JP2015536152A - トリコーム特異的プロモーター - Google Patents
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
Abstract
Description
本発明は、腺および非腺トリコーム、特に、様々な植物表面(葉、茎、花器等の地上部)に存在するが、一部の種において、果実および種子等の特定の植物表面に見出されない腺トリコームにおける、作動可能に連結された核酸分子の発現の方向づけに適したトリコーム特異的転写調節配列を提供する。単純トリコームは、大部分の被子植物ならびに一部の裸子植物および蘚苔類の地上部表面に存在する(Wagnerら、2004、Ann Bot 93、3)。被子植物において、トリコームは、種に応じて葉、花弁、葉柄、花柄、茎および種皮において生じ得る。腺トリコームは、維管束植物のおそらく30%に見出される(DellおよびMcComb、1978、Adv Bot Res 6、227;Fahn、2000、Adv Bot Res 31、37)。
(a)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列(またはその相補体)、
(b)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列の機能的断片(またはその相補体)、
(c)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を含む核酸配列(またはその相補体)、
(d)転写調節活性を含む(c)の核酸配列の機能的断片
の群から選択される、トランスジェニック植物または植物細胞または植物組織または器官が提供される。
(a)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列(またはその相補体)、
(b)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列の機能的断片(またはその相補体)、
(c)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を含む核酸配列(またはその相補体)、
(d)転写調節活性を含む(c)の核酸配列の機能的断片
から選択される配列を含む核酸配列も提供される。
(a)転写しようとする核酸配列に作動可能に連結され、3'UTR核酸配列に必要に応じてさらに連結された上述のプロモーターを含むキメラ遺伝子、または上述のプロモーターもしくは上述のキメラ遺伝子を含むベクターを作製する工程と、
(b)前記キメラ遺伝子またはベクターで植物または植物細胞を形質転換する工程と、必要に応じて、
(c)トランスジェニック植物または植物細胞を再生する工程と
を含む、トランスジェニック植物または植物細胞を作製するための方法が提供される。
「トリコーム」は、本明細書において、様々な型のトリコーム、腺トリコームおよび/または非腺トリコームの両方を包含する。
CaMV 35Sプロモーター(単一35Sプロモーター、Franckら、1980、Cell 21、285〜294により記載)等、構成的プロモーターは、特異的組織レベルで、例えば、師部またはトリコームにおいて、あるいは特異的条件下、例えば、ストレス誘導性条件下のみにおいて調節される必要がある遺伝子の発現に有用と考慮されない。
一実施形態において、葉、茎および花器官に見出されるトリコーム等、植物トリコームにおける強力な高い、好ましくは構成的な転写トリコーム特異的活性を示す、植物細胞においてプロモーター活性を有する単離された核酸配列(好ましくは、ゲノムまたは合成DNA配列)が提供される。好ましくは、プロモーターは、1種または複数の腺トリコーム(I、IV、VIおよび/またはVII型)において活性を有する。
本発明の一実施形態において、プロモーター活性を有する上述の核酸配列のいずれかは、キメラ遺伝子と、宿主細胞にキメラ遺伝子を移入し、形質転換細胞に由来する細胞、組織、器官または生物全体等、宿主細胞において作動可能に連結された相同または異種核酸配列を発現させるためのキメラ遺伝子を含むベクターの作製に用いられる。
2.草食動物忌避物質遺伝子または経路。
3.有害生物、病原体または草食動物誘引物質遺伝子または経路(捕獲またはトラップ作物を作製するため)。
4.エピジンギベレン等の(セスキ)テルペン、フラボノイドもしくは油、治療用および/または薬理学的および化粧品的に重要な産物または産業的に価値ある化合物の産生のための遺伝子、栄養的または栄養補助食品化合物、香味剤または香気剤(scents)、アロマ(ハーブ)をもたらす遺伝子、花粉媒介者誘引因子(attractor)遺伝子を含む、二次代謝物生合成遺伝子または経路。
5.ファイトレメディエーション適用、例えば、イオンおよび汚染物質金属分泌遺伝子(Psarasら、2000、Ann Bot 86、73)。
上述の方法により得ることができる、トランスジェニック細胞および生物、特に、植物、植物細胞、組織または器官が提供される。これらの細胞および生物は、本発明によるプロモーターの存在により、その細胞またはゲノムにおけるキメラ遺伝子の存在により特徴づけられる。加えて、mRNA転写物または翻訳されたタンパク質は、細胞または生物、例えば、植物トリコーム、特に、腺トリコームの表現型を変更することができる。
一実施形態において、植物に導入されたキメラ遺伝子は、全て宿主属または種における天然起源の部分で構成される、例えば、ソラナム属の宿主植物を形質転換する場合、好ましくは、ソラナム属由来の本発明によるプロモーターを用いて、同様にソラナム属由来の核酸配列と、必要に応じて、ソラナム属由来の3'UTRに作動可能に連結される。同じことを宿主の種に適用することができる。植物は、導入遺伝子を保有するが、そのあらゆるヌクレオチドエレメントは、宿主属または種に天然に見出され(この組合せではないが)、規制問題を減じ、世間的な受容を改善する。
(a)発現させようとする核酸配列に作動可能に連結された本発明によるプロモーターを含むキメラ遺伝子またはベクターを作製する工程と、
(b)前記キメラ遺伝子またはベクターで植物または植物細胞を形質転換する工程と、必要に応じて、
(c)トランスジェニック植物を再生する工程と
を含む、トランスジェニック植物または植物細胞を作製するための方法も提供される。
配列番号1:ShzFPSプロモーター配列
TGGCCATTACGTGGACTAATTTTTTTACAATAAATGATCACTTTATTTTTAACAAGTATGATTAATAATTAATTGAAATTAGTGAGTTTGAAATTTGACTTTTGTTTAGCCTATGAGCAAACCTTTAAAGTTAATTCAAAATTAAAAGTTATTGATTTTTAATCATGTTTATGAATCAAATGTGATCAAAAGGTCAAAATCAACTGTCTCCCAAATAATTTTTTTAAACTCGAGATGATTTGAAATTTTTTTCAACCAATAGTTATATTTTCCAATGTCATATTATTAAAAACTTGAGGCTAATTCCATCCTGGAATTTATGACTATAGTTATAGTTATCTTAGACTCTTAGCTGCGTTATAGTCAGACTTGATAATTATTAAAAAGTGTGTGACTCTGATTTTTCACATATGACGATTTGAGAAATTGATAATCTAGAAAGCTATATCATGAAAAATTCTAAGAATGATTGAAGATAATAAGAATATTTTGAAATATCGCAACCCTACCACAAAGTTTTACCAACCTATTTTCTTTTATATAGATATGAGCTATATGACACATGGAAATACAATTATAAAGCAGTAGTTAGAGGTGAATTAATATTGAATTTTAAAGGGAATAATCAATGGATGATATCTTTTTTACTTTTTTTTCTTTTATCACTAAAAGTGCATTCATTGTAGACTAAAACACATTAAATAGAGTTTTATATCCTTTTCTCATACATGGTCCCTCATTTTCTTCTTAGTCTTGTATTATAAGTCACCTCTTTTTAAAAATAATTGGATCATAATATATGTTATTTTATAAAATTTATGCATAAAATATCATATTTTGCTCATTATATTTTTATTGATTAATTAATAATCTTAAAATATATTTATTTTGACTGATCTTGAAAATCAATAACTAATTAAATAAGGGCATAGAAATAAAATTATCTTATTTCTTGTTACAAGTACAAATACAAAAAGTGACTTATAATATGGGACGGGGGGAGTAATTAAGTGAAAGGTTATTCGTTCTTTATTGGTATTATCAGTTATTTAGGAGATAACTGATTTAGCAATTTTTAGTCTTTATTTATTTTATACACAGTTTATAAAACATACTTACATTTTTGAACTTGGTGATGGCGTAGCCCAGGGGTGTTAAATGGGCGGGTTGGGTTGAAATTGGAAATATTACTATGGGTGAATAGAAATTGGGTTGGGTTTGACCCGCCCAAATTTACTTTGGGCTCAAATGAGCTAAAATATGGGTTGGGTCTTGACCCGCTCAATTTGACCCGCTTAATCTTAGTTATTTAACATATTGATATTTAATTTTTATAATCACAATTTGAATCTCCGTTCAAGAATTTTTTTTTTATAATAAAAGTAACAAATGGATAGATAAATCATAAAAAAAAAGCAACAAATCGATAATAATTCATACTGTAAATATAGGAACATATCTTAATACTAAGTTATAAAACAGGTTGAAATTAGTAATTGAATTGGGCTCAATTGAGAATTCTCTTCAAATAGGTTAAGCTTGAATGGGTTGAGGTTGAACCCAACTCAAATTATCTTGAGCTCAATCCTTAAAATTCTGAGCGTATTGGGCATGTTACCATGTTTGGGTTCATTTTTAACGCCCCTAGCGTAGTCGAAAGAAGTCAATCCATGAGGTTTGTAAAACAAATGCGAATAATTTACTCTACCATTGAGCTTGTTAGTCATATGGTGTAGCAAAATGGTAGATTATCGAAAAAATATCTTAATTATGCTTCATAGTTATAATTTGTTAATTACAATTAGTAGCTACATGTTATATGGAGGAGAGTGGCGAGCGAGATTGGGAGAGGAAAGAGAGAAGTGAGTGAGACAAGGTAGAGAGTGGGAGAGAGGCGAACTGCATATGCATATTTGTCAAAATAATTGTATATATGTAACTGGTATACATACGTATTCGTATATCTGGTGAGTGAGGAGAGAAAAGAGAGAAGCGAGCGAGATTGGAAGAGGAAAGAGAGAGCCGAGCGAGAGAGGACAATAATTTATGTAATTCGCATCTCATTTGTATAATTAATTTTGTTCGAAATGCGGTTCAATATAATTTTTTAACCATAAGCATAAACAACCCTATATAGAACTATTGATCAATATAGAACTATTGATCTATTGATCAAAAGAGTCATACCATAATTCTATTTAAACACCACCTCCCTTGTTTCACTTCACAATAAAATAAATTTGAGTAATAAAGC
配列番号2:ShZISプロモーター配列
CTCTCTCTAAAGAAGTTGAAGATACCTTCTTCCAGTAAGTGGGACTGGAGGGGGAGATTTGTTGAATCCATCCCATTTTTTTTGGTCAACTTTAGCTACTCAATTGGTACAAGCAATTGTTAAAAAGGAATAGTAATTGGAGTTGAAAAGAAAAGATTTGGTAGTTGGCAAATTGGTAAGATTTGCAACCATTTTTGACTTTGCTATGTTTACATATGTCATTAGTGACATAGGTATGGTTTTATCCTTCTATAAATAGCGCACTCTTGCTCATTTGTAGAACACACCAAGTTAGAGAGAAAAACAATTTTGAGAGCAAAGTGAGGTATTCCATAGACTATATAAGAAAATAGTCTGTGAAGAAAAATAGAGTGTGAGCGATATTTTAGTAAGACGGAAACCAAAAGAGTGTTGTTCCTTTTGAGTGTGTAGTAGTCACTTTGAGTATTGTATTCGTGACTACACAGTGTAAAATTCCTTACTATAGTAATATCAATTGCTCCTCTTAGTCCGCGGTTTTTTCCCTTATTCAGAAGGGTTTCCACGTAAAATTCTTGGTGTCATTATTTTCCCATTTTATTTCCATTACTTTTACCATATATACTTTtGTGCTTGTCCGCGTTTTCCCAACAAGATGGTGTTTAAATAGAATTATGGTATGACTCTTTTGATCAATAGTTCTATATAGGGTTGTTCATGCTTATGGTTAAAAAATCATATTGAATCGCATTTCGAATCAAAATTGATAATACAAATGAGATGCGAAGCTTGCATGAGTTCCAAAAAATATAAATAACGGTAAAATGGTAAAGTTACATCATTTTTTAATGCAACTGCAAAGTAAAAATATAACATATAAAATGAGACAGAGGAAGTATGTAAAATCAATAATGAATATGTATTACTCCCTCTATTTCATAATAACTTAAGCTTTGAAGTGTTTCACACCCTTTAAAAAAAGTAGGTTAGGACATAAATGAACATAATTTTTCATTTTTGTCCTTATTAATTATTGTCAAAAATAACTAAACATTAATTATAATAACTAATtCCAATACTAACTTAATGGGTAAAATTAGAAGAAATTTTTTAAAATAGTCTTGAAAATTTAAAACATAAGTTAATTGAAAAATGGAAAGAAAAAAAAGCTCAAATCTTGTTATTATGTAATGGAGGGAGTATTAGACAGAGAAATTATTAATTRCTCCCTCCGTCCCATATTATAAGTCACTTTTTTCATTTGTACTTGCAACAAGAAATAAGATAATTTTATTTCTATGCCCTTTGTTATAGATTTTCAAAATTAGTCAAAGTAAATATATTTTCAAAAYTAATTAATTAATCAATAAGGATATAATGAGCAAAATATGGTATTTAGTATAAATTTATAAATACATATATTATGATCAATATTTAGAGAAGGTGACCTATAATATGAAGGAAGAAATGAGGACCATATATGAGAAAGGATATAAACTCTATTTAATGTGTTTAGTGTACAATGAATGCACTTTAGTGATAAAGAAAAAAGTTAAAAAAATATCATCCATGATTATTCCCTTTAAAATTCGATATTAGTTCACCTCTAACTACTTACAATAATTGTATTTCCATGTGTCATATAGCTCATATTTATATAAAGAAAATAGGTTGGTAAAACTTTGTGGTAGGTTTGAGATATTTCAAAATATTCTTATAATTTTTCAATTATTCTTCCAATTTTTTCATGATATAGCTTTCTAGATCATCAATTTTCTTAAATCGTCATATGTGAAAATTGGAGTCACACACTTTTTAATAGTTATCAAGTTTGACTATAGCGCAGCTAAGAGTCTAAGATAACTATAACAATAATCATAAATTACAGGATGGAATTAGCCTCAAGTTTGTAATAACATGACATTCGAAAATATAACCATTGGATAAAAAAAATTTCAAATCATCTCGAGTTTATAAAAATTATTTGAGAGACAGTTGATTTTGACCTTTTGATCACGTGTGATTCATAAACATGATCAAAAATCAACAATTTTTAATTTTTAATTGACTTTAAAGGTTTGCTAATAGGCTAAACGGAAGTCAAATTTCAAACTCACTATTTCAATTAATTATTAATCATACTATGTTAAAAATAGTCCACGTAATGGCCAACAACTAGCAAAACTTATCACGAGATTCTATATGATACTATATATGCTTTGTTTTTTCGATATTCATTTTATTTAAAGTTTGATATTTATATTAAAATTAAAATAGATTTTAAATTTGTATTAAGAAAATTCATTATAAAAGGTTGAAACATTTTCTAACAAAAAGATATGATGTCCACTTGAATCAAAGAGTAATAATGCTCATATACTTTTTCTGCTTTGAAATAAGATATGCGATAATGATTGACTAATAAAAATTAAAGACTAGTCATTTATAGGGCAAAACGTGCATTTTTACATTTAATTACACATCAAGKTTATACCAAAGTGAGATATTATAAGGAAAAATCTTTGTGGCCAAAATTTTTGGACAGAACGATATTTTATTTATGTTATTTTAATTTTAATACATTTTAACTACAAAATGGAAAAAATAACAGTTTATTATAAAATAAAAAAATATTTTAGTTTTTTTTATTTTTTTAGTCAATTTTTCTAGCCATTTAGCTCTTTCCATATTATAATATAAAGAGAAAAGTATTTAAAATATCTCTAAATTTGGTGTGAATTAATAGGTTTGTCTCCGAATTATTGACAACATTAAAACTACTCTCTACTTGACAAATTGAACTTAAACATATATACCCTTGATCTTGTCACATCAGTGATATACAATCCCAAATTCTCGTCAACTTTAGGGGTATTTTGAACACTTCTTTTGACATTTTATTAAGAGTCTCACGTTCCTACAAGAGTTTGAGACTACTTGATATGCCATGTGGCAGACTGGAGTGTATTTTAAGTTCAGTTAGTCAACTAAACAATTTTTTTAGAGTAAATTTTAGGTTTAACAAACATAAAAATCATATATGTATGTTAATAATTATAGTTGGTATAATTGCGCTTCATAGCAAACTTTATGTTTGCTATGACTATTAATTTGTATATTTTGATATACATATACAAAAGAATGAATTGTATAATCTCTATTTGTATAAAGCGAGAACGAGAGAAGACAAATGAAAACTGGTAGCGAGAAATGGAGAGTGACGAAAGACAACTGTTTAATTTGAATCAATGATTTGCTATTTTATACATTTTTTCCTTATTTTTAAGACTATCAATAATTGAGTGACGAAATTAATAATTTGCATTAAATTTAATTAAAAATATTTTCAACATTTCTCTCCGCTAAATATTTATTTATAACGAGGAAACAAAATCAAAGACAAACACAAAATAGGAGAAATTTCTTCATTTTTGACCCCTCCACTCCCAAAAACAACACACAATATTCAAGG
配列番号3:ShTPS9プロモーター配列
TTATTTCACTAATTAAATTTATTCTTAAATATTTATATATATTTATTTTGCTATGCTAATTTATTTTTTTTATAATAAAATTAGTTGAGTGATTTGATGGATACAAAGTCATAAATTGAATGACTTAACTAAATAAATTATTAAAGTTGAATGATATTATTGATAAAAAGACATAAATTGAATAATTTTTTTGATATAAAATAAAGTTCAGATATTGTTACACAATTAACCATCCTTTTCAATTTTAATAAATAAACTCCTCTTTAATATCGTTCTAATGAAAATTTCTTCCAAACAACATAAATAATAAGTTCATCATTTATCGACTAATTCATAAATATTATTTGAGTAATATCTATGCAATTTTTTACAATGTTTATATTATGTCATTTAAAAGATAAGGACAGATGCCGGTAAGCATTACAATAAGTGGTAGTAACTACATTATAAATAGGCCCATCCAATTAGCATAACTTAAACCCACAAATTAAGCTTGAAAAAAAAAGAGCAAACCTTAGAACAAACAAGCA
配列番号4:ShTPS9プロモーター配列(長)
TTTAAATTTTATATTTATATTAAACATTTTATTAATATATATATATATATAGCTATAAACTCAATAATTACGATGACTTACTATAAATTCGATTTTAAGTTTGAACTCAAAAATTCTTAAAACTCTAATTCTACTTGTGTATTCATCTAGCCTCTTATGACACGTaAAAAAAAATACAATAAATAAATTGCAATAACTCAAATTATTTATATGTGACATAAAGAATCGTGTGGCTCTAAAATTTTATTTCTCTGCGGTCCAATTAAAGTTTTGATAATCCACCAAATTGAAGACTTAAAATGCCTTATTGAGGTGCCAAATACTAATGAAGAAGAAAACAAAACAAAATAAAAACACCTACTCATAAATTATAATATAACTGTATCTCATTGCTAATATGACATTTAATAGGAGAGTATGAAAATCGATAATTAGGATATATTGTTAATATATAATCAAACGTTTTATTTCTTCCTAGTGGTAGAGTAAGGTTCTAATCTAGAGCCCCTATCCCCTTACCATTACTGTTTAGTATTATGCAAGTTATTTTTTTACTTTGATTATCTCTAATATTTTTACTGTCGTTATTTTTGTTTTTTTAATATAATTTTTGTCATATTTTTTGCTGTTACAATACTTTCAAATCATGTTTTGAAGAATGATTTCTTGATCCGAGGATCTATAGTAAACATTCTTTCTATCAAATAAAGATACATATAACTTATAAGGTCTGCATACATAATACTATCCTTCTCAAACCCCACTTATATGAAATGATACCAGATGACTGAGTCAATATCTCAAAAGGTCACTCAAGTTTAAGAATATATCTAGTAAAGTTATTAAACTTTCTTTACTATCAATAAAATCACTTAACTTAGATACGTGGATCAATAAAATCACTCAACTCAATTTATCATTAAAAAAATTATCATAGATAAATAATTTTTTATGCCATGTAAATATGAACTCCATAAATTAATAAAATTAAAAAAAATCCATCAAGACTTTTTTATGAATAAACTTAATAATTTATTAGGATATTATTATATAATTCTAATGTATTATTACGAGCTTTATTAAGAAAAAGTTAGGGTATTGTATGGTAAATAATTGGGGGTACATGATTTTTATCATATAAAAATATATAGACATTGGCTTAATAACTCTAACTCTGCAAATATTACTCTGTTACGATCATTAAATTATAAAAATAAATTGACGTCTTATAATTATTTTTCGTTGCAATCATTAAGCCCTATGACAATATCAGTATATAGTAATTGGTAATGTAACATTCATTCTGATACCAATTTTAAGTGCATAATAATATTATATTAATATTTATTTCACTAATTAAATTTATTCTTAAATATTTATATATATTTATTTTGCTATGCTAATTTATTTTTTTTATAATAAAATTAGTTGAGTGATTTGATGGATACAAAGTCATAAATTGAATGACTTAACTAAATAAATTATTAAAGTTGAATGATATTATTGATAAAAAGACATAAATTGAATAATTTTTTTGATATAAAATAAAGTTCAGATATTGTTACACAATTAACCATCCTTTTCAATTTTAATAAATAAACTCCTCTTTAATATCGTTCTAATGAAAATTTCTTCCAAACAACATAAATAATAAGTTCATCATTTATCGACTAATTCATAAATATTATTTGAGTAATATCTATGCAATTTTTTACAATGTTTATATTATGTCATTTAAAAGATAAGGACAGATGCCGGTAAGCATTACAATAAGTGGTAGTAACTACATTATAAATAGGCCCATCCAATTAGCATAACTTAAACCCACAAATTAAGCTTGAAAAAAAAAAGAGCAAACCTTAGAACAAACAAGCA
配列番号5:ソラナム・ハブロカイテスZ,Z-ファルネシル二リン酸合成酵素(zFPS)アミノ酸配列
ARGLNKISCSLSLQTEKLCYEDNDNDLDEELMPKHIALIMDGNRRWAKDKGLDVSEGHKHLFPKLKEICDISSKLGIQVITAFAFSTENWKRAKGEVDFLMQMFEELYDEFSRSGVRVSIIGCKTDLPMTLQKCIALTEETTKGNKGLHLVIALNYGGYYDILQATKSIVNKAMNGLLDVENINKNLFDQELESKCPNPDLLIRTGGVQRVSNFLLWQLAYTEFYFTKTLFPDFGEEDLKEAIINFQQRHRRFGGHTY
配列番号6:ソラナム・ハブロカイテス7-エピジンギベレン(ZIS)アミノ酸配列
CSHSTPSSMNGFEDARDRIRESFGKVELSPSSYDTAWVAMVPSKHSLNEPCFPQCLDWIIENQREDGSWGLNPSHPLLLKDSLSSTLACLLALTKWRVGDEQIKRGLGFIETQSWAIDNKDQISPLGFEIIFPSMIKSAEKLNLNLAINKRDSTIKRALQNEFTRNIEYMSEGFGELCDWKEIIKLHQRQNGSLFDSPATTAAALIYHQHDKKCYEYLNSILQQHKNWVPTMYPTKIHSLLCLVDTLQNLGVHRHFKSEIKKALDEIYRLWQQKNEEIFSNVTHCAMAFRLLRISYYDVSSDELAEFVDEEHFFATSGKYTSHVEILELHKASQLAIDHEKDDILDKINNWTRTFMEQKLLNNGFIDRMSKKEVELALRNFYIISDLAENRRYIKSYEENNFKILKAAYRSPNINNKDLFIFSIRDFELCQAQHQEELQQLKRWFEDCRLDQLGLSEQFISASYLCAIPIVPGPELSDARLVYAKYVMLLTIVDDHFESFASTDECLNIIELVERWDDYASVGYKSERVKVLFSMFYKSIEEIATIAEIKQGRSVKNHLINLWLKVMKLMLMERVEWCSGKTIPRIEEYLYVSSITFGSRLIPLTTQYFIGIKISKDLLESDEIYGLCNFTGIVLRLLNDLQDSKREQKEGSINLVTLLMKSISEEEAIMKMKEILEMKRRELFKMVLVQKKGSQLPQLCKEIFWRTCKWAHFTYSQTDRYRFPEEMENHIDEVFYKPLNH
配列番号7:ソラナム・ハブロカイテスZ,Z-ファルネシル二リン酸合成酵素(zFPS)標的化配列(アミノ酸配列)
MSSLVLQCWKLSSPSLILQQNTSISMGAFKGIHKLQIPNSPLTVS
配列番号8:ソラナム・ハブロカイテス7-エピジンギベレン(ZIS)標的化配列(アミノ酸配列)
MIVGYRSTIITLSHPKLGNGKTISSNAIFRRSCRVR
次世代配列決定技術(Illumina HiSeq 2000)を用いて、S.リコペルシカムおよび野生種トマトS.ハブロカイテスのトリコーム特異的cDNAライブラリーを配列決定した。TruSeqキット(Illunima社)を用いて、cDNAライブラリーを調製した。配列決定したところ、データ解析は、S.ハブロカイテスファルネシル二リン酸合成酵素(ShzFPS;FJ194969)、S.ハブロカイテスジンギベレン合成酵素(ShZIS;JN990661)およびS.ハブロカイテスゲルマクレン合成酵素(ShTPS9;JN402388)の読み取りデータの頻度が、S.ハブロカイテス(LA1777およびPI127826)およびS.リコペルシカム(例えば、ShMKS1およびSlMTS1;Table 1(表1)を参照)のトリコームにおいて発現される他の公知のトリコーム特異的遺伝子と比較して非常に高かったことを示した。その後、S.リコペルシカムcv Moneymakerおよび野生種トマトS.ハブロカイテスの異なる組織のRNAを単離した。トリコームを含む数種類の異なる植物器官において、ShzFPS、ShZISおよびShTPS9の組織特異的発現レベルを検査した。ShzFPS、ShZISおよびShTPS9遺伝子の発現は、他の周知のトリコーム特異的遺伝子(例えば、ShMKS1およびSlMTS1;Table 1(表1))の発現よりもはるかに高かった。さらに、ShzFPSおよびShTPS9の発現がトリコーム特異的であることが示された(図1および図2)。
プロモーター配列を得るために、Clontech社GenomeWalkerUniversalキットに従ってゲノムDNAにおけるゲノムウォーキングを行った。S.ハブロカイテスPI127826から全ゲノムDNAを単離した。2μgのgDNAを、数種類の6塩基認識平滑切断制限酵素で別々に消化し、続いてアダプターライゲーションおよび希釈を行った。アダプタープライマー1および遺伝子特異的プライマーを用いて第1ラウンドの増幅を行った。その後、アダプタープライマー2およびネステッド遺伝子特異的プライマーを用いて二次ネステッド増幅を行った。追加的なラウンドのネステッド増幅を行った。増幅されたPCR断片をクローニングし、サンガー(Sanger)配列決定した。
アダプタープライマー1(AP1;22-mer)
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
ネステッドアダプタープライマー2(AP2;19-mer)
5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'
トリコーム特異的プロモーター配列
配列番号1:2254bp ShzFPSプロモーター
配列番号2:3451bp ShZISプロモーター
配列番号3:530bp ShTPS9プロモーター
配列番号4:1875bp ShTPS9プロモーター(長)
最終ShzFPSおよびShTPS9プロモーター配列(それぞれ配列番号1および4)を、pKG1662ベクターにおけるGUS-Aマーカー遺伝子の前に置いた。プロモーターおよびマーカー遺伝子をその後、バイナリーpBIN-plusベクター(Van Engelenら、1995、Transgenic Res、288)の多重クローニング部位にシャトルした(shuttled)。これらの構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101に組み入れ、Koornneefら(1986. Transformation of tomato. In: Nevins D.J.およびR.A. Jones編、Tomato Biotechnology. New York、NY、USA、Alan R. Liss, Inc. 169〜178頁)に記載された方法に従って、トマトS.リコペルシカムvar.Moneymakerの形質転換に用いた。植物を形質転換し、カナマイシン選択下で再生させ、一次再生体(regenerant)(T0)を生育して種子を得た。
T0植物において、定量的および定性的β-グルクロニダーゼ(GUS)活性解析を行った。
cDNA合成:全RNAを先ずPromega RQ1 RNaseフリーDNaseキットで処理して、メーカーに従って残るゲノムDNAを全て除去した。その後、500ngの全RNAから、Invitrogen Superscript(商標)II逆転写酵素キットを利用して、アンカーオリゴdTプライマーを用いて一本鎖cDNAを合成した。さらなる反応に先立ちcDNAを3倍希釈した。
ShZISプロモーター配列(配列番号2)は、pKG1662ベクターにおけるGUS-Aマーカー遺伝子の前に置かれる。プロモーターおよびマーカー遺伝子はその後、バイナリーpBIN-plusベクター(Van Engelenら、1995、Transgenic Res、288)の多重クローニング部位において左右に配置される。この構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101に組み入れ、Koornneefら(1986. Transformation of tomato. In: Nevins D.J.およびR.A. Jones編、Tomato Biotechnology. New York、NY、USA、Alan R. Liss, Inc. 169〜178頁)により記載された方法に従った、トマトS.リコペルシカムvar.Moneymakerの形質転換に用いる。植物を形質転換し、カナマイシン選択下で再生し、一次再生体(T0)を生育して種子を得る。
GUS発現解析を行い、S.リコペルシカムにおける高度に特異的なトリコーム発現を示す。GUSの発現、したがって、ShZISプロモーターの活性は、文献に記載されている公知のトリコーム特異的プロモーター(例えば、ShMKS1)の活性よりも有意に高い。さらに、これは、ShZISプロモーターが、それが単離された種以外の別の植物種のトリコームにおいて活性を有することを示す。
代謝経路操作を用いて、ShzPFS、ShZISおよびShTPS9プロモーターの高い活性が示される。それぞれ2種の公知のプロモーターSlMTS1およびShMKS1(それぞれWO2009/082208およびFridmanら、2005、上記参照)ならびに配列番号1、配列番号2または配列番号4のプロモーターにより駆動されたShzFPS(配列番号5のアミノ酸配列をコードする核酸配列)およびShZIS(配列番号6のアミノ酸配列をコードする核酸配列)のCDSで、トマト植物を形質転換する。プロモーター活性を評価するために、Q-PCRを用いてShzFPSおよびShZISの転写物レベルを決定する。さらに、これらのセットのトランスジェニック植物におけるGC-MSにより、ShzFPSおよびShZISの活性により産生される代謝最終産物であるジンギベレンを決定する。両方のアッセイは、ShzFPS、ShZISおよびShTPS9プロモーターの活性が、以前に記載されたトリコーム特異的プロモーターの活性よりも強いことを示す。
Claims (16)
- そのゲノムに組み込まれたキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物または植物細胞または植物組織または器官において、前記キメラ遺伝子が、相同または異種核酸配列に作動可能に連結されたトリコーム特異的プロモーターを含み、前記相同または異種核酸配列が、必要に応じて、相同または異種3'UTR配列にさらに作動可能に連結されることを特徴とし、プロモーターが、
(a)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列、
(b)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列の機能的断片、
(c)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を含む核酸配列、
(d)(c)の核酸配列の機能的断片
の群から選択される、トランスジェニック植物または植物細胞または植物組織または器官。 - プロモーターが、腺トリコームにおいて特異的に活性を有する、請求項1に記載の植物、植物細胞、組織または器官。
- プロモーターが、構成的活性を有する、請求項1または2に記載の植物、植物細胞、組織または器官。
- 植物、植物細胞、組織または器官が、1種または複数の生物的および/または非生物的ストレスに曝露されたときに、プロモーター活性が有意には低下しない、請求項1から3のいずれか一項に記載の植物、植物細胞、組織または器官。
- 植物がナス科に属する、請求項1から4のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物、植物細胞、組織または器官。
- 植物細胞に導入されるとトリコーム特異的プロモーター活性を有する単離された核酸配列であって、前記核酸配列が、
(a)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列、
(b)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列の断片、
(c)配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を含む核酸配列、
(d)(c)の核酸配列の機能的断片
から選択される配列を含む、単離された核酸配列。 - 配列番号4、配列番号3、配列番号1または配列番号2の核酸配列の少なくとも200の連続したヌクレオチドを含む、請求項1(d)または5(d)に規定の断片。
- 請求項6に記載の核酸配列または請求項7に記載の断片を含むキメラ遺伝子。
- 請求項6に記載の前記核酸配列または請求項7に記載の前記断片が、相同または異種核酸配列および必要に応じて3'UTR配列に作動可能に連結されている、請求項8に記載のキメラ遺伝子。
- 請求項6に記載の核酸配列、請求項7に記載の断片または請求項8もしくは9に記載のキメラ遺伝子を含むベクター。
- 請求項8に記載のキメラ遺伝子または請求項10に記載のベクターを含むトランスジェニック植物または植物細胞。
- (a)請求項8に記載のキメラ遺伝子または請求項10に記載のベクターを作製する工程と、
(b)前記キメラ遺伝子またはベクターで植物または植物細胞を形質転換する工程と、必要に応じて
(c)トランスジェニック植物を再生する工程と
を含む、トランスジェニック植物または植物細胞を作製するための方法。 - 請求項10に記載のベクターが、工程a)において用いられ、前記ベクターが、配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5のアミノ酸配列に対し少なくとも80%同一性を有するそのバリアントをコードする核酸配列に作動可能に連結された配列番号1の核酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、ファルネシル二リン酸合成酵素活性を有する、請求項12に記載の方法。
- 請求項10に記載の第2のベクターが、工程a)において用いられ、前記第2のベクターが、配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6のアミノ酸配列に対し少なくとも92%の同一性を有するそのバリアントをコードする核酸配列に作動可能に連結された配列番号2の核酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、ジンギベレン合成酵素活性を有する、請求項13に記載の方法。
- 請求項12から14のいずれか一項に記載の方法により得ることができるまたは得られるトランスジェニック植物または植物細胞。
- ソラナム・リコペルシカム植物または植物細胞である、請求項15に記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
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