JP2010523099A - 複数の産物を伴うz,z−ファルネシル二リン酸合成酵素及びセスキテルペン合成酵素をコード化する遺伝子及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
テルペンは、細菌、カビ、動物、及び植物などの全ての生きた生物に存在する分子である。それらは生物界において天然産物の最大の分類を形成する。植物において、これらの分子はホルモン(ジベレリン、サイトカイニン、ブラシノステロイド、及びアブシシン酸)として、又は、光合成(カロチノイド、クロロフィル、プラストキノン、及びフィトール)、タンパク質プレニル化過程、及び膜構造(ステロール)に関与する化合物として、一次代謝において役割を果たす。しかし、二次代謝から生ずるテルペノイドは、分子のこの分類での構造的多様性の大部分を占める。いわゆる二次テルペノイド(secondary terpenoid)は、主に、例えば、植物に有益な昆虫の誘引(受粉及び植食性昆虫の捕食者)、病原体及び昆虫に対する防御、ならびに光酸化ストレスに対する保護などの環境相互作用において役割を果たす(Tholl, 2006)。
本発明は、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンで主に構成されるセスキテルペンの混合物ならびにそれらの前駆体Z,Z−ファルネシル二リン酸(Z,Z−FPP)の合成に関与する2つの遺伝子、及び、細菌、酵母、動物細胞、及び植物などの生きた生物において該化合物を調製するためのその使用に関する。
a)該細胞中への、本発明のZ,Z−FPSをコード化する第1遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクト及び本発明のSBSと命名されたセスキテルペン合成酵素をコード化する第2遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)該第1遺伝子及び該第2遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるZ,Z−FPP又はSBS酵素のセスキテルペン産物又はその誘導体の回収
を含む。
a)該細胞中への、本発明のZ,Z−FPSをコード化する核酸配列を伴う発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるその誘導体の回収
を含む。
mRNA:メッセンジャーRNA
DNA:デオキシリボ核酸
cDNA:mRNAの逆転写により産生した相補的DNA
CaMV:カリフラワーモザイクウイルス
DMAPP:ジメチルアリル二リン酸
CBT−ol:センブラトリエン(cembratrien)−オール
CBTS:センブラトリエン−オール合成酵素
GPP:ゲラニル二リン酸
FPP:ファルネシル二リン酸
GC:ガスクロマトグラフィー
GGPP:ゲラニルゲラニル二リン酸
ihpRNAi:干渉イントロンヘアピンRNA
IPP:イソペンテニル二リン酸
MS:質量分析法
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
RACE:cDNA末端の迅速増幅
A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V:普遍的な命名法に従ったアミノ酸の標準的暗号
www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=t
A、C、G、T、B、D、H、K、M、N、R、S、V、W、Y:普遍的な命名法に従った塩基の標準的暗号
www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=t
RFLP:制限断片長多型
本発明は、従って、多くのセスキテルペンの合成経路に関与する酵素をコード化する遺伝子について初めて記載する。特に、本発明は、SB型化合物と呼ばれ、Z,Z−FPPからのアルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンで主に構成されるセスキテルペンの混合物の産生を可能にする複数の産物を伴うトマトのセスキテルペン合成酵素(SB合成酵素)の特性付けに関する。また、本発明は、さらに、IPP及びDMAPからのZ,Z−FPPの産生を可能にするトマトのZ,Z−ファルネシル二リン酸合成酵素(zFPS)の特性付けに関する。これらの酵素を使用して、トランスジェニック生物又は組み換え微生物もしくは細胞においてインビトロ又はインビボで、SB型セスキテルペン又はZ,Z−FPPを産生できる。トランスジェニック生物、細菌、酵母、カビ、動物、昆虫、もしくは植物細胞などの細胞又は微生物、及びトランスジェニック動物又は植物を検討する。それらはZ,Z−ファルネソールなどのZ,Z−FPPに由来する化合物の産生も可能にする。本発明の方法は、特に微生物(細菌、酵母)におけるZ,Z−FPP、及び分泌型の腺毛を保有する植物においてSB型化合物を産生するために使用できる。SB型セスキテルペン混合物又はその誘導体の産生は、また、植物、例えばトマトにおいて、遺伝子消失技術により、又は、変異導入法により低減又は抑制することができる。また、本発明において同定した配列は、生物の他の種、特に植物において同じ活性を有する酵素をコード化する遺伝子を同定及び/又はクローン化するために有用である。最後に、多型分子的マーカーはzFPS及びSB合成酵素をコード化する核酸から同定でき、他の種又は様々な栽培トマト(ソラナム・リコペルシカム)中への対応する機能的ゲノム配列の導入をモニター可能にする。
a)該細胞中への、本発明のzFPSをコード化する第1遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクト及び本発明のSB合成酵素をコード化する第2遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)該第1遺伝子及び該第2遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるSB型セスキテルペン又はその誘導体の回収
を含む。
a)本発明のzFPSをコード化する第1異種遺伝子及び本発明のSB合成酵素をコード化する第2異種遺伝子を含む組み換え細胞の提供;
b)該第1遺伝子及び該第2遺伝子の発現のための適切な条件における該細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるSB型セスキテルペン又はその誘導体の回収
を含む。
a)該細胞中への、本発明のZ,Z−FPP合成酵素をコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるZ,Z−FPP又はその誘導体の回収
を含む。
a)本発明のzFPSをコード化する異種遺伝子を含む組み換え細胞の提供;
b)該遺伝子の発現のための適切な条件における細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるZ,Z−FPP又はその誘導体の回収
を含む。
a)該細胞中への、本発明のSB合成酵素をコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるSB型セスキテルペン混合物又はその誘導体の回収
を含む。
a)本発明のSB合成酵素をコード化する異種遺伝子を含む組み換え細胞の提供;
b)該遺伝子の発現のための適切な条件における細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるSB型セスキテルペン混合物又はその誘導体の回収
を含む。
a)生物の細胞中への、本発明のZ,Z−FPP合成酵素をコード化する第1遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクト及び本発明のSB合成酵素をコード化する第2遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)該細胞からの生物の再構成及び導入した2つの遺伝子を発現するトランスジェニック生物の選択
を含む多細胞生物を調製するための方法に関する。
a)生物の細胞中への、本発明のZ,Z−FPP合成酵素をコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)該細胞からの生物の再構成及び導入した遺伝子を発現するトランスジェニック生物の選択
を含む多細胞生物を調製するための方法に関する。
a)生物の細胞中への、本発明のSB合成酵素をコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)該細胞からの生物の再構成及び導入した遺伝子を発現するトランスジェニック生物の選択
を含む多細胞生物を調製するための方法に関する。
一態様において、生物は非ヒト動物である。例えば、生物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどでありうる。別の好ましい態様において、生物は、植物、好ましくは植物の分泌トリコームである。この方法によって、該化合物を産生しない生物によりSB型セスキテルペン混合物を産生し、又は、生物により産生されるSB型セスキテルペン混合物の量を増加できる。
トマト葉cDNA(S.ハブロカイト)の合成
mRNAはトマト葉(ソラナム・ハブロカイト=L.ヒルスタム LA1777)から全RNA抽出キット(RNeasy Minikit, Qiagen)を使用して抽出した。対応するcDNAは、逆転写酵素(Roche,Cat.No.03 531 317)を使用して、製造者が推奨する反応条件においてポリTプライマーからの逆転写により合成する。
2つの遺伝子Sh−zFPS及びSh−SBSの完全コードヌクレオチド配列は、SGNウェブサイト(“SOL Genomics Network”,http://www.sgn.cornell.edu/)で入手可能なS.ハブロカイトトマト葉トリコームのESTライブラリー(Van der Hoeven, et al., 2000、未発表)中の公的に入手可能な配列データからクローン化した。
を、配列番号3についてはプライマー
を使用してトマト葉cDNAからPCRにより得た。制限酵素部位(NcoI及びXhoI)をプライマーの5’末端に付加し、プロモーターの下流でのcDNAのクローニングを容易にした。PCR増幅は、製造者により供給されるバッファーにおいて0.5単位のTaqポリメラーゼ(Eurogentec)で実施した。PCR産物はQiaquickカラム(Qiagen)で精製し、T4 DNAリガーゼ(NEB)でのライゲーションによりpGEM−Tクローニングベクター(Promega)中にクローン化した。予測配列を有するクローンは、挿入断片の完全シークエンシング後に選択した。
表1:Sh−zFPS配列でのSwissProt及びGenBankライブラリーに対するBlastP 2.2.13プログラム(Altschul et al., 1997)を使用したホモロジー検索により得られた最高パーセントの同一性(%同一性)を伴う配列
表2:Sh−SBS配列でのSwissProt及びGenBankライブラリーに対するBlastP 2.2.13プログラム(Altschul et al., 1997)を使用したホモロジー検索により得られた最高パーセントの同一性(%同一性)を伴う配列
Sh−zFPS及びSh−SBSをコード化する核酸配列(それぞれ配列番号1及び3)を別々にpET−30b発現ベクター(Novagen)中に導入した。組み換えタンパク質の精製を可能にするために、これらの配列の終止コドンを欠失させて、C末端に6ヒスチジンテールを伴う融合タンパク質を作製した。そのようにして得られたShzFPS−pET30b及びSh−SBS−pET30bベクターは、エレクトロポレーションにより、組み換えタンパク質の発現用に改変した大腸菌(Escherichia coli)(BL21−CodonPlus,Stratagene)中に導入した。タンパク質を産生するために、大腸菌培養(500ml)を37℃で開始し、600nmでの吸光度が0.5に達した。この段階で、培養温度を16℃まで下げ、エタノール(1%V/V)を培地に加えた。1時間のインキュベーション後、IPTGを1mM濃度で培地に加えて、組み換えタンパク質の発現を誘導した。培養物を次に18時間インキュベートし、細胞を4℃で遠心することにより停止した。細胞沈殿物を200mMリン酸バッファー中に再浮遊した。細胞をフレンチプレス(ΔP=19バール)で溶解させて、溶解物を15,000gで遠心した。可溶性タンパク質を含む上精をPD10カラム(Amersham)で脱塩し、50mMリン酸バッファー(pH7)で平衡化し、製造者の溶出プロトコルに厳密に従ってニッケル−ニトリロ三酢酸アフィニティ樹脂(Ni−NTA,Qiagen)上に添加した。最高量のSh−zFPS−6His及びSh−SBS−6Hisタンパク質を伴う画分をSDS−PAGEにより同定し、次に50mM HEPESバッファー(pH7.8,100mM KCl)で平衡化したPD10カラムで脱塩した。粗タンパク質画分と比較して、約20倍濃縮が2つのタンパク質について得られた。
活性テストは以下のバッファー中で実施した:50mM HEPES(pH7.8)、100mM KCl、7.5mM MgCl2、5%(w/v)グリセロール、及び5mM DTT。活性テストでは、濃縮画分からの25又は50μgのタンパク質を32℃で2時間基質IPP、DMAPP、GPP、FPP、GGPP(Sigma)と、単独又は併用で、各々65μMの濃度でインキュベートした。
*:脱リン酸化後
表3:異なるイソプレン基質を伴うSh−zFPS−6His及びSh−SBS−6His組み換えタンパク質で得られたインビトロ酵素活性テストのまとめ。A、Z,Z−ファルネソール、B、アルファ−サンタレン;C、エピ−ベータ−サンタレン;D、エンド−ベータ−ベルガモテン;E、シス−アルファ−ベルガモテン;F、トランス−アルファ−ベルガモテン
トリコーム特異的タバコプロモーター(eCBTS02, Tissier et al., 2004)をSh−zFPS及びSh−SBSのコード配列の上流にクローン化して、コンストラクトeCBTS1.0Sh−zFPS[#1]及びeCBTS1.0−Sh−SBS[#2]を形成した。これらの2つのコンストラクトを、カナマイシン耐性遺伝子を含む、アグロバクテリウムによる形質転換用の同じバイナリーベクター中に導入し、pLIBRO−064バイナリーベクターを得た(図2A)。コンストラクト#2もpLIBRO−065バイナリーベクター中に別々に導入した(図2B)。ベクターは、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム株LBA4404中に導入した。異なるベクターを持つ株を使用して、葉片法(leaf disc method)(Horsch et al., 1985)によるN.シルベストリスの遺伝子形質転換を実施した。
完全zFPS遺伝子は、以下のプライマーを使用して、S.リコペルシカム、S.ハブロカイト、及びTAS17のゲノムDNAからPCRにより増幅した:ACCATGGGTTCTTTGGTTCTTCAATGTTGGA(配列番号9)及びACTCGAGATATGTGTGTCCACCAAAACGTCTATG(配列番号10)。2つの産物が2つのゲノムにおいて増幅され、2つのゲノム中に少なくとも2コピーの遺伝子が存在することを示唆する(図8)。約3000ヌクレオチド(バンドA)のサイズを伴う2つの産物の1つは、2つのゲノムに共通である。第2の産物は、S.リコペルシカムにおいて約2000ヌクレオチド(バンドC)及びS.ハブロカイトにおいて約2500ヌクレオチド(バンドB)のサイズを有する。TA517系統のプロファイルは、S.ハブロカイトのものと同一である。これらの結果は、S.ハブロカイトに特異的な遺伝子BがTA517系統中に導入されていることを示唆する。産物Bのシークエンシングによって、それが本明細書において記載するzFPS遺伝子に対応することが確認された。この結果は、また、2つのゲノムの間に存在する多型をこの遺伝子について使用することによりS.ハブロカイトのzFPS遺伝子をS.リコペルシカム中に導入できることを実証する。
Claims (17)
- DMAP及びIPPの供給源を有する細胞においてZ,Z−FPPからSB型セスキテルペン又はその誘導体を産生するための方法であって、以下:
a)該細胞中への、zFPSをコード化し、配列番号2と少なくとも80%の同一性を伴う第1遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクト及びSB合成酵素をコード化し、配列番号4と少なくとも80%の同一性を伴う第2遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)該第1遺伝子及び該第2遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるSB型セスキテルペン又はその誘導体の回収
を含む、方法。 - Z,Z−FPP合成酵素活性及び配列番号2と少なくとも80%の同一性を伴う配列を有する単離又は組み換えタンパク質。
- その配列が配列番号2に対応することを特徴とする、請求項2記載のタンパク質。
- SB合成酵素活性を有し、及び、配列番号4と少なくとも80%の同一性を伴う配列を有する単離又は組み換えタンパク質。
- 請求項2から4記載のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸。
- 請求項5記載の核酸を含む発現カセット。
- 請求項5記載の核酸又は請求項6記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項5記載の核酸、請求項6記載の発現カセット、又は請求項7記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項5記載の核酸、請求項6記載の発現カセット、請求項7記載のベクター、又は請求項8記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック生物。
- 生物が植物の腺トリコームであり、好ましくはニコチアナ(Nicotiana)属又はソラナム(Solanum)属からであることを特徴とする、請求項9記載のトランスジェニック生物。
- IPP及びDMAPの供給源を有する細胞においてIPP及びDMAPからZ,Z−ファルネシル二リン酸(Z,Z−FPP)又はその誘導体を産生するための方法であって、以下:
a)該細胞中への、請求項2又は3記載のタンパク質をコード化する核酸配列を伴う発現カセットを有するコンストラクトの導入;
b)遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養;ならびに、
c)場合により、該細胞中及び/又は培養液中に含まれるその誘導体の回収
を含む、方法。 - Z,Z−FPP、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、アルファ−ベルガモテン、ベータ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテン、又は、アルファ−サンタロール、エピ−ベータ−サンタロール、アルファ−ベルガモトール、ベータ−ベルガモトール、及びZ,Z−ファルネソールなどのその誘導体を調製するための請求項2から4記載のタンパク質、請求項5記載の核酸、請求項8記載の宿主細胞、又は請求項9又は10記載のトランスジェニック生物の使用。
- SB型セスキテルペンの合成経路が、請求項2又は3記載のタンパク質をコード化する遺伝子もしくは請求項4記載のタンパク質をコード化する遺伝子、又は両方の遺伝子の不活化により遮断されることを特徴とする、細胞又は非ヒトトランスジェニック生物。
- S.ハブロカイトと性的和合性のあるソラナム型の種において対応する遺伝子の遺伝子移入を制御するためにS.ハブロカイトと該種との間のゲノム多型を同定するための配列番号1又は配列番号3と少なくとも80%の同一性を伴う核酸の全部又は一部を含む分子マーカーの使用。
- 分子マーカーが配列番号9及び10に対応する核酸配列を含むことを特徴とする、請求項14記載の使用。
- プロトプラスト融合による、ソラナム・ハブロカイト(Solanum habrochaites)と性的和合性のない種における、zFPSをコード化し、配列番号2と少なくとも80%の同一性を伴うzFPS遺伝子、及び、SB合成酵素をコード化し、配列番号4と少なくとも80%の同一性を伴うSBS遺伝子の導入に存する方法。
- ホスファターゼにより、請求項11記載の方法に従い得られるZ,Z−FPPの脱リン酸化によりZ,Z−ファルネソールを産生するための方法。
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