CN113528552B

CN113528552B - 一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合及其应用

Info

Publication number: CN113528552B
Application number: CN202110748006.7A
Authority: CN
Inventors: 夏涛; 姚胜波; 高丽萍; 刘亚军; 庄菊花; 代新龙
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2024-01-09
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113528552A

Abstract

本发明公开了一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合及其应用，属于分子生物学及代谢工程学技术领域，包括基因CsSCPL4和基因CsSCPL5，所述基因CsSCPL4和基因CsSCPL5具有如下序列中任意一种：(1)如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；(2)具有(1)的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明首次从茶树中克隆并验证了催化酯型儿茶素生物合成的基因CsSCPL4和CsSCPL5的功能，还提供了含有CsSCPL4和CsSCPL5基因的表达盒、载体组合、转基因工程农杆菌、转基因稳定共表达烟草和共表达重组蛋白。

Description

一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及代谢工程学领域，具体涉及的是一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合及其应用。

背景技术

茶树是一种重要的经济作物，现今广泛种植在世界上60多个国家。茶叶具有天然健康属性，已经成为全世界最流行的饮料之一，其消费市场不断扩大。茶叶中富含酯型儿茶素，约占茶叶干重的12％左右。酯型儿茶素是茶树中含量最多的次级代谢产物，与茶树的自身抗性和茶叶的感官品质密切相关。酯型儿茶素是茶叶苦味和涩味的主要贡献物质，与茶叶的感官品质密切相关。同时，酯型儿茶素也是对人体健康非常有益的一类物质，具有抗氧化、减肥降脂、抗病毒、抗癌等功效。

儿茶素类化合物的主体结构是2-苯基苯并吡喃，具有A环、B环和C环。酯型儿茶素是在儿茶素C环的3位羟基上连接有没食子基团。茶树体内的没食子酰基转移酶，负责催化将 βG上的没食子基团转移到儿茶素的C环3位羟基上形成酯型儿茶素。然而，有关参与酯型儿茶素生物合成的功能基因和分子调控机理尚没有真正探明，使得人们难以通过分子标记和育种手段对茶树高积累酯型儿茶素这一重要品质性状进行遗传改良，这也是目前酯型儿茶素生物合成研究领域的热点和难点。

通过对茶树中酯型儿茶素合成关键基因进行挖掘和鉴定，在农业上能够为茶树遗传育种，品质调控等方面奠定理论基础，在工业上能够为酶代谢工程合成高纯度酯型儿茶素提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合及其应用。

本发明采用以下技术方案来实现：

一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合，包括基因CsSCPL4和基因CsSCPL5，所述基因CsSCPL4和基因CsSCPL5具有如下序列中任意一种：

(1)如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)具有(1)的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

进一步改进在于，所述基因CsSCPL4和CsSCPL5是从茶树鲜叶中分离并克隆获得。

进一步改进在于，所述基因CsSCPL4和CsSCPL5编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3 和SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种表达盒，包含上述协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合。

本发明还提供了一种重组植物表达载体组合，所述载体组合包含将上述协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合重组至PCB2004载体上所获得的PCB-CsSCPL4质粒和PCB-CsSCPL5质粒。

本发明还提供了一种工程菌组合，其所述工程菌组合包含将上述PCB-CsSCPL4质粒和 PCB-CsSCPL5质粒分别转化至农杆菌GV3101获得的工程菌。

本发明还提供了一种上述基因组合在催化酯型儿茶素生物合成中的应用。

本发明还提供了一种酯型儿茶素生物的合成方法，向含有βG和表儿茶素类物质作为底物的反应体系中，加入上述工程菌组合菌液在本式烟叶片中瞬时共表达的重组蛋白，或者是加入上述稳定转基因烟草共表达的重组蛋白，通过酶催化反应合成酯型儿茶素。

进一步改进在于，所述基因组合的共表达重组蛋白的获得方法包括：利用农杆菌介导的瞬时共表达技术，将CsSCPL4基因和CsSCPL5基因共同转化至植物细胞中进行蛋白共表达，或者，将CsSCPL4基因和CsSCPL5基因的阳性稳定转基因植株通过授粉杂交方法获得共表达植株。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供了一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合及其应用，首次从茶树中克隆并验证了催化酯型儿茶素生物合成的基因CsSCPL4和CsSCPL5的功能。

2、本发明还提供了含有CsSCPL4和CsSCPL5基因的表达盒、载体组合、转基因工程农杆菌、转基因稳定共表达烟草和共表达重组蛋白。

3、本发明提供了一种简单高效的酯型儿茶素生物合成技术，为进一步实现利用酶代谢工程生产高纯度酯型儿茶素提供了基础。

4、本发明对CsSCPL4和CsSCPL5基因的功能验证，为茶树酯型儿茶素的生物合成与代谢调控等研究领域奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为本发明实施例中茶树体内共表达的CsSCPL4和CsSCPL5蛋白协同催化酯型儿茶素生物合成流程图。

图2为本发明实施例中CsSCPL4和CsSCPL5基因与不同植物的SCPL基因系统进化树分析图；其中CsSCPL4和CsSCPL5基因分布于SCPL-IA组，该组蛋白具有酰基转移酶功能。

图3为本发明实施例中CsSCPL4和CsSCPL5蛋白与已知的丝氨酸羧肽酶氨基酸序列比对结果图。

图4为本发明实施例中利用烟草真核共表达体系验证CsSCPL4和CsSCPL5基因的酶活功能图；其中，图4-A为农杆菌介导的本式烟瞬时共表达流程图；图4-B为利用UPLC技术检测瞬时共表达的重组蛋白酶反应产物EGCG图；图4-C为底物注射本式烟叶片流程图；图4-D为利用UPLC-MS/MS技术检测本式烟体内酶反应产物EGCG图；图4-E为转基因烟草杂交流程图；图4-F为利用UPLC技术检测稳定共表达的重组蛋白酶反应产物EGCG图。

图5为本发明实施例中CsSCPL4和CsSCPL5共表达的重组蛋白催化合成的酯型儿茶素的LC-MS/MS分析谱图；其中，图5-A为酶反应产物EGCG和ECG的母离子谱图，酶反应分别是以EGC和βG为底物合成EGCG，以EC和βG为底物合成ECG；图5-B为酶反应产物和ECG的二级碎片谱图。

图6为本发明实施例中CsSCPL4和CsSCPL5共表达的重组蛋白酶反应时间梯度曲线图。

图7为本发明实施例中植物表达载体PCB2004的结构图谱。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

1、材料

(1)茶树品种：舒茶早(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze.var.sinensiscultivar Shuchazao)，采集茶树鲜叶，立即用液氮冷冻，存于-80℃冰箱保存备用；

(2)模式植物本式烟和烟草，生长温室条件：16h光照，8h黑暗，环境温度25±1℃。

(3)克隆感受态大肠杆菌细胞DH5α，农杆菌感受态GV3101均购自上海唯地生物技术有限公司；

(4)LB培养基：称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，加950mL纯水，超声至充分溶解后，用1mol/LNaOH溶液调节pH至7.0，加水定容至1L；LB固体培养基，按照每200mLLB液体培养基加3g琼脂粉混匀，121℃高压蒸汽灭菌15min。

(5)卡那霉素母液(50mg/mL)：称取0.5g卡那霉素，溶于10mL灭菌水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存；

(6)利福平母液(20mg/mL)：称取0.2g利福平，溶于10mLDMSO溶液，过滤除菌，分装小管，-20℃保存；

(7)乙酰丁香酮母液(0.2mol/L)：称取0.0314g乙酰丁香酮，充分溶于0.8mLDMSO溶液即可。

(8)MES缓冲液：称取1.066gMES，0.476gMgCl₂，溶于500mL纯水中，超声至充分溶解后，加入0.5mL乙酰丁香酮母液，用1mol/LKOH溶液调pH至5.6。

若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

2、方法

2.1协同催化酯型儿茶素生物合成的基因组合的克隆及表达

2.1.1CsSCPL4和CsSCPL5基因的克隆

(1)根据CsSCPL4和CsSCPL5基因的开放阅读框序列，设计特异引物。

引物序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示：

SEQ ID NO：5：CsSCPL4正向引物：

5’-ATGTTTCCAACAAAGTCATACAGTTC-3’；

SEQ ID NO：6：CsSCPL4反向引物：

5’-CTAAATAGGATAGTAATGAATCCATCTG-3’；

SEQ ID NO：7：CsSCPL5正向引物：

5’-ATGGCACCACAAGCAAAAGTTGAGC-3’；

SEQ ID NO：8：CsSCPL5反向引物：

5’-TTAGATTGGATAATAAGCGAACCAC-3’；

(2)按照多糖多酚总RNA提取试剂盒说明书，从茶树品种舒茶早鲜叶中提取出总RNA，然后利用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，获得茶树cDNA模板。

(3)以茶树cDNA为模板，用SEQ ID NO.5和6所示的引物以及SEQ ID NO.7和8所示的引物分别进行扩增，扩增程序为：98℃变性10s，62℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环，再72℃继续延伸10min。

(4)利用DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物，送测序公司测序，结果表明：两条基因开放阅读框长度均为1443bp，编码480个氨基酸。

(5)植物表达载体构建方法：根据Gateway克隆技术说明书，通过BP反应和LR反应，将CsSCPL4和CsSCPL5基因重组到PCB2004载体上，然后转化至DH5α大肠杆菌感受态，涂布含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。利用菌落PCR鉴定阳性克隆，测序正确后抽提PCB-CsSCPL4质粒和PCB-CsSCPL5质粒。

2.1.2CsSCPL4和CsSCPL5基因的序列分析

茶树体内酯型儿茶素的生物合成途径如图1所示。通过将茶树CsSCPL4和CsSCPL5的蛋白序列与拟南芥、葡萄、柿树等植物中检索到的SCPL蛋白序列一起构建系统进化树，图2 结果显示：CsSCPL4和CsSCPL5蛋白属于SCPL-IA分支，该分支的蛋白在功能划分上属于SCPL酰基转移酶。

从图3的CsSCPL4和CsSCPL5氨基酸序列比对结果，可以看出：CsSCPL4和CsSCPL5序列一致性为50.2％，并具有SCPL蛋白典型特征：信号肽区域、氧阴离子结合位点、五肽基序和形成二硫键的半胱氨酸残基，但是二者在催化三联体的位置存在差异，CsSCPL4蛋白具有保守的催化三联体Ser-Asp-His(S-D-H)；而CsSCPL5蛋白的催化三联体出现了突变现象，为Thr-Asp-Tyr(T-D-Y)。

2.1.3CsSCPL4和CsSCPL5基因的转烟草共表达与蛋白提取技术

本实施例中所用到的烟草共表达和蛋白提取技术为本领域的技术人员常用或完全可以理解的技术手段。

(1)本式烟瞬时共表达技术

将所述植物表达载体PCB-CsSCPL4质粒和PCB-CsSCPL5质粒分别用电击法转入农杆菌感受态GV3101(含pSoup-P19)中，然后涂布在含有50μg/mL卡纳霉素和20μg/mL利福平的培养基上进行抗性筛选。利用菌落PCR鉴定出阳性克隆，获得转基因工程菌。随后挑取阳性菌落，分别摇菌以及扩大培养。待OD600值达到1.0时，离心收集菌体，用MES缓冲液反复重悬三次，然后将菌液OD600值稀释到0.8。然后将CsSCPL4农杆菌液和CsSCPL5农杆菌液等体积混合均匀，室温孵育2h后，注射生长四周的本式烟叶片。人工气候室培养3d 后，收集叶片，用液氮冷冻后保存在-80℃冰箱。

(2)烟草稳定共表达技术

本发明将单基因稳定表达的CsSCPL4转基因烟草和CsSCPL5转基因烟草进行异花授粉杂交。具体操作步骤：首先将CsSCPL4转基因烟草和CsSCPL5转基因烟草在气候室生长至开花，选择半开放还未授粉的花朵作为母本花朵，用剪刀小心去掉雄蕊，再用牙签蘸取父本花朵的花粉，轻轻涂在母本花朵的柱头上，将透明袋子扎几处小孔，套在授粉后的花朵上，防止污染其他花粉。做好标记待种子成熟后收集。取适量的杂交种子放到2mL管子里，随后无菌条件下操作，加1mL75％消毒酒精快速振荡15s，无菌水重复清洗4次；再加0.1％生汞振荡8min，无菌水重复清洗4次。将种子用无菌水悬浮起来后，用枪头吸取种子，均匀滴在 MSK固体培养基(含除草剂10mg/L)培养瓶中。封好封口膜，置于培养室中长出小苗。然后移栽至营养土中，待长至4～5片真叶时，进行PCR验证。筛选出CsSCPL4和CsSCPL5基因共表达的阳性植株后，采摘叶片，液氮冷冻，-80℃保存，以备提取粗酶。

(3)粗酶蛋白提取技术方法

研磨叶片：研钵中加入5g转基因烟草叶片，液氮下充分研磨，加入10mL0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.15MNaCl)后充分研磨成匀浆状溶液。接着，转入50mL离心管中，5000g 离心10min，转移上清至新的离心管中定容至15mL；

硫酸铵分级沉淀蛋白：按照硫酸铵溶液饱和度表，向上清液中加硫酸铵，置于摇床上4℃ 条件下混匀6h，以利于蛋白充分沉淀，离心收集0～85％硫酸铵饱和度区间段的沉淀蛋白，用适量的0.1M磷酸盐缓冲液充分溶解，10000g离心收集上清液，利用考马斯亮兰试剂盒测定蛋白浓度。

2.2CsSCPL4和CsSCPL5共表达重组蛋白的酶活功能验证

2.2.1酶活检测方法

酶活反应体系100μl：包括50mM的磷酸盐缓冲液(pH6.0)，60μg粗酶蛋白，0.4mMEGC， 0.4mMβG没食子酰葡萄糖，4mM抗坏血酸。接着30℃水浴反应3h后，加等体积甲醇后振荡混匀，室温静置5min，然后放超声仪中超声10min，使酶充分变性，12000g离心20min，吸取上清至进样瓶中待测。

UPLC检测酶反应产物方法：安捷伦1260UPLC系统，流动相：A相1％乙酸水，B相纯乙腈，流速0.4mL/min，柱子型号PoroshellHPH-C18column(2.7μm,4.6×100mm)，检测器波长 280nm，进样量5μl，梯度洗脱方法：从0min到5min，B相从1％升至10％；从5min到20min，B相由10％升至35％；从20min到21min，B相从35％降至10％，从21min到23min，B相从10％降至1％，从23min到25min，维持B相1％状态平衡柱子。根据标准品出峰时间和最大紫外吸收峰确定酶反应产物。

UPLC-MS/MS检测酶反应产物方法：安捷伦6460UPLC-QqQ-LC/MS系统，流动相A相为0.4％乙酸水，B相纯乙腈，柱子型号与梯度洗脱方法同上述UPLC方法。质谱条件：电喷雾，负离子模式，采集质荷比在100-1000的化合物。根据标准品和特征离子碎片对产物峰进行鉴定分析。

2.2.2CsSCPL4和CsSCPL5共表达重组蛋白的酶反应产物鉴定

以本式烟为实验材料，利用农杆菌介导的瞬时表达技术，将CsSCPL4、CsSCPL5以及空载PCB2004分别转入本式烟叶片中进行蛋白表达，同时，利用农杆菌介导的瞬时共表达技术，将CsSCPL4和CsSCPL5共同转化至本式烟叶片中进行蛋白共表达(图4-A)。酶活检测结果表明：在CsSCPL4+CsSCPL5基因共表达的酶反应体系中检测到了产物峰EGCG，而同一时间注射的空载PCB2004，CsSCPL4和CsSCPL5单基因表达的酶反应体系中均没有检测到产物峰EGCG(图4-B)。为了进一步在植物体内验证酶活，将底物βG和EGC等比例混合后注射进已转化2天的本式烟叶片内，使底物与植物体内瞬时表达的目的蛋白进行反应，1天后收集叶片(图4-C)。利用UPLC-MS/MS技术检测本式烟叶片的代谢产物，图4-D结果表明：在CsSCPL4+CsSCPL5基因共表达的叶片中检测到了产物峰EGCG，而在单基因表达的叶片中均没有检测到产物峰EGCG。

以烟草为实验材料，利用烟草遗传转化方法分别获得过表达CsSCPL4基因和CsSCPL5 基因的阳性植株烟草，并通过授粉杂交获得CsSCPL4和CsSCPL5基因共表达烟草(图4-E)。然后提取转基因植株粗酶进行酶活检测。UPLC分析图谱显示：在稳定转基因共表达CsSCPL4 和CsSCPL5植株的酶反应样品中检测到了产物峰EGCG，而在单基因过表达植株的酶反应样品中均没有检测到产物峰EGCG(图4-F)。综合以上实验得出结论：只有CsSCPL4和CsSCPL5 基因在烟草体内共表达，才能形成具有催化活性的没食子酰基转移酶。

利用UPLC-MS/MS对酶反应产物进行定性分析，图5结果表明：产物峰的保留时间，一级和二级质谱信息与标准品的色谱和质谱信息一致，进一步确定了酶反应产物为EGCG和 ECG。

2.2.3CsSCPL4和CsSCPL5共表达重组蛋白的底物转化率检测

通过对体外酶活实验设置不同反应时间梯度，从图6共表达的酶反应体系中底物和产物的变化曲线可以看出：随着反应时间的延长，底物βG和EGC在逐渐减少，产物EGCG则逐渐增长，反应1h后的底物转化率达到50％以上，反应3h后的底物转化率能达到80％以上。这为后续利用酶工程生产酯型儿茶素提供了基础条件。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> 茶(TEA)

<400> 1

atgtttccaa caaagtcata cagttctagc ttctctgcta actgtgttag atatgggttg 60

tacatccatt attttctgct tctacttcta ctctcagcac aatctgtctt aggcggccac 120

attgtcaagt atttaccggg atacgatggc gaacttccct ttaaacttga aactggatat 180

attagagtaa atgagtcgga attgttctac tatttcattg agtcacaagg gaaccctcaa 240

gaggacccga ttctcctttg gctcacaggc ggtcctggct gttcttcttt ttgtggactt 300

gtttatgaaa ttggtccaat ggagtttgta attcaaaatt acaccggggg tctaccaaaa 360

ttgagatatt atccatacgc atggacaaag actgctagca ttatatttct tgatgaaccc 420

gtggggaccg ggttctccta ctcaagaact gcggacggtt ggccaacctc agactccaag 480

tcagcagaac aatcttacca attccttaga aagtggtttg atgaacaccc tcaatatcta 540

gcagttcaac tatttgttgg tggtgattct tattcaggca ttactgtccc attggtcact 600

aaaaagattg ttgatggtaa taaagatgga gtcaagccat ttatgaacct caagggatac 660

ttacttggga gcccacgaac agattcagtt attgatgaga attcaaaagt agtttttgct 720

cataggatgg cacttatatc ggatgagatt tatgagaatg ccaaaaaggg ttgcaatgag 780

acttatgtga atatagaccc agcaaacaca gcatgtatag ttgcgctcgg caatatcaaa 840

acgtgcatta aagagctgtt tcgcaatgat attttggaac cgaaatgtgt ttttgcaact 900

cctgaccctg gagaagaacc tgcagcacga aggtctcttg aagaaggtcc ttcagatttc 960

cttctctcac ctccaatgat cccgaatctt tggtgccgaa attttaatta tgtactctcc 1020

tacatctggt caaatgatga tactgttcaa gaagctttac atgttcgaaa gggatctgta 1080

ttgaattggg agagatgcaa caaaagctta tcatacacaa aagacatctt gactgttgtt 1140

cctgttcatg aagaactcaa agaattaggc ttagaagtgc ttgtggagac tggtgaccgt 1200

gacatggttg ttccgtttgt gggtactgtg aaatggataa agtctctgaa tttgacagtt 1260

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tctgagcatg ggtatcgttt gacatatgca actgtaaaag gtgcaggtca cacagctcca 1380

gagtactatc gcagggaatg ctattacatg tttgacagat ggattcatta ctatcctatt 1440

tag 1443

<210> 2

<211> 1443

<212> DNA

<213> 茶(TEA)

<400> 2

atggcaccac aagcaaaagt tgagcatcaa caacgtctaa taaagatgag tttgtgcata 60

tttcttgtgt tggctctctc tagtgtagct gcctctcagt cacttgtcaa gtacttgcca 120

ggttttgatg gagagctgcc cttcaacctt gaaaccggat acatcggcat aggggacacg 180

gatgatgtgc agctatttta ttatttcatt gagtcggaga gagacccagt gactgatcct 240

cttgtcctgt ggctcaccgg tggccctggc tgttcgggtt tctctgcact tgtttacgaa 300

atcggtccat tgttgtttga tgttgagtca tggactggcc aattaccatc tcttagagta 360

aagaaatact catggacaaa ggttgccaac ataatcttta tagaccaacc tgtgggaact 420

ggattttcct atgccagaac atcagctggt tacaatactt ctgacacaaa gtccgtggca 480

caaatctata gttttctcag aaagtggttg gtgtaccatc cgcaattcca aacaaatcct 540

ctctacattg gtggggatac gtattcagga attactgttc cgctcctcgt ccaaacaata 600

ttagatggtc ttgatgaagg gcttgagcca ctcatgggac tccaaggata tttgttggga 660

aacccagtga cagattctta catcgatgat aattcaagga tcccatatgt tcaccgggtg 720

aatctgatat ctgatgagct ttacgaggat gcaaaattat attgccacgg tgactatgtt 780

aatgtacaat tcaacaatag tttatgtgta accgctcttc tggcaatcaa acattgtctg 840

ctgcaaataa acctagttca aattttagaa cctcaatgcg ctttttcatc gcctaggaga 900

atggaaatcg aatgggattt gagagttcga gaagccgaaa ccatagaata tctcgattca 960

ctaaataaac ttcctaagct aacttgcagg agttttagtt acatgctatc cgacaagtgg 1020

gcaaatgata aagctgtcca aaaggctctt aacgtccgag agggaacaat gaattatact 1080

agttggatga ggtgtgcaaa aaccttacca ttctatacag aagatgtctc aagtaccatt 1140

gattatcata aaaatttcac aaagaccggt cttcgagctc ttgtatacag tggtgaccat 1200

gacgttactg ttccatatat tggcacgctg gagtggataa attcactcgg agttcctatt 1260

tttgatcaat ggcgaccgtg gtttgttgat ggccaaattg caggatatac gcagaaatat 1320

atgaatgata actatcgctt ggcatacgca actttaaagg gagcaggata cacagctcca 1380

gaatataaac gcaaggaagc cctcaacctg gtggataggt ggttcgctta ttatccaatc 1440

taa 1443

<210> 3

<211> 480

<212> PRT

<213> 茶(TEA)

<400> 3

Met Phe Pro Thr Lys Ser Tyr Ser Ser Ser Phe Ser Ala Asn Cys Val

1 5 10 15

Arg Tyr Gly Leu Tyr Ile His Tyr Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser

20 25 30

Ala Gln Ser Val Leu Gly Gly His Ile Val Lys Tyr Leu Pro Gly Tyr

35 40 45

Asp Gly Glu Leu Pro Phe Lys Leu Glu Thr Gly Tyr Ile Arg Val Asn

50 55 60

Glu Ser Glu Leu Phe Tyr Tyr Phe Ile Glu Ser Gln Gly Asn Pro Gln

65 70 75 80

Glu Asp Pro Ile Leu Leu Trp Leu Thr Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser

85 90 95

Phe Cys Gly Leu Val Tyr Glu Ile Gly Pro Met Glu Phe Val Ile Gln

100 105 110

Asn Tyr Thr Gly Gly Leu Pro Lys Leu Arg Tyr Tyr Pro Tyr Ala Trp

115 120 125

Thr Lys Thr Ala Ser Ile Ile Phe Leu Asp Glu Pro Val Gly Thr Gly

130 135 140

Phe Ser Tyr Ser Arg Thr Ala Asp Gly Trp Pro Thr Ser Asp Ser Lys

145 150 155 160

Ser Ala Glu Gln Ser Tyr Gln Phe Leu Arg Lys Trp Phe Asp Glu His

165 170 175

Pro Gln Tyr Leu Ala Val Gln Leu Phe Val Gly Gly Asp Ser Tyr Ser

180 185 190

Gly Ile Thr Val Pro Leu Val Thr Lys Lys Ile Val Asp Gly Asn Lys

195 200 205

Asp Gly Val Lys Pro Phe Met Asn Leu Lys Gly Tyr Leu Leu Gly Ser

210 215 220

Pro Arg Thr Asp Ser Val Ile Asp Glu Asn Ser Lys Val Val Phe Ala

225 230 235 240

His Arg Met Ala Leu Ile Ser Asp Glu Ile Tyr Glu Asn Ala Lys Lys

245 250 255

Gly Cys Asn Glu Thr Tyr Val Asn Ile Asp Pro Ala Asn Thr Ala Cys

260 265 270

Ile Val Ala Leu Gly Asn Ile Lys Thr Cys Ile Lys Glu Leu Phe Arg

275 280 285

Asn Asp Ile Leu Glu Pro Lys Cys Val Phe Ala Thr Pro Asp Pro Gly

290 295 300

Glu Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Leu Glu Glu Gly Pro Ser Asp Phe

305 310 315 320

Leu Leu Ser Pro Pro Met Ile Pro Asn Leu Trp Cys Arg Asn Phe Asn

325 330 335

Tyr Val Leu Ser Tyr Ile Trp Ser Asn Asp Asp Thr Val Gln Glu Ala

340 345 350

Leu His Val Arg Lys Gly Ser Val Leu Asn Trp Glu Arg Cys Asn Lys

355 360 365

Ser Leu Ser Tyr Thr Lys Asp Ile Leu Thr Val Val Pro Val His Glu

370 375 380

Glu Leu Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Leu Val Glu Thr Gly Asp Arg

385 390 395 400

Asp Met Val Val Pro Phe Val Gly Thr Val Lys Trp Ile Lys Ser Leu

405 410 415

Asn Leu Thr Val Val Asn Asp Trp Arg Pro Trp Phe Val Asp Gly Gln

420 425 430

Val Ala Gly Tyr Thr Val Lys Tyr Ser Glu His Gly Tyr Arg Leu Thr

435 440 445

Tyr Ala Thr Val Lys Gly Ala Gly His Thr Ala Pro Glu Tyr Tyr Arg

450 455 460

Arg Glu Cys Tyr Tyr Met Phe Asp Arg Trp Ile His Tyr Tyr Pro Ile

465 470 475 480

<210> 4

<211> 480

<212> PRT

<213> 茶(TEA)

<400> 4

Met Ala Pro Gln Ala Lys Val Glu His Gln Gln Arg Leu Ile Lys Met

1 5 10 15

Ser Leu Cys Ile Phe Leu Val Leu Ala Leu Ser Ser Val Ala Ala Ser

20 25 30

Gln Ser Leu Val Lys Tyr Leu Pro Gly Phe Asp Gly Glu Leu Pro Phe

35 40 45

Asn Leu Glu Thr Gly Tyr Ile Gly Ile Gly Asp Thr Asp Asp Val Gln

50 55 60

Leu Phe Tyr Tyr Phe Ile Glu Ser Glu Arg Asp Pro Val Thr Asp Pro

65 70 75 80

Leu Val Leu Trp Leu Thr Gly Gly Pro Gly Cys Ser Gly Phe Ser Ala

85 90 95

Leu Val Tyr Glu Ile Gly Pro Leu Leu Phe Asp Val Glu Ser Trp Thr

100 105 110

Gly Gln Leu Pro Ser Leu Arg Val Lys Lys Tyr Ser Trp Thr Lys Val

115 120 125

Ala Asn Ile Ile Phe Ile Asp Gln Pro Val Gly Thr Gly Phe Ser Tyr

130 135 140

Ala Arg Thr Ser Ala Gly Tyr Asn Thr Ser Asp Thr Lys Ser Val Ala

145 150 155 160

Gln Ile Tyr Ser Phe Leu Arg Lys Trp Leu Val Tyr His Pro Gln Phe

165 170 175

Gln Thr Asn Pro Leu Tyr Ile Gly Gly Asp Thr Tyr Ser Gly Ile Thr

180 185 190

Val Pro Leu Leu Val Gln Thr Ile Leu Asp Gly Leu Asp Glu Gly Leu

195 200 205

Glu Pro Leu Met Gly Leu Gln Gly Tyr Leu Leu Gly Asn Pro Val Thr

210 215 220

Asp Ser Tyr Ile Asp Asp Asn Ser Arg Ile Pro Tyr Val His Arg Val

225 230 235 240

Asn Leu Ile Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Asp Ala Lys Leu Tyr Cys His

245 250 255

Gly Asp Tyr Val Asn Val Gln Phe Asn Asn Ser Leu Cys Val Thr Ala

260 265 270

Leu Leu Ala Ile Lys His Cys Leu Leu Gln Ile Asn Leu Val Gln Ile

275 280 285

Leu Glu Pro Gln Cys Ala Phe Ser Ser Pro Arg Arg Met Glu Ile Glu

290 295 300

Trp Asp Leu Arg Val Arg Glu Ala Glu Thr Ile Glu Tyr Leu Asp Ser

305 310 315 320

Leu Asn Lys Leu Pro Lys Leu Thr Cys Arg Ser Phe Ser Tyr Met Leu

325 330 335

Ser Asp Lys Trp Ala Asn Asp Lys Ala Val Gln Lys Ala Leu Asn Val

340 345 350

Arg Glu Gly Thr Met Asn Tyr Thr Ser Trp Met Arg Cys Ala Lys Thr

355 360 365

Leu Pro Phe Tyr Thr Glu Asp Val Ser Ser Thr Ile Asp Tyr His Lys

370 375 380

Asn Phe Thr Lys Thr Gly Leu Arg Ala Leu Val Tyr Ser Gly Asp His

385 390 395 400

Asp Val Thr Val Pro Tyr Ile Gly Thr Leu Glu Trp Ile Asn Ser Leu

405 410 415

Gly Val Pro Ile Phe Asp Gln Trp Arg Pro Trp Phe Val Asp Gly Gln

420 425 430

Ile Ala Gly Tyr Thr Gln Lys Tyr Met Asn Asp Asn Tyr Arg Leu Ala

435 440 445

Tyr Ala Thr Leu Lys Gly Ala Gly Tyr Thr Ala Pro Glu Tyr Lys Arg

450 455 460

Lys Glu Ala Leu Asn Leu Val Asp Arg Trp Phe Ala Tyr Tyr Pro Ile

465 470 475 480

Claims

1.一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合，其特征在于，包括基因CsSCPL4和基因CsSCPL5，所述基因CsSCPL4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因CsSCPL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合，其特征在于，所述基因CsSCPL4和CsSCPL5是从茶树鲜叶中分离并克隆获得。

3.根据权利要求1所述的一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合，其特征在于，所述基因CsSCPL4和CsSCPL5的编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

4.一种表达盒，其特征在于，包含如权利要求1-3任一所述的一种协同催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合。

5.一种重组植物表达载体组合，其特征在于，所述载体组合包含将权利要求1-3任一所述催化茶树酯型儿茶素生物合成的基因组合重组至PCB2004载体上所获得的PCB-CsSCPL4质粒和PCB-CsSCPL5质粒。

6.一种工程菌组合，其特征在于，所述工程菌组合包含将权利要求5中所述PCB-CsSCPL4质粒和PCB-CsSCPL5质粒分别转化至农杆菌GV3101获得的工程菌。

7.一种如权利要求1-3任一所述的基因组合在催化酯型儿茶素生物合成中的应用。

8.一种酯型儿茶素的生物合成方法，其特征在于，向含有βG和表儿茶素作为底物的反应体系中，加入权利要求1-3任一所述基因组合的共表达重组蛋白，通过酶催化反应合成酯型儿茶素。

9.根据权利要求8所述的一种酯型儿茶素的生物合成方法，其特征在于，所述基因组合的共表达重组蛋白的获得方法包括：利用农杆菌介导的瞬时共表达技术，将CsSCPL4基因和CsSCPL5基因共同转化至植物细胞中进行蛋白共表达，或者，将CsSCPL4基因和CsSCPL5基因的阳性稳定转基因植株通过授粉杂交方法获得共表达植株。