ES2426388T3

ES2426388T3 - Genes que codifican Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa y una sesquiterpeno sintasa de productos múltiples y sus usos

Info

Publication number: ES2426388T3
Application number: ES08788102T
Authority: ES
Inventors: Christophe Sallaud; Denis Rontein; Alain Tissier
Original assignee: Philip Morris Products SA
Current assignee: Philip Morris Products SA
Priority date: 2007-04-03
Filing date: 2008-04-02
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2028-04-02
Also published as: CN101688191B; FR2914652A1; US20140154768A1; US20100138954A1; WO2008142318A2; EP2132305A2; US8629321B2; WO2008142318A3; CN101688191A; EP2132305B1; JP2010523099A; FR2914652B1; CA2681878A1; JP5369089B2

Abstract

Método de producción de sesquiterpenos de tipo SB (santaleno y bergamoteno) o de derivados de losmismos a partir de Z,Z-FPP (Z,Z-difosfato de farnesilo) en una célula que tiene una fuente de DMAP e IPP, quecomprende: a) la introducción en dicha célula de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprendeun primer gen codificante de una zFPS (Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa) que presenta al menos un 80% deidentidad con la SEQ ID Nº 2 y de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende unsegundo gen codificante de una SB sintasa que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 4; b) el cultivo de la célula transformada en condiciones apropiadas para la expresión de dichos primer ysegundo genes, y c) opcionalmente, la recogida de los sesquiterpenos de tipo SB los derivados de los mismos contenidos endicha célula y/o en el medio de cultivo.

Description

Genes que codifican Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa y una sesquiterpeno sintasa de productos múltiples y sus usos

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a dos genes responsables de la síntesis de una mezcla de sesquiterpenos y a su uso para la preparación de estos compuestos en organismos vivos tales como bacterias, levaduras, células animales y plantas.

Introducción

Los terpenos son moléculas presentes en todos los organismos vivos tales como bacterias, hongos, animales y plantas. Forman la mayor clase de moléculas naturales del mundo de los seres vivos. En las plantas, estas moléculas están presentes en el metabolismo primario como hormonas (giberelinas, citocininas, brasinoesteroides y ácido abscísico) o como compuestos implicados en la fotosíntesis (carotenoides, clorofilas, plastoquinonas y fitol) así como en procesos de prenilación de proteínas y en la estructura de membranas (esteroles). Sin embargo, los terpenoides procedentes del metabolismo secundario representan la parte esencial de la diversidad estructural de esta clase de moléculas. Los papeles de los terpenoides denominados secundarios se sitúan esencialmente en el campo de las interacciones con el entorno, como por ejemplo la atracción de insectos benéficos para la planta (polinización y predadores de insectos fitófagos), la defensa contra patógenos e insectos y la protección contra el estrés fotooxidativo (ThoIl, 2006).

Los terpenos están constituidos por múltiples unidades de isoprenilo de 5 carbonos. El número de unidades de isoprenilo permite clasificarlas en monoterpenos (compuestos de 10 átomos de carbono o C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) y así en adelante. Los precursores universales de todos los terpenos son difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP). Dos rutas distintas conducen a la formación de IPP y DMAPP. Una, la ruta del mevalonato (MEV), está localizada en el citoplasmas de las células eucariotas mientras que la otra, la ruta del metileritritol (MEP) solo existe en ciertas bacterias y plantas, donde está localizada en el cloroplasto (Rodríguez-Concepción y Boronat, 2002). Todas las etapas y todos los genes que codifican enzimas de las etapas de estas dos rutas son conocidos en un cierto número de organismos.

La primera etapa de la biosíntesis de terpenos a partir de los precursores comunes IPP y DMAPP se realiza mediante las difosfato de prenilo sintasas (o preniltransferasas) que van a generar mediante condensación de un precursor homoalílico, IPP, y un precursor alílico (DMAPP, difosfato de geranilo, difosfato de farnesilo o también difosfato de geranilgeranilo), cadenas de difosfatos de prenilo de longitud variable. Existen dos grandes clases principales de difosfato de prenilo sintasas: las cis-preniltransferasas o Z-preniltransferasas y las transpreniltransferasas o E-preniltransferasas. Las cis-preniltransferasas conducen a la formación de un doble enlace en configuración cis, mientras que las trans-preniltransferasas conducen a la formación de un doble enlace en configuración trans (Koyama 1999). Así, la adición secuencial de 2 unidades de IPP a un DMAPP por una transdifosfato de farnesilo sintasa o E-FPS produce un E,E-difosfato de farnesilo (E,E-FPP, C15). La reacción de alargamiento comienza por la formación de un catión alílico después de la eliminación del ión difosfato, formando un prenilo alílico. A continuación, se produce la adición de un IPP con una eliminación estereoespecífica de un protón en posición 2, formando un nuevo enlace C-C y un nuevo doble enlace en el producto. La repetición de esta condensación estereoespecífica de IPP con un difosfato de prenilo alílico conduce a la síntesis de un difosfato de prenilo de longitud de cadena y estereoquímica dadas específicas de cada enzima. En particular, la longitud de cadena del producto final puede variar considerablemente, desde C10 (difosfato de geranilo) hasta poli(difosfatos de prenilo) precursores del látex natural compuestos por varios miles de átomos de carbono.

Como se menciona anteriormente, las preniltransferasas pueden dividirse en dos familias genéticas diferentes según la estereoquímica (E o Z) del doble enlace formado después de cada ciclo de alargamiento (Poulter, 2006; Liang et al., 2002).

Las E-preniltransferasas caracterizadas hasta la fecha son responsables de la síntesis de fosfatos de prenilo de cadena corta (C10 a C50) en configuración E. Se pueden citar, por ejemplo, la difosfato de geranilo sintasa (GPS), la difosfato de farnesilo sintasa (FPS), la difosfato de geranilgeranilo sintasa (GGPS), la difosfato de octaprenilo sintasa (OPS), la difosfato de solanesilo sintasa (SPS) y la difosfato de decaprenilo sintasa (DPS), que son responsables respectivamente de la síntesis de (E)-GPP (C10), (E,E)-FPP (C15), (E,E,E)-GGPP (C20), (E,E,E,E,E,E,E)-OPP (C40), (E,E,E,E,E,E,E,E)-SPP (C45) y (E,E,E,E,E,E,E,E,E)-DPP (C50). Hay que observar que el (E,E)-FPP es en general el sustrato de las preniltransferasas responsables de la síntesis de cadenas de más de 20 carbonos. El primer gen codificante de una (E)-preniltransferasa caracterizado es el de FPS de rata (Clarke et al., 1987). El alineamiento de secuencias codificantes de E-preniltransferasas ha permitido poner de manifiesto dos motivos conservados de tipo DDXXD. La estructura tridimensional de una E-preniltransferasa, determinada por rayos X por primera vez con una FPS (Tarshis et al., 1994), y los estudios de mutagénesis dirigida han mostrado que los dos motivos DDXXD estaban implicados en el enlace con los sustratos y en la actividad catalítica resultante. Finalmente, se ha demostrado que un pequeño número de aminoácidos específicos, localizados en 5’ del primer motivo DDXXD, determinaban la longitud del alargamiento de la cadena de isoprenilos sintetizada (Wang y Ohnuma, 1999).

El primer gen codificante de una Z-preniltransferasa se clonó en Micrococus luteus (Shimizu et al., 1998). Codifica una undecapreniltransferasa (UPS) que usa el E-FPP como sustrato para formar un difosfato de prenilo de 55 carbonos que posee una estereoquímica de tipo Z,E. Esta molécula interviene en la biosíntesis de peptidiglicanos de la pared de ciertas bacterias. Se ha caracterizado una secuencia homóloga en Arabidopsis por ser la responsable de la síntesis de un difosfato de isoprenilo de conformación Z,E de 100 a 130 carbonos (Oh et al., 2000). El análisis de las secuencias aminoacídicas de estas enzimas no muestra ninguna homología con las secuencias de Epreniltransferasas (Koyama, 1999). En particular, las Z-preniltransferasas no poseen motivos ricos en ácido aspártico (DDXXD). Se han identificado 7 regiones conservadas que intervienen todas más o menos en la fijación del sustrato y la catálisis de este. Todas las Z-preniltransferasas identificadas hasta la fecha sintetizan difosfatos de prenilo que tienen una longitud de cadena mayor o igual a 55 carbonos, con excepción de una Z,E-FPS de Mycobacterium tuberculosis que usa el E-GPP como sustrato para formar Z,E-FPP (Schulbach et al., 2000). Un estudio reciente de mutagénesis dirigida a UPS de M. luteus ha permitido identificar varios aminoácidos que desempeñan un papel clave en el número de ciclos de alargamiento de la cadena de isoprenilos sintetizada (Kharel et al., 2006).

Los difosfatos de isoprenilo son los sustratos de una clase de enzimas, las terpeno sintasas, que permiten la formación de un esqueleto básico de terpenos cíclicos o acíclicos de C10 (monoterpenos), C15 (sesquiterpenos), C20 (diterpenos) y C30 (triterpenos) (Cane 1999; McMillan y Beale, 1999; Wise y Croteau, 1999). La diversidad de reacción de estas enzimas es el origen de la diversidad de los esqueletos terpénicos cíclicos que se encuentran en la naturaleza. Son teóricamente posibles cuatro estereoisómeros de difosfato de farnesilo en función de la configuración estereoquímica de los doble enlaces en posición 2 o 6 de la molécula (E,E, Z,E, E,Z o Z,Z). Sin embargo, hasta la fecha, todas las sesquiterpenos sintasas para las que se han caracterizado los genes usan como sustrato el E,E-FPP. Este es el caso, por ejemplo, de la 5-epiaristoloqueno sintasa del tabaco (Facchini y Chappell, 1992), de la (E)-a-bisaboleno sintasa de Abies grandis (Bohlmann et al., 1998), de la germacreno A sintasa de achicoria (Bouwmeester et al., 2002), de la amorfa-4,11-dieno sintasa de ajenjo dulce (Wallaart et al., 2001), de la germacreno C sintasa de tomate (Colby et al., 1998), de la cariofileno sintasa de ajenjo dulce (Cai et al., 2002) y de la valenceno sintasa de naranja (Sharon-Asa et al., 2003). Sin embargo, un estudio reciente ha mostrado que una sesquiterpeno sintasa de maíz (tps4) responsable de la síntesis de una mezcla de 14 sesquiterpenos aceptaba E,E-FPP y Z,E-FPP (Kollner et al., 2006), mostrando así que las sesquiterpenos sintasas podían usar isómeros distintos de E,E-FPP como sustrato. No obstante, ninguna sesquiterpeno sintasa clonada hasta la fecha usa Z,Z-FPP.

Los tricomas glandulares de tipo VI de Solanum habrochaites (antiguamente denominado Lycopersicum hirsutum) excretan grandes cantidades de sesquiterpenos olefínicos pertenecientes a dos clases distintas. La clase I contiene especialmente germacreno B y la clase II contiene entre otros a-santaleno y a-bergamoteno. El análisis de la segregación entre un genotipo de tomate cultivado (Lycopersicon esculentum = Solanum lycopersicum) y un genotipo de tomate silvestre (Lycopersicon hirsutum = Solanum habrochaites) ha permitido demostrar que la biosíntesis de estas dos clases diferentes de sesquiterpenos estaba controlada por dos loci diferentes (Sst1A y Sst2) localizados en dos cromosomas diferentes (van der Hoeven et al. 2000). El locus Sst1A se localiza en el cromosoma 6, y los genes de este locus son responsables de la acumulación de sesquiterpenos de clase I. El alelo Sst2 de S. habrochaites localizado en el cromosoma 8 controla la acumulación de sesquiterpenos de clase II como a-santaleno, pero también cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno, epi-�-santaleno y �-bergamoteno y otros compuestos menores no identificados. Aunque se han identificado las secuencias codificantes correspondientes a los genes localizados en el locus Sst1A, (van der Hoeven et al. 2000), las localizadas en el locus Sst2 no lo han sido.

Los documentos W02004/111183 y ADW26108 de la base de datos EMBL describen una secuencia nucleotídica (SEQ ID Nº 70) a la que no se ha asociado ninguna función. AW616634 de la base de datos EMBL describe una secuencia a la que no se ha asociado ninguna función. Por último, Adams et al. (PHYTOCHEMISTRY, vol. 12, nº 9, 1973, páginas 2167-2172) describen el aislamiento de una fracción proteica que posee actividad Z,Z-FPP sintasa.

Sumario de la invención

La presente invención hace referencia a dos genes responsables de la síntesis de una mezcla de sesquiterpenos compuesta principalmente por a-santaleno, epi-�-santaleno, cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo-�bergamoteno y su precursor Z,Z-difosfato de farnesilo (Z,Z-FPP) y a su uso para la preparación de estos compuestos en organismos vivos tales como bacterias, levaduras, células animales y plantas.

Más precisamente, el presente documento describe la identificación y caracterización de dos genes de S. habrochaites responsables de la síntesis de sesquiterpernos de clase II (a-santaleno, epi-�-santaleno, cis-abergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo-�-bergamoteno entre otros) de S. habrochaites que se han renombrado como sesquiterpenos de tipo SB (por santaleno y bergamoteno) en la continuación del texto. El primer gen codifica una Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa y el segundo una sesquiterpeno sintasa de productos múltiples que usa Z,Zdifosfato de farnesilo como sustrato. La producción de proteínas recombinantes correspondientes ha permitido demostrar que el perfil sesquiterpénico obtenido in vitro es idéntico al del control para el locus Sst2 de tomate.

La invención trata de actividades enzimáticas de la biosíntesis de Z,Z-FPP a partir de IPP y DMAP por una parte, y de una mezcla de sesquiterpenos compuesta principalmente por a-santaleno, epi--santaleno, cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo--bergamoteno a partir de Z,Z-FPP, de las secuencias peptídicas responsables de estas actividades y de las secuencias de ácido nucleico codificantes de estas secuencias peptídicas. La invención hace referencia igualmente a métodos que usan estas actividades enzimáticas para la producción de estos compuestos o de derivados de los mismos.

La presente invención se refiere por tanto a un método de producción de una mezcla de sesquiterpenos, principalmente compuestos de a-santaleno, epi--santaleno, cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo-bergamoteno, a partir de Z,Z-FPP en una célula que tiene una fuente de de IPP y DMAP, que comprende:

a) la introducción en dicha célula de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un primer gen codificante de una Z,Z-FPS que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 2 y de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un segundo gen codificante de una sesquiterpeno sintasa denominada SBS que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 4;

b) el cultivo de la célula transformada en condiciones apropiadas para la expresión de dichos primer y segundo genes, y

c) opcionalmente, la recogida del Z,Z-FPP o de productos sesquiterpénicos de la enzima SBS o de derivados del mismo contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.

La presente invención se refiere a una proteína aislada o recombinante que tiene una actividad Z,Z-FPS y una secuencia que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 2. La descripción describe también un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica codificante de dicha proteína, o una secuencia capaz de hibridar con el mismo en condiciones rigurosas.

La presente invención se refiere igualmente a una proteína aislada o recombinante que tiene una actividad de tipo SB sintasa y que tiene una secuencia que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 4. La descripción describe también un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica codificante de dicha proteína, o una secuencia capaz de hibridarse con el mismo en condiciones rigurosas.

La presente invención se refiere a un módulo de expresión que comprende un ácido nucleico heterólogo codificante de una proteína según la presente invención, a un vector que comprende un módulo de expresión o un ácido nucleico heterólogo codificante de una proteína según la invención, a una célula hospedadora que comprende un vector, un módulo de expresión o un ácido nucleico que comprende una secuencia heteróloga codificante de una proteína según la presente invención y a un organismo transgénico no humano que comprende una célula, un vector, un módulo de expresión o un ácido nucleico que comprende una secuencia heteróloga codificante de una proteína según la presente invención.

La presente invención se refiere además a un método de producción de Z,Z-difosfato de farnesilo (ZZ-FPP) o de derivados del mismo a partir de IPP y DMAP en una célula que tiene una fuente de IPP y DMAP, que comprende:

a) la introducción en dicha célula de una construcción portadora de un módulo de expresión con una secuencia nucleica que codifica una Z,Z-FPS según la presente invención;

b) el cultivo de la célula transformada en condiciones apropiadas para la expresión del gen; y

c) opcionalmente, la recogida del derivado o derivados del mismo contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.

La presente invención se refiere al uso de una proteína, un ácido nucleico, una célula hospedadora o un organismo transgénico según la presente invención para la preparación de Z,Z-FPP o sesquiterpenos de tipo SB, tales como asantaleno, epi--santaleno, cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo--bergamoteno, o de derivados de los mismos como a-santalol, epi--santalol, cis-a-bergamotol, trans-a-bergamotol y -bergamotol.

La presente invención se refiere a una célula u organismo transgénico no humano caracterizado porque la ruta de síntesis de sesquiterpenos de clase II está bloqueada por la inactivación o bien del gen que codifica una Z,Z-FPS según la presente invención o bien del gen que codifica una SB sintasa según la presente invención, o bien también de los dos genes.

La presente invención se refiere además al uso de un ácido nucleico para identificar marcadores moleculares que permitan introducir las secuencias genómicas correspondientes en otras especies o variedades de tomate cultivadas (Solanum lycopersicum). Mediante la presente invención, pueden usarse igualmente secuencias nucleotídicas de SEQ ID N°1 y N°2 o variantes de las mismas como marcadores moleculares para la introgresión de estas secuencias en otras especies o variedades de tomates cultivados.

Así, la presente invención se refiere a marcadores moleculares que comprenden todo o parte de un ácido nucleico que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 3 para identificar un polimorfismo genómico entre S. habrochaites y especies de tipo Solanum sexualmente compatibles con S. habrochaites, con el fin de introducir los genes correspondientes en estas especies. Se refiere igualmente a un método que consiste en introducir los genes zFPS y SBS en una especie no sexualmente compatible con Solanum habrochaites por fusión de protoplastos.

La descripción describe también un método de producción de Z,Z-farnesol mediante desfosforilación de Z,Z-FPP por una fosfatasa.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Estereoisómeros posibles de FPP. Todos los estereoisómeros de FPP se biosintetizan a partir de IPP y DMAPP. Hasta la fecha, solo eran conocidas E,E-difosfato de farnesilo sintasa (1), caracterizada en numerosos organismos, y Z,E-difosfato de farnesilo sintasa (2), de Mycobacterium tuberculosis (Schulbach et al., 2000). (3): Z,Zdifosfato de farnesilo sintasa de tomate según la presente invención; (4): E,Z-difosfato de farnesilo sintasa: no se ha descrito hasta la fecha ninguna enzima que tuviera esta actividad.

Figura 2: Representación esquemática de ADN-T portadores de los transgenes Sh-zFPS y Sh-SBS. Km: gen de resistencia a la kanamicina; 35S: promotor del gen 35S de CaMV. CBTS-ter: terminador del gen CBTS; eCBTS1.0: promotor de 1 kb del gen CBTS fusionado con el amplificador del promotor 35S de CaMV. Sh-zFPS: fase codificante del gen codificante de zFPS de tomate (S. habrochaites LA1777); Sh-SBS: fase codificante del gen codificante de SB sintasa de tomate (S. habrochaites LA1777); LB: borde izquierdo del ADN-T; RB: borde derecho del ADN-T; 35Ster: terminador del gen 35S de CaMV; nos-ter: terminador del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefasciens. Figura 2A: fragmento de ADN-T del vector binario pLIBRO64; Figura 2B: fragmento de ADN-T del vector binario pLIBRO65.

Figura 3: Análisis de la expresión del transgén Sh-SBS en hojas de tabaco transgénicas. Se ha medido la expresión por PCR cuantitativa instantánea usando sondas fluorescentes (®TAQ-MAN, ABI). Una de las sondas es específica del transgén Sh-SBS, mientras que la otra es específica del gen de actina de tabaco (gen de control). Los valores del eje de ordenadas representan la relación de las potencias de 2 de los valores obtenidos con la sonda de Sh-SBS frente a aquellos obtenidos con la sonda de actina (2SBS/2actina). Esta relación expresa la relación de la expresión del transgén Sh-SBS frente a la de actina. Los valores del eje de abscisas indican el número de estirpes transgénicas. Figura 3A: estirpes de tabaco transgénicas que han integrado los transgenes Sh-zFPS y Sh-SBS (pLIBRO-064). Figura 3B: Estirpes de tabaco transgénicas que han integrado únicamente el transgén Sh-SBS (pLIBRO-065).

Figura 4: Perfil de CG/EM de (Z,Z)-farnesol superpuesto al patrón de farnesoles (mezclas de isómeros). Figura 4A: El cromatograma gris (m/z: 69) corresponde al producto obtenido in vitro con la proteína recombinante Sh-zFPS6His. Se incubó Sh-FPS-6His con DMAPP e IPP. Se desfosforiló el producto difosfato de isoprenilo a un alcohol y se purificó por cromatografía en fase líquida. El pico nº 1 corresponde a Z,Z-farnesol. 1. El cromatograma negro (m/z: 69) corresponde al patrón de farnesol constituido por una mezcla de isómeros (Z,E)-, (E,Z)-y(E,E)-farnesol (Fluka). El pico nº 2 corresponde a una mezcla de (Z,E)-y (E,Z)-famesol y el pico nº 3 al (E,E)-farnesol. Figure 4B: Espectro de masas de (Z,Z)-famesol correspondiente al pico nº 1. Figura 4C: Espectro de masas de (Z,E)-y (E,Z)-farnesol (mezcla) correspondiente al pico nº 2. Figura 4D: Espectro de masas de (E,E)-farnesol, correspondiente al pico nº 3.

Figura 5: Perfil de CG/EM de los ensayos de actividades in vitro realizados con las proteínas recombinantes ShzFPS-6His y Sh-SBS-6His: Se incubaron las dos enzimas recombinantes Sh-zFPS-6His y Sh-SBS-6His junto con IPP y DMAPP. Se extrajo la mezcla de reacción con pentano y se analizó por GC-EM. Figura 5A: Cromatograma del producto obtenido in vitro de Sh-zFPS y Sh-SBS. El pico 2 es el producto mayoritario y corresponde a a-santaleno. 1, cis-a-bergamoteno; 2, a-santaleno; 3, trans-a-bergamoteno; 4, epi--santaleno; 5, endo--bergamoteno. Figura 5B: Espectro de masas correspondiente al pico nº 2 (a la izquierda) y estructura de a-santaleno (a la derecha).

Figura 6: Superposición de los perfiles de CG entre los productos obtenidos in vitro con las enzimas recombinantes Sh-zFPS-6His y Sh-SBS-6His y el exudado de la estirpe recombinante isogénica de tomate TA517. Las trazas corresponden al ión extraído de m/z 94. En gris: olefinas producidas in vitro por Sh-zFPS y Sh-KS. En negro: exudado de la estirpe isogénica TA517. 1, cis-a-bergamoteno; 2, a-santaleno; 3, trans-a-bergamoteno; 4, epi-santaleno; 5, endo--bergamoteno.

Figura 7: Perfil de CG/EM de las moléculas volátiles emitidas por una planta transgénica (nº 3877) portadora de los transgenes Sh-zFPS y Sh-SBS. La planta transgénica nº 3877 se cultivó durante 24 horas en atmósfera controlada en un recinto de cultivo. Se atraparon las moléculas volátiles emitidas por las plantas en una matriz Super® Q (Alltech) y se analizaron por CG/EM. El cromatograma (7A) muestra varios picos que tienen m/z distintivas características de sesquiterpenos de tipo SB. Se identificaron los picos por comparación de sus tiempos de retención y su espectro de masas con los de la estirpe TA517 (7B). 1, cis-a-bergamoteno 2, a-santaleno; 3, trans-abergamoteno: 4, epi--santaleno; 5, endo--bergamoteno.

Figura 8: Polimorfismo del gen zFPS entre S. lycopersicum (SI) y S. habrochaites (Sh): Se amplificó el gen completo zFPS por PCR a partir de ADN genómico de S. lycopersicum, S. habrochaites y TA517. La separación de los productos de PCR sobre gel de agarosa al 0,8% permite identificar 3 bandas A, B y C de un tamaño de aproximadamente 3000, 2500 y 2000 nucleótidos respectivamente. El producto de PCR correspondiente a la banda B es específico del genoma S.h y corresponde al gen zFPS presentado en este documento. kb: kilobases.

Abreviaturas y definiciones

ARNm: ácido ribonucleico mensajero ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ADN complementario producido por transcripción inversa a partir de ARNm CaMV: virus del mosaico de la coliflor DMAPP: difosfato de dimetilalilo CST-ol: cembratrienol CSTS: cembratrienol sintasa GPP: difosfato de geranilo FPP: difosfato de farnesilo CG: cromatografía de gases GGPP: difosfato de geranilgeranilo ihpRNAi: ARN interferente de horquilla intrónico IPP: difosfato de isopentenilo EM: espectrometría de masas PCR: “reacción en cadena de la polimerasa” RACE: "amplificación rápida de extremos de ADNc" A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V: código estándar de aminoácidos según la nomenclatura

universal www3.ncbi.nlm.nih.gov/TaxonomylUtils/wprintgc.cgi?mode=t A, C, G, T, B, D, H, K, M, N, R, S, V, W, Y: código estándar de bases según la nomenclatura universal

www3.ncbi.nlm.nih.gov/TaxonomylUtils/wprintgc.cgi?mode=t RFLP: “polimorfismo de longitud de fragmento de restricción” Se entiende por “Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa” o zFPS una enzima capaz de producir Z,Z-difosfato de farnesilo

((2Z,6Z)-difosfato de farnesilo o cis,cis-FPP), a partir de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAP). Se entiende por “actividad Z,Z-FPS” la producción de Z,Z-difosfato de farnesilo a partir de IPP y DMAPP. La actividad Z,Z-FPS puede medirse midiendo la aparición de Z,Z-difosfato de farnesilo.

Se entiende por “SB sintasa” o SBS una enzima capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos compuesta principalmente por a-santaleno, epi--santaleno, cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo--bergamoteno a partir de Z,Z-FPP. Se entiende por “actividad de tipo SB” la producción de sesquiterpenos de tipo SB a partir de Z,Zdifosfato de farnesilo. La actividad de tipo SB puede medirse midiendo la aparición de uno o varios sesquiterpenos de tipo SB. Se describe en los ejemplos un ejemplo de medida de actividad de tipo SB.

Se entiende por “sesquiterpeno de tipo SB” una mezcla de sesquiterpenos compuesta principalmente por a

santaleno, epi--santaleno, cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo--bergamoteno. “Condiciones de hibridación rigurosas”: Generalmente, se obtienen condiciones rigurosas, para un polinucleótido de tamaño y secuencia dados, trabajando a una temperatura inferior a aproximadamente 5 a 10ºC a la temperatura de fusión (Tm) del híbrido formado, en la misma mezcla de reacción, por este polinucleótido y su complementario. Las condiciones de hibridación rigurosas para un polinucleótido dado pueden identificarse por el especialista en la materia en función del tamaño y la composición en bases del polinucleótido referido, así como de la composición de la mezcla de hibridación (particularmente pH y fuerza iónica). Las condiciones de alto rigor incluyen una etapa de lavado con tampón de 0,2 x SSC a 65ºC.

Las condiciones de hibridación por rigor descritas anteriormente pueden adaptarse por el especialista en la materia para polinucleótidos de tamaño mayor o menor, según las enseñanzas apropiadas conocidas por el especialista en la materia, especialmente descritas en Sambrook et al., 1989, “Molecular cloning, A laboratory Manual”, Cold Spring Harbor; Maniatis et al., 1982, “Molecular cloning, A laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Lab. CSH, N. Y. USA, o una de sus reediciones recientes, y en Ausubel et al., Eds., 1995, “Current Protocols in Molecular Biology”, capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N. Y.).

Se entiende por “heterólogo” que el gen se ha introducido por ingeniería genética en la célula. Puede estar presente en forma episómica o cromosómica. El origen del gen puede ser diferente del de la célula en la que se introduce. Sin embargo, el gen puede proceder igualmente de la misma especie que la célula en la que se introduce, pero se considera heterólogo a causa de su entorno, que no será natural. Por ejemplo, el gen se denomina heterólogo puesto que está bajo el control de un promotor distinto que su promotor natural, se introduce en un lugar diferente de donde está situado naturalmente. La célula hospedadora puede contener una copia del gen endógeno previamente a la introducción del gen heterólogo o puede no contener una copia endógena.

Se entiende por “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos en el sentido de la presente invención designar un porcentaje de nucleótidos o de residuos aminoacídicos idénticos entre las dos secuencias para comparar, obtenido después del mejor alineamiento, siendo este porcentaje puramente estadístico y estando repartidas las diferencias entre las dos secuencias al azar sobre toda su longitud. El mejor alineamiento o alineamiento óptimo es el alineamiento para el que el porcentaje de identidad entre las dos secuencias para comparar, como se calcula a continuación, es el más elevado. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos se realizan tradicionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado de manera óptima, realizándose dicha comparación por segmento o por ventana de comparación para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede realizarse, además de manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2: 482), mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) (J. Mol. Biol. 48: 443), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444), mediante software informático que usa estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas de manera óptima por ventana de comparación, en la que la región de la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos para comparar puede comprender adiciones o deleciones con relación a la secuencia de referencia para un alineamiento óptimo entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas para las que el nucleótido o aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe por tanto por primera vez los genes codificantes de las enzimas implicadas en la ruta de síntesis de varios sesquiterpenos. En particular, la presente invención hace referencia a la caracterización de una sesquiterpeno sintasa de tomate de productos múltiples (SB sintasa) que permite la producción de una mezcla de sesquiterpenosdenominados compuestos detipo SB y compuesta principalmente por a-santaleno, epi--santaleno, cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo--bergamoteno a partir de Z,Z-FPP. Además, se refiere igualmente a la caracterización de Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa (zFPS) de tomate que permite la producción de Z,Z-FPP a partir de IPP y DMAP. Estas enzimas pueden usarse para la producción de sesquiterpenos de tipo SB o de Z,Z-FPP in vitro o in vivo en organismos transgénicos o células o microorganismos recombinantes. Se consideran los organismos transgénicos, células o microorganismos tales como bacterias, levaduras, hongos, células animales, de insectos o plantas y las plantas o animales transgénicos. Permiten igualmente la producción de compuestos derivados de Z,Z-FPP como Z,Z-farnesol. Los procedimientos de la presente invención son más particularmente aplicables a la producción de Z,Z-FPP en microorganismos (bacterias, levaduras) y de compuestos de tipo SB en plantas que poseen tricomas glandulares de tipo secretor. La producción de la mezcla de sesquiterpenos de tipo SB

o de sus derivados puede reducirse o suprimirse igualmente en las plantas, por ejemplo tomate, mediante técnicas de extinción génica o mediante mutagénesis. Además, las secuencias identificadas en la presente invención son útiles para la identificación y/o clonación de genes codificantes de enzimas que tienen las mismas actividades en otras especies de organismos, en particular de plantas. Por último, pueden identificarse marcadores moleculares polimórficos a partir de ácidos nucleicos codificantes de zFPS y SB sintasa que permitirán seguir la introducción de secuencias genómicas funcionales correspondientes en otras especies o variedades de tomate cultivadas (Solanum lycopersicum).

El Z,Z-FPP es un sustrato potencial de sesquiterpenos sintasas que no está disponible comercialmente en la actualidad. Si la mayoría de sesquiterpenos sintasas caracterizadas hasta le fecha usa E,E-FPP, resulta evidente por otro lado que la ausencia de Z,Z-FPP disponible comercialmente ha limitado en gran medida su uso con fines experimentales. La cadineno sintasa de algodón es el único ejemplo que describe el uso preferencial de Z,Z-FPP por una sesquiterpeno sintasa (Heinstein et al., 1970). En este caso el Z,Z-FPP se ha producido por síntesis química, y la Z,Z-FPP sintasa descrita en esta patente proporciona un medio de producir esta molécula de manera sencilla y poco costosa.

Por otro lado, los sesquiterpenos de tipo SB contienen a-santaleno, precursor directo él mismo dea -santalol. El asantalol es uno de los componentes característicos del aceite esencial de madera de sándalo. El aceite de madera de sándalo es extremadamente apreciado en perfumería y su coste ha aumentado en gran medida desde hace 10 años a causa de la sobreexplotación de la madera de sándalo, principalmente en la India. Esta sobreexplotación supone una amenaza sobre la viabilidad del recurso natural de la madera de sándalo. El a -santalol puede obtenerse a partir de a-santaleno mediante una sencilla hidroxilación.

La presente invención se refiere por tanto a un método de producción de sesquiterpenos de tipo SB o derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP en una célula que tiene una fuente de DMAP e IPPP, que comprende:

a) la introducción en dicha célula de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un primer gen codificante de una zFPS según la presente invención y de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un segundo gen codificante de una SB sintasa según la presente invención;

b) el cultivo de la célula transformada en condiciones apropiadas para la expresión de dichos primer y segundo genes; y

c) opcionalmente, la recogida de los sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.

En un modo de realización particular, se recogen en la etapa c) los sesquiterpenos de tipo SB producidos. En un modo de realización preferido, se seleccionan los sesquiterpenos de tipo SB producidos entre a-santaleno, epi-santaleno, a-bergamoteno, -bergamoteno y endo--bergamoteno. En otro modo de realización particular, los sesquiterpenos de tipo SB producidos son los productos de partida para obtener otros compuestos de interés como a-santalol. En un modo de realización preferido, los derivados de sesquiterpenos de tipo SB se seleccionan entre a santalol, epi--santalol, cis-a-bergamotol, trans-a-bergamotol y endo--bergamotol.

En un modo de realización particular, la presente invención se refiere a un método de producción de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP en una célula que tiene una fuente de DMAP e IPPP, que comprende:

a) el suministro de una célula recombinante que comprende un primer gen heterólogo codificante de una zFPS según la presente invención y un segundo gen heterólogo codificante de una SB sintasa según la presente invención;

b) el cultivo de la célula en condiciones apropiadas para la expresión de dichos primer y segundo genes; y

c) opcionalmente, la recogida de sesquiterpenos de tipo SB o derivados de los mismos contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.

En un modo de realización preferido, dicha célula produce Z,Z-FPP. En otro modo de realización, el Z,Z-FPP se proporciona a la célula.

En un modo de realización particular, los dos módulos de expresión están portados por una misma construcción. En otro modo de realización, los dos módulos de expresión están portados por dos construcciones distintas.

La descripción describe una proteína aislada o recombinante que tiene una actividad Z,Z-FPP sintasa. En particular, se refiere a un polipéptido aislado o recombinante que tiene una actividad Z,Z-FPP sintasa y cuya secuencia presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%,98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 2. Preferiblemente, el polipéptido presenta al menos un 95% de identidad con la SEQ ID Nº 2. En un modo de realización particular, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID Nº 2. Este polipéptido puede comprender igualmente una secuencia adicional que permita facilitar la purificación de la enzima, por ejemplo una secuencia marcadora que comprende varios aminoácidos de histidina consecutivos.

La descripción describe igualmente un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica codificante de un polipéptido que tiene una actividad Z,Z-FPP sintasa y cuya secuencia presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 2 o una secuencia capaz de hibridar con el mismo en condiciones rigurosas. Es un ejemplo de ácido nucleico el ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº 1 o una secuencia complementaria del mismo. La descripción describe un ácido nucleico aislado capaz de hibridar en condiciones de alto rigor con un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad Z,Z-FPP sintasa y presentando la secuencia de dicho polipéptido al menos un 95% o 98% de identidad con la de SEQ ID Nº

2. En un modo de realización particular, el ácido nucleico comprende o consiste en la SEQ ID Nº 1. La presente invención se refiere igualmente a un módulo de expresión, un vector, una célula hospedadora o un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico heterólogo según la presente invención.

Los ácidos nucleicos pueden ser ADN genómicos, ADN complementarios (ADNc) o ADN sintéticos. Pueden estar en forma monocatenaria o bicatenaria o una mezcla de las dos. En el marco de la presente invención, los ácidos nucleicos transcritos son preferiblemente ADNc desprovistos de intrones. Los ácidos nucleicos transcritos pueden ser moléculas sintéticas o semisintéticas, recombinantes, eventualmente amplificadas o clonadas en vectores, modificadas químicamente o comprender bases no naturales. Se trata típicamente de moléculas de ADN aisladas, sintetizadas mediante técnicas recombinantes bien conocidas en sí por el especialista en la materia.

La presente invención se refiere igualmente a un polipéptido aislado o recombinante que tiene una actividad SB sintasa y cuya secuencia presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 4. En un modo de realización particular, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia SEQ ID Nº 4. En este caso, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado o recombinante que tiene una actividad SB sintasa y cuya secuencia presenta al menos un 95% de identidad con la SEQ ID Nº 4. Este polipéptido puede comprender igualmente una secuencia adicional que permita facilitar la purificación de la enzima, por ejemplo una secuencia marcadora que comprende varios aminoácidos de histidina consecutivos.

La descripción describe igualmente un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica codificante de un polipéptido que tiene una actividad SB sintasa y cuya secuencia presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 4 o una secuencia capaz de hibridar con el mismo en condiciones rigurosas. Es un ejemplo de ácido nucleico el ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 3 o una secuencia complementaria del mismo. La descripción describe un ácido nucleico aislado capaz de hibridar en condiciones de alto rigor con un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad SB sintasa, presentando la secuencia de dicho polipéptido al menos un 95% o 98% de identidad con la SEQ ID Nº 4. En un modo de realización particular, el ácido nucleico comprende o consiste en la secuencia SEQ ID Nº 3. La presente invención se refiere igualmente a un módulo de expresión, un vector, una célula hospedadora o un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico heterólogo según la presente invención.

La presente invención se refiere muy particularmente a un vector, una célula hospedadora o un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia heteróloga codificante de un polipéptido que tiene actividad SB sintasa y cuya secuencia presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%

o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 4 y un ácido nucleico que comprende una secuencia heteróloga codificante de un polipéptido que tiene actividad Z,Z-FPP sintasa y cuya secuencia presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 2. En un modo de realización particular, el organismo transgénico es una planta, y en particular una planta con tricomas.

La presente invención se refiere igualmente a un vector, una célula hospedadora o un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia heteróloga codificante de un polipéptido que tiene una actividad SB sintasa y cuya secuencia presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 4.

La presente invención se refiere además a un vector, una célula hospedadora o un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia heteróloga codificante de un polipéptido que tiene una actividad Z,Z-FPP sintasa, preferiblemente cuya secuencia presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 2.

La descripción describe un método de producción de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos a partir de IPP y DMAP, que comprende la puesta en contacto de IPP y DMAP con una Z,Z-FPP sintasa recombinante o purificada que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 3 y una SB sintasa recombinante o purificada que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 4 en las condiciones apropiadas y la recogida de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos obtenidos. La invención se refiere al uso de una Z,Z-FPP sintasa recombinante o purificada que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 2 y una SB sintasa recombinante o purificada que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 4 para la preparación de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB

: o de derivados de los mismos a partir de IPP y DMAP.

La descripción describe un método de producción de Z,Z-FPP o de derivados de los mismos a partir de IPP y DMAP, que comprende la puesta en contacto de IPP y DMAP con una Z,Z-FPP sintasa recombinante o purificada que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 2 en las condiciones apropiadas y la recogida del Z,Z-FPP o de derivados del mismo obtenidos. Opcionalmente, el método comprende además la incubación del Z,Z-FPP obtenido con una fosfatasa alcalina de intestino de ternero y la recogida del Z,Zfarnesol. La presente invención se refiere al uso de una Z,Z-FPP sintasa recombinante o purificada que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 2 para la preparación de Z,Z-FPP

: o de derivados del mismo a partir de IPP y DMAP.

La descripción describe un método de producción de una mezcla de sesquiterpenos de clase II o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP, que comprende la puesta en contacto de Z,Z-FPP con una SB sintasa recombinante o purificada que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 4 en las condiciones apropiadas y la recogida de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos obtenidos.

La invención se refiere al uso de una SB sintasa recombinante o purificada que presenta al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la SEQ ID Nº 4 para la preparación de una mezcla de sesquiterpenos de clase II o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP.

De manera general, un módulo de expresión comprende todos los elementos necesarios para la transcripción y traducción del gen en una proteína. Especialmente, comprende un promotor, eventualmente un amplificador, un terminador de la transcripción y elementos que permiten la traducción.

El promotor está adaptado a la célula hospedadora. Por ejemplo, si la célula es procariota, el promotor puede seleccionarse entre los promotores siguientes: Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, los promotores de ARN polimerasa de bacteriófago T3 o T7, el promotor de poliedrina y el promotor PR o PL del fago lambda. Si la célula es eucariota o animal, el promotor puede seleccionarse entre los promotores siguientes: promotor temprano de citomegalovirus (CMV), promotor de timidina cinasa del herpesvirus simple (herpesvirus simple, HSV), el promotor temprano o tardío del virus de simio 40 (SV40), el promotor de metalotioneína L de ratón, y las regiones LTR (repetición terminal larga) de ciertos retrovirus. De manera general, para la elección de un promotor adaptado, el especialista en la materia podrá referirse ventajosamente a la obra de Sambrook y Russell (2000) o también a las técnicas descritas en la obra de Ausubel et al. (2006).

El vector puede ser un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un virus, un YAC, un BAC, un plásmido pTi de Agrobacterium, etc. El vector puede comprender preferiblemente uno o varios elementos seleccionados entre un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador. El marcador puede ser un gen informador que genera una señal detectable. La señal detectable puede ser una señal fluorescente, una coloración o una emisión de luz. El marcador podrá ser por tanto GFP, EGFP, DsRed, -galactosidasa, -glucosidasa, luciferasa, etc. El marcador es preferiblemente un marcador de selección que confiere a la célula resistencia a un antibiótico o un herbicida. Por ejemplo, el gen puede ser un gen de resistencia a kanamicina, neomicina, etc. En un modo de realización preferido, el vector es un plásmido. Figuran ejemplos de vectores procarióticos en la lista siguiente, que no es exhaustiva: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322 y pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen) y pQE-30 (QIAGEN). Figuran ejemplos de vectores eucarióticos en la lista siguiente, que no es exhaustiva: pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia). Los vectores víricos pueden ser de manera no exhaustiva adenovirus, AAV, HSV, lentivirus, etc. Preferiblemente, el vector de expresión es un plásmido o un vector vírico.

La célula hospedadora puede ser un procariota, por ejemplo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp. y Pseudomonas sp. o un eucariota. El eucariota puede ser un eucariota inferior como una levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) o u hongo filamentoso (por ejemplo, del género Aspergillus) o un eucariota superior como una célula de insecto, de mamífero o de planta. La célula puede ser una célula de mamífero, por ejemplo una célula COS o CHO (documentos US 4.889.803; US 5.047.335). En un modo de realización particular, la célula no es humana y no es embrionaria. La célula puede aislarse, por ejemplo, en un medio de cultivo. Las células pueden estar comprendidas igualmente en organismos, por ejemplo animales transgénicos no humanos o plantas transgénicas.

La presente invención se refiere por tanto a un método de producción de Z,Z-FPP o de derivados del mismo a partir de IPP y DMAP en una célula que tiene una fuente de IPP y DMAP, que comprende:

a) la introducción en dicha célula de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un gen codificante de una Z,Z-FPP sintasa según la presente invención;

c) opcionalmente, la recogida del Z,Z-FPP o de derivados del mismo contenidos en dicha células y/o en el medio de cultivo.

En un modo de realización particular, se recoge el Z,Z-FPP producido en la etapa c). En otro modo de realización particular, el Z,Z-FPP producido es el producto de partida para obtener otro compuesto de interés como Z,Z-farnesol. Por ejemplo, el Z,Z-FPP puede transformarse en Z,Z-farnesol por una fosfatasa. Así, el método puede comprender además de la etapa a) la introducción de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un gen codificante de una fosfatasa, permitiendo así la recogida de Z,Z-farnesol en la etapa c). La descripción describe por tanto un método de producción de Z,Z-FPP o de derivados del mismo a partir de IPP y DMAP en una célula recombinante que tiene una fuente de IPP y DMAP y que comprende un gen heterólogo codificante de una Z,Z-FPP sintasa según la presente descripción. La presente invención se refiere así a un método de producción de Z,Z-FPP en una célula recombinante que tiene una fuente de DMAP e IPPP, que comprende:

a) el suministro de una célula recombinante que comprende un gen heterólogo codificante de una zFPS según la presente invención;

b) el cultivo de la célula en condiciones apropiadas para la expresión de dicho gen; y

c) opcionalmente, la recogida de Z,Z-FPP o de derivados del mismo contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.

La descripción describe por tanto un método de producción de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP en una célula que tiene una fuente de Z,Z-FPP, que comprende:

a) la introducción en dicha célula de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un gen codificante de una SB sintasa según la presente descripción;

c) opcionalmente, la recogida de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.

En un modo de realización particular, la mezcla de sesquiterpenos de tipo SB producida se recoge en la etapa c). En otro modo de realización particular, la mezcla de sesquiterpenos de tipo SB producida es el producto de partida para obtener otros compuestos de interés como a-santalol. La descripción descrita se refiere por tanto a un método de producción de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP en una célula recombinante que tiene una fuente de Z,Z-FPP y que comprende un gen heterólogo codificante de una SB sintasa según la presente descripción. La presente invención se refiere así a un método de producción de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP en una célula recombinante que tiene una fuente de Z,Z-FPP, que comprende:

a) el suministro de una célula recombinante que comprende un gen heterólogo codificante de una SB sintasa según la presente invención;

c) opcionalmente, la recogida de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos contenidos en dicha célula y/o el medio de cultivo.

La célula puede ser igualmente parte de un organismo multicelular, por ejemplo una planta o un animal no humano. En este caso, la descripción describe un método de preparación de un organismo multicelular que comprende:

a) la introducción en una célula del organismo de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un primer gen codificante de una Z,Z-FPP sintasa según la presente descripción y de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un segundo gen codificante de una SB sintasa según la presente descripción; y

b) la reconstitución de un organismo a partir de dicha célula y la selección de organismos transgénicos que expresan los dos genes introducidos.

En un modo de realización, el organismo es un animal no humano. Por ejemplo, el organismo puede ser un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, etc. En otro modo de realización preferido, el organismo es una planta, preferiblemente una planta con tricomas glandulares.

La descripción describe por tanto un método de producción de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB que comprende el suministro de un organismo multicelular transgénico que expresa una Z,Z-FPP sintasa según la presente descripción y una SB sintasa según la presente descripción, y la recogida de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB producidos o de derivados de los mismos en dichos organismos transgénicos.

El método permite producir una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB a organismos que no producen estos compuestos o aumentar la cantidad de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB producidos por organismos que ya los producen.

La descripción describe un método de preparación de un organismo multicelular que comprende:

a) la introducción en una célula del organismo de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un gen codificante de una Z,Z-FPP sintasa según la presente descripción; y

b) la reconstitución de un organismo a partir de dicha célula y la selección de organismos transgénicos que expresan el gen introducido.

La presente invención se refiere igualmente a un método de producción de Z,Z-FPP o de derivados del mismo que comprende el suministro de un organismo multicelular transgénico que expresa una Z,Z-FPP sintasa según la presente descripción y la recogida del Z,Z-FPP producido o de derivados del mismo en dichos organismos transgénicos.

En un modo de realización, el organismo es un animal no humano. Por ejemplo, el organismo puede ser un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, etc. En otro modo de realización preferido, el organismo es una planta, preferiblemente una planta con tricomas glandulares. El método permite producir Z,Z-FPP a organismos que no producen este compuesto o aumentar la cantidad de Z,Z-FPP producido por los organismos.

a) la introducción en una célula del organismo de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un gen codificante de una SB sintasa según la presente descripción; y

La descripción describe un método de producción de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos que comprende el suministro de un organismo multicelular transgénico que expresa una SB sintasa según la presente descripción y la recogida de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB producidos o de derivados de los mismos en dichos organismos transgénicos.

En un modo de realización, el organismo es un animal no humano. Por ejemplo, el organismo puede ser un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, etc. En otro modo de realización preferido, el organismo es una planta, preferiblemente una planta con tricomas secretores. El método permite producir una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB a organismos que no producen este compuesto o aumentar la cantidad de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB producidos por los organismos.

La invención es aplicable especialmente a todas las plantas de las familias que poseen tricomas glandulares, por ejemplo asteráceas (girasol, etc.), solanáceas (tomate, tabaco, patata, pimiento, berenjena, etc.), cannabáceas (Ej. Cannabis sativa) y lamiáceas (menta, albahaca, lavanda, tomillo, etc.). Está particularmente adaptada a plantas de la familia de las solanáceas, tales como por ejemplo de los géneros Nicotiana, Solanum, Capsicum, Petunia, Datura, Atropa, etc., y en particular de los géneros Solanum y Nicotiana como por ejemplo el tomate cultivado (Solanum lycopersicum), el tomate silvestre (Solanum habrochaites), el tabaco cultivado (Nicotiana tabacum) y el tabaco silvestre (Nicotiana sylvestris). De manera no limitante, la invención puede aplicarse a plantas de los géneros siguientes: Populus, Nicotiana, Cannabis, Pharbitis, Apteria, Psychotria, Mercurialis, Chrysanthemum, Polypodium, Pelargonium, Mimulus, Matricaria, Monarda, Solanum, Achillea, Valeriana, Ocimum, Medicago, Aesculus, Plumbago, Pityrogramma, Phacelia, Avicennia, Tamarix, Frankenia, Limonium, Foeniculum, Thymus, Salvia, Kadsura, Beyeria, Humulus, Mentha, Artemisia, Nepta, Geraea, Pogostemon, Majorana, Cleome, Cnicus, Parthenium, Ricinocarpos, Hymennaea, Larrea, Primula, Phacelia, Dryopteris, Plectranthus, Cypripedium, Petunia, Datura, Mucuna, Ricinus, Hypericum, Myoporum, Acacia, Diplopeltis, Dodonaea, Halgania, Cyanostegia, Prostanthera, Anthocercis, Olearia y Viscaria. Preferiblemente, la planta es una planta de la familia de las asteráceas, cannabáceas, solanáceas o lamiáceas. En un modo de realización aún más preferido, la planta pertenece a los géneros Solanum o Nicotiana, preferiblemente Solanum esculentum, Solanum habrochaites, Nicotiana tabacum o Nicotiana sylvestris.

En este modo de realización, los genes se disponen bajo el control de un promotor que permita una expresión, preferiblemente específica, de los tricomas de la planta. Dichos promotores existen y son conocidos por el especialista en la materia (Tissier et al., 2004).

En el sentido de la invención, se entiende por promotor “específico” un promotor principalmente activo en un tejido o un grupo celular dado. Se entiende que no puede excluirse completamente una expresión residual, generalmente más débil, en otros tejidos o células. Una característica particular de la invención reside en la capacidad de construir promotores específicos de las células secretoras de tricomas glandulares que permitan una modificación de las secreciones foliares de la planta, y especialmente expresar los genes de la presente invención que permiten preparar la mezcla de sesquiterpenos de tipo SB. Así, el Z,Z-FPP y la mezcla de sesquiterpenos de tipo SB o derivados de los mismos pueden recogerse a la altura de los tricomas de estas plantas, en particular en el exudado de los tricomas mediante extracción con un disolvente o también por destilación.

Por ejemplo, se ha mostrado que una secuencia reguladora de 1852 pb, situada en dirección 5’ del ATG del gen CYP71D16, permite dirigir la expresión del gen informador uidA específicamente a células secretoras de tricomas de tabaco (solicitud US2003/0100050 A1, Wagner et al., 2003). Por otro lado, se han identificado varias secuencias promotoras extraídas de diferentes especies por ser capaces de dirigir la expresión de un gen heterólogo en tricomas de tabaco.

Abreviatura del gen: Nombre del gen Plantas Referencias

LTP3: Algodón Liu et al., 2000, BBA, 1487:106111

LTP6: Algodón Hsu et al., 1999, Plant science, 143: 6370

wax9D: Proteína de transferencia de lípidos B. oleracea Pyee y Kolattukudy, 1995, Plant J. 7:4559

LTP1: Arabidopsis Thoma et al., 1994, Plant Physiol. 105, 3545

CYC71D16: CBTol hidroxilasa Tabaco Wang et al., 2002, J.of Exp. Bot. 1891-1897

En un modo de realización preferido de la presente invención, el promotor utilizado en el módulo deriva de los genes NsTPS-02a, 02b, 03 y 04 de la especie Nicotiana sylvestris que poseen una alta similitud de secuencia con CYC-2 (CBT-ol ciclasa; NID: AF401234). Estas secuencias promotoras se describen más ampliamente en la solicitud de

5 patente W02006040479 (Tissier et al., 2004).

Entre las secuencias terminadoras preferidas, se puede citar el terminador NOS (Bevan et al., 1983) y el terminador del gen de histona (EPO 633.317).

En un modo de realización particular, el módulo de expresión puede comprender una secuencia que permita aumentar la expresión (“amplificadora”), por ejemplo ciertos elementos del promotor CaMV35S y genes de octopina

10 sintasa (documento US 5.290.924). Preferiblemente, se usan los elementos activadores del promotor CaMV35S.

La introducción de construcciones portadoras de uno o los dos genes de la invención en una célula o un tejido vegetal, incluyendo un grano o planta, puede realizarse mediante cualquier técnica conocida por el especialista en la materia, incluyendo en forma episómica o cromosómica. Las técnicas de transgénesis vegetal son bien conocidas en el campo, y comprenden por ejemplo el uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la electroporación, técnicas

15 biolísticas, la transfección por vector vírico especialmente y cualquier otra técnica conocida por el especialista en la materia.

Una técnica usada comúnmente se basa en el uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que consiste esencialmente en introducir la construcción de interés (ácido nucleico, módulo, vector, etc.) en la bacteria A. tumefaciens, y poner en contacto después esta bacteria transformada con discos de hojas de la planta elegida. La 20 introducción del módulo de expresión en la bacteria se realiza típicamente usando como vector el plásmido Ti (o ADN-T), que puede transferirse a la bacteria, por ejemplo, por choque térmico o por electroporación. La incubación de la bacteria transformada con los discos foliares permite obtener la transferencia del plásmido Ti al genoma de las células de los discos. Estos pueden cultivarse eventualmente en condiciones apropiadas para reconstituir una planta transgénica cuyas células comprendan la construcción de la invención. Para más detalles o variantes de ejecución

25 de la técnica de transformación por A. tumefaciens, se puede acudir, por ejemplo, a Horsch et al. (1985) o Hooykaas y Schilperoort (1992).

Así, en un modo de realización particular, el módulo de expresión así constituido se inserta entre los bordes izquierdo y derecho del ADN de transferencia (ADN-T) de un plásmido Ti desactivado para transferencia en células vegetales por Agrobacterium tumefaciens. El ADN-T comprende igualmente un gen cuya expresión confiere

30 resistencia a un antibiótico o herbicida y que permite la selección de los transformantes.

Una vez regeneradas, puede ensayarse en las plantas transgénicas la expresión heteróloga de los genes de la presente invención o la producción de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB, de Z,Z-FPP o de Z,Z-farnesol en los tricomas. Esto puede realizarse recogiendo el exudado de las hojas y ensayando la presencia del producto de interés en este exudado. El análisis de los productos volátiles emitidos por la planta puede permitir igualmente

35 identificar dichos compuestos. Esto puede hacerse igualmente analizando la presencia de una o de las enzimas heterólogas de la presente invención en las hojas y, más particularmente, en las células de tricoma (por ejemplo, analizando los ARNm o el ADN genómico mediante sondas o cebadores específicos). Las plantas pueden eventualmente seleccionarse, cruzarse, tratarse, etc. para obtener plantas que presenten niveles de expresión mejorados.

40 Otro objeto de la invención reside igualmente en una planta o grano que comprende un ácido nucleico, un módulo de expresión o un vector tales como se definen anteriormente.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de un ácido nucleico de la presente invención como marcador molecular para permitir introducir las secuencias genómicas correspondientes de S. habrochaites en otras especies o variedades de tomate cultivado (S. lycopersicum) sexualmente compatibles. Efectivamente, estos marcadores 45 permiten controlar la introducción de secuencias genómicas correspondientes a S. habrochaites en otras especies o variedades de tomate cultivado (S. lycopersicum) sexualmente compatibles y así, por ejemplo, identificar y seleccionar los individuos procedentes de un cruzamiento entre la especie silvestre y una especie cultivada en los

que haya tenido lugar la introgresión de los ácidos nucleicos de la presente invención. El uso de ácidos nucleicos de la presente invención como marcadores moleculares puede realizarse mediante cualquier técnica conocida por el especialista en la materia. Por ejemplo, una técnica comúnmente usada se basa en la identificación de un polimorfismo de banda (RFLP) entre dos genomas digeridos por diferentes enzimas de restricción mediante hibridación molecular con los ácidos nucleicos de la presente invención. Otro ejemplo consiste en buscar un polimorfismo usando la técnica de PCR para amplificar en los genomas para comparar todo o parte de un ácido nucleico de la presente invención a partir de cebadores complementarios del ácido nucleico de la presente invención, para identificar después de amplificación por PCR un polimorfismo de tamaño entre los dos genomas. El polimorfismo puede revelarse igualmente después de la digestión de dichos productos de PCR por una o las enzimas de restricción, que harán aparecer fragmentos de tamaño diferente entre los genomas comparados.

Una vez identificado el polimorfismo, se usa esta información, por ejemplo, para identificar los individuos de una población F2 procedentes de un cruzamiento entre S. habrochaites y una variedad de tomate en la que se desea la introgresión de los ácidos nucleicos de la presente invención.

Otro objeto de la invención se refiere a la introducción de secuencias genómicas de S. habrochaites codificantes de zFPS y SB sintasa en especies no compatibles sexualmente mediante fusión de células, especialmente de protoplastos. Las técnicas de fusión de protoplastos son conocidas por el especialista en la materia (Zimmermann et al., 1981, Bates et al., 1983), y permiten crear células híbridas que contienen cromosomas pertenecientes a las dos especies fusionadas. Durante la fusión, se eliminan cromosomas o fragmentos de cromosomas de las dos especies. Las células híbridas que han conservado el o los fragmentos cromosómicos que contienen los genes de la presente invención pueden seleccionarse entonces por PCR usando cebadores específicos del gen codificante de zFPS (SEQ ID N°1) o del codificante de SB sintasa (SEQ ID N°2) o de los dos a la vez.

La presente invención se refiere por último a una célula u organismo transgénico no humano caracterizado porque la ruta de síntesis de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB está bloqueada por la inactivación del gen codificante de una Z,Z-FPP sintasa según la presente invención o del gen codificante de una SB sintasa según la presente invención o de los dos genes. La expresión de estos genes puede bloquearse por numerosas técnicas disponibles y conocidas para el especialista en la materia. Los genes pueden eliminarse, mutarse (por ejemplo, por mutagénesis química por metanosulfonato de etilo o por radiación ionizante) o interrumpirse (mutagénesis de inserción). Por otro lado, el bloqueo de la expresión de estos genes puede realizarse igualmente mediante la extinción de los genes que expresan un transcrito inhibidor. El transcrito inhibidor es un ARN que puede presentarse en forma de un ARN bicatenario, de un ARN anticodificante, de una ribozima, de un ARN capaz de formar una triple hélice, y que tiene una cierta complementariedad o especificidad con el transcrito del gen para bloquear.

La descripción describe igualmente un ácido nucleico capaz de reducir o suprimir la expresión de un gen codificante de una Z,Z-FPP sintasa. Efectivamente, puede prepararse basándose en las enseñanzas de la presente invención un ARN inhibidor que puede presentarse en forma de un ARN bicatenario, un ARN anticodificante, una ribozima, un ARN capaz de formar una triple hélice, y que tiene una cierta complementariedad o especificidad con el gen codificante de Z,Z-FPP sintasa. Así, la descripción describe un ARN inhibidor del gen codificante de una Z,Z-FPP sintasa que comprende al menos 21, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID Nº 1 o de una secuencia complementaria de la misma. De la misma manera, describe el uso de un polinucleótido que comprende al menos 21, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID Nº 1 o de una secuencia complementaria de la misma para inhibir la expresión del gen codificante de una Z,Z-FPP sintasa. La inhibición de esta enzima puede ser útil para detener o retardar la ruta de síntesis de la mezcla de sesquiterpenos de tipo SB y poner a IPP y DMAP a disposición para otra ruta de síntesis de interés que necesite un aporte de Z,Z-FPP. Por ejemplo, la inhibición de esta enzima puede permitir aumentar el índice de producción de germacreno B por las células glandulares de tricomas de hojas de tomate. La presente invención se refiere por tanto a células u organismos transgénicos en los que se ha inactivado el gen codificante de una Z,Z-FPP sintasa. La inactivación puede efectuarse mediante técnicas de ARN interferente, de deleción génica, de mutación química o de inactivación por recombinación homóloga. Así el índice de Z,Z-FPP o de mezcla de sesquiterpenos de tipo SB puede reducirse en estas células u organismos transgénicos.

Además, la descripción describe igualmente un ácido nucleico capaz de reducir o suprimir la expresión de un gen codificante de una SB sintasa. Efectivamente, puede prepararse basándose en las enseñanzas de la presente invención un ARN inhibidor que puede presentarse en forma de un ARN bicatenario, un ARN anticodificante, una ribozima o un ARN capaz de formar una triple hélice, y que tiene una cierta complementariedad o especificidad con el gen codificante de una SB sintasa. Así, la descripción describe un ARN inhibidor del gen codificante de una SB sintasa que comprende al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID Nº 3. De la misma manera, se refiere al uso de un polinucleótido que comprende al menos 21, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID Nº 3 para inhibir la expresión del gen codificante de una SB sintasa. La inhibición de esta enzima puede ser útil para detener la ruta de síntesis de una mezcla de sesquiterpenos de tipo SB y poner el Z,Z-FPP a disposición para otra ruta de síntesis de interés que necesite un aporte de este compuesto, por ejemplo para preparar derivados de Z,Z-FPP, por ejemplo Z,Z-farnesol, u otros sesquiterpenos que son el producto de sintasas que usan Z,Z-FPP como sustrato.

La presente invención se refiere por tanto a células u organismos transgénicos en los que está inactivado el gen codificante de una SB sintasa. La inactivación puede efectuarse mediante las técnicas de ARN interferente, deleción génica, mutación química o inactivación por recombinación homóloga. Así, el índice de mezcla de sesquiterpenos de tipo SB puede reducirse en las células u organismos transgénicos.

5 La descripción describe igualmente un método de identificación o clonación de otros genes codificantes de una Z,Z-FPP sintasa o una SB sintasa procedentes de otra especie en la que se prepara una sonda que presenta al menos 15, 30, 50, 75, 100, 200 o 300 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID Nº 1 o 3, respectivamente, y se usa para identificar o seleccionar en una muestra una secuencia nucleotídica capaz de hibridar con dicha sonda. La muestra puede ser, por ejemplo, un banco genómico o de ADNc procedente de uno o varios organismos. El método

10 puede comprender una etapa suplementaria de caracterización de la secuencia identificada o seleccionada. Esta etapa suplementaria puede comprender la clonación y/o secuenciación y/o alineamiento de secuencia y/o un ensayo de actividad enzimática.

Aparecerán otros aspectos y ventajas de la presente invención tras la lectura de los ejemplos siguientes, que deben considerarse como ilustrativos y no limitantes.

15 Ejemplos

Síntesis de ADNc de hojas de tomate (S. habrochaites)

Se extrajeron ARNm a partir de hojas de tomate (Solanum habrochaites = L. Hirsutum LAI777) usando un kit de extracción de ARN totales (RNeasy minikit, Qiagen). Se sintetizaron los ADNc correspondientes mediante transcripción inversa a partir de un cebador de poliT usando una transcriptasa inversa (Roche, nº de cat. 03.531.317)

20 en las condiciones de reacción recomendadas por el fabricante.

Clonación de las secuencias codificantes de Z,Z-FPP sintasa (Sh-zFPS) y SB sintasa (Sh-SBS) de tomate Solanum habrochaites.

Se clonaron las secuencias nucleotídicas codificantes y completas de los dos genes Sh-zFPS y Sh-SBS a partir de las informaciones públicas de secuencias del banco de EST de tricomas de hojas de tomate de S. habrochaites (Van

25 der Hoeven, et al., 2000, no publicado) obtenido en el sitio de SGN (“SOL Genomics Network”, http://www.sgn.comell.edu/).

Se obtuvieron las secuencias de Sh-zFPS (SEQ ID N° 1) y Sh-SBS (SEQ ID N°3) por PCR a partir de los ADNc de hojas de tomate usando los cebadores 5'-ACCATGGGTTCTTTGGTTCTTCAATGTTGGA-3' (SEQ ID Nº 5) y 5'-ACTCGAGATATGTGTGTCCACCAAAACGTCTATG-3' (SEQ ID Nº 6) para SEQ ID N° 1 y los cebadores 5'30 TCCATGGTAGTTGGCTATAGAAGCACAATCA-3' (SEQ ID Nº 7) y 5'-TCTCGAGCATAAATTCAAATTGAGGGATTAATGA-3' (SEQ ID Nº 8) para la SEQ ID Nº 3. Se añadieron sitios de enzimas de restricción (NcoI y XhoI) al extremo 5’ de los cebadores para facilitar la clonación del ADNc en dirección 3’ de un promotor. La amplificación por PCR se realizó con 0,5 unidades de polimerasa Taq (Eurogentec) en tampón proporcionado por el fabricante. Se purificó el producto de PCR en una columna Qiaquick (Qiagen) y se clonó por

35 ligamiento con una ADN ligasa de T4 (NEB) en el vector de clonación pGEM-T (Promega). Se seleccionaron los clones correspondientes a la secuencia esperada después de la secuenciación completa de los insertos.

La secuencia nucleotídica de Sh-zFPS (SEQ ID N° 1) tiene una longitud de 912 bases y codifica una proteína (SEQ ID N° 2) de 303 aminoácidos. Se identificó un dominio proteico conservado de tipo cis-(Z)-difosfato de isoprenilo sintasas (cis-IPPS) o igualmente denominado undecaprenilo sintasa (UPPS) por simulación informática con el 40 sistema CCD (NCBI, Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004). Se buscaron las secuencias aminoacídicas similares a Sh-zFPS en el banco de proteínas SwissProt y GenBank usando el programa BlastP (Altschul et al., 1997). Se obtuvieron los mejores porcentajes de identidad con secuencias de plantas que tienen homología con las difosfato de undecaprenilo sintasas, pero cuyas funciones no se han demostrado (Tab. 1). Por ejemplo, Sh-zFPS posee un porcentaje de identidad de un 42% y de un 39% con las presuntas UPPS de Arabidopis thaliana BAA97345 y

45 AA063349 respectivamente. Puede observarse igualmente que la secuencia de Sh-zFPS posee un grado de identidad muy bajo (24%) con la Z,E-FPS de Micrococcus tuberculosis (O53434).

Organismo PID Función % de identidad

Arabidopsis thaliana BAA97345 Presunta UPPS

Arabidopsis thaliana AAO63349 Presunta UPPS

Arabidopsis thaliana AAO42764 Presunta UPPS

Anabaena sp. PCC 7120 DP58563 Presunta UPPS 37

Oryza sativa NP_915561 Presunta UPPS

Synechococcus elongatus Q8DI29 Presunta UPPS

Organismo PID Función % de identidad

Micrococcus luteus O82827 Presunta UPPS 34

Gloeobacer violaceus Q7NPE7 Presunta UPPS

Micrococcus tuberculosis P60479 UPPS 30

Micrococcus tuberculosis O53434 E,Z-FPS

Tabla 1: Secuencias que presentan el mejor porcentaje de identidad (% de identidad) obtenido por investigación de la homología con el programa BlastP 2.2.13 (Altschul et al., 1997) frente a los bancos SwissProt y GenBank con la secuencia de Sh-zFPS.

La secuencia nucleotídica de Sh-SBS (SEQ ID N°3) tiene una longitud de 2334 bases y codifica una proteína (SEQ

5 ID N°4) de 777 aminoácidos. Se identificó un dominio proteico conservado de terpeno ciclasa (cd00684.2) por simulación informática con el sistema CCD (NCBI, Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004). Se han buscado secuencias aminoacídicas similares a Sh-SBS en el banco de proteínas SwissProt y GenBank usando el programa BlastP (Altschul et al., 1997). A excepción de una secuencia de tabaco de función desconocida (60% de identidad), se obtuvieron las mejores homologías con diterpenos sintasas de plantas (Tab. 2), con un porcentaje de identidad de

10 aproximadamente 40 a 45%, con secuencias codificantes de caureno sintasas de diferentes plantas (Arabidopsis thaliana, Cucurbita maxima, Stevia rebaudiana, Oryza sativa). Sh-SBS posee igualmente homologías más débiles (de 26 a 33% de identidad) con terpenos sintasas de función conocida como abietadina sintasa y taxadieno sintasa y a-bisaboleno sintasa.

Organismo PID Función % de identidad

Nicotiana tabacum AAS98912 Presunta terpeno sintasa 60

Arabidopsis thaliana AAC39443 Caureno sintasa 44

Lactuca sativa BAB12441 Presunta caureno sintasa 43

Cucurbita maxima Q39548 Caureno sintasa 43

Medicago troncatula ABE87878 Presunta terpeno sintasa 43

Stevia rebaudiana AAD34294 Caureno sintasa 42

Oryza sativa AAQ72559 Caureno sintasa 41

Hordeum vulgare AAT49066 Caureno sintasa 36

Abies grandis AAC24192 a-Bisaboleno sintasa 33

Abies grandis AAB0S407 Abietadina sintasa 27

Taxus baccata 2211347A Taxadieno sintasa 26

Tabla 2: Secuencias que presentan el mejor porcentaje de identidad (% de identidad) obtenido por investigación de 15 la homología con el programa BlastP 2.2.13 (Altschul et al., 1997) frente a los bancos SwissProt y GenBank con la secuencia de Sh-SBS.

Producción de las proteínas recombinantes Sh-zFPS y Sh-SBS

Se introdujeron las secuencias nucleicas codificantes de Sh-zFPS y Sh-SBS (SEQ ID N° 1 y 3, respectivamente) separadamente en el vector de expresión pET-30b (Novagen). Para permitir la purificación de las proteínas 20 recombinantes, se suprimieron los codones de terminación de estas secuencias con el fin de crear una proteína de fusión con una cola de 6 histidina en el extremo C-terminal. Se introdujeron los vectores Sh-zFPS-pET30b y ShSBS-pET30b así obtenidos por electroporación en células de Escherichia coli modificadas para la expresión de proteínas recombinantes (BL21-CodonPlus, Stratagene). Para la producción de proteínas, se inician los cultivos (500 ml) de E. coli a 37ºC hasta una densidad óptica de 0,5 a 600 nm. En esta etapa, se reduce la temperatura de cultivo 25 a 16ºC y se añade etanol (1%, v/v) a los medios. Después de 1 hora de incubación, se añade IPTG al medio a una concentración 1 mM para inducir la expresión de la proteína recombinante. Se incuba entonces el cultivo durante un periodo de 18 horas. Se detiene el cultivo por centrifugación de las células a 4ºC. Se retoma el sedimento celular en un tampón fosfato 200 mM. Se lisan las células con prensa de French (LP = 1,9 MPa). Se centrifugan los lisados a

15.000 x g. Se desalan los sobrenadantes que contienen las proteínas solubles en columna PD10 (Amersham), se

30 equilibran con un tampón fosfato (pH 7, 50 mM), y se aplican después a una resina de afinidad de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA, Qiagen). Se sigue estrictamente el protocolo de elución del fabricante. Se identifican las fracciones más enriquecidas en proteínas Sh-zFPS-6His y Sh-SBS-6His por PAGE-SDS en gel, se desalan después en PD10 y se equilibran con un tampón (Hepes 50 mM, pH 7,8, KCl 100 mM). Se obtuvo un factor de enriquecimiento de aproximadamente 20 para las dos proteínas con relación a la fracción proteica bruta.

Ensayo de actividad enzimática in vitro de las proteínas recombinantes Sh-zFPS y Sh-SBS

Se realizan los ensayos de actividad en un tampón que tiene la composición siguiente: Hepes 50 mM, pH 7,8, KCl 100 mM, MgCl2 7,5 mM, glicerol al 5% (p/v) y DTT 5 mM. Para los ensayos de actividad, se incubaron 25 o 50 µg de proteínas procedentes de la fracción enriquecida con los sustratos IPP, DMAPP, GPP, FPP, GGPP (Sigma), solos o

5 en combinación, a una concentración de 65 µm cada uno a 32ºC durante 2 horas.

Para los ensayos realizados con Sh-zFPS-6His, se desfosforilan a continuación los productos de reacción por la adición de 20 unidades de fosfatasa alcalina de intestino de ternero (New England Biolabs) durante 1 hora a 37ºC. Se extraen a continuación los alcoholes terpénicos, productos de la desfosforilación, mediante una mezcla de cloroformo:metanol:agua (0,5:1:0,4). Se separan las fases acuosas y orgánicas mediante la adición de agua (0,5 vol)

10 y cloroformo (0,5 vol) y se centrifugan (2.000 x g). Se retiran las fases orgánicas y se secan bajo corriente de nitrógeno gaseoso, se retoman en pentano y se analizan por cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas (CG-EM 5973N, Agilent Technologies). Se identifican los alcoholes terpénicos por comparación de su espectro de masas con los de la base de datos del “National Institute of Standards and Technology” (NIST) y por superposición de los tiempos de retención con los patrones de geraniol, farnesol y geranilgeraniol (Fluka).

15 Para los ensayos realizados con Sh-SBS-6His, se extraen directamente los terpenos producidos en la reacción (en 3 tomas) de las mezclas de reacción con pentano (volumen a volumen). Se reúnen los 3 extractos de pentano, se concentran bajo corriente de nitrógeno gaseoso y se analizan por CG-EM. Se identifican los productos terpénicos mediante examen de la base de datos del NIST y comparación con un cromatograma extraído del exudado de Solanum habrochaites.

20 Se incubó la proteína recombinante Sh-zFPS-6His con los sustratos IPP+DMAPP o IPP+GPP (véase la tabla 1). Solo la primera combinación (IPP+DMAPP) conduce, después de desfosforilación, a la formación de un alcohol terpénico único de 15 átomos de carbono (C15), cuyo espectro de masas permite identificarlo como un farnesol en comparación con el espectro estándar presente en la base de datos del NIST (Figure 4). Se comparó el tiempo de retención con el de un patrón de farnesol que contenía una mezcla de los 4 isómeros de farnesol (E,E-farnesol; E,Z

25 farnesol; Z,E-farnesol y Z,Z-farnesol). El farnesol producido por Sh-zFPS-6His tiene un tiempo de retención idéntico al de Z,Z-farnesol.

Se incubó la proteína recombinante Sh-SBS-6His con los sustratos GPP, FPP y GGPP. Cualquiera que fuera el sustrato usado, no pudo detectarse ningún nuevo terpeno, lo que significa que la enzima es inactiva para los sustratos trans-alílicos (tabla 1).

Enz1 Enz2 Sustrato IPP Productos

Sh-zFPS Ausente DMAP IPP A* Sh-zFPS Ausente E-GPP IPP -Ausente Sh-SBS E-GPP No -Ausente Sh-SBS E,E-FPP No -Ausente Sh-SBS E,E,E-GGPP No -Sh-zFPS Sh-SBS DMAPP IPP B, C, D, E, F Sh-zFPS Sh-SBS GPP IPP

*después de desfosforilación 30 Tabla 3: Resumen de los ensayos de actividad enzimática obtenidos in vitro con las proteínas recombinantes ShzFPS-6His y Sh-SBS-6His en función de los diferentes sustratos isoprenoicos usados. A, Z,Z-famesol, B, asantaleno; C, epi--santaleno; D, endo--bergamoteno; E, cis-a-bergamoteno; F, trans-a-bergamoteno.

Se incubaron las enzimas Sh-zFPS-6His y Sh-SBS-6His junto con los sustratos DMAPP e IPP o GPP e IPP. El producto de reacción no se trató con fosfatasa, sino que se extrajo con pentano en el que es soluble cualquier 35 olefina. Con DMAPP e IPP como sustratos, el análisis cromatográfico del extracto revela la presencia de varios compuestos terpénicos (Fig. 5). Se comparó el perfil de CG con el del exudado de la estirpe de tomate TA517. Esta estirpe es una estirpe cuasi-isogénica obtenida a partir de progenitores S. lycopersicum y S. habrochaites (Monforte y Tanksley, 2000). La estirpe TA517 posee un fragmento de introgresión de S. habrochaites responsable de la biosíntesis de sesquiterpenos de clase II (van der Hoeven et al., 2000). Los dos perfiles de CG son idénticos, lo que

40 confirma que las enzimas recombinantes tienen una actividad estrictamente idéntica a las presentes en el tomate (Fig. 6). El compuesto mayoritario (Fig. 5, pico 2) se identifica como a-santaleno por comparación de su tiempo de retención y su espectro de masas con el del extracto de exudado de tomate TA517. Por orden de cantidades decrecientes, se identificaron igualmente a-santaleno (pico 4), endo--bergamoteno (pico 5) ya-bergamoteno (pico 1). La enzima Sh-SBS-6His es por tanto una enzima cuya actividad conduce a la formación de varios productos.

Puede concluirse que Sh-zFPS es una enzima que actúa sobre IPP y DMAPP produciendo un compuesto fosforilado de tipo difosfato de farnesilo. El tiempo de retención es idéntico al del patrón de (Z,Z)-famesol, indicando que el difosfato de farnesilo producido por Shz-FPS se caracteriza por una configuración de tipo Z,Z. La inactividad de ShzFPS-6His sobre E-difosfato de geranilo en combinación con IPP indica que esta molécula no es un producto intermedio de Sh-zFPS-6His y produce al menos un enlace de tipo Z al combinar un DMAPP y un IPP. Sh-SBS es activo únicamente sobre el compuesto difosfato de farnesilo producido por la enzima Sh-zFPS, pero produce al menos 4 sesquiterpenos claramente identificados, siendo el mayoritario a-santaleno. Por último, la presencia de una extensión C-terminal por un espaciador de 6 histidinas no modifica en nada la actividad de la enzima con relación a las enzimas nativas de la planta de origen (Fig. 3).

Expresión de genes de Z,Z-FPP sintasa (Sh-zFPS) y SB sintasa (Sh-SBS) en el tabaco

Se clonó un promotor de tabaco específico de tricomas (eCBTS02, Tissier et al., 2004) en dirección 5’ de las secuencias codificantes Sh-zFPS y Sh-SBS, formando las construcciones eCBTS1.0-Sh-zFPS [nº 1] y eCBTS1.0-Sh-SBS [nº 2]. Se introdujeron estas dos construcciones en un mismo vector binario para transformación en Agrobacterium que contiene un gen de resistencia a kanamicina, dando el vector binario pLIBRO-064 (Fig. 2A). Se introdujo igualmente la construcción nº 2 de manera independiente en un vector binario pLIBRO-065 (Fig. 2B). Se introdujeron los vectores en la cepa de Agrobacterium LBA4404 por electroporación. Se utilizaron las cepas que contenían los diferentes vectores para realizar la transformación genética de N. sylvestris mediante el método de los discos foliares (Horsch et al., 1985).

Se introdujeron los ADN-T portadores de transgenes mediante transformación genética en una estirpe transgénica de N. sylvestris (estirpe de cepa ihpCBTS) cuya inhibición del gen CBTS se ha inhibido por interferencia de ARN (Tissier et al., 2005). En esta estirpe, la cantidad de CBT-diol de las hojas es muy reducida. N. sylvestris, un tabaco silvestre, no produce sesquiterpenos equivalentes a los del tomate. Se obtuvieron 25 plantas resistentes a la kanamicina para cada construcción. Se confirmó la presencia de transgenes en cada planta por PCR a partir del ADN genómico de hojas. Se verificó el nivel de expresión de los transgenes en las hojas por PCR cuantitativa instantánea a partir de ARNm de hojas de tabaco. Se comparó el nivel de expresión del transgén Sh-SBS con el de un gen de actina cuya expresión es constitutiva en las hojas de tabaco. Los resultados se presentan en la Figura 3 del ejemplo. Indican que las estirpes seleccionadas expresan todas el transgén a niveles variables de 1 a 50 para la construcción pLIBRO-064 y de 1 a 10 para la construcción pLIBRO-065, con relación al gen de actina.

Al ser los sesquiterpenos olefínicos moléculas volátiles, se analizaron las moléculas volátiles emitidas por las plantas en atmósfera controlada en un recinto de cultivo. Se captó una parte de la atmósfera en un circuito de derivación que contenía un filtro SuperQ® (Altech) que tiene la capacidad de adsorber las moléculas terpénicas olefínicas. Se eluyeron a continuación las moléculas con 1 ml de pentano y se analizaron por CG/EM. Se presenta en la figura 7 un ejemplo de perfil cromatográfico de las moléculas volátiles emitidas por una planta transgénica. Muestra que la estirpe nº 3877 que expresa los genes Sh-zFPS y Sh-SBS contiene varios nuevos picos que poseen unos iones moleculares 93, 94, 121 y 204 distintivos característicos de los sesquiterpenos de esta clase. Se comparó el perfil cromatográfico con el obtenido a partir de exudado de la estirpe de tomate TA517 que produce naturalmente estos compuestos (Fig. 7). Los dos perfiles son idénticos y los espectros de masas de cada uno de los picos son idénticos a los de los picos de la estirpe TA517. Las plantas que expresan los dos transgenes Sh-zFPS y Sh-SBS producen asantaleno, epi--santaleno, cis-a-bergamoteno, trans-a-bergamoteno y endo--bergamoteno, mientras que las estirpes transgénicas que han integrado el gen Sh-SBS solo no producen ninguno de estos compuestos. Estos resultados indican que es necesaria la presencia de los dos genes para la síntesis de sesquiterpenos de tipo SB. Confirman los resultados obtenidos in vitro con las enzimas recombinantes. En conclusión, los genes Sh-zFPS y Sh-SBS son responsables de la biosíntesis de sesquiterpenos de tomate localizados a la altura del locus Sst2 descrito por van der Hoeven et al., 2000.

Polimorfismo genético del gen zFPS entre S. lycopersicum y S. habrochaites,

Se amplificó el gen completo zFPS por PCR a partir de ADN genómico de S. lycopersicum, S. habrochaites y TA517 usando los cebadores ACCATGGGTTCTTTGGTTCTTCAATGTTGGA (SEQ ID Nº 9) y ACTCGAGATATGTGTGTCCACCAAAACGTCTATG (SEQ ID Nº 10). Se amplificaron dos productos en los dos genomas, indicando que existen al menos dos copias del gen en los dos genomas (Fig. 8). Uno de los productos, que posee un tamaño de aproximadamente 3000 nucleótidos (banda A), es común a los dos genomas. El segundo producto posee un tamaño de aproximadamente 2000 nucleótidos (banda C) en S. lycopersicum y de aproximadamente 2500 nucleótidos (banda B) en S. habrochaites. La estirpe TA517 muestra un perfil idéntico al de

S. habrochaites. Estos resultados indican que se introdujo el gen B específico de S. habrochaites en la estirpe TA517. La secuenciación del producto B ha permitido confirmar que corresponde al gen zFPS presentado en este documento. Este resultado muestra igualmente que el gen zFPS de S. habrochaites puede introducirse en S. lycopersicum usando el polimorfismo que existe entre los dos genomas para este gen.

Referencias

Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schâffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Millar y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

Bates GW, Gaynor JJ, Shekhawat NS. (1983) “Fusion of Plant Protoplasts by Electric Fields”. Plant Physiol. 72: 1110-1113.

Bohlmann J, Crock J, Jetter R, Croteau R. (1998) “Terpenoid-based defenses in conifers: cDNA cloning, characterization, and functional expression of wound-inducible (E)-alpha-bisabolene synthase from grand fir (Abies grandis)”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95: 6756-6761.

Bouwmeester HJ, Kodde J, Verstappen FW, Altug IG, de Kraker JW, Wallaart TE. (2002) “Isolation and characterization of two germacrene A synthase cDNA clones from chicory”. Plant Physiol. 29: 134-144.

Cai Y, Jia JW, Crock J, Lin ZX, Chen XY, Croteau R. (2002) “A cDNA clone for beta-caryophyllene synthase from Artemisia annua”. Phytochemistry. 61: 523-529.

Cane DE. (1999) “Sesquiterpene biosynthesis: Cyclization mechanisms. In comprehensive natural products chemistry, isoprenoids including carotenoids and steroids”, Vol. 2, D.D. Cane, ed (Amsterdam, Holanda, Elsever), pág.155-200.

Carman RM, Ouffield AR (1993) “The Biosynthesis of Labdanoids -the Optical Purity ofNaturally-Occurring Manool and Abienol”. Aust. J. Chem. 46: 1105-1114.

Clarke CF, Tanaka RD, Svenson K, Wamsley M, Fogelman AM, Edwards PA (1987) “Molecular cloning and sequence of a cholesterol-repressible enzyme related to prenyltransferase in the isoprene biosynthetic pathway”. Mol. CeIl. Biol 7: 3138-3146.

Colby SM, Crock J, Dowdle-Rizzo B, Lemaux PG, Croteau R. “Germacrene C 10 synthase from Lycopersicon esculentum cv. VFNT cherry tomate: cDNA isolation, characterization, and bacterial expression of the multiple product sesquiterpene cyclase” (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 2216-2221.

Facchini PJ, Chappell J. “Gene family for an elicitor-induced sesquiterpene cyclase in tobacco” (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89(22): 11088-11092.

Heinstein PF, Herman DL, Tove SB, Smith FH. “Biosynthesis of gossypol. Incorporation of mevalonate-2-14C and isoprenyl pyrophosphates” (1970) J. Biol. Chem. 245: 4658-4665.

Horsch RB, Rogers SG, Fraley RT (1985) “Transgenic plants”. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 50: 433-437.

Kharel Y, Takahashi S, Yamashita S, Koyama T. (2006) “Manipulation of prenyl chain length determination mechanism of cis-prenyltransferases”. FEBS J. 273:647-657.

Kollner TG, O'Maille PE, Gatto N, Boland W, Gershenzon J, Degenhardt J. (2006) “Two pockets in the active site of maize sesquiterpene synthase TPS4 carry out sequential parts of the reaction scheme resulting in multiple products”. Arch. Biochem. Biophys. 25 448: 83-92.

Koyama T (1999) “Molecular analysis of prenyl chain elongation enzymes”. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 16711676.

Liang PH, Ko TP, Wang AH. (2002) “Structure, mechanism and function of prenyltransferases”. (2002) 269: 33393354.

Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004), "CD-Search: protein domain annotations on the fly.", Nucleic Acids Res. 32(W) 327-331.

McMillan J. y Beale M.H. (1999) “Dipterpene biosynthesis. In comprehensive natural products chemistry, isoprenoids including carotenoids and steroids” Vol. 2, D.D. Cane, ed (Amsterdam, Holanda; Elsever), pág. 217-243.

Monforte AJ, Tanksley SD (2000) “Development of a set of near isogenic and backcross recombinant inbred lines containing most of the Lycopersicon hirsutum genome in an L. esculentum background: A tool for gene mapping and gene discovery”. Genomic 43: 803-813.

Oh SK, Han KR, Ryu SB, Kang H. (2000) “Molecular cloning, expression, and functional analysis of a cisprenyltransferase from Arabidopsis thaliana. Implications in rubber biosynthesis”. J. Biol. Chem. 275: 18482-18488.

Poulter DC (2006) “Famesyl Diphosphate Synthase. A Paradigm for Understanding Structure and Function Relationships in E-polyprenyl Diphosphate Synthases”. Phytochem. review 5: 17-26.

Rodríguez-Concepción M, Boronat A. (2002) “Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids. A metabolic milestone achieved through genomics”. Plant Physiol. 130(3): 1079-89.

Sharon-Asa L, Shalit M, Frydman A, Bar E, Holland D, Or E, Lavi U, Lewinsohn E, Eyal Y. (2003) “Citrus fruit flavor and aroma biosynthesis: isolation, functional characterization, and developmental regulation of Cstps1, a key gene in the production of the sesquiterpene aroma compound valencene”. Plant J. 2003, 36: 664-74.

Shimizu N, Koyama T, Ogura K. (1998) “Molecular cloning, expression, and purification of undecaprenyl diphosphate synthase. No sequence similarity between E-and Z-prenyl diphosphate synthases”. J Biol Chem. 273: 19476-19481.

Schulbach MC, Brennan PJ, Crick OC. (2000) “Identification of a short (C25) chain Z-isoprenyl diphosphate synthase and a homologous long (C50) chain isoprenyl diphosphate synthase in Mycobacterium tuberculosis”. J. Biol. Chem.

275: 22876-22881.

Tarshis LC, Yan M, Poulter CD, Sacchettini JC. (1994) “Crystal structure of recombinant famesyl diphosphate synthase at 2.6-A resolution”. Biochemistry 33: 10871-10877.

Tholl D. (2006) “Terpene synthases and the regulation, diversity and biological roles of terpene metabolism” Curr. Opin. Plant. Biol. 9: 297-304.

Thompson, J.D., Gibson,T.J., Plewniak,F., Jeanmougin, F. y Higgins, D.G. (1997) “The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools”, Nucleic Acids Research 24: 48764882.

Tissier A, Sallaud C, Rontein D (2004) “Promoteurs végétaux et utilisations PCT/FR 05/02530.

Tissier A, Sallaud C, Rontein D (2005) “Système de production de terpènes dans les plantes”, solicitud de patente francesa FR 0500855.

van Der Hoeven RS, Monforte AJ, Breeden D, Tanksley SD, Steffens JC. (2000) “Free in PMC Genetic control and evolution of sesquiterpene biosynthesis in Lycopersicon esculentum and L. hirsutum”. Plant Cell. 12: 2283-2294.

Wallaart TE, Bouwmeester Hl, Hille J, Poppinga L, Maijers NC (2001) “Amorpha-4,11-diene synthase: cloning and functional expression of a key enzyme in the biosynthetic pathway of the novel antimalarial drug artemisinin”. Planta

212: 460-465.

Wang K, Ohnuma SI (1999) “Chain-Iength determination mechanism of isoprenyl diphosphate synthases and implications for molecular evolution” 24: 445-451.

Wise ML, Croteau RA (1999). “Monoterpene biosynthesis. In comprehensive natural products chemistry, isoprenoids including carotenoids and steroids” Vol. 2, D.D. Cane, ed (Amsterdam, Holanda; EIsever), pág. 97-153.

Zimmermann D, Scheurich P. (1981) “High frequency fusion of plant protoplasts by electric fields”. Planta 151: 26-32.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> LIBROPHYT

<120> GENES QUE CODIFICAN Z,Z-DIFOSFATO DE FARNESILO SINTASA Y UNA SESQUITERPENO SINTASA DE PRODUCTOS MÚLTIPLES Y SUS USOS

5 <130> B0S63WO

<160> 10

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 912 10 <212> ADN

<213> Solanum abutiloides

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(912) 15 <400> 1

<210> 2

<211> 303

<212> PRT

<213> Solanum abutiloides

<400> 2

<210> 3

<211> 2334

<212> ADN

<213> Solanum habrochaites

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2334)

<400> 3

<210> 4

<211> 777

<212> PRT

<213> Solanum habrochaites

<400> 4

5: <210> 5 <211> 31 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 5 accatgggtt ctttggttct tcaatgttgg a: 31

10: <210> 6 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artificial

15: <220> <223> cebador

<400> 6 actcgagata tgtgtgtcca ccaaaacgtc tatg: 34

20: <210> 7 <211> 31 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 7 tccatggtag ttggctatag aagcacaatc a: 31

<210> 8 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 8 tctcgagcat aaattcaaat tgagggatta atga: 34

<210> 9 <211> 31 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 9 accatgggtt ctttggttct tcaatgttgg a: 31

<210> 10 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 10 actcgagata tgtgtgtcca ccaaaacgtc tatg: 34

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de producción de sesquiterpenos de tipo SB (santaleno y bergamoteno) o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP (Z,Z-difosfato de farnesilo) en una célula que tiene una fuente de DMAP e IPP, que comprende:

a) la introducción en dicha célula de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un primer gen codificante de una zFPS (Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa) que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 2 y de una construcción portadora de un módulo de expresión que comprende un segundo gen codificante de una SB sintasa que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 4;

b) el cultivo de la célula transformada en condiciones apropiadas para la expresión de dichos primer y segundo genes, y

c) opcionalmente, la recogida de los sesquiterpenos de tipo SB los derivados de los mismos contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.
2.

Proteína aislada o recombinante que tiene una actividad Z,Z-FPP sintasa y una secuencia que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 2.
3.

Proteína según la reivindicación 2, caracterizada porque su secuencia corresponde a la SEQ ID Nº 2.
4.

Proteína aislada o recombinante que tiene una actividad SB sintasa y que tiene una secuencia que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 4.
5.

Módulo de expresión o vector que comprende una secuencia nucleotídica heteróloga codificante de una proteína según las reivindicaciones 2 a 4.
6.

Célula hospedadora que comprende un ácido nucleico, un módulo de expresión o un vector que comprende una secuencia nucleotídica heteróloga codificante de una proteína según las reivindicaciones 2 a 4.
7.

Organismo transgénico no humano que comprende un ácido nucleico, un módulo de expresión o un vector que comprende una secuencia nucleotídica heteróloga codificante de una proteína según las reivindicaciones 2 a 4,

o una célula según la reivindicación 6.
8.

Organismo transgénico según la reivindicación 7, caracterizado porque el organismo es una planta con tricomas glandulares, preferiblemente del género Nicotiana o Solanum.
9.

Método de producción de Z,Z-difosfato de farnesilo (Z,Z-FPP) o de derivados del mismo a partir de IPP y DMAP en una célula que tiene una fuente de IPP y DMAP, que comprende:

a) la introducción en dicha célula de una construcción portadora de un módulo de expresión con una secuencia nucleotídica codificante de una proteína según la reivindicación 2 o 3;

b) el cultivo de la célula transformada en condiciones apropiadas para la expresión del gen y

c) opcionalmente la recogida del Z,Z-FPP o de derivados del mismo contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.
10.

Uso de una proteína según las reivindicaciones 2 a 4, de un ácido nucleico según la reivindicación 5, de una célula hospedadora según la reivindicación 6 o de un organismo transgénico según la reivindicación 7 u 8 para la preparación de Z,Z-��, a-santaleno, epi--santaleno, a-bergamoteno, -bergamoteno y endo--bergarnoteno o de deri�ados de los mismos como a-santalol, epi--santalol, a-bergamotol, �-bergamotol y Z,Z-farnesol.
11.

Célula u organismo transgénico no humano, caracterizado porque la ruta de síntesis de sesquiterpenos de tipo SB está bloqueada por la inactivación del gen codificante de una proteína según la reivindicación 2 o 3, o del gen codificante de una proteína según la reivindicación 4, o de los dos genes.
12.

Uso de marcadores moleculares que comprenden todo o parte de un ácido nucleico que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 3 para identificar un polimorfismo genómico entre S. habrochaites y especies de tipo Solanum sexualmente compatibles con S. habrochaites, con el fin de controlar la introgresión de los genes correspondientes en estas especies.
13.

Uso según la reivindicación 12, caracterizado porque los marcadores moleculares comprenden secuencias de ácidos nucleicos correspondientes a las SEQ ID Nº 9 y 10.
14.

Método consistente en introducir el gen zFPS codificante de una zFPS (Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa) que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 2 y el gen SBS (SB sintasa) codificante de una SB (santaleno y bergamoteno) sintasa que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 4 en una especie no sexualmente compatible con Solanum habrochaites por fusión de protoplastos.
15.

Método según la reivindicación 9, que comprende además la transformación del Z,Z-FPP obtenido en Z,Zfarnesol por una fosfatasa.
16.

Método de producción de sesquiterpenos de tipo SB (santaleno y bergamoteno) o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP (Z,Z-difosfato de farnesilo) en una célula que tiene una fuente de DMAP e IPPP, que comprende:

a) el suministro de una célula recombinante que comprende un primer gen heterólogo codificante de una zFPS (Z,Z-difosfato de farnesilo sintasa) que presenta el menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 2 y un segundo gen heterólogo codificante de una SB sintasa que presenta al menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 4;

b) el cultivo de la célula en condiciones apropiadas para la expresión de dichos primer y segundo genes; y

c) opcionalmente, la recogida de sesquiterpenos de tipo SB o derivados de los mismos contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.
17. Método de producción de Z,Z-FPP en una célula recombinante que tiene una fuente de DMAP e IPPP, que comprende:

a) el suministro de una célula recombinante que comprende un gen heterólogo codificante de una zFPS que presenta el menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 2;

b) el cultivo de la célula en condiciones apropiadas para la expresión de dicho gen; y

c) opcionalmente, la recogida del Z,Z-FPP o derivados del mismo contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.
18. Método de producción de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos a partir de Z,Z-FPP en una célula recombinante que tiene una fuente de Z,Z-FPP, que comprende:

a) el suministro de una célula recombinante que comprende un gen heterólogo codificante de una SB sintasa que presenta el menos un 80% de identidad con la SEQ ID Nº 4;

b) el cultivo de la célula en condiciones apropiadas para la expresión de dicho gen; y

c) opcionalmente, la recogida de sesquiterpenos de tipo SB o de derivados de los mismos contenidos en dicha célula y/o en el medio de cultivo.