CN109295024B

CN109295024B - 降低OsSAMS1蛋白及其编码基因表达在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中的应用

Info

Publication number: CN109295024B
Application number: CN201710604760.7A
Authority: CN
Inventors: 李毅; 赵珊珊; 洪薇; 魏春红
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2017-07-24
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2037-07-24
Also published as: CN109295024A

Abstract

本发明提供了降低OsSAMS1蛋白及其编码基因表达在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中的应用。所述蛋白OsSAMS1的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明发现RDV外壳蛋白Pns11能够与水稻OsSAMS1蛋白相互作用，使得OsSAMS1酶活性升高，OsSAMS1蛋白过量积累的水稻更容易感病，而通过CRISPR/Cas9途径将OsSAMS1敲除的转基水稻对RDV的抗性增强。

Description

降低OsSAMS1蛋白及其编码基因表达在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及降低OsSAMS1蛋白及其编码基因表达在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中的应用。

背景技术

乙烯是植物经典激素之一，也是唯一的一种气体激素。乙烯在植物的各个生长发育阶段都发挥着重要的作用，包括种子萌发、根毛发育、茎和根的伸长抑制、植物开花、果实成熟以及器官的衰老和脱落等。此外，由于乙烯具备能够快速扩散到植物的整个植株和迅速对外界环境做出反应的特点，它还是介导植物应对各种非生物与生物胁迫的重要激素。

几乎所有的植物都能合成乙烯，但大多数情况下浓度都很低。经过多年的研究科学家们已经比较完整的揭示了乙烯的生物合成途径，其中最大的研究进展就是确定了S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)和1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)作为植物体内乙烯合成的前体。由SAM转化为乙烯主要分为三个步骤：首先甲硫氨酸和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosyl-L-methionine synthetase,SAMS)的催化下生成SAM，SAM是植物体内重要的生化代谢中间产物，参与多种生物合成途径。其次，SAM在ACC合成酶(ACS)的催化作用下生成ACC及甲硫腺苷(MTA)，其中ACC用于继续合成乙烯，而MTA则通过甲硫氨酸循环变回甲硫氨酸，以保证在甲硫氨酸水平下降时仍能够维持乙烯的快速生物合成。最后，由ACC氧化酶(ACO)催化ACC合成乙烯。

SAMS是乙烯合成通路中的关键酶，它广泛存在于真核、原核等生物中。在金属离子存在的条件下，SAMS以ATP和甲硫氨酸为底物，在细胞内合成SAM，这是目前体内所知道的SAM生成的唯一途径。对植物中SAMS的研究目前主要集中于长春花、拟南芥、番茄和水稻等。植物中的SAMS也存在同工酶，一般没有内含子，5’非翻译区对基因的转录和翻译起着十分重要的作用。水稻全基因组中存在3个编码腺苷甲硫氨酸合成酶的基因。分别为OsSAMS1、OsSAMS2和OsSAMS3，它们在DNA以及氨基酸序列上都存在很高的同源性。三者在水稻中均为组成型表达，其中OsSAMS1在水稻中的表达丰度要远高于OsSAMS2和OsSAMS3，而且在各组织和各生长时期表达都很高。分别对三个基因进行降低表达发现，OsSAMS1被降低表达后产生的异常表型最严重，推测其在水稻中发挥的作用最大。若对三个基因同时进行降低表达，则会导致植株致死。

水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus，RDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员(Fauquet CM et al.,1995.Updated ICTV list ofnames and abbreviations of viruses,viroids,and satellites infectingplants.Archives of Virology.140:393-413)。RDV是引起水稻矮缩病的病原，可以感染水稻，造成水稻严重减产。RDV的传播需借助于昆虫介体叶蝉。RDV为双链RNA病毒，其基因组为十二条双链RNA。根据这十二条双链RNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率由慢到快，分别命名为S1到S12。RDV基因组编码至少七种结构蛋白，包括P1、P2、P3、P5、P7、P8、P9；五种非结构蛋白，包括Pns4、Pns6、Pns10、Pns11、Pns12。

Pns11是RDV的非结构蛋白，由S11编码，它在N端包含一个锌指结构，C端包含一个双组份的核定位信号，Pns11能够以序列非特异性的方式结合单链或双链的DNA或RNA(Xuet al.,1998.Rice Dwarf Phytoreovirus segment S11 encodes a nucleic acidbinding protein.Virology.240(2):267-272.)。另外，Pns11是RDV病毒包涵体基质的主要成分之一，可能与子代病毒粒子的装配以及病毒RNA的合成相关。(Wei et al.,2006，Pns12protein of Rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms andnucleation of viral-assembly complexes.Journal of General Virology.87(2):429-438.)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于调控植物抗水稻矮缩病(或提高植物对水稻矮缩病毒抗性)的蛋白OsSAMS1，所述蛋白是：

(A)具有序列表中的序列2所示的氨基酸序列的蛋白；

(B)包括与序列2所示的氨基酸序列具有95％以上，优选98％以上，更优选99％以上的同一性的氨基酸序列且具有对水稻矮缩病毒抗性的蛋白。

上述(B)的蛋白可以通过置换、取代、附加或缺失(A)的序列中一个或多个氨基酸来获得。

本发明的另一个目的是提供用于调控植物抗水稻矮缩病(或提高植物对水稻矮缩病毒抗性)的编码蛋白OsSAMS1的基因，所述基因是：

(A)具有序列表中的序列1所示的碱基序列的DNA分子；

(B)编码具有序列表中的序列2所示的氨基酸序列的蛋白的DNA分子；

(C)编码蛋白的DNA分子，所述蛋白为包括与序列2所示的氨基酸序列具有95％以上，优选98％以上，更优选99％以上的同一性的氨基酸序列且具有对水稻矮缩病毒抗性的蛋白。

本发明的又一个目的是提供用于敲除编码蛋白OsSAMS1的基因的载体。在一个实施方案中，该载体是上述基因的CRISPR/Cas9载体pH-Ubi-cas9-sams1:sgRNA。该CRISPR-Cas9载体利用Gateway兼容性CRISPR/Cas9系统生成(Miao et al.,2013,Targetedmutagenesis in rice using CRISPR-Cas system.Cell Research.23(10):1233)，包括中间载体和终载体，其中，中间载体含有特异性靶向OsSAMS1外显子的sgRNA，其DNA序列为：TGATACCTTCCTCTTTACCT。将中间载体和CRISPR-Cas9终载体进行Gateway重组后转入水稻中，该sgRNA可引导Cas9切割靶基因OsSAMS1，从而引起该基因发生移码突变，致使其功能缺失。

本发明还提供了构建上述CRISPR/Cas9载体的方法，该方法包括：

1)根据网站ftp://ftp.cbi.pku.edu.cn/pub/supplementary_file/.依据末端序列为NGG的PAM位点，选取靶向OsSMAS1编码区N端的20bp特异性靶点序列如下：TGATACCTTCCTCTTTACCT；

2)根据靶点的DNA序列设计引物，并在引物两端加上BsaI酶切位点，引物序列为SAMS1-5'BsaI：5’-GGCATGATACCTTCCTCTTTACCT-3’，SAMS1-3'BsaI：5’-AAACAGGTAAAGAGGAAGGTATCA-3’；

3)将两条引物进行退火，然后用限制性内切酶BsaI将中间载体pOs-sgRNA进行酶切，回收酶切产物，再用T4DNA ligase将引物退火产物与中间载体酶切产物进行连接，生成含有靶点序列的中间载体；

4)将上述连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，涂布卡纳抗性培养基，菌落PCR筛选得到阳性转化子；

5)分别提取阳性转化子以及终载体pH-Ubi-cas9-7的质粒，利用Gateway系统中的LR酶将二者以1:1的比例进行重组，转化大肠杆菌菌株DH5α，涂布壮观霉素抗性的培养基得到转化子，提取转化子的质粒送去测序，阳性转化子即为最终重组载体，命名为pH-Ubi-cas9-sams1:sgRNA。

本发明的再一个目的提供了上述蛋白OsSAMS1或其编码基因或所述编码基因的CRISPR/Cas9载体在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中(或在调控植物抗水稻矮缩病中)的应用。

上述应用中，所述水稻矮缩病的病原为水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus)(Fauquet CM et al.,1995.Updated ICTV list of names and abbreviations ofviruses,viroids,and satellites infecting plants.Archives of Virology.140:393-413)。

上述应用中，所述植物优选为单子叶植物或双子叶植物，上述单子叶植物为水稻。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，所述包括如下步骤：将上述蛋白OsSAMS1的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的水稻矮缩病抗性低于所述目的植物；或者将上述基因CRISPR/Cas9载体转入目的植物中，得到其敲除的转基因植物，所述转基因植物的水稻矮缩病抗性高于所述目的植物。

上述方法中，所述蛋白OsSAMS1的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1，或者为编码具有序列表中的序列2所示的氨基酸序列的蛋白的DNA分子，或者编码蛋白的DNA分子，所述蛋白为包括与序列2所示的氨基酸序列具有95％以上，优选98％以上，更优选99％以上的同一性的氨基酸序列且具有对水稻矮缩病毒抗性的蛋白。

上述方法中，所述水稻矮缩病的病原菌为水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus)(Fauquet CM et al.,1995.Updated ICTV list of names and abbreviations ofviruses,viroids,and satellites infecting plants.Archives of Virology.140:393-413)。

上述方法中，所述蛋白OsSAMS1的编码基因通过重组载体导入目的植物。

所述重组载体为将所述蛋白OsSAMS1的编码基因插入表达载体中得到的重组载体。例如通过以上所述方法制备的重组载体。上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，上述单子叶植物为水稻。

所述转基因植物的水稻矮缩病抗性高于所述目的植物具体体现在接RDV后，所述转基因植物的感染的RDV病毒的植株数目少于所述目的植物；可通过鉴定是否含有RDV病毒的目的基因(S11)或者植株的感病特征来确定感染的RDV病毒的植株。

其中植物表达载体包括但不局限于pCambia2300、pCambia1300、pCambia1301、pCambia3301、pWM101等；水稻品种优选为对RDV敏感的品种如中花11、秀水11、日本晴、武3等；水稻组织或细胞的转化方法可选自农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法、脂质体融合法以及其他任意可将质粒导入的方法。

本领域的技术人员懂得，通过置换、取代、附加或缺失蛋白序列中的一个或多个氨基酸，可对其进行修饰而不改变其功能。因此，本发明应该被理解为包括了对序列2所示的(OsSAMS1)蛋白进行的上述修饰。

OsSAMS1基因的碱基序列不局限于序列表中序列1所示，还包括具有将OsSAMS1及带有上述修饰的OsSAMS1蛋白中各氨基酸残基对应的任一密码子进行选择并组合的DNA序列。该密码子的选择可以按照常规方法，也可以参考宿主的密码子偏好型。

本发明的实验证明，本发明发现RDV非结构蛋白Pns11能够与OsSAMS1相互作用，提高OsSAMS1的酶活性，增加产物SAM及乙烯的含量，促进病毒侵染，而将OsSAMS1表达量通过CRISPR/Cas9的方式敲除的水稻，对RDV的抗性增强。

附图说明

图1为Pns11和OsSAMS1蛋白在酵母中相互作用的结果(三次重复)；

图2为免疫共沉淀实验(Co-IP)验证Pns11和OsSAMS1相互作用的结果；

图3为体外酶活实验证明Pns11使得OsSAMS1酶活性增强；

图4为转OsSAMS1水稻的Western鉴定；

图5为转OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻的鉴定；

图6为转OsSAMS1和OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻和野生型水稻(中花11)中SAM及乙烯含量测定；

图7为转OsSAMS1和OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻和野生型水稻(中花11)在RDV侵染后的RDV病毒相关基因的qRT-PCR检测；

图8为感染RDV的不同水稻株系症状图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下将用实施例对本发明进行详细说明，但这些实施例并非对本发明的限制。

实施例1、OsSAMS1蛋白及其编码基因的获得

一、OsSAMS1蛋白及其编码基因的获得

水稻文库的构建所用试剂盒为HybriZAP-2.1Two-HybridPredigested Vector/GigapackCloning Kit(Stratagene)，文库构建及筛选方法根据说明书进行。所用诱饵克隆pDHB1-S11-中S11序列与文献(Xu et al.,1998.Rice Dwarf Phytoreovirus segment S11encodes a nucleic acid binding protein.Virology.240(2):267-272.)中相同。所用酵母菌株为NMY51。筛选得到的阳性克隆经测序和序列分析，确定其编码的蛋白片段具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，将该蛋白全长(即序列2对应蛋白)命名为OsSAMS1，其编码基因为序列表中序列1所示的核苷酸，将其命名为OsSAMS1。

二、OsSAMS1全长序列的克隆及含有该片段的重组载体的获得

根据序列1设计引物，并在引物两端加上所需酶切位点，引物序列为SAMS1-5'SfiI：5’-GGCCATTACGGCCATGGCCGCACTTGATACCTTCCTC-3’，SAMS1-3'Sfi I：5’-GGCCGAGGCGGCCTTAGGCAGAAGGCTTCTCCCACTTG-3’。

依照说明书，用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取中花11水稻(Oryzasativa L.japonica cv.Zhonghua 11,许昱等《“中花11”水稻谷蛋白Gt1基因克隆及蜡质基因启动子引导Gt1基因表达载体的构建》，上海师范大学学报(自然科学版)，2010年4月第39卷第2期，204页，公众可从北京大学获得)的总RNA，用该公司的SuperScript II逆转录酶进行逆转录，得到cDNA。逆转录所用引物为16个核苷酸的Oligod(T)引物。

以逆转录所得cDNA为模板，以上述基因特异性引物SAMS1-5'Sfi I和SAMS1-3'SfiI进行PCR(Polymerase Chain Reaction)反应，得到1191bp的PCR产物，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸。

回收PCR产物后用限制性内切酶Sfi I进行酶切，回收1191bp带有粘性末端的PCR产物；将载体pPR3-N(Dualsystems Biotech公司，产品目录号：P01601-P01629)用限制性内切酶Sfi I酶切，回收6204bp载体骨架；将上述1191bp带有粘性末端的PCR产物与6204bp载体骨架用T₄连接酶连接，转化大肠杆菌菌株DH5α，得到转化子。提取转化子的质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列1所示的基因OsSMAS1插入载体pPR3-N的Sfi I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pPR3-N-SAMS1，即为重组载体。

实施例2、体外证明OsSAMS1蛋白与RDV Pns11的相互作用

一、酵母双杂交实验证明OsSAMS1与RDV Pns11的相互作用

将实施例1得到的重组载体pRR3-N-SAMS1与pDHB1-S11(S11为RDV Pns11蛋白的编码基因，RDV Pns11蛋白的编码基因导入pDHB1中得到的。)共转化酵母菌株NMY51(购自Dualsystems Biotech公司，产品目录号为P01601-P01629)，酵母转化方法采用公知的PEG/LiAc法；转化后的酵母细胞涂布营养缺陷型平板SD/-Trp-Leu，30℃条件下培养2天。转化子划线至SD/-Trp-Leu-His-Ade营养缺陷型平板，30℃培养4天，观察转化子的生长情况。该实验同时设置负对照pPR3-N(购自Dualsystems Biotech公司，产品目录号为：P01601-P01629)和pDHB1-S11、pPR3-N-SAMS1和pDHB1(购自Dualsystems Biotech公司，产品目录号为P01601-P01629)。

结果如图1所示(A：pDHB1-LargeT-和pPR3-N-P53(阳性对照)；B：pPR3-N-SAMS1和pDHB1-S11；C：pPR3-N-SAMS1和pDHB1；D：pPR3-N和pDHB1-S11)。结果证明，OsSAMS1全长蛋白与RDVPns11能在酵母中相互作用。

二、免疫共沉淀实验证明OsSAMS1与RDV Pns11的相互作用

1)pCambia2300-FLAGSAMS1及pWM101-HAS11克隆的构建pCambia2300-FlagSAMS1载体的构建：以pPR3-N-SAMS1为模板，以引物FLAGSAMS1-5'SmaI(序列为:5’-CCGCCCGGGATGGACTACAAGGACGACGATGGCCGCACTTGATACCTTCCTC-3’)和SAMS1-3’XbaI(序列为：5’-GCTCTAGATTAGGCAGAAGGCTTCTCCCACTTG-3’)进行PCR扩增，得到1210bp的PCR产物。将上述PCR产物用SmaI和XbaI双酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切的pCambia2300质粒的8742bp的载体骨架连接，得到重组质粒pCambia2300-FLAGSAMS1，经过测序，重组质粒pCambia2300-FLAGSAMS1为将FLAG-SAMS1插入pCambia2300质粒的SmaI和XbaI酶切位点间得到的载体。

pWM101-HAS11载体的构建：以pDHB1-S11为模板，以引物HAS11-5'KpnI(序列为:5’-CCGGTACCATGTAC CCT TAT GAT GTA CCTGACTACGCAATGAGTGGAACATTACCCTTGGCTATGAC-3’)和S11-3’SmaI(序列为：5’-CCGCCCGGGTTACGCTTTGATTTGCGAGTATTGG-3’)进行PCR扩增，得到600bp的PCR产物。将上述PCR产物用KpnI和SmaI双酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切pWM101质粒的9961bp的载体骨架连接，得到重组质粒pWM101-HAS11，经过测序，重组质粒pWM101-HAS11为将HAS11插入pWM101质粒的KpnI和SmaI酶切位点间得到的载体。

pCambia2300-FlagSAMS1和pWM101-HAS11分别转化农杆菌EHA105，转化方法为公知的电击转化方法，得到EHA105/pCambia2300-FlagSAMS1和EHA105/pWM101-HAS11。

2)HAPns11和FLAGSAMS1在烟草中的表达

分别挑取EHA105/pCambia2300-FlagSAMS1和EHA105/pWM101-HAS11单菌落，接入2ml LB液体培养基(含有Kanamycin 100mg/L，Rifampicin 50mg/L)，28℃振荡培养16hr(hr为小时hour的简写)。1:50转接入10ml LB液体培养基(含有Kanamycin 100mg/L，Rifampicin50mg/L)，继续培养至OD₆₀₀约为0.8。4000rpm(rpm为每分钟转速)离心5min(min为分钟)收菌。AS buffer(10mM MES，150μM AS，10mM MgCl₂)重悬，调OD₆₀₀至1.0。

将两种菌液以1:1(体积)混合，通过压力注射方法注射烟草N.benthamiana(记载该烟草的非专利文献为Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2 Proteininteractswith ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis ofGibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公众可从北京大学获得)并分别单独取两种菌悬液通过压力注射方法注射烟草作为负对照。烟草继续生长3天后，将注射的叶片置于液氮中研磨成粉末。

3)免疫共沉淀实验

取约500mg上述叶片粉末加入1.5ml离心管中，加入1ml IP Buffer(150mM NaCl，50mM Tris-Cl(pH7.5)，0.1％NP-40，5mM DTT，每50ml加1片蛋白酶抑制剂(ProteaseInhibitor Cocktail Tablets,EDTA-free；Roche)，混匀后4℃，12000rpm离心10min，将上清吸出转移至新的离心管中。再次以上面条件离心5min，将上清吸出转移至新的离心管中，防止吸到沉淀，得到烟草蛋白提取物。

在上述步骤中得到的烟草蛋白提取物中加入20μlprotein G beads(GEhealthcare，17-0618-06)，同时加入0.2μl FLAG抗体(Sigma，F3165)，4℃温育1.5hr。4℃，1000rpm离心1min，吸掉上清。用IP Buffer洗beads 3次。加入50μl 3×protein samplebuffer(125mM Tris-Cl(pH6.8)，20％甘油，6％SDS，0.004％溴酚蓝，30mM DTT)，95℃加热5min，吸取上清进行SDS-PAGE。

SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及产品说明书进行。所用抗体为anti-FLAG-HRP(sigma)和anti-HA-Peroxidase(Roche)。

结果如图2所示，表明用FLAG抗体能够将FLAGSMAS1和HAPns11同时沉淀下来，说明这两种蛋白之间相互作用。

实施例3、Pns11能够激活OsSAMS1的酶活性

一、表达克隆构建及蛋白的表达

以pDHB1-S11质粒为模板，用S11-5'SalI(序列为：5’-CCCGGGTTACGCTTTGATTTGCGAGTATTGG-3’和S11-3'PstI(序列为：5’-CTGCAGTTACTTACGCTTTGATTTGCGAGTATTGG-3’)进行PCR扩增，得到570bp的PCR产物。将此570bp的PCR产物以SalI和PstI双酶切后，凝胶电泳回收570bp的酶切产物；将pMAL-p2x质粒(New England Biolabs，E8000S，本身表达MBP蛋白)用SalI和PstI双酶切，凝胶电泳回收6703bp的载体骨架；将570bp的酶切产物和6713bp的载体骨架以T4DNA连接酶连接，得到重组载体pMAL-p2x-S11，经过测序，该重组载体为将S11序列的DNA分子插入pMAL-p2x的SalI和PstI酶切位点间得到的载体，命名为pMAL-p2x-S11。

以pPR3-N-SAMS1质粒为模板，用SAMS1-5'KpnI(序列为：5’-GGTACCATGGCCGCACTTGATACCTTCCTC-3’和SAMS1-3'PstI(序列为：5’-CTGCAGTTAGGCAGAAGGCTTCTCCCACTTG-3’)进行PCR扩增，得到1191bp的PCR产物。将此1191bp的PCR产物用KpnI和PstI双酶切后，凝胶电泳回收1191bp的酶切产物；将pGEX-4T-1质粒(GEHealthcare Life Sciences公司，28-9545-49，本身表达GST蛋白)用KpnI和PstI双酶切，凝胶电泳回收4900bp的载体骨架；将1191bp的酶切产物和4900bp的载体骨架以T4DNA连接酶连接，得到重组载体pGEX-4T-SAMS1，经过测序，该重组载体为将序列表中序列1所示的DNA分子插入pGEX-4T-1的KpnI和PstI酶切位点间得到的载体，命名为pGEX-4T-SAMS1。

将pMAL-p2x-S11、pMAL-p2x和pGEX-4T-SAMS1质粒分别转化原核表达菌株Rosetta(DE3)：取0.5μl质粒，加入50μl感受态细胞中，混匀后冰上静置30min；42℃热激90sec，加入1ml新鲜LB培养基，37℃振荡培养1hr；3000rpm离心2min收集菌体，涂布LB平板(含100mg/LAmpicillin)，得到Rosetta(DE3)/pMAL-p2x-S11(SalI和PstI双酶切鉴定，得到570bp的酶切产物的为阳性)、Rosetta(DE3)/pMAL-p2x和Rosetta(DE3)/pGEX-4T-SAMS1(KpnI和PstI双酶切鉴定，得到1191bp的酶切产物的为阳性)。

分别挑Rosetta(DE3)/pMAL-p2x-S11、Rosetta(DE3)/pMAL-p2x和Rosetta(DE3)/pGEX-4T-SAMS1单菌落接于5ml LB培养基中(含100mg/L Ampicillin)，37℃过夜培养。1:200转接于300ml LB培养基中(含100mg/L Ampicillin)培养至OD₆₀₀约为0.6。对于pMAL-p2x-S11和pMAL-p2x加入IPTG至终浓度0.5mM，对于pGEX-4T-SAMS1加入IPTG至终浓度0.0125mM，诱导表达4hr，得到Rosetta(DE3)/pMAL-p2x-S11菌液,、Rosetta(DE3)/pMAL-p2x和Rosetta(DE3)/pGEX-4T-SAMS1菌液。5000rpm离心10min收集菌体。加入5ml过柱缓冲液(20mM Tris-Cl pH7.5，100mM NaCl，0.1％NP-40，1mM DTT，0.01M PMSF)悬浮菌体，超声破碎。4℃，12000rpm,离心20min，取上清液加入到用8倍体积过柱缓冲液洗涤过的AmyloseResin Column(适用于pMal-p2x载体)或Glutathione Sepharose^TM4B(适用于pGEX-4T-1载体)，使其缓缓流过柱体。用12倍体积过柱缓冲液洗涤。对于MBP融合蛋白，用含有10mM麦芽糖的过柱缓冲液洗脱纯化的蛋白。对于GST融合蛋白，加入蛋白酶切掉GST标签，直接穿出即为去掉标签的OsSAMS1蛋白。用Bradford法测定蛋白的浓度(Bio－Rad)。

二、MBP-Pns11在体外能够激活OsSAMS1的酶活性

15μL反应体系含Tris-HCl(pH 8.0)100mM，KCl 200mM，MgCl₂ 10mM，DTT 1mM，ATP1mM，[³⁵S]L-Met(1175Ci/mmol)(中国同福股份有限公司)5μCi。

在一个干净的管子中先将30pmol OsSAMS1和不同比例的MBP-Pns11(或MBP)预先混合，30℃反应20min，再加入其它成分，于30℃继续反应20min。最后加入1.5μL 0.5M EDTA终止反应。

取5μL反应体系点于预先于80℃活化过的HPTLC Silica Gel 60F254板上进行层析。展开液为正丁醇-冰乙酸-水(60:15:25)。

待展开液跑到距离层析板边缘1cm时停止层析，将薄层取出，室温晾干(或用吹风机吹干)，用保鲜膜平整覆盖后，压磷屏4hr后用Typhoon FLA900(GE Healthcare LifeSciences公司)扫描。

结果如图3所示，固定OsSAMS1的量在30pmol，从0pmol到180pmol逐渐增加MBP-Pns11(或MBP)的量，使二者的比例(MBP-Pns11:OsSAMS1或MBP:OsSAMS1)分别为0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0和6.0，随着MBP-Pns11量的增加，底物³⁵S标记的甲硫氨酸逐渐减少，而产物³⁵S标记的SAM含量逐渐增加(图3A)，单独MBP蛋白对底物和产物的量无影响(图3B)，说明Pns11对OsSAMS1有激活作用，使产物SAM的含量增加。

实施例4、OsSAMS1过量表达能够提高水稻SAM及乙烯含量，OsSAMS1CRISPR/Cas9降低水稻SAM及乙烯含量。

一、表达载体的构建

1)pCambia2300-FLAGSAMS1构建见实施例2、二、1)。

2)pH-Ubi-cas9-sams1:sgRNA：根据网站ftp://ftp.cbi.pku.edu.cn/pub/supplementary_file/.依据末端序列为NGG的PAM位点，选取靶向OsSMAS1编码区N端的20bp特异性靶点序列：TGATACCTTCCTCTTTACCT根据靶点序列所示的DNA序列设计引物，并在引物两端加上BsaI酶切位点，引物序列为SAMS1-5'BsaI：5’-GGCATGATACCTTCCTCTTTACCT-3’，SAMS1-3'BsaI：5’-AAACAGGTAAAGAGGAAGGTATCA-3’；将两条引物进行退火，然后用限制性内切酶BsaI将中间载体pOs-sgRNA进行酶切，回收酶切产物，再用T4DNA ligase将引物退火产物与中间载体酶切产物进行连接，生成含有靶点序列的中间载体。将上述连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，涂布卡纳抗性培养基，菌落PCR筛选得到阳性转化子。分别提取阳性转化子以及终载体pH-Ubi-cas9-7的质粒，利用Gateway系统中的LR酶将二者以1:1的比例进行重组，转化大肠杆菌菌株DH5α，涂布壮观霉素抗性的培养基得到转化子，提取转化子的质粒送去测序，阳性转化子即为最终重组载体，命名为pH-Ubi-cas9-sams1:sgRNA。

二、过量表达转OsSAMS1以及OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻的获得

1)愈伤组织的诱导培养

中花11水稻(以下也称为野生型水稻)种子去壳，先用70％乙醇浸泡10min，再用0.1％升汞浸泡30min；进行表面除菌。用大量无菌水洗去种子表面的溶液，用无菌滤纸吸去种子表面的水分。将种子置于成熟胚愈伤诱导培养基平板上，用Parafilm膜封闭平皿边缘，于26℃温箱内避光培养。大约15天后，小心取下长出的愈伤组织，转移到成熟胚继代培养基上，同样条件继续进行培养。每两周需进行一次继代培养。用于转化时，需挑选继代培养5天左右、呈淡黄色的颗粒状愈伤组织。

2)农杆菌的培养

将pCambia2300-FLAGSAMS1和pH-Ubi-cas9-sams1:sgRNA电转入农杆菌EHA105中，得到重组菌EHA105/pCambia2300-FLAGSAMS1和EHA105/pH-Ubi-cas9-sams1:sgRNA。

将EHA105/pCambia2300-FLAGSAMS1和EHA105/pH-Ubi-cas9-sams1:sgRNA在含有抗生素(50mg/L Kanamycin，50mg/L Rifampicin)的LB平板上划线，28℃培养2天。挑取单菌落接入液体LB培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5，加入乙酰丁香酮至终浓度100mM，得到用于转化水稻愈伤组织的农杆菌悬液。

3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

将继代愈伤组织放入灭过菌的锥形瓶中，倒入农杆菌悬液使之浸没愈伤组织。室温放置20min，并不时轻轻晃动使愈伤组织与菌液充分接触。用无菌的镊子轻轻取出愈伤组织，放于无菌滤纸上吸去多余的菌液，转移到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基平板上。28℃暗培养3天，得到经过共培养的愈伤组织。

4)抗性愈伤组织的筛选与分化

将经过共培养的愈伤组织用适量无菌水清洗，除去表面残余的农杆菌，放在筛选培养基上，26℃避光培养进行筛选，两周后转移到新的筛选培养基上继续筛选两周。挑选经过两轮筛选后状态较好的愈伤组织，将其转移到分化培养基平板上，先避光培养3天，然后再转至光照培养箱中(15hr/day)进行光照培养。一个月后可见分化出的小苗。当分化的小苗长至约2cm时，将其转移到锥形瓶中的生根培养基上，继续培养两周左右。选择长势较好、根系发达的小苗，用自来水洗去根部的培养基后移栽入土壤中，收取种子，得到T₁代转FLAGSAMS1和OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻种子，播种得到T₁代转FLAGSAMS1和SAMS1 CRISPR/Cas9水稻。

T₁代的水稻种子通过潮霉素或G418初步筛选(pCambia2300载体带有G418抗性筛选基因，pH-Ubi-cas9-7载体带有潮霉素抗性筛选基因)，发芽的种子，表明载体转入水稻。将发芽的种子种入土中，生长2周后，取0.1g叶片，用液氮磨成粉末。

OsSAMS1过量表达的转基因水稻株系的叶片粉末中加入蛋白提取缓冲液(0.25MTris-HCl，pH6.8，8％SDS，8％β-巯基乙醇，20％甘油)200μl,冰上孵育10min，100℃煮沸10min，4℃，12000rpm离心10min后取上清，进行SDS-PAGE，转膜之后用Western检测。SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及产品说明书进行。所用抗体为anti-FLAG-HRP(sigma),用抗体anti-Actin检测水稻内源Actin蛋白，作为内参。如图4，在45KDa处出现条带者为阳性，表明基因转入且蛋白表达，选择三个株系#10，#17和#25用于之后的抗病分析实验(图中“－”为野生型中花11水稻，用作负对照)。

OsSAMS1 CRISPR/Cas9的转基因水稻株系的叶片粉末用于提取基因组DNA，具体方法参照高效植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：DP350)。之后，以0.5g基因组DNA为模板，引物SAMS1-5’：5’-CATAGTGGCACCACGATTGATTATGC-3’和引物SAMS1-3’：5’-GCTCTCATTGCGGTACTCAACAGTC-3’进行PCR反应，PCR产物直接送测序，然后进行序列比对。如图5所示，DNA测序结果比对显示两个阳性的株系分别命名为SAMS1KO#31和SAMS1KO#39，其中，SAMS1KO#31在OsSAMS1编码区第27和28位碱基之间插入一个“T”，SAMS1KO#39缺失了24到31位碱基，造成了OsSAMS1氨基酸序列的移码和提前终止，从而使得OsSAMS1蛋白缺失。

三、过量表达转OsSAMS1以及OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻中SAM及乙烯含量的测定

1)SAM含量的测定：取0.2g新鲜的水稻叶片。液氮充分研磨。加入1mL预冷的5％三氯乙酸，冰上充分振荡15min进行提取。4℃，12000rpm离心15min，吸取上清，过滤到新的管子中，吸取150μL到色谱瓶的内插管中，待测。所有样品全部置于冰上。标准品的配制：SAM标准品购自Sigma，货号A2408，配成以下5个浓度的标准品，0.000625mg/mL，0.00125mg/mL，0.0025mg/mL，0.005mg/mL，0.01mg/mL。标准品与样品经过相同的提取过程。检测仪器为Agilent UPLC 1290-MS/MS 6495，参数如下：

化合物名称	前体离子	产物离子	极性
				SAM	399	249.5	正极
SAM	399	135.6	正极

根据标准曲线计算SAM的含量。如图6A所示，过量表达转OsSAMS1的水稻(SAMS1OE)中SAM含量高于野生型中花11水稻，而OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻(SAMS1KO)中SAM含量低于野生型中花11水稻(星号代表有显著差异)。

2)乙烯含量的测定：同部位水稻叶片剪成8cm的小段，每6个叶片作为一个样本，将叶片称重，然后放入50mL西林瓶中，加入3mL双蒸水，用封口膜封严瓶口，防止漏气，置于28℃，48hr后测定。打开氢气发生器，待指示数字为0时，开GC，开电脑，双击桌面的程序图标，打开色谱工作站。等待各项参数均达到设定值后，先选择clean程序对内部环境进行clean。clean程序结束后选择测定程序，此时各参数会有变化，待参数稳定后且基线跑平后可以开始测定。色谱条件：

色谱柱：毛细管柱载气：N₂ 载气流速：1mL/min

进样口温度：130℃检测器温度：250℃柱温：80℃

准备标样：准备一个1L容量的干净烧杯，注入3-5μL标准乙烯气体，使其终浓度达到3～5ppm。待气体在烧杯中均匀分散开后，用微量注射器(Hamilton)吸取100μL标样进样，积分算出乙烯标样的峰面积。用微量注射器吸取100μL样品进样，积分算出样品乙烯的峰面积，换算成乙烯含量。换算公式如下：

N：标准乙烯气体的浓度

S：标准乙烯气体的峰面积

S1：样品乙烯气体的峰面积

V：容器的体积

W：测定样品所含的鲜重

T：密封时间。

结果如图6B所示，过量表达转OsSAMS1的水稻(SAMS1 OE)中乙烯含量高于野生型中花11水稻，而OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻(SAMS1 KO)中乙烯含量低于野生型中花11水稻(星号代表有显著差异)。

实施例5、OsSAMS1过量表达能够提高水稻对RDV的敏感性，OsSAMS1 CRISPR/Cas9能够提高水稻对RDV的抗性。

1)通过荧光定量PCR(qRT-PCR)鉴定RDVS11的表达量来鉴定RDV的侵染

用携带RDV(参见Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reducedbiosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公众可从北京大学获得)的叶蝉(病原菌为水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus))接种T₁代转OsSAMS1过量表达和CRISPR/Cas9转基因水稻和野生型水稻中花11，每种水稻接种30株，白天30度，晚上22度，湿度60％培养，每株接5头叶蝉，咬食三天后将叶蝉捉出，咬食过的水稻在阳光温室中培养(自然光，温度。实验重复3次，结果取平均值)。

接毒4周后，提取T₁代转OsSAMS1过量表达、CRISPR/Cas9转基因水稻和野生型水稻中花11感病后的水稻叶片粉末，分别加入Trizol(Invitrogen)，按照说明书所述方法提取RNA。之后，按照下表1，用RQ1DNase(Promega，货号：M610A)对RNA中的基因组DNA进行消化：

表1 为消化体系

然后取2ug消化后的RNA进行反转录qRT-PCR，具体方法参见invitrogen M-MLVReverse Transcriptase(货号：28025-021)。以OsEF1a作为内参，内参的引物为EF1a-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’和EF1a-R：5‘-AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT-3’，检测S11的表达量，S11的引物为S11-F：5’-ATGAGTGGAACATTACCCTTGG-3’，和S11-R：5’-TTACTTACGCTTTGATTTGCG-3’。结果如图7所示，可以看出，OsSAMS1过量表达T1代水稻(SAMS1OE)中S11的积累量高于野生型水稻中花11，而OsSAMS1 CRISPR/Cas9转基因水稻中S11的积累量低于野生型水稻中花11(图中星号表示有显著差异).因此，OsSAMS1过量表达能够提高水稻对RDV的敏感性，而OsSMAS1 CRISPR/Cas9能提高水稻对RDV的抗性。

2)通过表型确定RDV侵染率

接毒4周后，观察30株T₁代转OsSAMS1过量表达、30株OsSAMS1 CRISPR/Cas9转基因水稻和30株野生型水稻中花11的症状(其中感染RDV病毒的为植株矮缩，叶色浓绿，叶片僵硬，在叶片或叶鞘上出现白色斑点并与叶脉平行排列成虚线状，无感染RDV病毒的为叶片或叶鞘上不出现白色斑点)，统计有症状植株数目，计算带毒率＝(有表型株数/总株数)*％。

结果统计如下表2：

表2 为转基因水稻在病毒侵染后带毒率统计结果

可以看出，OsSAMS1过量表达水稻感病率更高，而OsSAMS1 CRISPR/Cas9水稻感病率相对较低。除此以外，我们对不同株系感病水稻进行了拍照，如图8所示，为侵染后4周健康，OsSAMS1过量表达和OsSAMS1 CRISPR/Cas9转基因水稻的感病症状图。可以看出，OsSAMS1过量表达的水稻感病症状更强，表现为矮化程度更强，叶片上表示病毒积累的斑点数量更多；而OsSAMS1 CRISPR/Cas9的转基因水稻的感病症状则相对更弱，表现为矮化程度相对野生型更弱，而病斑数量更少(图8，图中WT代表野生型中花11水稻，SAMS1 OE代表OsSAMS1过量表达转基因水稻，SAMS1 KO代表OsSAMS1 CRISPR/Cas9的转基因水稻)。与野生型水稻相比，OsSAMS1过量表达转基因水稻更加易感，而OsSAMS1 CRISPR/Cas9转基因水稻更加抗病。

序列表

<110> 北京大学

<120> 降低OsSAMS1蛋白及其编码基因表达在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中的应用

<130> 1707673F

<140> 2017106047607

<141> 2017-07-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggccgcac ttgatacctt cctctttacc tcggagtctg tgaacgaggg ccaccctgac 60

aagctctgcg accaagtctc agatgctgtg cttgatgcct gcctcgccga ggaccctgac 120

agcaaggtcg cttgtgagac ctgcaccaag acaaacatgg tcatggtctt tggtgagatc 180

accaccaagg ctaacgttga ctatgagaag attgtcaggg agacatgccg taacatcggt 240

tttgtgtcag ctgatgtcgg tctcgatgct gaccactgca aggtgcttgt gaacatcgag 300

cagcagtccc ctgacattgc acagggtgtg cacggccact tcaccaagcg ccctgaggag 360

attggtgctg gtgaccaggg acacatgttt ggatatgcaa ctgatgagac ccctgagttg 420

atgcccctca gccatgtcct tgctaccaag cttggcgctc gtcttacgga ggttcgcaag 480

aatgggacct gcgcatggct caggcctgac gggaagaccc aagtgactgt tgagtaccgc 540

aatgagagcg gtgccagggt ccctgtccgt gtccacaccg tcctcatctc tacccagcat 600

gatgagacag tcaccaacga tgagattgct gctgacctga aggagcatgt catcaagcct 660

gtcattcccg agcagtacct tgatgagaag acaatcttcc atcttaaccc atctggtcgc 720

ttcgtcattg gcggacctca tggtgatgct ggtctcactg gccggaagat catcattgac 780

acttatggtg gctggggagc tcacggtggt ggtgccttct ctggcaagga cccaaccaag 840

gttgaccgca gtggagcata cgtcgcaagg caagctgcca agagcattgt tgctagtggc 900

cttgctcgcc gctgcattgt ccaagtatca tacgccatcg gtgtcccaga gccactgtcc 960

gtattcgtcg acacatacgg cactggcagg atccctgaca aggagatcct caagattgtg 1020

aaggagaact tcgacttcag gcctggcatg atcatcatca accttgacct caagaaaggc 1080

ggcaacggac gctacctcaa gacggcggct tacggtcact tcggaaggga cgacccagac 1140

ttcacctggg aggtggtgaa gcccctcaag tgggagaagc cttctgccta a 1191

<210> 2

<211> 396

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Ala Leu Asp Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Asn Glu

1 5 10 15

Gly His Pro Asp Lys Leu Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Val Leu Asp

20 25 30

Ala Cys Leu Ala Glu Asp Pro Asp Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Cys

35 40 45

Thr Lys Thr Asn Met Val Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala

50 55 60

Asn Val Asp Tyr Glu Lys Ile Val Arg Glu Thr Cys Arg Asn Ile Gly

65 70 75 80

Phe Val Ser Ala Asp Val Gly Leu Asp Ala Asp His Cys Lys Val Leu

85 90 95

Val Asn Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Gly

100 105 110

His Phe Thr Lys Arg Pro Glu Glu Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly His

115 120 125

Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Leu Met Pro Leu Ser

130 135 140

His Val Leu Ala Thr Lys Leu Gly Ala Arg Leu Thr Glu Val Arg Lys

145 150 155 160

Asn Gly Thr Cys Ala Trp Leu Arg Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr

165 170 175

Val Glu Tyr Arg Asn Glu Ser Gly Ala Arg Val Pro Val Arg Val His

180 185 190

Thr Val Leu Ile Ser Thr Gln His Asp Glu Thr Val Thr Asn Asp Glu

195 200 205

Ile Ala Ala Asp Leu Lys Glu His Val Ile Lys Pro Val Ile Pro Glu

210 215 220

Gln Tyr Leu Asp Glu Lys Thr Ile Phe His Leu Asn Pro Ser Gly Arg

225 230 235 240

Phe Val Ile Gly Gly Pro His Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys

245 250 255

Ile Ile Ile Asp Thr Tyr Gly Gly Trp Gly Ala His Gly Gly Gly Ala

260 265 270

Phe Ser Gly Lys Asp Pro Thr Lys Val Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Val

275 280 285

Ala Arg Gln Ala Ala Lys Ser Ile Val Ala Ser Gly Leu Ala Arg Arg

290 295 300

Cys Ile Val Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly Val Pro Glu Pro Leu Ser

305 310 315 320

Val Phe Val Asp Thr Tyr Gly Thr Gly Arg Ile Pro Asp Lys Glu Ile

325 330 335

Leu Lys Ile Val Lys Glu Asn Phe Asp Phe Arg Pro Gly Met Ile Ile

340 345 350

Ile Asn Leu Asp Leu Lys Lys Gly Gly Asn Gly Arg Tyr Leu Lys Thr

355 360 365

Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Asp Asp Pro Asp Phe Thr Trp Glu

370 375 380

Val Val Lys Pro Leu Lys Trp Glu Lys Pro Ser Ala

385 390 395

Claims

1.蛋白或基因或包含所述基因的载体在提高水稻对水稻矮缩病毒抗性中的应用，其中所述蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示，所述基因的碱基序列如序列表中的序列1所示。

2.一种提高水稻对水稻矮缩病毒抗性的方法，包括如下步骤：将用于敲除编码蛋白OsSAMS1的基因的载体转入目的植物水稻中，得到敲除编码蛋白OsSAMS1的基因的转基因水稻，其中所述基因的碱基序列如序列表中的序列1所示。

3.一种降低水稻对水稻矮缩病毒抗性的方法，包括如下步骤：将基因导入目的植物水稻中，得到转基因水稻，所述基因的碱基序列如序列表中的序列1所示。