAATCATTTTCCATTGGTTTTATTAC
TTCTCATATATATAGACATCACATATATGATAGGATTTCTTGAGAATAAT
GTTAACATTGAGATTTTTATTACAACTGATATATTGATTATGCTTAGATG
GCTTGAATTTGAGCGACATATATAGAAAGAGTATAGAATGATATATATGC
ACATCCAAAATATGTACCAAAATATTAGGTGACAATTTAGATAAATGGAA
GAGAAAATTATAGAAAAATGAGGGTTTATATTTTTGTGGTTATTTAATTT
TAGACATAGTGTGATCCAATAATTTTAGGATGTATAATTGTTAGGCACAT
GGATTACTTGTTTTTTTATTAAGTATAACCTTACAAAGTAGATGGTAGTA
ATTAATGTAGAAGGTTCCAATAATGTATTTATATAAATTGTTAGGCATGC
AAAGCCTAATTAATTAATAAATGAGGGTGGCCAATGGCCACTATATATAT
CAAGGCATCGACTGTATGTAGCATAATGTGATTTATATAATTATCAAAAA
AAAAAAATAAAAATAAGAAGAAGAAGAAAGTTGAGAAAGAGA
配列番号７（４８５ｂｐ）
オリベトール酸環化酵素（ＯＡＣ）ＯＲＦ
1 aaaaaagaag aagaagaaga aagttgagaa agagaatggc agtgaagcat ttgattgtat
61 tgaagttcaa agatgaaatc acagaagccc aaaaggaaga atttttcaag acgtatgtga
121 atcttgtgaa tatcatccca gccatgaaag atgtatactg gggtaaagat gtgactcaaa
181 agaataagga agaagggtac actcacatag ttgaggtaac atttgagagt gtggagacta
241 ttcaggacta cattattcat cctgcccatg ttggatttgg agatgtctat cgttctttct
301 gggaaaaact tctcattttt gactacacac cacgaaagta gactatatat agtagccgac
361 caagctgcct tcatcttcat cttctcaaat aatatatcta atatctaatt atataataat
421 aactacttaa taaaagactg tgtttataac attaaataat aataataata aagtcttttg
481 tagct
配列番号８（１３６１ｂｐ）
芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）プロモーター
TCAAACCAGATTTTTTATAATAATTT
ACACACCAATTAACTAAGAAATTCTAACTAGAGTTAGTGTTGAATTAGAA
GGAGTATCAAGGTAACCTATCTCCTTTGTCTCTTTAAATTTTTAAAAGAA
AAGCTaTTGTTGTAATTAGTTTGGATTTTATGGGTTAGGTTTTGTAGAGT
TTGTTTGAGCTTAAAATTGTTGTTGGTTTGATTTAAGGTTGAATTCTGTG
TTGGTTTGTAAGATTTTAGCTGATGTAGTTCGTGTTGGAGGAGTTCGAGT
TTTTGAACTCAAAGTCCACTCAACAATATGGTGAAATTAGTTTTAGGTGG
TTTTAGATGCTTTTGAAGTGTATGTTTTGTTTAGATTACCCTCTTTTTGG
TAAGTTTGATAGCCTTTGGTCAAGGAATGACTTAATTTTGAAGGTCTGAA
AGTTGAGTAGTTTTGAACTCTTTTCTGCCCAAAATGGTTTCGAATGAGTT
GTACTTGTCATATGTGATTTGAGTGGTAAGGTTCGGAAGGGTAGTCCTAG
ACAGTGTTTTCAATGATTAGGTTTGGGGTTGGTGAATCTAGAGTTAAGAG
CCTAGAGTTTTGGTTGCTTGGATTGGTGTGACCTGGTTGTTAGTATCCTT
ATCAAGGGATCCCGAATAGGTGATGAGTGAGGTTTGGATGGTATATTCTG
GATCAAAATTTTTAGATGGGGTCCAAACTGATAGTTTCAAAAATGTGTGT
GTGTGTCTGGTTAAGGATTTATTTTGGGAAGGCTCTAGTTGGGAGGTCCT
GGATTGGAAGTTCTAGATGTGAGGCTCCGGGTAGGAGGGTCCTGTAGGAA
GATTCTAGATGGTATTTGGTGGTCGAGATGAGGGATTTCCGAACATGTTT
TAATAGTTACAATAATTCATAAATTTTCAACACTAAATCAAAATATTAAT
TTTGATATGATTGTATAAATTTAATCTCATCGTAGTGTAGAGCTCTACAT
GCATGCATGGTTTGTATAGCCATAATTAATTAATTAGGCAAGAAAGATAG
ATGTGCCTACCATGCATGACTTCTAAAACATGGATGACTTTAAATTTTGA
AACCAAGCAAAAATTGTTTTACTATAAATCTTGTTAATTTTTCATTATTG
ATATCACTATGTTATTCTAACCCTTTCGTAGCCATAATTAGTTAATTAGG
CAAGAAAGATAGATGTGCCTACCATGCATGACTTCTAAAACATGGATGAC
TTTAAATTTTGAAACCAAGCAAAAATTATTTTACTATAAATCTTGTTATT
TTTTCATTATTGATATCACTATGTTATTCTAACCCTTTCTTTCCCTCATT
TTTTCTTAATATTCAATCAATAATAATCTCCATGG
配列番号９（１３５７ｂｐ）
芳香族プレニルトランスフェラーゼ１（ＰＴ１）プロモーター
TCAAACCAGATTTTTTATAATAATTT
ACACACCAATTAACTAAGAAATTCTAACTAGAGTTAGTGTTGAATTAGAA
GGAGTATCAAGGTAACCTATCTCCTTTGTCTCTTTAAATTTTTAAAAGAA
AAGCTaTTGTTGTAATTAGTTTGGATTTTATGGGTTAGGTTTTGTAGAGT
TTGTTTGAGCTTAAAATTGTTGTTGGTTTGATTTAAGGTTGAATTCTGTG
TTGGTTTGTAAGATTTTAGCTGATGTAGTTCGTGTTGGAGGAGTTCGAGT
TTTTGAACTCAAAGTCCACTCAACAATATGGTGAAATTAGTTTTAGGTGG
TTTTAGATGCTTTTGAAGTGTATGTTTTGTTTAGATTACCCTCTTTTTGG
TAAGTTTGATAGCCTTTGGTCAAGGAATGACTTAATTTTGAAGGTCTGAA
AGTTGAGTAGTTTTGAACTCTTTTCTGCCCAAAATGGTTTCGAATGAGTT
GTACTTGTCATATGTGATTTGAGTGGTAAGGTTCGGAAGGGTAGTCCTAG
ACAGTGTTTTCAATGATTAGGTTTGGGGTTGGTGAATCTAGAGTTAAGAG
CCTAGAGTTTTGGTTGCTTGGATTGGTGTGACCTGGTTGTTAGTATCCTT
ATCAAGGGATCCCGAATAGGTGATGAGTGAGGTTTGGATGGTATATTCTG
GATCAAAATTTTTAGATGGGGTCCAAACTGATAGTTTCAAAAATGTGTGT
GTGTGTCTGGTTAAGGATTTATTTTGGGAAGGCTCTAGTTGGGAGGTCCT
GGATTGGAAGTTCTAGATGTGAGGCTCCGGGTAGGAGGGTCCTGTAGGAA
GATTCTAGATGGTATTTGGTGGTCGAGATGAGGGATTTCCGAACATGTTT
TAATAGTTACAATAATTCATAAATTTTCAACACTAAATCAAAATATTAAT
TTTGATATGATTGTATAAATTTAATCTCATCGTAGTGTAGAGCTCTACAT
GCATGCATGGTTTGTATAGCCATAATTAATTAATTAGGCAAGAAAGATAG
ATGTGCCTACCATGCATGACTTCTAAAACATGGATGACTTTAAATTTTGA
AACCAAGCAAAAATTGTTTTACTATAAATCTTGTTAATTTTTCATTATTG
ATATCACTATGTTATTCTAACCCTTTCGTAGCCATAATTAGTTAATTAGG
CAAGAAAGATAGATGTGCCTACCATGCATGACTTCTAAAACATGGATGAC
TTTAAATTTTGAAACCAAGCAAAAATTATTTTACTATAAATCTTGTTATT
TTTTCATTATTGATATCACTATGTTATTCTAACCCTTTCTTTCCCTCATT
TTTTCTTAATATTCAATCAATAATAATCTCC
配列番号１０（１１８８ｂｐ）
芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）ＯＲＦ
1 atgggactct catcagtttg taccttttca tttcaaacta attaccatac tttattaaat
61 cctcacaata ataatcccaa aacctcatta ttatgttatc gacaccccaa aacaccaatt
121 aaatactctt acaataattt tccctctaaa cattgctcca ccaagagttt tcatctacaa
181 aacaaatgct cagaatcatt atcaatcgca aaaaattcca ttagggcagc tactacaaat
241 caaactgagc ctccagaatc tgataatcat tcagtagcaa ctaaaatttt aaactttggg
301 aaggcatgtt ggaaacttca aagaccatat acaatcatag catttacttc atgcgcttgt
361 ggattgtttg ggaaagagtt gttgcataac acaaatttaa taagttggtc tctgatgttc
421 aaggcattct tttttttggt ggctatatta tgcattgctt cttttacaac taccatcaat
481 cagatttacg atcttcacat tgacagaata aacaagcctg atctaccact agcttcaggg
541 gaaatatcag taaacacagc ttggattatg agcataattg tggcactgtt tggattgata
601 ataactataa aaatgaaggg tggaccactc tatatatttg gctactgttt tggtattttt
661 ggtgggattg tctattctgt tccaccattt agatggaagc aaaatccttc cactgcattt
721 cttctcaatt tcctggccca tattattaca aatttcacat tttattatgc cagcagagca
781 gctcttggcc taccatttga gttgaggcct tcttttactt tcctgctagc atttatgaaa
841 tcaatgggtt cagctttggc tttaatcaaa gatgcttcag acgttgaagg cgacactaaa
901 tttggcatat caaccttggc aagtaaatat ggttccagaa acttgacatt attttgttct
961 ggaattgttc tcctatccta tgtggctgct atacttgctg ggattatctg gccccaggct
1021 ttcaacagta acgtaatgtt actttctcat gcaatcttag cattttggtt aatcctccag
1081 actcgagatt ttgcgttaac aaattacgac ccggaagcag gcagaagatt ttacgagttc
1141 atgtggaagc tttattatgc tgaatattta gtatatgttt tcatataa
配列番号１１（８０５ｂｐ）
ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１）プロモーター
ATAATGTTATTTATTATTTAATACAATATGACATTTATACAGCGTACCAA
ACGAGCCCATAATGTATTGCAATTGTATTGTTGTACGAATTAAAATAATA
AAATACTAATTAAGTTAATATTGTAAGATAGATAATATGGCAAACAAATA
AATAATTTTCAGTTGAGAATATGTACAAAATTAAAGTTGATTTTACAAGA
AACAAGTAGTACTAATTAAAATGGTAGATTTACATATAGTGTTCGTTAAA
TTTGAAAAAAGAAAACGACTAATTCATTGGAAAATTGATTGTGGAAGAAA
TCAAAATTTGGTGGCTGAACCGCCCTAGTTACTTAACACAATTCATAAAA
CAACCCTACACTACTTACCCTACACTATATACGTATATTTTTTTTTTATA
TTCCATTTGTTAATAAAATAAATATGCATTGTTATTATGTGTACCAAGAT
GCTAATACGGTGACGTTTTATATAAGTTTATAATTTTTTATTAAAGTAAA
ACAATTGTCCCTCAATATTAAATTAAAGAAAATAAGTAGGTTTTAGCATT
TCTCATGATAAATAAGTAGGAGTAGTAAGTATATTAATTTATATGCATAT
GTTAAAAGGCAACACAGTGATAGGTTGTGTAGTACGTACCCAAACCAAAT
TCCAGCCTAATCCATTATTAATGAGCAAGTCCTTGATAAAATAAGGTGCA
TGTTGTTAGATCAAATAACCCGTCCCGAAATCCAATATATATATATATAT
AATATTCAAACTCTCTCTTTCTATCTTCGTACAATTTAATAGAAGTAACC
ATGGG
配列番号１２（８００ｂｐ）
ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１’）プロモーター
ATAATGTTATTTATTATTTAATACAATATGACATTTATACAGCGTACCAA
ACGAGCCCATAATGTATTGCAATTGTATTGTTGTACGAATTAAAATAATA
AAATACTAATTAAGTTAATATTGTAAGATAGATAATATGGCAAACAAATA
AATAATTTTCAGTTGAGAATATGTACAAAATTAAAGTTGATTTTACAAGA
AACAAGTAGTACTAATTAAAATGGTAGATTTACATATAGTGTTCGTTAAA
TTTGAAAAAAGAAAACGACTAATTCATTGGAAAATTGATTGTGGAAGAAA
TCAAAATTTGGTGGCTGAACCGCCCTAGTTACTTAACACAATTCATAAAA
CAACCCTACACTACTTACCCTACACTATATACGTATATTTTTTTTTTATA
TTCCATTTGTTAATAAAATAAATATGCATTGTTATTATGTGTACCAAGAT
GCTAATACGGTGACGTTTTATATAAGTTTATAATTTTTTATTAAAGTAAA
ACAATTGTCCCTCAATATTAAATTAAAGAAAATAAGTAGGTTTTAGCATT
TCTCATGATAAATAAGTAGGAGTAGTAAGTATATTAATTTATATGCATAT
GTTAAAAGGCAACACAGTGATAGGTTGTGTAGTACGTACCCAAACCAAAT
TCCAGCCTAATCCATTATTAATGAGCAAGTCCTTGATAAAATAAGGTGCA
TGTTGTTAGATCAAATAACCCGTCCCGAAATCCAATATATATATATATAT
AATATTCAAACTCTCTCTTTCTATCTTCGTACAATTTAATAGAAGTAATA
配列番号１３（１０００ｂｐ）
ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ３）プロモーター
TAAAAATTAGATTATATTTTTATCAGAATTTTTTATTTATATTTTTCATC
GAGTTACGTTGATTTAACGTATGTTGACGGTGCTTATAATTGTCTATTAT
TTTTAAGTTATATACACGCACTACTTACGTAAATTTAGTTGGCAGATTTT
CTGTCTCTATGGGCTATATTGTTGGACATCAGCTATCTCATTAATTAATA
ATACCATACTTTTTCTTAAAAGTTAAATAAAACAAAATTATACACGCACT
GATTCGAATGGTGTAGCCCACGCACTTGCTAAGTCTGTTACTAGTTCTGT
AGGAGTTAATGTGTGGACTGATGCTTGTCCTAGATTTTATCAGCTATCTC
ATTAATTAATAATACCATACTTTTTCTTAAAAGTTAAATAAAACAAAATT
ATACACGCACTACGATAAGGATTATATAAATGATTAACTAAAAAATATCT
ATTTAACATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGG
GATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGT
AGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAA
GGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCA
CGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCA
TCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGT
GATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGC
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCC
CTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAACA
CCACCACCACCACCACCACCACGGTGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCCCATG
ATCAAACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGAATTCGCCCTTATGGAG
配列番号１４（８６９ｂｐ）
ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１２）プロモーター
GTGACAAACTGAAGAATTCTGTTTATTTTATTTTATACATT
AGTGATGTTTTTTACTTTTTTAGAGTTATTTTTATGCCTATGTAATTTGC
ATATTGTAGTGGAGTTTATGCAGTTATTTTTTTGTTGTTATTTAGTTGTT
TAACTAAGAGAAATAAATATATATATTTTTTATTTGTGCGTTGTTTTTAT
TTTATTTTTTAAGTTGACGTAAGTGTTGATGCTCAATTAATTTTTATATT
AACATAAAATTGTTATTGTGTTGCTTATTCGTTGCTATTGAGTTATTTCA
ATATTGTACTTTTTGAAGTTTTTGTCTTATAAATTTATTTTTATTTGCAT
AACATATGATAAACTTTAATGGATTTATATGTTACGGTTAAGTTGTTTTC
TAGTTGCTTTTGTGTTGTTGTTTAGTTGTTTTGCGCTGAGAAAAGAAGCC
CTATACGTTAAAATTCACTTTGTCCGAATTCGCCACGTGGCAACTACTGC
TACGTTCTGACGCTACAGATTGTGAGCGTCAGGCAAGTCTGAATGCTTTG
TCCCGCACTCACGTGTGAGTCTCACTCGCCCACATAGCCATATGTGTGCC
ACACATCTCCTTGCGCATCTAGGGGAGTTTTTCTACTGTATTTTTGTAAA
TAAGAAACTTTGAAAATAGTATATTTGAAATTAATAAATAATATAAATGT
TTATTTTTACTTATAGTAGTATAAATATTTATTTAAGATAATTTTAACTT
AAAATAGAAAAAATCTCAAAAAAAAATAAAATAAAATAAACTATACCTTT
AATTTTTATATTTATGAAAATTTCCCGTATAAAAGGGAAGATTTTTTTTT
TTAAAATTAGTAGGTAAGTAATAGGATG
配列番号１５（２３５１ｂｐ）
ヘキサノイル−ＣｏＡ合成酵素（ＡＡＥ１−１）ＯＲＦ
1 tcttggagtg tatatataga tatatatata catttctcca tttttggcca cccaaattac
61 ctaaattgaa ttcgtcgtgt tcgtctttct ccgccataaa taacaattga tttccttcgt
121 tctttcaagt ttttgtcaac tgagtactga gatccagtct gagtcgacac ttgtagaggt
181 tcgaaaatgg cgcagaagaa gtttattttt gaggttgaaa aggctaagga agctaaggat
241 ggaaggcctt ccatgggacc tgtttatcga agtatgtacg ccaaggatgg ctttcctcct
301 ccgattgatg gattggattg ttgttgggat gtgtttaggc tttctgtgga gagaaatcct
361 ggaaacaaaa tgctcggtcg ccgggaggtt gtggatggga aggctggaaa gtatgtttgg
421 caaacttata aggaggttta tgattgtgtg ataaaacttg gaaatgccat gcgcagttgt
481 ggtttcggag aaggagacaa atgtggtatc tatggtgcca attgctctga atggattatg
541 agcatgcagg cttgcaatgc tcatggactc tattgtgttc cgttgtatga caccttaggt
601 gctaatgcaa ttgagtttgt cataaaacat gccgaggtta caattgcttt tgcagaagag
661 aaaaagcttc ctgagctgtt gaaaacactt cctaacacca cagactattt aaaaacactt
721 gtgagctttg ggaaggtcac accggaacaa agggaatctg ttgaaaagtt tggattgaag
781 atctattcct gggaagagtt cttgcaattg ggtgattgta aagatttcga tcttccagtg
841 aaaaagaaaa ctgatatatg cactataatg tatactagtg gaactactgg tgacccaaag
901 ggagtactga tatccaatga gagcatcatt tctcttttgg ctggggtgag gcgattgctt
961 gagagtgtaa atgaaaagtt gaccgagaaa gatgtatttc tttcatatct tccccttgca
1021 catatcttcg atcgggtgat tgaggagtta tttattttgc atggtgcctc aatcgggttc
1081 tggcgtggcg atgtcaaatt attacttgaa gacattgggg agctaaaacc aactattttc
1141 tgtgccgttc cccgtgtgct ggatagagtc tatgctggtt tgacgcagaa gatttctgct
1201 gggggattct taaagaagac tctcttcaat ttcgcatact cacgcaagta taataacatg
1261 cgaaaggggc ttaaacacgg ggacgcagct ccattatgtg acaaaattgt atttagtaag
1321 gtgaagcaag gtttgggagg taatgtgcgg cttattctgt ctggagctgc gcctctagct
1381 cctcatgttg aagcttactt acgagttgtg acatgtgctc atgtttgcca aggatatggg
1441 ctaactgaaa cttgtgcggg gacatttgtc tcgataccaa atgaactacc aatgctcggt
1501 acagttggtc ctccagtacc caatgttgat gtatgtctgg aatcagttcc ggaaatggga
1561 tatgatgccc ttgcagaagt accgcgtgga gaagtatgtg tgaagggaag caccttattc
1621 tctgggtact acaaacgtga agacttaacc aaggaggtca tgattgatgg gtggttccat
1681 acaggtgatg ttggtgagtg gcaagcagat ggaagcttga aaatcattga ccgtaagaaa
1741 aatattttca aactttctca aggagaatat gtggcagttg agaacttaga gaacatttat
1801 ggtcttgttt ctgacattga ctcaatatgg gtttacggga acagcttcga gtccttcctc
1861 gttgctgtga ttaacccgaa ccagcaagca cttgaacgtt gggccggaga gaataatata
1921 tctggtgact tcaagtccat ttgtgaaaat ccaagagcaa aggaatacat tttgggagag
1981 ctcaataaga ttggcaaaga gaaaaagttg aaaggttttg agttcataag agctgttcac
2041 cttgacccag aggcatttga catagaacgt gaccttatta ctccaacata taagaaaaag
2101 agaccccagt tgctcaaata ctaccagagt gttattgata acatgtacaa ggaaggaaac
2161 aagcccagga cctgaaagat ataatagaca tttagagctt cactttctaa tatttcttca
2221 cacacttccc attttcatct ctctcttact tattacacta taaataatta acaaggttta
2281 ctgtgttgta aatgacattt taatattttc atagtctcaa tgtttcaatt cttagaggac
2341 gttttgattg g
配列番号１６（４２０ｂｐ）
ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）プロモーター
GTTAATAAACATACTTGTGAGTAGATCTAAGATCCTGGTAAAATAATTCCCAACATATT
TCAATCGTAAATTCATGAGTGATTCTTATCACTTCTTAAAAAAAAGATAT
AAAGATCCATAGATAAATAT TTGCTAGTCC TTTCTTTCCA TAGTCAACTT
CAATATGGCA TCTTAACTTC TTTCCATCAA CAAATGATGC TCAACTACTT
AATGTACAAT TTATATTTAT TTTTAGTAAG GGATACACCT AACAATGATG
CCTAATTTTG GTGAATTTTT TTTTACCACA TGTGACTTAA TGATATCAAA
TTTGGAAATA TTTAGTTAAT TTATTTGCCC CTGCTCCATT ATATAAAGCT
ATAAATAGGA TAGTTCTTAA TTCATAGTAA TTCAAAAATT ATTAGAACTA
AAGAACCATG G
配列番号１７（４１６ｂｐ）
ＣＢＤＡシンターゼ１（ＣＢＤＡＳ１）プロモーター
GTTAATAAACATACTTGTGAGTAGATCTAAGATCCTGGTAAAATAATTCCCAACATATT
TCAATCGTAAATTCATGAGTGATTCTTATCACTTCTTAAAAAAAAGATAT
AAAGATCCATAGATAAATAT TTGCTAGTCC TTTCTTTCCA TAGTCAACTT
CAATATGGCA TCTTAACTTC TTTCCATCAA CAAATGATGC TCAACTACTT
AATGTACAAT TTATATTTAT TTTTAGTAAG GGATACACCT AACAATGATG
CCTAATTTTG GTGAATTTTT TTTTACCACA TGTGACTTAA TGATATCAAA
TTTGGAAATA TTTAGTTAAT TTATTTGCCC CTGCTCCATT ATATAAAGCT
ATAAATAGGA TAGTTCTTAA TTCATAGTAA TTCAAAAATT ATTAGAACTA
AAGAAAA
配列番号１８（５３５ｂｐ）
ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）２０８００プロモーター
AGACGTT ATAGCTTTATTGTCTAAATT TCTTGGGGTA GTTTTGTCCC ATGTTGCTCG
CTTACTTTAGAAGTTCAAAG TTTGACAAAA CATGCTATTC GGTTATACAA
TGAGCTATCC
TAGTTCAAGG AGATTCCTGT GCTATTTGTG GATGTCTACA TTGTAAATTC
ATGAGTGATT CTTATAACTT TATTAAAAAA AAGACAAATA GATCCATAGA
TAAATATTTG CAAGTGCTTT CTTGTCATAG CAATTTTTTT TTACATAGGT
AATTTAAAAA ATTCATCTTA ACTTTTTTTC ATCAATAAAT GATGCTCAAT
TATTCAATGC ACCATGTACA TTTATTTTTA ATAAGGGCTG CACCTAACAA
AGGTGCCTAA TTTTGGTAAA AAAGAAATTA CGGCATGTGA ATATTTAATG
AGCATCAAAT TACAAAATAT TTAGCTAATT TCTTTACCCC CACTCCAATC
TATAAAGCTA TAAATAGGAT AATTTTCCAT TCATAGTAAT TTCCAACATT
ACGACTAAAG AACCATGG
配列番号１９（５３１ｂｐ）
ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）２０８００’プロモーター
AGACGTT ATAGCTTTATTGTCTAAATT TCTTGGGGTA GTTTTGTCCC ATGTTGCTCG
CTTACTTTAGAAGTTCAAAG TTTGACAAAA CATGCTATTC GGTTATACAA
TGAGCTATCC
TAGTTCAAGG AGATTCCTGT GCTATTTGTG GATGTCTACA TTGTAAATTC
ATGAGTGATT CTTATAACTT TATTAAAAAA AAGACAAATA GATCCATAGA
TAAATATTTG CAAGTGCTTT CTTGTCATAG CAATTTTTTT TTACATAGGT
AATTTAAAAA ATTCATCTTA ACTTTTTTTC ATCAATAAAT GATGCTCAAT
TATTCAATGC ACCATGTACA TTTATTTTTA ATAAGGGCTG CACCTAACAA
AGGTGCCTAA TTTTGGTAAA AAAGAAATTA CGGCATGTGA ATATTTAATG
AGCATCAAAT TACAAAATAT TTAGCTAATT TCTTTACCCC CACTCCAATC
TATAAAGCTA TAAATAGGAT AATTTTCCAT TCATAGTAAT TTCCAACATT
ACGACTAAAG AAAA
配列番号２０（１６３５ｂｐ）
ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）ＯＲＦ
1 atgaagtgct caacattctc cttttggttt gtttgcaaga taatattttt ctttttctca
61 ttcaatatcc aaacttccat tgctaatcct cgagaaaact tccttaaatg cttctcgcaa
121 tatattccca ataatgcaac aaatctaaaa ctcgtataca ctcaaaacaa cccattgtat
181 atgtctgtcc taaattcgac aatacacaat cttagattca cctctgacac aaccccaaaa
241 ccacttgtta tcgtcactcc ttcacatgtc tctcatatcc aaggcactat tctatgctcc
301 aagaaagttg gcttgcagat tcgaactcga agtggtggtc atgattctga gggcatgtcc
361 tacatatctc aagtcccatt tgttatagta gacttgagaa acatgcgttc aatcaaaata
421 gatgttcata gccaaactgc atgggttgaa gccggagcta cccttggaga agtttattat
481 tgggttaatg agaaaaatga gaatcttagt ttggcggctg ggtattgccc tactgtttgc
541 gcaggtggac actttggtgg aggaggctat ggaccattga tgagaaacta tggcctcgcg
601 gctgataata tcattgatgc acacttagtc aacgttcatg gaaaagtgct agatcgaaaa
661 tctatggggg aagatctctt ttgggcttta cgtggtggtg gagcagaaag cttcggaatc
721 attgtagcat ggaaaattag actggttgct gtcccaaagt ctactatgtt tagtgttaaa
781 aagatcatgg agatacatga gcttgtcaag ttagttaaca aatggcaaaa tattgcttac
841 aagtatgaca aagatttatt actcatgact cacttcataa ctaggaacat tacagataat
901 caagggaaga ataagacagc aatacacact tacttctctt cagttttcct tggtggagtg
961 gatagtctag tcgacttgat gaacaagagt tttcctgagt tgggtattaa aaaaacggat
1021 tgcagacaat tgagctggat tgatactatc atcttctata gtggtgttgt aaattacgac
1081 actgataatt ttaacaagga aattttgctt gatagatccg ctgggcagaa cggtgctttc
1141 aagattaagt tagactacgt taagaaacca attccagaat ctgtatttgt ccaaattttg
1201 gaaaaattat atgaagaaga tataggagct gggatgtatg cgttgtaccc ttacggtggt
1261 ataatggatg agatttcaga atcagcaatt ccattccctc atcgagctgg aatcttgtat
1321 gagttatggt acatatgtag ttgggagaag caagaagata acgaaaagca tctaaactgg
1381 attagaaata tttataactt catgactcct tatgtgtcca aaaatccaag attggcatat
1441 ctcaattata gagaccttga tataggaata aatgatccca agaatccaaa taattacaca
1501 caagcacgta tttggggtga gaagtatttt ggtaaaaatt ttgacaggct agtaaaagtg
1561 aaaaccctgg ttgatcccaa taactttttt agaaacgaac aaagcatccc acctcttcca
1621 cggcatcgtc attaa
配列番号２１（８００ｂｐ）
ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１９６０３プロモーター
CTTATCACTC ATTCGGGAGC AACTTAAAAA AATTACAATT ATTATGAAAG
ACGGCACAAA AAGCGAATTA ATTACCTAAT CGTAAATAAA AGAAATTTTA
CATAAATATA TTATATAATT TTATATTATT CATAAAAAAT ATAAAATAGT
ATTAGACTGA ATTGAGATTT GATTCGTAAC TAAAAATTAA TTTCTTTAAT
GTAAAATTTT AAAAACAAAT TATTAAAACC GCGTGAAGCG CGGATCTATT
CCCTAGTTGA ATAATAAAGT AGATAGTAGA GGAGGTTAGA ATTTATAATT
TTTCATTTAA ATATTTGAAT TTACTTTACT GTTCTTTGTT ATTCTTCATT
TAATTTTGCT ATTTGTTATT TTACTTTTCA AAAATTATAA TTTTAATTAC
CAAATAAAAA GTAAAATAGA TATTGGTACT TGATATTCAC TCTTTATGGG
AACCATAATA AACTATAAAA GTCATTATGT GTACTTGCTA CCATAGGCAC
CTATATCCCA CAAACTAGCT ACCATAGCCA ATTTCTTGTT TTTTGTTTCC
AATATCCAAT TTTTATTGAT GCCAAACTAT TCAATGTACA ATGTACATTT
ATTTTCAATA AGGGCTTCAC CTAACAAAGG TGCCTAATTT TAGTTGATTT
ATTTTTTATC ACATGTGACT ATTTAATGAC TATCAAATTA TAAAATATTT
AAGTCAATTT ATTTGCCCCA ACTCCAATAT ATAATATTAT AAATAGGATA
GTTCTCAATT CCTAATAATT CAAAAAATCA TTAGGACTGA AGAACCATGG
配列番号２２（７９６ｂｐ）
ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１９６０３’プロモーター
CTTATCACTC ATTCGGGAGC AACTTAAAAA AATTACAATT ATTATGAAAG
ACGGCACAAA AAGCGAATTA ATTACCTAAT CGTAAATAAA AGAAATTTTA
CATAAATATA TTATATAATT TTATATTATT CATAAAAAAT ATAAAATAGT
ATTAGACTGA ATTGAGATTT GATTCGTAAC TAAAAATTAA TTTCTTTAAT
GTAAAATTTT AAAAACAAAT TATTAAAACC GCGTGAAGCG CGGATCTATT
CCCTAGTTGA ATAATAAAGT AGATAGTAGA GGAGGTTAGA ATTTATAATT
TTTCATTTAA ATATTTGAAT TTACTTTACT GTTCTTTGTT ATTCTTCATT
TAATTTTGCT ATTTGTTATT TTACTTTTCA AAAATTATAA TTTTAATTAC
CAAATAAAAA GTAAAATAGA TATTGGTACT TGATATTCAC TCTTTATGGG
AACCATAATA AACTATAAAA GTCATTATGT GTACTTGCTA CCATAGGCAC
CTATATCCCA CAAACTAGCT ACCATAGCCA ATTTCTTGTT TTTTGTTTCC
AATATCCAAT TTTTATTGAT GCCAAACTAT TCAATGTACA ATGTACATTT
ATTTTCAATA AGGGCTTCAC CTAACAAAGG TGCCTAATTT TAGTTGATTT
ATTTTTTATC ACATGTGACT ATTTAATGAC TATCAAATTA TAAAATATTT
AAGTCAATTT ATTTGCCCCA ACTCCAATAT ATAATATTAT AAATAGGATA
GTTCTCAATT CCTAATAATT CAAAAAATCA TTAGGACTGA AGAAAA
配列番号２３（７９６ｂｐ）
ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）５０３２０プロモーター
TTATTTAAAT TTCTCAGAGA GATATAGAGA ATTTACAATA GGTCAAGTTG
TATATTTTTT AATCCGAATA ATTAATGCTT TTGAATATCC ATCATCAATA
TTGAATAATA AAGTAGATAG CAGAGGAGAT TAGAACTCAT AATTTTTCAT
TTATATTTTT GAATTTAGTT TACTGTTCTT TATTATTCTT CATTTAATTT
TGCTATATGT TATTTTACTT TTCAAAAATT CTAATTTTGA TTACCAAATA
AAAAATAAAA TATATATTGG TACTTCATAT TTAGTTTTTA TGGGAATGAT
AATGAATGAT ATTGTAATAA ACTATAAAAG TAATTTTGTA TACTTGCATA
GTTCTTAATT TTTACCCAAA AAAATATATA TTAATGAAAA AAAAAGGTGG
AAAGTGCCAT AGGCACCTAT ATCCCACAAA CTAGCTATAA GATATTGAAA
GACAAATAGA TCCATAGATA AATATTTGCG TGTCCTTTCT TTTCATATCT
AATTTTTTGT TTTTTTATTT TTTTCCAATA GTCAATTTTG GCAGCTTAAC
TTCTTTCCAT AAATAATGAT GCCAAACTAT TCAATGTAAA ATTTAGATTT
ATTTTCATTA AGGGCTTCAC CTAACAAATG TGCCTAATTT TTGTGGATTT
TTTTACCATA TGTCGCTATT TAATGACTAC CAAATTATAG AATTATTTAA
GTCAATTTCT CAGTCCCCGC TCCAATATAT AAAGTTATAG AAAGGACAAT
TCTTAATTCA TAGTAATTCA AAAATCATTA AGACTAAAAA CCATGG
配列番号２４（７９２ｂｐ）
ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）５０３２０’プロモーター
TTATTTAAAT TTCTCAGAGA GATATAGAGA ATTTACAATA GGTCAAGTTG
TATATTTTTT AATCCGAATA ATTAATGCTT TTGAATATCC ATCATCAATA
TTGAATAATA AAGTAGATAG CAGAGGAGAT TAGAACTCAT AATTTTTCAT
TTATATTTTT GAATTTAGTT TACTGTTCTT TATTATTCTT CATTTAATTT
TGCTATATGT TATTTTACTT TTCAAAAATT CTAATTTTGA TTACCAAATA
AAAAATAAAA TATATATTGG TACTTCATAT TTAGTTTTTA TGGGAATGAT
AATGAATGAT ATTGTAATAA ACTATAAAAG TAATTTTGTA TACTTGCATA
GTTCTTAATT TTTACCCAAA AAAATATATA TTAATGAAAA AAAAAGGTGG
AAAGTGCCAT AGGCACCTAT ATCCCACAAA CTAGCTATAA GATATTGAAA
GACAAATAGA TCCATAGATA AATATTTGCG TGTCCTTTCT TTTCATATCT
AATTTTTTGT TTTTTTATTT TTTTCCAATA GTCAATTTTG GCAGCTTAAC
TTCTTTCCAT AAATAATGAT GCCAAACTAT TCAATGTAAA ATTTAGATTT
ATTTTCATTA AGGGCTTCAC CTAACAAATG TGCCTAATTT TTGTGGATTT
TTTTACCATA TGTCGCTATT TAATGACTAC CAAATTATAG AATTATTTAA
GTCAATTTCT CAGTCCCCGC TCCAATATAT AAAGTTATAG AAAGGACAAT
TCTTAATTCA TAGTAATTCA AAAATCATTA AGACTAAAAA AA
配列番号２５（７２０ｂｐ）
ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１３３０プロモーター
TTTTCAATTG ATTTAATTTC TTATATTGAT ATAAAGAATT TGCAATACAT
TGAGTTTCTT AACCCGAATA TTAAACGGTT TTGAATATCT TCATCATTGA
TTGAATAATA AAGTGGATAG TAGAGGGAAT TAGAATCCAT AATTTTTTAT
TTATATATTT GAAGTTAGTT TATTATTCTT TGCTATCCTT CATTTAATTT
TGCTATTTGT TATTTTAGTT TCAAAAATTT ATTTTTCATT ACAAAATAAA
AAATAAGATA GGATATTGGT ACTTGATAAG TCTTCTTTGT GGAAACGATA
ATCGGTATTA TTAGGTATAT TTGCATATTT CAATATTATT GCAAAAAATA
AATATATTAA TAAATAAAGT GGAAGGTGCC ATAGGTACCT ATATCCACAA
ACTAGCATAT TGAAAGAAAA TGGATCCAAG GATAAATATT TGCAAGTCTT
TTTTTTTTTG CATAGCCAAT TTCTTTTTTT ATTATTATTT TAATAGAATA
TTTCAAAAGG GCATCTAACA TTTATTTTTA ATAAGGACTG CACCTAACAA
AGGTGCCTAA TTTTTGTGAA CTTTTTTTTA CCACATGTGA CTATTTAATG
AGTACTAAAT TATGAAATAT TTAGTTAATT TCTTTGCCCC CGCTCCAATA
TATAATGCTA TAAATAGCAT AATTTTCTAT TCATAGTAAT TCAAAAATCA
TTAGGACTAA AGAACCATGG
配列番号２６（７１６ｂｐ）
ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）１３３０’プロモーター
TTTTCAATTG ATTTAATTTC TTATATTGAT ATAAAGAATT TGCAATACAT
TGAGTTTCTT AACCCGAATA TTAAACGGTT TTGAATATCT TCATCATTGA
TTGAATAATA AAGTGGATAG TAGAGGGAAT TAGAATCCAT AATTTTTTAT
TTATATATTT GAAGTTAGTT TATTATTCTT TGCTATCCTT CATTTAATTT
TGCTATTTGT TATTTTAGTT TCAAAAATTT ATTTTTCATT ACAAAATAAA
AAATAAGATA GGATATTGGT ACTTGATAAG TCTTCTTTGT GGAAACGATA
ATCGGTATTA TTAGGTATAT TTGCATATTT CAATATTATT GCAAAAAATA
AATATATTAA TAAATAAAGT GGAAGGTGCC ATAGGTACCT ATATCCACAA
ACTAGCATAT TGAAAGAAAA TGGATCCAAG GATAAATATT TGCAAGTCTT
TTTTTTTTTG CATAGCCAAT TTCTTTTTTT ATTATTATTT TAATAGAATA
TTTCAAAAGG GCATCTAACA TTTATTTTTA ATAAGGACTG CACCTAACAA
AGGTGCCTAA TTTTTGTGAA CTTTTTTTTA CCACATGTGA CTATTTAATG
AGTACTAAAT TATGAAATAT TTAGTTAATT TCTTTGCCCC CGCTCCAATA
TATAATGCTA TAAATAGCAT AATTTTCTAT TCATAGTAAT TCAAAAATCA
TTAGGACTAA AGAAAG
配列番号２７（１６３５ｂｐ）
ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）ＯＲＦ
1 atgaattgct cagcattttc cttttggttt gtttgcaaaa taatattttt ctttctctca
61 ttcaatatcc aaatttcaat agctaatcct caagaaaact tccttaaatg cttctcggaa
121 tatattccta acaatccagc aaatccaaaa ttcatataca ctcaacacga ccaattgtat
181 atgtctgtcc tgaattcgac aatacaaaat cttagattca cctctgatac aaccccaaaa
241 ccactcgtta ttgtcactcc ttcaaatgtc tcccatatcc aggccagtat tctctgctcc
301 aagaaagttg gtttgcagat tcgaactcga agcggtggcc atgatgctga gggtatgtcc
361 tacatatctc aagtcccatt tgttgtagta gacttgagaa acatgcattc gatcaaaata
421 gatgttcata gccaaactgc gtgggttgaa gccggagcta cccttggaga agtttattat
481 tggatcaatg agaagaatga gaattttagt tttcctggtg ggtattgccc tactgttggc
541 gtaggtggac actttagtgg aggaggctat ggagcattga tgcgaaatta tggccttgcg
601 gctgataata tcattgatgc acacttagtc aatgttgatg gaaaagttct agatcgaaaa
661 tccatgggag aagatctatt ttgggctata cgtggtggag gaggagaaaa ctttggaatc
721 attgcagcat ggaaaatcaa actggttgtt gtcccatcaa agtctactat attcagtgtt
781 aaaaagaaca tggagataca tgggcttgtc aagttattta acaaatggca aaatattgct
841 tacaagtatg acaaagattt agtactcatg actcacttca taacaaagaa tattacagat
901 aatcatggga agaataagac tacagtacat ggttacttct cttcaatttt tcatggtgga
961 gtggatagtc tagtcgactt gatgaacaag agctttcctg agttgggtat taaaaaaact
1021 gattgcaaag aatttagctg gattgataca accatcttct acagtggtgt tgtaaatttt
1081 aacactgcta attttaaaaa ggaaattttg cttgatagat cagctgggaa gaagacggct
1141 ttctcaatta agttagacta tgttaagaaa ccaattccag aaactgcaat ggtcaaaatt
1201 ttggaaaaat tatatgaaga agatgtagga gctgggatgt atgtgttgta cccttacggt
1261 ggtataatgg aggagatttc agaatcagca attccattcc ctcatcgagc tggaataatg
1321 tatgaacttt ggtacactgc ttcctgggag aagcaagaag ataatgaaaa gcatataaac
1381 tgggttcgaa gtgtttataa ttttacgact ccttatgtgt cccaaaatcc aagattggcg
1441 tatctcaatt atagggacct tgatttagga aaaactaatc ctgagagtcc taataattac
1501 acacaagcac gtatttgggg tgaaaagtat tttggtaaaa attttaacag gttagttaag
1561 gtgaaaacca aagctgatcc caataatttt tttagaaacg aacaaagtat cccacctctt
1621 ccaccgcatc atcat
配列番号２８（８０４ｂｐ）
ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）３４９８プロモーター
GATAATTTTT CTTCCAAATT TAATAGTATC TTTTATATAA GTTCAGTCAT
GTTTTTCTTA TGTAAGTTAG GCTATTAATT ATTTTGATGT ATTTATTATA
TTGTATGTCG TTTACTGCAT TCTGCCAACA TTGGTTTTTG TCGATTTATG
ATATATAATA TGATATGCTG TTAAGTTAGA GGTAAGATTC AATTTATTTA
AGATTATTTA ATTTGCGCTT TTATTATATA CATCTTCTAG TTGTAATTAA
TGGGGTAGAA TTAAGACTGT GTTTTGAATT AATATCGGTA TTAGAATAGG
ATTTGCATGA CTATATTTCT ACCTTACCAA GTTTTTTATC TGATAACACC
CTTTCACTTA TTATTTTCTT ATTTTTAATT TATTTAT
ATTTTTACCATATTCTATTTATACTAATCTTAAGTGGTACATTACCTCCCTGTG
GATACGACATATA
ATCTGTTTACTATCGTGACCGAAGTATAACTAATTGGGCGACATCACACCTATA
TCCCACAAACTAGCTACTATAGTCAATTTCTTGTTTTTTTTCCAATAGCCAATT
TTAAATGATGCCAAACTATTCAATGTATAATGTACATTTATTTTAAATAAGGGC
TTCACCTAACAAATGTGCCTAATTTTAGTTAATTTATTTTTTTATCGCATCTTA
CTATTTAAAGGAACTATCAAATTATAAAATATTTATGTCAATTCATTTGCCCCA
ACTCCAATATATAATATTATAAATAGGATAGTTCTCTATTCATAATAATTCAAA
ATATCATTAGGACTGAAGAACCATGG
配列番号２９（８００ｂｐ）
ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）３４９８’プロモーター
GATAATTTTT CTTCCAAATT TAATAGTATC TTTTATATAA GTTCAGTCAT
GTTTTTCTTA TGTAAGTTAG GCTATTAATT ATTTTGATGT ATTTATTATA
TTGTATGTCG TTTACTGCAT TCTGCCAACA TTGGTTTTTG TCGATTTATG
ATATATAATA TGATATGCTG TTAAGTTAGA GGTAAGATTC AATTTATTTA
AGATTATTTA ATTTGCGCTT TTATTATATA CATCTTCTAG TTGTAATTAA
TGGGGTAGAA TTAAGACTGT GTTTTGAATT AATATCGGTA TTAGAATAGG
ATTTGCATGA CTATATTTCT ACCTTACCAA GTTTTTTATC TGATAACACC
CTTTCACTTA TTATTTTCTT ATTTTTAATT TATTTAT
ATTTTTACCATATTCTATTTATACTAATCTTAAGTGGTACATTACCTCCCTGTG
GATACGACATATA
ATCTGTTTACTATCGTGACCGAAGTATAACTAATTGGGCGACATCACACCTATA
TCCCACAAACTAGCTACTATAGTCAATTTCTTGTTTTTTTTCCAATAGCCAATT
TTAAATGATGCCAAACTATTCAATGTATAATGTACATTTATTTTAAATAAGGGC
TTCACCTAACAAATGTGCCTAATTTTAGTTAATTTATTTTTTTATCGCATCTTA
CTATTTAAAGGAACTATCAAATTATAAAATATTTATGTCAATTCATTTGCCCCA
ACTCCAATATATAATATTATAAATAGGATAGTTCTCTATTCATAATAATTCAAA
ATATCATTAGGACTGAAGAAAA
配列番号３０（１６３５ｂｐ）
ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）ＯＲＦ
1 atgaattgct caacattctc cttttggttt gtttgcaaaa taatattttt ctttctctca
61 ttcaatatcc aaatttcaat agctaatcct caagaaaact tccttaaatg cttctcggaa
121 tatattccta acaatccagc aaatccaaaa ttcatataca ctcaacacga ccaattgtat
181 atgtctgtcc tgaattcgac aatacaaaat cttagattca cctctgatac aaccccaaaa
241 ccactcgtta ttgtcactcc ttcaaatgtc tcccatatcc aggccagtat tctctgctcc
301 aagaaagttg gtttgcagat tcgaactcga agcggtggcc atgatgctga gggtttgtcc
361 tacatatctc aagtcccatt tgctatagta gacttgagaa acatgcatac ggtcaaagta
421 gatattcata gccaaactgc gtgggttgaa gccggagcta cccttggaga agtttattat
481 tggatcaatg agatgaatga gaattttagt tttcctggtg ggtattgccc tactgttggc
541 gtaggtggac actttagtgg aggaggctat ggagcattga tgcgaaatta tggccttgcg
601 gctgataata tcattgatgc acacttagtc aatgttgatg gaaaagttct agatcgaaaa
661 tccatgggag aagatctatt ttgggctata cgtggtggag gaggagaaaa ctttggaatc
721 attgcagcat gtaaaatcaa acttgttgtt gtcccatcaa aggctactat attcagtgtt
781 aaaaagaaca tggagataca tgggcttgtc aagttattta acaaatggca aaatattgct
841 tacaagtatg acaaagattt aatgctcacg actcacttca gaactaggaa tattacagat
901 aatcatggga agaataagac tacagtacat ggttacttct cttccatttt tcttggtgga
961 gtggatagtc tagttgactt gatgaacaag agctttcctg agttgggtat taaaaaaact
1021 gattgcaaag aattgagctg gattgataca accatcttct acagtggtgt tgtaaattac
1081 aacactgcta attttaaaaa ggaaattttg cttgatagat cagctgggaa gaagacggct
1141 ttctcaatta agttagacta tgttaagaaa ctaatacctg aaactgcaat ggtcaaaatt
1201 ttggaaaaat tatatgaaga agaggtagga gttgggatgt atgtgttgta cccttacggt
1261 ggtataatgg atgagatttc agaatcagca attccattcc ctcatcgagc tggaataatg
1321 tatgaacttt ggtacactgc tacctgggag aagcaagaag ataacgaaaa gcatataaac
1381 tgggttcgaa gtgtttataa tttcacaact ccttatgtgt cccaaaatcc aagattggcg
1441 tatctcaatt atagggacct tgatttagga aaaactaatc ctgagagtcc taataattac
1501 acacaagcac gtatttgggg tgaaaagtat tttggtaaaa attttaacag gttagttaag
1561 gtgaaaacca aagctgatcc caataatttt tttagaaacg aacaaagtat cccacctctt
1621 ccaccgcgtc atcat
配列番号３１（１７１ｂｐ）
ＣＡＮＯＮ断片
atgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttttaataagggcttcacctaacaaaggtgcctaatttttgtgaacttttttttaccacatgtgactatttaatgactatcaaattataaaatatttaagtcaatttctttgcccccactccaatatataatgt
配列番号３２（２３２ｂｐ）
推定ＴＡＴＡボックス、５’ＵＴＲおよび開始コドンを含むＣＡＮＯＮ断片
atgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttttaataagggcttcacctaacaaaggtgcctaatttttgtgaacttttttttaccacatgtgactatttaatgactatcaaattataaaatatttaagtcaatttctttgcccccactccaatatataatgttataaataggataattctcaattcatagtaattcaaaaatcattaggactaaagaaaaatg
配列番号３３（７０９ｂｐ）
４×ＣＡＮＯＮ断片合成プロモーター
atgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttttaataagggcttcacctaacaaaggtgcctaatttttgtgaacttttttttaccacatgtgactatttaatgactatcaaattataaaatatttaagtcaatttctttgcccccactccatgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttttaataagggcttcacctaacaaaggtgcctaatttttgtgaacttttttttaccacatgtgactatttaatgactatcaaattataaaatatttaagtcaatttctttgcccccactccatgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttttaataagggcttcacctaacaaaggtgcctaatttttgtgaacttttttttaccacatgtgactatttaatgactatcaaattataaaatatttaagtcaatttctttgcccccactccatgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttttaataagggcttcacctaacaaaggtgcctaatttttgtgaacttttttttaccacatgtgactatttaatgactatcaaattataaaatatttaagtcaatttctttgcccccactccaatatataatgttataaataggataattctcaattcatagtaattcaaaaatcattaggactaaagaaaaatg

Claims (35)

  1. （ａ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列；および
    （ｂ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子であって、
    ヌクレオチド配列が異種性核酸に作動可能に連結されている、合成ＤＮＡ分子。
  2. ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
  3. 請求項２に記載の発現ベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞。
  4. Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ細胞である、請求項３に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
  5. Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ細胞である、請求項３に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
  6. 請求項１に記載の合成ＤＮＡ分子を含むキメラ核酸構築物を含む細胞を含む遺伝子操作された植物。
  7. Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物である、請求項６に記載の操作された植物。
  8. Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物である、請求項６に記載の操作された植物。
  9. 請求項６から８のいずれか一項に記載の操作された植物に由来する種子であって、キメラ核酸構築物を含む種子。
  10. キメラ遺伝子がゲノム中に組み込まれている遺伝子操作された植物または植物細胞であって、キメラ遺伝子が、相同性または異種性核酸配列に作動可能に連結されている毛状突起特異的プロモーターを含み、プロモーターが、
    （ａ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列；および
    （ｂ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列
    からなる群から選択される、遺伝子操作された植物または植物細胞。
  11. Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物である、請求項１０に記載の遺伝子操作された植物または植物細胞。
  12. Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物である、請求項１０に記載の遺伝子操作された植物または植物細胞。
  13. 植物毛状突起においてポリペプチドを発現させるための方法であって、
    （ａ）宿主細胞中に、
    （ｉ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列；および
    （ｉｉ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するステップであって、（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列が、ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている、ステップ、ならびに
    （ｂ）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で植物を生育させるステップ
    を含む方法。
  14. 宿主植物毛状突起においてカンナビノイドを増加させる方法であって、
    （ａ）宿主細胞中に、
    （ｉ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列；および
    （ｉｉ）配列番号１〜３、５、６、８、９、１１〜１４、１６〜１９、２１〜２６、２８、２９または３１〜３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列；
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するステップであって、（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列が、カンナビノイド生合成経路の酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている、ステップ、ならびに
    （ｂ）カンナビノイド生合成経路酵素の発現を可能にする条件下で植物を生育させるステップであって、カンナビノイド生合成経路酵素の発現により、植物は、同様の条件下で生育された対照植物と比較してカンナビノイド含有量が増加している、ステップ
    を含む方法。
  15. カンナビノイド生合成経路酵素が、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）シンターゼ、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）シンターゼまたはΔ９テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）シンターゼである、請求項１４に記載の方法。
  16. 植物にカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を提供することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 請求項１４に記載の方法によって作出される遺伝子操作された植物であって、対照植物と比較してΔ９テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）含有量が増加している遺伝子操作された植物。
  18. （ａ）配列番号３１、３２または３３のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列；および
    （ｂ）配列番号３１、３２または３３のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であり、植物毛状突起腺特異的転写活性を有するプロモーターをコードするヌクレオチド配列
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子であって、
    ヌクレオチド配列が異種性核酸に作動可能に連結されている、合成ＤＮＡ分子。
  19. ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている、請求項１８に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
  20. 請求項１９に記載の発現ベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞。
  21. Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ細胞である、請求項２０に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
  22. Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ細胞である、請求項２０に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
  23. 請求項１８に記載の合成ＤＮＡ分子を含むキメラ核酸構築物を含む細胞を含む遺伝子操作された植物。
  24. Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物である、請求項２３に記載の操作された植物。
  25. Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物である、請求項２３に記載の操作された植物。
  26. 請求項２３から２５のいずれか一項に記載の操作された植物に由来する種子であって、キメラ核酸構築物を含む種子。
  27. 配列番号３３に記載のヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ分子。
  28. ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されている、請求項２７に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
  29. 請求項２８に記載の発現ベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞。
  30. Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ細胞である、請求項２９に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
  31. Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ細胞である、請求項２９に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
  32. 請求項２７に記載の合成ＤＮＡ分子を含むキメラ核酸構築物を含む細胞を含む遺伝子操作された植物。
  33. Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物である、請求項３２に記載の操作された植物。
  34. Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物である、請求項３２に記載の操作された植物。
  35. 請求項３２から３４のいずれか一項に記載の操作された植物に由来する種子であって、キメラ核酸構築物を含む種子。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200035118A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Joseph Pandolfino Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes
US10897925B2 (en) 2018-07-27 2021-01-26 Joseph Pandolfino Articles and formulations for smoking products and vaporizers
JP2022513411A (ja) * 2018-10-31 2022-02-07 ベイメディカ インコーポレイテッド カンナビノイド類似体およびそれらの調製のための方法
US20220154197A1 (en) * 2019-03-12 2022-05-19 Perpetuum Cropscience Bvba Cannabinoid precursor production
WO2021003180A1 (en) * 2019-07-01 2021-01-07 22Nd Century Limited, Llc Cannabis terpene synthase promoters for the manipulation of terpene biosynthesis in trichomes
US20220298522A1 (en) * 2019-07-30 2022-09-22 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby
EP4244371A1 (en) * 2020-11-12 2023-09-20 Technische Universität Darmstadt Production of cannabinoids/phytocannabinoids with a plant extract
EP4288447A1 (en) * 2021-02-03 2023-12-13 Altria Client Services LLC Increasing trichome density and improving transport of metabolites in plant trichomes
CN113234726B (zh) * 2021-06-21 2022-07-22 贵州省烟草科学研究院 一种烟草腺毛特异性启动子pNtTCP9a及其应用
CN113528365B (zh) * 2021-07-13 2023-04-07 浙江寿仙谷医药股份有限公司 产大麻二酚的重组酿酒酵母、其构建方法以及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130067619A1 (en) * 2010-04-15 2013-03-14 Jonathan E. Page Genes and proteins for aromatic polyketide synthesis
JP2014521311A (ja) * 2011-07-13 2014-08-28 ナショナル、リサーチ、カウンシル、オブ、カナダ アルカノイル−ｃｏａ合成のための遺伝子およびタンパク質
US20140298511A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-02 Biotech Institute, Llc Breeding, production, processing and use of medical cannabis
JP2015536152A (ja) * 2012-11-30 2015-12-21 キージーン・エン・フェー トリコーム特異的プロモーター
WO2015196275A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 National Research Council Of Canada (Nrc) Cannabichromenic acid synthase from cannabis sativa
WO2016030828A1 (en) * 2014-08-25 2016-03-03 Full Spectrum Laboratories Limited Apparatus and methods for the simultaneous production of cannabinoid compounds
US20160177404A1 (en) * 2011-08-18 2016-06-23 Courtagen Life Sciences Inc. Cannabis genomes and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
EP1161541A4 (en) 1999-02-26 2004-11-24 Cropdesign Nv METHOD FOR MODIFYING THE MORPHOLOGY, BIOCHEMISTRY OR PHYSIOLOGY OF PLANTS USING SUBSTRATES COMPRISING CDC25
AU784571B2 (en) 2000-02-08 2006-05-04 Sakata Seed Corporation Novel methods and constructs for plant transformation
US6730826B2 (en) * 2000-03-22 2004-05-04 University Of Kentucky Research Foundation Plant trichome gland specific promoter sequence
US7534934B2 (en) 2002-02-20 2009-05-19 J.R. Simplot Company Precise breeding
EP1636333A4 (en) 2003-06-19 2007-10-24 Evogene Ltd NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR REGULATING GENE EXPRESSION IN VEGETABLE TRICHROMES, AND HYBRID GENES AND METHODS IN WHICH THEY INTERVENE
SI1919514T1 (sl) * 2005-07-05 2012-08-31 Univ California Polinukleotidi, ki kodirajo encime, ki modificirajo izoprenoid, in postopki za njihovo uporabo
JP2011507506A (ja) * 2007-12-21 2011-03-10 ケイヘーネ・エヌ・ブイ トリコーム特異的なプロモーター
US20140057251A1 (en) * 2011-08-18 2014-02-27 Medicinal Genomics Corporation Cannabis Genomes and Uses Thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130067619A1 (en) * 2010-04-15 2013-03-14 Jonathan E. Page Genes and proteins for aromatic polyketide synthesis
JP2014521311A (ja) * 2011-07-13 2014-08-28 ナショナル、リサーチ、カウンシル、オブ、カナダ アルカノイル−ｃｏａ合成のための遺伝子およびタンパク質
US20160177404A1 (en) * 2011-08-18 2016-06-23 Courtagen Life Sciences Inc. Cannabis genomes and uses thereof
JP2015536152A (ja) * 2012-11-30 2015-12-21 キージーン・エン・フェー トリコーム特異的プロモーター
US20140298511A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-02 Biotech Institute, Llc Breeding, production, processing and use of medical cannabis
WO2015196275A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 National Research Council Of Canada (Nrc) Cannabichromenic acid synthase from cannabis sativa
WO2016030828A1 (en) * 2014-08-25 2016-03-03 Full Spectrum Laboratories Limited Apparatus and methods for the simultaneous production of cannabinoid compounds

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