CN109971744B

CN109971744B - 一种马蓝BcTSA基因及其编码的蛋白与应用

Info

Publication number: CN109971744B
Application number: CN201910133567.9A
Authority: CN
Inventors: 张磊; 刁勇; 郭志英; 谭何新; 黄豆豆; 陈越
Original assignee: Second Military Medical University SMMU; Huaqiao University
Current assignee: Second Military Medical University SMMU; Huaqiao University
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2039-02-22
Also published as: CN109971744A

Abstract

一种马蓝BcTSA基因及其编码的蛋白与应用，该马蓝BcTSA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明从马蓝中分离出BcTSA基因，并完成了马蓝BcTSA基因的克隆和生物信息分析，完善了吲哚类生物碱生物合成的认识。该马蓝BcTSA基因可控制吲哚类生物碱合成，马蓝BcTSA基因编码的蛋白可以应用于合成吲哚类生物碱，用来提高吲哚类生物碱的产量，为吲哚类生物碱的规模化生产提供高产、稳定的植物材料。

Description

一种马蓝BcTSA基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种马蓝BcTSA基因及其编码的蛋白与应用。

背景技术

马蓝(Baphicacanthus cusia)，广泛分布于我国西南、华南及华东地区，是重要的爵床科药用植物。由其茎、叶加工而成的青黛，以福建产品质最佳，被誉为建青黛，是福建道地药材。马蓝和青黛的主要功能性成分为靛蓝、靛玉红。特别是靛玉红已经成为青黛及其原植物马蓝的指标性成分，靛玉红为双吲哚生物碱，被认为具有抗肿瘤作用，临床上用于治疗慢性粒细胞白血病，是中成药“黄黛片”及“当归芦荟丸”的主要活性成分。目前，对马蓝以及青黛的研究多集中于鉴定、加工工艺和药理活性等方面，而缺乏对马蓝药效物质生物合成途径的研究，制约了马蓝优质种质的构建，因此梳理马蓝药效物质次生代谢通路及其调控机理、挖掘马蓝药效相关的关键基因，是培育优质马蓝品系的基础，也是我们研究工作的当务之急。

吲哚类生物碱大多数是由色氨酸衍生而来的，因此含有吲哚环的色氨酸可以看作是吲哚-3-乙胺、吲哚等次生代谢物的生物合成前体。吲哚类生物碱结构一般较为复杂，但具有重要的生物活性。由色氨酸合成途径产生的吲哚-3-甘油磷酸(indole-3-glyceraldehyde phosphate)在色氨酸合成酶α亚基(TSA)的催化下形成靛蓝的前体物质吲哚；吲哚在细胞色素P450单加氧酶(CYP450)的催化下形成吲哚酚；吲哚酚β-D-葡萄糖苷酶(GLU)的催化下形成一系列靛蓝的前体物质，并最终合成靛蓝类色素物质。

同时，由于植物表达体系的方便、廉价等优点，利用转基因植物生产药用蛋白越来越受重视，并迅猛发展，已有100余种蛋白得到表达，有些已进入商业化生产。因此，从马蓝中分离出参与吲哚类生物碱合成的基因有重大意义，在药物研发及农业生产上有重要作用。

经对现有技术的文献检索发现，尚未有关马蓝BcTSA基因及其编码的蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马蓝BcTSA基因及其编码的蛋白与应用，该马蓝BcTSA基因可控制吲哚类生物碱合成，马蓝BcTSA基因编码的蛋白可以应用于合成吲哚类生物碱，用来提高吲哚类生物碱的产量，为吲哚类生物碱的规模化生产提供高产、稳定的植物材料。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种马蓝BcTSA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述马蓝BcTSA基因的核苷酸序列为948bp，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

本发明的第二方面，提供一种由所述马蓝BcTSA基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述马蓝BcTSA基因编码的蛋白的氨基酸序列为315aa。

本发明提供的马蓝BcTSA编码蛋白含有典型的Trp_syntA保守结构域并且Trp_syntA结构域覆盖整个蛋白序列上第57位至第314位的氨基酸长度。该Trp_syntA保守结构域属于TSA类蛋白的标志保守域，因此，所述马蓝BcTSA蛋白在植物中可参与合成色氨酸。同时验证了，本发明提供的马蓝BcTSA编码蛋白包含1rd5.1的全部功能结构域，与BX1酶一样具有催化生成游离吲哚的功能。

本发明经过亚细胞定位分析发现，所述马蓝BcTSA基因特异地定位在叶绿体中，与吲哚类生物碱合成部位相一致。

本发明的第三方面，提供一种含有所述马蓝BcTSA基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因毛状根。

优选的，在制备所述表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因毛状根时，用于扩增所述马蓝BcTSA基因全长的引物对为：

正向(F)：CCTTTCATTCTTTCAGAGCAGC(如SEQ ID NO:3所示)；

反向(R)：GAAGACAACTGATGGCAGCT(如SEQ ID NO:4所示)。

优选的，所述重组表达载体为质粒PHB-35SX2-BcTSA。

优选的，所述重组菌即宿主细胞为大肠杆菌、农杆菌等。优选为农杆菌。更优选发根农杆菌C58C1。

优选的，所述转基因毛状根为转基因菘蓝毛状根、转基因拟南芥毛状根或转基因玉米毛状根。

本发明的第四方面，提供所述马蓝BcTSA基因在生物合成吲哚类生物碱中的应用。

本发明的第五方面，提供所述马蓝BcTSA基因编码的蛋白在生物合成吲哚类生物碱中的应用。

本发明的第六方面，提供含有所述马蓝BcTSA基因的重组表达载体、重组菌或转基因毛状根在生物合成吲哚类生物碱中的应用。

本发明的第七方面，提供所述马蓝BcTSA基因在提高植物中吲哚类生物碱含量中的应用。

本发明的第八方面，提供所述马蓝BcTSA基因编码的蛋白在提高植物中吲哚类生物碱含量中的应用。

优选的，所述植物为菘蓝、拟南芥或玉米。

本发明的第七方面，提供一种提高植物中吲哚类生物碱含量的方法，包含如下步骤：

(1)、构建含有BcTSA基因的重组表达载体，所述BcTSA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；

(2)、将步骤(1)构建的重组表达载体转入宿主细胞农杆菌，并将其转化到菘蓝的毛状根；

(3)、通过抗生素筛选得到转化成功的菘蓝毛状根，所得的转基因毛状根中吲哚类生物碱含量得到提高。

优选的，一种提高菘蓝中吲哚类生物碱含量的方法，包括如下步骤：

(1)采用基因克隆方法获得马蓝BcTSA基因的cDNA全长；

(2)将BcTSA基因连于植物表达调控序列上，构建含BcTSA基因的植物重组表达载体；

(3)将含BcTSA基因的植物重组表达载体转化发根农杆菌，获得成功转入马蓝BcTSA基因的发根农杆菌菌株；

(4)将构建的发根农杆菌菌株转化菘蓝叶盘，获得经检测为阳性的转基因BcTSA毛状根。

优选的，步骤(1)包括如下步骤：提取马蓝基因组总RNA；根据BcTSA基因如SEQ IDNO:1所示的序列设计基因特异性引物：正向引物(F)：CCTTTCATTCTTTCAGAGCAGC(SEQ IDNO:3)；反向引物(R)：GAAGACAACTGATGGCAGCT(SEQ ID NO:4)；以所提取的马蓝基因组总RNA为模板，经PCR扩增后合成马蓝BcTSA基因的cDNA全长。

优选的，步骤(2)中，所述构建含BcTSA基因的植物重组表达载体包括如下步骤：以马蓝BcTSA基因的cDNA全长为模板，设计带酶切位点的正向引物PHB-TSA-F：aaaGGATCCatggcagctgccgctttcaa(如SEQ ID NO:13所示)和反向引物PHB-TSA-R：aaaACTAGTttctttcagagcagctttta(如SEQ ID NO:14所示)，用PFU酶进行PCR扩增，获得的PCR产物经电泳、胶回收、连接、转化，过夜培养后，最后选取测序正确的含目的基因的单克隆，提取质粒I；利用Bam HI和Spe I双酶切的方法，分别酶切质粒I和过表达载体(PHB-Flag)质粒，然后按照NEB公司T4连接酶的操作说明，连接酶切后的片段，获得BcTSA基因的双元过表达载体PHB-35SX2-BcTSA。

优选的，步骤(3)中，所述转化包括如下步骤：

a)含BcTSA过表达载体根癌农杆菌菌株的获得

采用冻融法将含有BcTSA基因的双元过表达载体PHB-35SX2-BcTSA转入C58C1根癌农杆菌中，然后PCR鉴定，阳性菌株为成功转入过表达载体的发根农杆菌；

b)发根农杆菌介导菘蓝发根

选取阳性C58C1农杆菌大摇至OD₆₀₀＝0.6，离心，菌体以MS培养基重悬，活化30min，然后1cm²的菘蓝叶盘浸入活化好的农杆菌培养液中，200rpm，28℃摇床上浸染10min；捞出叶盘平放在1/2MS培养基上，置于恒温培养箱中(25℃)暗培养2d后将叶盘转入到毛状根诱导培养基(1/2MS+潮霉素20mg/L+头孢霉素500mg/L)上于继续暗培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得潮霉素抗性毛状根；然后将生长良好的毛状根通过PCR反应进行分子鉴定；经鉴定为阳性毛状根转移到1/2MS液体培养基进行扩大培养；

c)抗性毛状根的PCR鉴定

以BcTSA基因构建过表达载体时的引物PHB-TSA-F为正向引物，过表达载体PHB-Flag上的一段序列为反向引物RBCSR(ATTAACTTCGGTCATTAGAGGC，如SEQ ID NO:15所示)，提取潮霉素抗性培养基上生长足够量阳性毛状根的DNA，进行PCR鉴定；琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察到目的条带的阳性株系即为转基因菘蓝植株。

本发明上述方法得到的转基因BcTSA菘蓝毛状根经PCR鉴定，能扩增出特异的DNA片段，而以野生型菘蓝发根DNA为模板，未能获得任何特异性片段。同时利用LC-MS/MS测定转基因菘蓝中吲哚类生物碱的含量，结果显示，所有转化BcTSA基因成功的转基因菘蓝中吲哚类生物碱的含量均显著提高。

本发明从马蓝中分离、筛选出参与吲哚类生物碱合成的BcTSA基因，通过生物信息学对BcTSA基因全长cDNA进行序列特征分析和预测，并进行一系列体内、体外生物学功能研究，为今后通过生物技术提高马蓝中吲哚类生物碱等活性物质含量提供基础和保障。

本发明的有益效果：

本发明从马蓝中分离出BcTSA基因，并完成了马蓝BcTSA基因的克隆和生物信息分析，完善了吲哚类生物碱生物合成的认识。本发明提供的BcTSA基因编码的蛋白可以用来生产新的高吲哚类生物碱含量的品系，在吲哚类生物碱的获得和农业生产上具有十分重要的应用。

本发明通过构建BcTSA基因的过表达载体，并将质粒转入农杆菌中，从而将马蓝BcTSA基因转入菘蓝获得转基因BcTSA菘蓝毛状根，经检测，转基因BcTSA菘蓝毛状根中吲哚苷、3-羟基吲哚、靛红、靛蓝和靛玉红等吲哚类生物碱含量显著增高，其中，靛玉红含量变化最明显，与野生型相比，转基因BcTSA菘蓝毛状根中靛玉红含量提高了5.71～22.46倍。

附图说明

图1为本发明实施例2中BcTSA基因的结构域示意图。

图2为本发明实施例3-4中BcTSA的生物信息学分析结果，A)BcTSA的保守结构域示意图；B)BcTSA蛋白的三级结构图；C)BcTSA的亚细胞定位分析结果，BcTSA蛋白特异的定位在细胞的叶绿体，其中a显示绿色荧光蛋白(GFP)的绿光，b为叶绿体的红光，c为白光，d为绿光和红光合并在一起，e为绿光、红光和白光合并在一起。

图3为本发明实施例5中BcTSA基因表达特征分析结果，其中A为MeJA诱导马蓝植株1-72h马蓝BcTSA基因的表达情况；B为ABA诱导马蓝植物1-72h马蓝BcTSA基因的表达情况；C为SA诱导马蓝植物1-72h马蓝BcTSA基因的表达情况；D为BcTSA基因在马蓝根、茎及叶中的表达情况；

图4为本发明实施例6中BcTSA基因蛋白全长在pET-32a载体中表达的SDS-PAGE检测结果，箭头所指为纯化后BcTSA蛋白，Marker为蛋白分子量标准。

图5为本发明实施例7中BcTSA基因在菘蓝中过表达的植物表达载体PHB-35SX2-BcTSA的构建示意图。

图6为本发明实施例9中菘蓝毛状根中过表达BcTSA基因的含量检测结果，其中A为吲哚酮含量相对表达量，B为靛红含量相对表达量，C为靛玉红含量相对表达量，D为3-羟基吲哚含量相对表达量，E为吲哚苷含量相对表达量，F为靛蓝含量相对表达量。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件；用到的过表达载体(PHB-Flag)质粒的构建方法参考RuibingC,Xianghui C,Tingting Z,et al.Integrated Transcript and Metabolite ProfilesReveal That EbCHI Plays an Important Role in Scutellarin Accumulation inErigeron breviscapus Hairy Roots[J].Frontiers in Plant Science,2018,9:789-。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：马蓝BcTSA基因筛选

1.马蓝根、茎和叶材料转录组数据获得

采用TRNzolA+法分别抽提马蓝不同器官根、茎、叶共9个样品的总RNA，采用Agilent 2100Bioanalyzer检测RNA的质量并测定其浓度。根据Oligotexm RNA Midi Kit(Qiagen)说明书从质量合格的总RNA中分离mRNA并富集，按照SMART PCR cDNA synthesiskit(Clonetech)说明书操作方法进行cDNA第一链合成，然后按照Advantage 2PCR kit(Clonetech)说明书进行cDNA第二链合成。按照Pure PCR purification kit(Invitrogen)说明书，对>300bp的dsDNA进行回收，酶切去除PolyA。依照QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen)说明书对上述酶切产物进行纯化：使用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台对cDNA文库进行测序。本实施例实验使用Illumina Hiseq 2500测序平台，对马蓝不同器官根、茎、叶共9个样品的cDNA文库进行完整Run的测序。

2.马蓝转录组数据组装

1)使用GSAssembler v2.0.01.14对原始序列进行筛选，去除adaptor序列、低质量reads、含N较多的reads；

2)使用GS De novo Assembler对筛选reads进行拼接，对reads数量、长度分布进行统计；

3)使用Trinity软件

(http://trinityranseq.sourceforge.net/analysis/extract_protein_from_trnity_trans cripts.html)对拼接序列(unigene)进行ORF预测。

3.获得马蓝TSA核苷酸序列

在NCBI数据库下载已经报道其他物种TSA核苷酸序列，并将这些序列提交到获得马蓝转录组数据库中进行blast，筛选得到马蓝中TSA核苷酸序列。

实施例2：马蓝BcTSA基因的克隆

1.马蓝基因组总RNA和DNA的提取

取适量新鲜的马蓝叶片于液氮中迅速研磨成粉末，再取约100mg粉末加入预先装有植物组织裂解液的1.5ml EP管中，充分振荡混匀，然后分别按照TIANGEN RNAprep Pure植物总RNA和TIANGEN植物基因组DNA(gDNA)提取试剂盒的说明书提取马蓝总RNA和gDNA。用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA和gDNA的质量，然后在NanoDrop 2000C上测定RNA和gDNA浓度。

2.马蓝BcTSA基因的克隆

以所提取的总RNA为模板，利用全式金TransScript First-Strand cDNASynthesis Supermix试剂盒合成马蓝cDNA。

根据BcTSA基因的序列设计基因特异性引物：

正向(F)：CCTTTCATTCTTTCAGAGCAGC(如SEQ ID NO:3所示)

反向(R)：GAAGACAACTGATGGCAGCT(如SEQ ID NO:4所示)。

PCR反应体系及条件如下：模板(cDNA或gDNA)1μL，正、反向引物各1μL，2×PhusionHF PCR Master Mix 12.5μL，去离子水9.5μL，构成25μL反应体系。反应条件为预变性：98℃30sec，变性：98℃10sec，退火：55℃30sec，延伸：72℃1min继续延伸：72℃8min，其中变性-退火-延伸经历35个循环。

获得的PCR产物经电泳、胶回收、连接、转化，过夜培养后，挑单克隆，然后菌检、测序、比对，最后获得马蓝中BcTSA基因的全长编码序列(如SEQ ID NO：1所示)，利用NCBI的ORFfinder功能推导出其蛋白编码序列(如SEQ ID NO：2所示)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

以gDNA为模板的PCR扩增，获得4378bp片段，结果如图1。测序结果表明，TSA基因由9个外显子(图1中用黑色实心方框表示)和8个内含子(图1中用黑色实线表示)组成。

实施例3：马蓝BcTSA基因的生物信息学分析

采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)软件，预测出BcTSA蛋白含有典型的Trp_syntA保守结构域并且Trp_syntA结构域覆盖整个蛋白序列上第57位至第314位的氨基酸长度(如图2A所示)，是TSA类蛋白的标志保守域，在植物中含有这一结构域的蛋白多数是参与色氨酸合成的蛋白。

通过SWISS-MODEL，其中TSA以Crystal structure of Tryptophan synthasealpha chain homolog BX1(PDB id：1rd5.1)为参比模板，TSA与参比模板两者序列一致性达到59.46％，构建BcTSA蛋白三维结构(如图2B所示)，从结构上看，BcTSA包含1rd5.1的全部功能结构域。BX1是初生代谢途径通过吲哚类生物碱途径分支的可以催化生成游离吲哚的一个代表性酶，从而可以推断出马蓝BcTSA具有同样的功能。

实施例4：马蓝BcTSA基因的亚细胞定位分析

根据实施例2生物信息学分析的内容可知，BcTSA基因具有Trp_syntA结构域，为进一步验证BcTSA基因的性质，本实施例构建了BcTSA基因的亚细胞定位载体，通过转化水稻原生质体，证实BcTSA定位于叶绿体，符合BcTSA基因的特性。

1.亚细胞定位载体的构建

在本实施例中，设计正向引物、反向引物，具体为：正向引物为subTSA-F:aaAGATCTtatggcagctgccgctttcaa(如SEQ ID NO：5所示)，含Bgl II酶切位点；反向引物为subTSA-R:aaACTAGT ttctttcagagcagctttta(如SEQ ID NO：6所示)，含Spe I酶切位点。以含目的基因(BcTSA基因)的菌液为模板进行PCR，酶切和连接，最终获得测序正确的BcTSA基因亚细胞定位载体。

PCR反应体系及条件如下：模板1μL，正、反向引物各1μL，2×Phusion HF PCRMaster Mix 12.5μL，去离子水9.5μL，构成25μL反应体系。反应条件为预变性：98℃30sec，变性：98℃10sec，退火：55℃30sec，延伸：72℃1min继续延伸：72℃8min，其中变性-退火-延伸经历35个循环。

酶切反应体系如表1所示。

表1

反应体系组分	体积	反应体系组分	体积
				PHB-Flag Plasmid	24μL	TSA Plasmid	24μL
Bam HI-HF	1.8μL	Bam HI-HF	1.8μL
				SpeI-HF	1.8μL	SpeI-HF	1.8μL
10×Cutsmart	6μL	10×Cutsmart	6μL
				ddH2O	26.4μL	ddH2O	26.4μL
总体积	60μL	总体积	60μL

按照表1配制完成混合液后，轻轻吹打混匀，37℃培养箱孵育3小时，然后电泳、胶回收、连接。

根据电泳后目的条带亮度，按照片段与载体摩尔比为3：1～7：1加入相应体积胶回收溶液，利用NEB公司T4连接酶，将TSA基因连入PHB-Flag载体。连接体系如表2所示。

表2

反应体系组分	体积
		基因片段	8μL
载体	2μL
		T4 DNA Liagase	1μL
2×Buffer	2μL
		ddH2O	7μL
总体积	20μL

按照表2配制完成混合液后，轻轻吹打混匀，16℃过夜连接(大约8～9小时)。连接产物转化Trans1-T1大肠杆菌，挑取单克隆，送测序获得目的重组载体。

2.原生质体转化及观察

按照质粒大提QIAGEN试剂盒的操作说明，提取获得纯度和浓度较高的BcTSA基因亚细胞定位载体，然后转化水稻原生质体。具体方法参照PEG介导的原生质体转化方法。以相同条件下转化1301-GFP空载体的原生质体作为阴性对照。

转化完成的水稻原生质体，室温25℃培养18h后用激光共聚焦显微镜观察，发现BcTSA特异地定位在叶绿体中，与吲哚类生物碱合成部位相一致(如图2C所示)。

实施例5：马蓝BcTSA基因表达特征分析

1.材料准备

选取福建省莆田市仙游县书峰乡一马蓝种植示范田(25°25'N 118°39'E)，选取一定规模的未开花马蓝植株，地上部分喷洒茉莉酸甲酯(MeJA)(100μM，辅以黑色塑料袋避光保湿)，处理后分别于0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、36h、48h和72h收取马蓝叶片，立即投入液氮速冻，于-80℃保存备用(三个生物学重复)，脱落酸(ABA)(100μM)和水杨酸(SA)(100μM)处理方法同MeJA。此外，选取马蓝植株的根、茎、叶作为非应激条件下的马蓝样品。根据实施例1中所使用的总RNA的提取方法，分别提取马蓝不同组织部位和诱导材料的总RNA，并反转录成cDNA。

2.实时荧光定量PCR分析

通过primer 5设计BcTSA基因和18S内参基因跨内含子的定量PCR引物，具体序列如表3所示，使用TransStart Top Green qPCR Supper Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR分析。仪器为Thermal Cycler Dice，PCR采用两步法，条件为：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40个循环。按照2^-ΔΔCt值法计算基因相对表达量。

表3定量PCR引物序列

引物	引物序列(5’-3’)
		TSA-F-1	ACCGGAGTTCATGGACTTGT(如SEQ ID NO:7所示)
TSA-R-1	AGCCGGGACCCTTTCATTTA(如SEQ ID NO:8所示)
		qPCR18S-F	GCTTCCCTCCCGACAATTTC(如SEQ ID NO:9所示)
qPCR18S-R	AGTCGGGTTGTTTGGGAATG(如SEQ ID NO:10所示)

实验结果显示，经不同外界因素刺激后，马蓝基因表达发生一定变化。在MeJA诱导条件下，马蓝叶片中BcTSA表达随诱导时间增加先上升，在诱导12h后表达量达到最大值，随后表达量下降，如图3A所示；在ABA诱导条件下，马蓝叶片中BcTSA变化比较不稳定，在诱导4h、8h、36h和48h后表达量较高，其余时间点表达量变化不大，如图3B所示；在SA诱导条件下，马蓝叶片中BcTSA表达量变化的总体趋势是先上升然后下降，如图3C所示；组织器官表达分析结果显示BcTSA基因在茎中表达量最高，约为叶中的2倍，根和叶中BcTSA基因表达量相当，如图3D所示。

实施例6：马蓝BcTSA蛋白的表达纯化

1.BcTSA蛋白表达载体构建

在本实施例中，利用诺唯赞ClonExpress^TM II一步法无缝克隆试剂盒构建BcTSA原核表达载体。插入片段PCR反应中使用的5'端寡核苷酸引物序列为：acgacgacgacaaggCCATGGgaatggcagctgccgctttcaa(如SEQ ID NO:11所示)包含Nco I限制性内切酶的酶切位点和起始密码子；3'端引物序列为：gtggtggtggtggtgCTCGAGttctttcagagcagctttta(如SEQ IDNO:12所示)包含Xho I限制性内切酶的酶切位点。将2μg环状pET-32a质粒加入到20μL酶切反应体系中，37℃酶切2h。酶切完成后，将线性化克隆载体和插入片段扩增产物进行连接反应，最终获得测序正确的BcTSA基因原核表达载体。

2.BcTSA蛋白表达

提取上步中获得的载体质粒，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，挑选表达BcTSA蛋白的阳性菌株，接种于8ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜，1：100稀释于LB培养基继续振荡培养3hr，至OD₆₀₀＝0.7，加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度1mM后16℃80rpm振荡诱导16h。然后5000g 4℃离心15min去上清，收集菌体，置冰上，用20ml PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)重悬，超声破碎，12000g 4℃离心10min，取上清进行纯化。沉淀用相同体积PBS重悬后备用。

3.BcTSA蛋白的纯化

取上步中所得的蛋白上清液，按照Bio-Scale Mini Profinity GST Cartridges的纯化说明书对其进行纯化，然后进行SDS-PAGE电泳检测。

分别取沉淀溶液、纯化前上清和纯化后上清各10μl，加入2×SDS上样缓冲液5μl，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，取上清加入10％的SDS-PAGE胶中进行电泳。

图4是BcTSA重组蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中原核表达的SDS-PAGE检测结果。融合蛋白分子量约为51.5kDa，BcTSA蛋白分子量为33.5kDa。图4中箭头指向蛋白条带为BcTSA蛋白纯化后上清SDS-PAGE图；M为蛋白分子量标准(Marker)，其分子量范围是10-170KD。

结果表明：BcTSA基因能成功利用pET-32a载体的表达元件进行表达；BcTSA融合蛋白基本存在于上清液中。

实施例7：马蓝BcTSA基因的植物过表达双元载体的构建

在本实施例中，以含目的基因(BcTSA基因)的菌液为模板，设计带酶切位点的正向引物PHB-TSA-F：aaaGGATCCatggcagctgccgctttcaa(如SEQ ID NO:13所示，含Bam HI酶切位点)和反向引物PHB-TSA-R：aaaACTAGTttctttcagagcagctttta(如SEQ ID NO:14所示，含SpeI酶切位点)，用PFU酶进行PCR扩增。经基因克隆的相同步骤(参见实施例1)，最后选取测序正确的含目的基因的单克隆，按全式金公司的质粒抽提试剂盒提取质粒。

利用Bam HI和Spe I双酶切的方法，分别酶切上述实验中获得的质粒和过表达载体(PHB-Flag)质粒。然后按照NEB公司T4连接酶的操作说明，连接酶切后的片段，获得BcTSA基因的双元过表达载体PHB-35SX2-BcTSA，植物表达载体PHB-35SX2-BcTSA的构建示意图如图5所示。

实施例8：发根农杆菌介导的BcTSA过表达载体遗传转化菘蓝叶片及转基因毛状根的获得

1.含BcTSA过表达载体根癌农杆菌菌株的获得

在该实施例中，将实施例7中获得的BcTSA基因植物双元过表达载体PHB-35SX2-BcTSA，采用冻融法将该质粒转入C58C1根癌农杆菌中，然后PCR鉴定，阳性菌株为成功转入过表达载体的发根农杆菌。

2.叶盘法C58C1农杆菌介导菘蓝发根遗传转化

2.1发根农杆菌介导菘蓝发根

选取第一步中所得到的阳性C58C1农杆菌大摇至OD₆₀₀＝0.6，离心，菌体以MS培养基重悬，活化30min，然后1cm²的菘蓝叶盘浸入活化好的农杆菌培养液中，200rpm，28℃摇床上浸染10min。捞出叶盘平放在1/2MS培养基上，置于恒温培养箱中(25℃)暗培养2d后将叶盘转入到毛状根诱导培养基(1/2MS+潮霉素20mg/L+头孢霉素500mg/L)上于继续暗培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得潮霉素抗性毛状根；然后将生长良好的毛状根通过PCR反应进行分子鉴定；经鉴定为阳性毛状根转移到1/2MS液体培养基进行扩大培养。

2.2抗性毛状根的PCR鉴定

在本实施例中，以BcTSA基因构建过表达载体时的引物PHB-TSA-F为正向引物，过表达载体PHB-Flag上的一段序列为反向引物RBCSR(ATTAACTTCGGTCATTAGAG GC，如SEQ IDNO:15所示)，提取潮霉素抗性培养基上生长足够量发根的DNA，进行PCR鉴定。

结果表明，以转基因菘蓝发根DNA为模板，利用设计的特异性引物，能扩增出特异DNA片段；而以野生型菘蓝发根DNA为模板，利用设计的特异性引物，未能获得任何片段。

实施例9：利用LC-MS/MS测定转基因菘蓝中吲哚类生物碱的含量

1.样品的制备

分别收获实施例6中不同株系的过表达转基因BcTSA以及野生型菘蓝毛状根，于50℃烘箱中烘至恒重，然后磨成粉末。称取约0.2g干粉于15mL离心管中，加入5mL提取液(甲醇：三氯甲烷)，用40W超声波处理60min，5000rpm离心10min收集上清液后再加5mL提取液超声波处理60min后合并上清液，用0.22μm滤膜过滤，取5mL上清液进行真空旋转挥干后加入200μL甲醇进行复溶，15000rpm离心15min取上清即可用于LC-MS/MS含量测定。

2.仪器条件及标准品的配置

质谱条件如表4。

表4质谱条件参数

化合物/参数	Precursor Ion	Product Ion	F值	CE值	Polarity
						indigo	263.1	77	130	25	Positive
indirubin	263.1	219.1	140	25	Positive
						indican	294	131	110	6	Negative
isatin	148.1	102.1	140	40	Positive
						oxindole	134.1	106	130	24	Positive
indoxyl	134.1	106	120	18	Positive

色谱条件：采用安捷伦1290液相色谱-G6460三重四级杆质谱联用仪；色谱柱：ZORBAX SB-C18 3.5μm，2.1×100mm，PN：861753-902；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；单针运行时间：25min。

混标配制：分别精密称取靛蓝(Indigo)、靛玉红(Indirubin)、吲哚苷(Indican)、靛红(Isatin)、吲哚酮(Oxindole)和3-羟基吲哚(indoxyl)标准品2.00mg。均加2mL流动相(乙腈-0.1％甲酸水溶液)溶解得1.0mg/mL的标准溶液。经超声溶解后，分别取七不同标准品溶液100μL加流动相300μL稀释至1mL，即得到混标。混标溶液按照比例稀释得到混标标准曲线溶液。由于吲哚酮出峰时间与3-羟基吲哚的出峰时间比较接近，因此单独配制标准曲线。

样品的测定和计算：

如图6所示(图6中横坐标CK为野生型，T-5、T-14，T-15、T-19代表不同株系转基因BcTSA菘蓝)，在本发明中BcTSA基因过表达毛状根中吲哚苷、3-羟基吲哚、吲哚酮、靛红、靛蓝和靛玉红的含量均提高。与野生型相比，过表达BcTSA基因过表达菘蓝毛状根中吲哚苷、3-羟基吲哚、吲哚酮、靛红、靛蓝和靛玉红含量分别提高了1.05-9.24倍，1.53-12.67倍，1.91-5.51倍，2.90-5.08倍，3.37-8.96倍和5.71-22.46倍。结果为三个生物学重复的平均值，误差线表示标准差，统计分析采用t-test检验。因此，本发明在菘蓝毛状根中过表达BcTSA基因可以使吲哚苷、3-羟基吲哚、靛红、靛蓝和靛玉红吲哚类生物碱含量增高。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第二军医大学

华侨大学

<120> 一种马蓝BcTSA基因及其编码的蛋白与应用

<130> /

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 948

<212> DNA

<213> 马蓝(Baphicacanthus cusia)

<400> 1

atggcagctg ccgctttcaa ggctatttgc ttccttcacc ctaggaccac tttcaatacc 60

ccaccacagc gttgcccttc tattgccttt ccggcggcca aatcgctcca gtgtaaccct 120

gccatggcgg cgctcaccgc ttcccccgcc ctctccatct ccgagacttt cgtcaaattg 180

aaagaacgtg gagaggtggc gttgattccg tacattaccg ctggtgatcc tgacctttca 240

accactgcag aagctcttaa ggtccttgat ttgtcaggtt ctgacatcat agaactgggg 300

gtaccttact cagatccttt ggccgatgga cctgttattc aggatgccgc cacacgtgca 360

ttagccagag gaaccacctt tgagagtatc attgagatgc ttaaggatgt gattcctcaa 420

ttatcatgcc caatttcact gttcacatat tataacccaa tacttaagcg tggtgtggat 480

aaattcatga cgactgtgaa agataccgga gttcatggac ttgttgttcc agatgtccct 540

cttgaggaga ctgagatatt gaggaaagaa gcttctagca aaaatataga actggtgctg 600

cttacaaccc ccaccactcc tactgagcga atgaaagcca ttgctgaagc ttcagaagga 660

tttctctatc ttgtaagctc tgtgggagtg acgggagcaa gatcatccat aaatgaaagg 720

gtcccggctc ttcttcgcga cattaaagag gcaacaaaca agccggtggc agttggtttt 780

ggtatctcca aacctgagca tgtcaaacag atggctggat ggggagcaga tggtgtgatt 840

attggaagtg ctatagtgaa aatattgggt gaagcaaaat ctcctgaaga aggattgaaa 900

gagttggaag cattcaccaa aagcttaaaa gctgctctga aagaatga 948

<210> 2

<211> 315

<212> PRT

<213> 马蓝(Baphicacanthus cusia)

<400> 2

Met Ala Ala Ala Ala Phe Lys Ala Ile Cys Phe Leu His Pro Arg Thr

1 5 10 15

Thr Phe Asn Thr Pro Pro Gln Arg Cys Pro Ser Ile Ala Phe Pro Ala

20 25 30

Ala Lys Ser Leu Gln Cys Asn Pro Ala Met Ala Ala Leu Thr Ala Ser

35 40 45

Pro Ala Leu Ser Ile Ser Glu Thr Phe Val Lys Leu Lys Glu Arg Gly

50 55 60

Glu Val Ala Leu Ile Pro Tyr Ile Thr Ala Gly Asp Pro Asp Leu Ser

65 70 75 80

Thr Thr Ala Glu Ala Leu Lys Val Leu Asp Leu Ser Gly Ser Asp Ile

85 90 95

Ile Glu Leu Gly Val Pro Tyr Ser Asp Pro Leu Ala Asp Gly Pro Val

100 105 110

Ile Gln Asp Ala Ala Thr Arg Ala Leu Ala Arg Gly Thr Thr Phe Glu

115 120 125

Ser Ile Ile Glu Met Leu Lys Asp Val Ile Pro Gln Leu Ser Cys Pro

130 135 140

Ile Ser Leu Phe Thr Tyr Tyr Asn Pro Ile Leu Lys Arg Gly Val Asp

145 150 155 160

Lys Phe Met Thr Thr Val Lys Asp Thr Gly Val His Gly Leu Val Val

165 170 175

Pro Asp Val Pro Leu Glu Glu Thr Glu Ile Leu Arg Lys Glu Ala Ser

180 185 190

Ser Lys Asn Ile Glu Leu Val Leu Leu Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr

195 200 205

Glu Arg Met Lys Ala Ile Ala Glu Ala Ser Glu Gly Phe Leu Tyr Leu

210 215 220

Val Ser Ser Val Gly Val Thr Gly Ala Arg Ser Ser Ile Asn Glu Arg

225 230 235 240

Val Pro Ala Leu Leu Arg Asp Ile Lys Glu Ala Thr Asn Lys Pro Val

245 250 255

Ala Val Gly Phe Gly Ile Ser Lys Pro Glu His Val Lys Gln Met Ala

260 265 270

Gly Trp Gly Ala Asp Gly Val Ile Ile Gly Ser Ala Ile Val Lys Ile

275 280 285

Leu Gly Glu Ala Lys Ser Pro Glu Glu Gly Leu Lys Glu Leu Glu Ala

290 295 300

Phe Thr Lys Ser Leu Lys Ala Ala Leu Lys Glu

305 310 315

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

cctttcattc tttcagagca gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gaagacaact gatggcagct 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

aaagatctta tggcagctgc cgctttcaa 29

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

aaactagttt ctttcagagc agctttta 28

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

accggagttc atggacttgt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

agccgggacc ctttcattta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

gcttccctcc cgacaatttc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

agtcgggttg tttgggaatg 20

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

acgacgacga caaggccatg ggaatggcag ctgccgcttt caa 43

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

gtggtggtgg tggtgctcga gttctttcag agcagctttt a 41

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

aaaggatcca tggcagctgc cgctttcaa 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

aaaactagtt tctttcagag cagctttta 29

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

attaacttcg gtcattagag gc 22

Claims

1.一种马蓝BcTSA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的马蓝BcTSA基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种含有如权利要求1所述的马蓝BcTSA基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因毛状根。

4.根据权利要求3所述的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因毛状根，其特征在于，在制备所述的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因毛状根时，用于扩增马蓝BcTSA基因的引物对包括：正向引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；反向引物：核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。

5.根据权利要求3所述的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因毛状根，其特征在于，所述的重组表达载体为质粒PHB-35SX2-BcTSA；所述的重组菌为大肠杆菌或农杆菌；所述的转基因毛状根为转基因菘蓝毛状根、转基因拟南芥毛状根或转基因玉米毛状根。

6.一种如权利要求1所述的马蓝BcTSA基因在生物合成吲哚类生物碱中的应用。

7.一种如权利要求2所述的马蓝BcTSA基因编码的蛋白在生物合成吲哚类生物碱中的应用。

8.一种如权利要求1所述的马蓝BcTSA基因在提高植物中吲哚类生物碱含量中的应用。

9.一种如权利要求2所述的马蓝BcTSA基因编码的蛋白提高植物中吲哚类生物碱含量中的应用。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述植物为菘蓝、拟南芥或玉米。

11.如权利要求3-5任一项所述的马蓝BcTSA基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因毛状根在生物合成吲哚类生物碱中的应用。

12.一种提高植物中吲哚类生物碱含量的方法，其特征在于，所述的方法包含以下步骤：

S1：构建含马蓝BcTSA基因的重组表达载体，所述马蓝BcTSA基因序列如SEQ ID NO:1所示；

S2：将步骤S1构建的重组表达载体转入宿主细胞农杆菌，并将其转化植物的叶盘；

S3：通过抗生素筛选得到转化成功的植物发根，并培育使之长成毛状根，所得的转基因毛状根中吲哚类生物碱含量得到提高。