CN101665793B - 青蒿4-(5'-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤藓醇合酶编码序列 - Google Patents

Abstract

一种基因工程技术领域的青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列，该序列如SEQ ID NO：3中第18～926位所示或者是SEQ ID NO：3序列中第18～926位所示的核苷酸中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列；利用所述编码序列提高植物青蒿素含量的方法：将所述编码序列连于植物表达调控序列上，构建含所述编码序列的植物表达载体；将步骤一中的表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细胞，再生转基因植株；本发明还涉及一种多肽，序列如SEQ ID NO：4所示。本发明可提高青蒿中青蒿素的含量以及其他植物的异戊二烯类化合物含量。

Description

青蒿4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域的编码序列，具体是一种青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，为0.01％-1％，低含量使得青蒿素的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大、产量低、成本高，因此人工生产缺乏可行性。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中的含量低于干重的0.1％，在芽中含量最高也只有干重的0.16％，大多数研究没有检测到青蒿素。因此，利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的也不具备可行性。Dahua Chen等在《Plant Science》(植物科学)2000年155期179-185页发表了题为“Expression of a chimeric farnesyl diphosphatesynthase gene in Artemisia annua L.transgenic plants via Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation”(通过农杆菌介导转化在青蒿植株中表达法尼基焦磷酸合酶基因)的论文，文中评述，通过过量表达法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，FPS)可在原有基础上提高青蒿素含量2倍-3倍，达到1％左右。

随着近年来植物基因组学的发展，青蒿素合成途径的基因分离、克隆和功能性研究已经取得了突破性的进展。人们已经初步完成了对参与青蒿素合成途径关键基因的分离和功能验证工作，并分析了青蒿素合成途径概貌。

经对现有技术的文献检索发现，尚未见与青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列。本发明可提高青蒿中青蒿素的含量以及其他植物的异戊二烯类化合物含量，可以使含青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列的转基因植物成为生物反应器，实现青蒿素的大规模生产和其他异戊二烯类化合物的生产。

本发明是通过以下技术方案实现的，

本发明涉及一种青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列，该序列如SEQ ID NO：3中第18～926位所示或者是SEQ ID NO：3序列中第18～926位所示的核苷酸中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。

所述青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列如SEQ IDNO：3中第18～926位所示。

本发明还涉及一种多肽，序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还涉及一种利用所述青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列提高植物青蒿素含量的方法，包括如下步骤：

步骤一，将青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列连于植物表达调控序列上，构建含青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列的植物表达载体；

步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；

步骤三，通过抗生素筛选，获得含有青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列的转化细胞，再生转基因植株。

步骤二中，所述转入采用冻融法。

本发明中，构建步骤一中含青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列的植物表达载体时可选用本领域已知的各种载体，例如：质粒，粘粒等。

本发明中，步骤三中，含有青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列的转化细胞为真核细胞。进一步地，真核宿主细胞为酵母细胞、拟南芥的生殖细胞或愈伤组织细胞、其他植物的生殖细胞或愈伤组织细胞。

术语“简并”是指：编码氨基酸的大部分密码子具有简并性，即两个或多个密码子编码同一氨基酸。例如：GAA和GAG都编码谷氨酰胺。

本发明具有如下的有益效果：本发明可提高青蒿素含量；同时本发明可使含青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列的转基因植物成为生物反应器，实现异戊二烯类化合物的大规模生产；利用本发明的青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

步骤一，青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列(CMS)的克隆

(1)RNA的提取(RNA extraction)

取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

(2)基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据拟南芥中相关基因所编码的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech公司SMART^TMRACE试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

①首链cDNA的合成

利用SMART^TM RACE试剂盒所提供的5’-CDS primer A和SMART II A oligo引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成5’-RACE-Ready cDNA；利用Clontech试剂盒所提供的3’-CDS primer A为引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成3’-RACE-Ready cDNA。

②3’-RACE

用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物2(GSP2)(SEQ ID NO：1)进行3’-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上进行测序。

③5’-RACE

用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物1(GSP1)(SEQ ID NO：2)进行5’-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上进行测序。将测序结果的重叠区拼接，得到该基因的完整编码区序列。BLAST分析结果证明从青蒿中得到的基因确为一个4-(5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶的相关基因。

通过上述步骤，获得了青蒿中参与异戊二烯类化合物合成的4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO：3)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。

步骤二，青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶相关基因的序列信息与同源性分析

步骤一中得到的青蒿CMS(4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶)的全长cDNA长度为1108bp(SEQ ID NO：3)，其中开放阅读框位于第15-1214位核苷酸，根据所获得的cDNA推导出青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶的氨基酸序列(见SEQ ID NO：4)，共302个氨基酸残基，分子量为33522.35，等电点为7.81。利用vectorNTI 9.0软件对来源于各种植物的4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶的相关氨基酸序列进行同源比对，结果发现，克隆到的青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)，烟草(Nicotiana langsdorffii x Nicotianasanderae)，蓖麻(Ricinus communis)，巴西橡胶树(Hevea Brasiliensis)，甜叶菊(Stevia rebaudiana)以及长春花(Catharanthus Roseus)中同源基因所编码的氨基酸序列相似性分别为：83％，78％，66％，78％，82％，88％。由此可见，青蒿CMS基因与其他高等植物中的CMS相关基因在所编码的氨基酸水平上存在较高的同源性，可以认为它们的产物在功能上也有较高的相似性。

步骤三，青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶相关蛋白或多肽在青蒿细胞中进行真核细胞表达

(1)含目的基因(青蒿CMS基因)的表达载体的构建

根据青蒿CMS的全长编码序列(SEQ ID NO：3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入BamHI和SacI限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以青蒿cDNA为模板，经PCR扩增后，将青蒿CMS的编码区序列连接至中间载体pMD18-T中进行测序。将测序正确的CMS的编码区序列进一步克隆到表达载体pCAMBIA2300中，接着将其转入根癌农杆菌EHA105，并进行PCR验证。结果表明，含青蒿CMS基因的植物表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

(2)根癌农杆菌介导CMS基因转化青蒿

①外植体的预培养

青蒿种子用75％(v/v)乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3-4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

②农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

③抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光和8小时的黑暗中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

④转基因青蒿植株的PCR检测

根据目的基因所在表达盒p35s-CMS-nos序列p35s和CMS分别设计正向引物设计和反向引物对CMS基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

步骤四，利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

(1)HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymMetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相甲醇(Methanol)∶水为70％∶30％，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar；

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本实施例中流动相甲醇(Methanol)∶水为70％∶30％时，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。

(2)标准曲线的制作

将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μL，4μL，6μL，8μL，10μL记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本实施例中青蒿素在4～20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。

(3)样品的制备和青蒿素含量的测定

青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al.(2006)中报道的方法：取少量新鲜的青蒿叶片(1～2g鲜重)，于50ml试管中将其浸没在10ml氯仿中摇荡1分钟，将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3ml无水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC检测。同时，氯仿提取后的叶片收集放入60度烘箱进行烘干，称重(计算青蒿叶片的干重)；

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μL，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

在本实施例中编码4-(5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶(CMS)基因的转化显著提高了青蒿叶片中青蒿素含量，这使得转基因植株中青蒿素的含量超过对照非转化普通青蒿的50％以上。由此可见，4-(5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶基因可作为一种获得了青蒿素高产的青蒿植株的候选基因，用于利用转基因技术提高植物青蒿素含量和其他异戊二烯类化合物的研究和产业化生产中。

                           序列表

<110>上海交通大学

<120>青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶蛋白编码序列

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>青蒿(Artemisia annua L.)

<400>1

caagattccg tgtacagtgg acttcagac                                       29

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>青蒿(Artemisia annua L.)

<400>2

aacaccaaga actgatgctc caactcgc                                        28

<210>3

<211>1108

<212>DNA

<213>青蒿(Artemisia annua L.)

<400>3

ggaaaaccaa aaccaaaatg attcttcagg ttatctctcc gtcatcc ata ctaataatcc    60

cccgtcgtca agtagcaccc aattccatct actttcaccc tcaattatca tcatctgtta    120

agtattctta ttccttacca cccaaaacaa acaatttcag acaaaaaaac atcacttgtt    180

ctgctaataa tcccaccgtt acaactgaga ggtctgaaga tgttgttaaa gagaaaagtg    240

tatcggtggt tcttctcgcc ggagggaagg gaaaaagaat gggcgcaagc atgccaaagc    300

agtatcttcc acttttagga caaccaattg ctttgtatag tttctacact ttttcacgaa    360

tgcctgaagt taaggaaatt gtcgtagttt gcgatccatc ttaccaggac atttttgaag    420

atgccagaga aaagatcaac gtggacctaa aatttgcgtt gccaggaaag gaaagacaag    480

attccgtgta cagtggactt cagacaattg atttgaactc tgaacttgta tgcgtccatg  540

attctgcaag acctttggta acgtctagtg atgtagaaaa ggttctgaag gatggattgc  600

gagttggagc atcagttctt ggtgttcctg ctaaagctac tataaaagag ggaaatagtg  660

aatcttttgt ggtgaagaca ttggacagga aaacactttg ggaaatgcag actccacagg  720

ttatcaagcc tgagttgttg aagaaaggtt ttgagcttgt aaatagagaa ggccttgaag  780

tcacggatga tgtgtccatt gttgagcacc ttaaacatcc tgtatacatc actgaaggat  840

cctatactaa catcaaggtc acaactcctg atgatctatt acttgctgaa agaatattaa  900

atacggcctc gtttgtgcca gcttaatcat tcattttatt tacaatatac atgatgagct  960

atatgacagt gaagggacac tgaacaacaa gaaacgaatt tatacgtgtt ttcactgcat  1020

gcttagtaga aacggcattg gtacgattag tgcaaaatga aatttatgat tctgaaataa  1080

tttttttgaa ccaaaaaaaa aaaaaaaa                                     1108

<210>4

<211>302

<212>PRT

<213>青蒿(Artemisia annua L.)

<400>4

Met Ile Leu Gln Val Ile Ser Pro Ser Ser Ile Leu Ile Ile Pro Arg

1               5                   10                  15

Arg Gln Val Ala Pro Asn Ser Ile Tyr Phe His Pro Gln Leu Ser Ser

            20                  25                  30

Ser Val Lys Tyr Ser Tyr Ser Leu Pro Pro Lys Thr Asn Asn Phe Arg

        35                  40                  45

Gln Lys Asn Ile Thr Cys Ser Ala Asn Asn Pro Thr Val Thr Thr Glu

    50                  55                  60

Arg Ser Glu Asp Val Val Lys Glu Lys Ser Val Ser Val Val Leu Leu

65                  70                  75                  80

Ala Gly Gly Lys Gly Lys Arg Met Gly Ala Ser Met Pro Lys Gln Tyr

                85                  90                  95

Leu Pro Leu Leu Gly Gln Pro Ile Ala Leu Tyr Ser Phe Tyr Thr Phe

            100                 105                 110

Ser Arg Met Pro Glu Val Lys Glu Ile Val Val Val Cys Asp Pro Ser

        115                 120                 125

Tyr Gln Asp Ile Phe Glu Asp Ala Arg Glu Lys Ile Asn Val Asp Leu

    130                 135                 140

Lys Phe Ala Leu Pro Gly Lys Glu Arg Gln Asp Ser Val Tyr Ser Gly

145                 150                 155                 160

Leu Gln Thr Ile Asp Leu Asn Ser Glu Leu Val Cys Val His Asp Ser

                165                 170                 175

Ala Arg Pro Leu Val Thr Ser Ser Asp Val Glu Lys Val Leu Lys Asp

            180                 185                 190

Gly Leu Arg Val Gly Ala Ser Val Leu Gly Val Pro Ala Lys Ala Thr

        195                 200                 205

Ile Lys Glu Gly Asn Ser Glu Ser Phe Val Val Lys Thr Leu Asp Arg

    210                 215                 220

Lys Thr Leu Trp Glu Met Gln Thr Pro Gln Val Ile Lys Pro Glu Leu

225                 230                 235                 240

Leu Lys Lys Gly Phe Glu Leu Val Asn Arg Glu Gly Leu Glu Val Thr

                245                 250                 255

Asp Asp Val Ser Ile Val Glu His Leu Lys His Pro Val Tyr Ile Thr

            260                 265                 270

Glu Gly Ser Tyr Thr Asn Ile Lys Val Thr Thr Pro Asp Asp Leu Leu

        275                 280                 285

Leu Ala Glu Arg Ile Leu Asn Thr Ala Ser Phe Val Pro Ala

    290                 295                 300

Claims (4)

1.一种青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列，其特征是，该序列如SEQ ID NO：3中第18～926位所示。

2.根据权利要求1所述的青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列，其特征是，该序列如SEQ ID NO：3中第18～926位所示。

3.一种多肽，其特征在于，序列如SEQ ID NO：4所示。

4.一种利用权利要求1所述的青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列提高植物青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，将青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列连于植物表达调控序列上，构建含青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列的植物表达载体；

步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；

步骤三，通过抗生素筛选，获得含有青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶编码序列的转化细胞，再生转基因植株。