CN110156883B

CN110156883B - 烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2及其编码基因，重组表达载体、基因编辑载体及应用

Info

Publication number: CN110156883B
Application number: CN201910415305.1A
Authority: CN
Inventors: 谢小东; 杨军; 史清照; 罗朝鹏; 魏攀; 张剑锋; 王中; 武明珠; 李锋; 许亚龙; 李泽锋
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2039-05-17
Also published as: CN110156883A

Abstract

本发明涉及烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2及其编码基因，重组表达载体、基因编辑载体及应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过设计特异性引物，克隆获得了烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2的编码基因NtDAD2基因。通过实时定量PCR分析发现，正常烟草植株中，NtDAD2基因在花、叶、茎和腋芽中的表达量较高。NtDAD2基因敲除的突变株系，其分枝明显增多，腋芽增长活跃；表明NtDAD2蛋白在烟草生长发育、分枝发育中具有十分重要的作用。因此，可以利用NtDAD2基因对于植物品种进行育种。

Description

烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2及其编码基因，重组表达载体、基因编辑载体及应用

技术领域

本发明涉及烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2及其编码基因，重组表达载体、基因编辑载体及应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

独脚金内酯（Strigolactones，SLs）是一种新发现的重要植物激素，尤其是在抑制植物的分枝方面具有突出作用。通过对植物多分枝突变体的研究发现，导致突变植株分枝现象明显增加的原因在于天然SLs的合成受阻。SLs是以类胡萝卜素为前体，经脱氧、氧化等过程生成独脚金醇，再转化成具有生物活性、不同类型的的独脚金内酯衍生物。类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD7、CCD8和细胞色素P450单加氧酶（Cyt P450）基因MAX1是独脚金内酯合成酶的重要基因。在矮牵牛中和烟草中，SLs转运蛋白PhPDR1和NtPDR6参与对SLs转运过程。在SLs信号途径中，水稻DWARF14（D14）和拟南芥D14 作为SLs受体。F-box蛋白DWARF3(D3)与SLs的受体D14形成SCF复合体，参与泛素介导的蛋白降解。DWARF53 (D53)基因编码SLs信号途径中的关键抑制因子，能够负调控SLs信号转导。在SLs作用下，D53与D14、D3形成复合体，并被泛素化修饰和降解，从而激活SLs信号转导。D14/DAD2是SLs信号转导的核心元件，在SLs信号转导抑制分枝的过程中发挥了非常重要的作用。

公开号为CN104086637A的中国发明专利申请中公开了烟草SLs转运蛋白基因NtPDR6具有抑制侧枝或腋芽的作用，该专利通过调控SLs转运过程来调节侧枝或腋芽的生长。公开号为CN107653252A中国发明专利申请中公开了棉花GbSLR1基因可响应植物激素信号（独脚金内酯），研究表明棉花GbSLR1基因具有控制植物分枝发育的作用，但棉花GbSLR1基因的功能不明确。烟草作为一种重要的科研模式作物，也是重要的经济作物和农作物，烟草的分枝发育与烟叶产量及其内在品质具有十分密切的关系，但目前尚未有SLs信号转导基因及其在抑制分枝发育方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供烟草SLs信号转导蛋白编码基因，为NtDAD2基因，该基因能够编码烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2。

本发明还提供了烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2，该蛋白与烟草中SLs信号转导相关，在烟草生长发育、分枝发育中具有十分重要的作用。

本发明还提供了包含烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因的重组表达载体，该载体携带NtDAD2基因，因此能够超表达NtDAD2基因，进而抑制烟草分枝和腋芽的增长。

本发明还提供了针对NtDAD2基因的基因编辑载体，该载体能够敲除烟草中的NtDAD2基因。

本发明还提供了上述的烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因和重组表达载体在植物品种育种中的应用，能够获得分枝和腋芽的增长受到抑制的植物品种。

本发明还提供了上述的基因编辑载体在植物品种育种中的应用，能够获得分枝和腋芽增长受到促进的烟草品种。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中通过设计特异性引物，克隆获得了烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2的编码基因NtDAD2基因；实时定量PCR分析表明，正常烟草植株中，NtDAD2基因在花、叶、茎和腋芽中的表达量较高。

烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中的NtDAD2蛋白与烟草中SLs信号转导相关，在烟草生长发育、分枝发育中起着重要的作用。

重组表达载体，所述重组表达载体包含烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因，所述NtDAD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

NtDAD2蛋白能够转导SLs信号，具有抑制侧枝及腋芽生长的作用，因此可以通过构建得到的重组表达载体超表达NtDAD2基因，进而抑制烟草分枝和腋芽的增长。

基因编辑载体，所述基因编辑载体中包含根据NtDAD2基因所设计的的靶位点敲除序列，所述NtDAD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

NtDAD2蛋白能够转导SLs信号，具有抑制侧枝及腋芽生长的作用，可通过基因编辑载体构建NtDAD2基因缺失的转基因突变株，从而促进烟草分枝和腋芽增长。

优选的，依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：

NtDAD2-K-F： 5’- GATTGCTCTGAACGTACGAGTCGT-3’；

NtDAD2-K-R： 5’-AAACACGACTCGTACGTTCAGAGC-3’。该敲除引物序列具有较高的敲除效率。

烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因在植物品种育种中的应用。具体的，烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因在获得植物分枝和腋芽的增长受到抑制的植物品种中的应用。上述的重组表达载体在植物品种育种中的应用。具体的，上述的重组表达载体在获得植物分枝和腋芽的增长受到抑制的植物品种中的应用。

超表达NtDAD2基因可以抑制烟草分枝和腋芽的增长，因此可以利用NtDAD2基因及包含该基因的载体超表达NtDAD2基因，进行植物品种育种，获得植物分枝和腋芽的增长受到抑制的植物品种。

上述的基因编辑载体在植物品种育种中的应用。具体的，上述的基因编辑载体在获得植物分枝和腋芽的增长受到促进的植物品种中的应用。

NtDAD2基因敲除的突变株系，其分枝明显增多，腋芽增长活跃；因此可以利用基因编辑载体使NtDAD2基因少表达或不表达，进行植物品种育种，获得植物分枝和腋芽的增长受到促进的植物品种。

附图说明

图1为本发明试验例2中NtDAD2基因在不同组织中的表达特征图；

图2为本发明试验例3中NtDAD2基因敲除的靶位点选择示意图；

图3为本发明试验例4中T0代转基因系敲除靶位点测序结果图；

图4为本发明试验例4中T0代转基因株系dad2突变体的表型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：

生物材料：

烟草品种：K326，普通栽培烟草品种，所使用的种子由国家烟草基因研究中心提供。

载体：pEASY-T1 Simple 载体，购自北京全式金生物技术有限公司；CRISPR/Cas9载体由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供。

菌株：Trans1-T1化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；LBA4404农杆菌菌株，生物实验中常用菌株，可公开获得；引物的合成和DNA测序由北京六合华大基因科技股份有限公司提供完成。

实验试剂：RNA 提取试剂盒，SuperPure Plant polyRNA Kit；荧光定量PCR酶（SYBR qPCR kit），购自郑州安赛生物科技有限公司；反转录试剂盒、T4连接酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶BsaI，购自NEB公司；DNA扩增酶，购自北京全式金生物技术有限公司；植物基因组提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司。

实验设备：PCR合成仪Tprofessional Thermocycler，Biometra公司；定量PCR仪CFX96，Bio-Rad公司；紫外凝胶成像系统BioSpectrum，UVP公司。

烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因的实施例1

本实施例中烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2的实施例1

本实施例中烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

重组表达载体的实施例1

本实施例中的重组表达载体包含烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因，所述NtDAD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基因编辑载体的实施例1

本实施例的基因编辑载体中包含根据NtDAD2基因靶位点所设计的敲除引物序列，所述NtDAD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述敲除引物序列如下所示：

NtDAD2-K-F： 5’- GATTGCTCTGAACGTACGAGTCGT-3’；

NtDAD2-K-R： 5’-AAACACGACTCGTACGTTCAGAGC-3’。

烟草SLs信号转导蛋白编码基因NtDAD2基因的应用的实施例1

本实施例中通过在植物中稳定的超表达NtDAD2基因，进而获得植物分枝和腋芽的增长受到抑制的植物品种。

重组表达载体的应用的实施例1

本实施例中将包含NtDAD2基因的超表达载体转入植物植株中，在植物中稳定的超表达NtDAD2基因，进而获得植物分枝和腋芽的增长受到抑制的植物品种。

基因编辑载体的应用的实施例1

本实施例中基因编辑载体为CRISPR/Cas9载体，将该载体转化烟草植株后，构建获得了NtDAD2基因敲除的突变株系，该突变株系枝明显增多，腋芽增长活跃；获得了植物分枝和腋芽的增长受到促进的烟草植株。

试验例1 NtDAD2基因的克隆

NtDAD2基因的克隆及获得过程如下所示：

（1）制备cDNA作为克隆模板

取旺长期烟草（红花大金元）的叶片100mg作为样品，在液氮中充分研磨，参照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，然后反转录为cDNA备用。

（2）设计引物，进行PCR扩增

设计用于扩增NtDAD2基因的引物序列如下：

NtDAD2-F：5’-ATGGGTCAGACACTTTTGGATGCTC-3’（如SEQ ID NO.3所示）；

NtDAD2-R：5’-TCACCTATGAGAAAGAGCTCTTCTA-3’（如SEQ ID NO.4所示）。

以步骤（1）中所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；再72℃终延伸10min；PCR扩增4℃保存备用，或者直接进行电泳检测分析。

参照胶回收试剂盒说明书纯化PCR扩增后产物，纯化产物再连接至pEASY-T1载体上，连接体系如下：DNA扩增产物，6μL；pEASY-T1载体，1μL；混匀后，25℃连接25 min。

将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，具体转化过程如下所示：

从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上使其溶解，加连接产物于50μL的Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min；42℃水浴中热激30s，立即置于冰上2min；加入250μL平衡至室温的LB（不含抗生素），37℃摇荡培养1h；取8μL的500mM的IPTG、40μL的20 mg/mL的X-gal，混合后均匀地涂布到LB固体平板（含60μg/μL 氨苄青霉素）上，倒置培养皿，37℃培养过夜。

挑取白斑扩增培养后，提取各质粒DNA，通过质粒PCR扩增对重组质粒进行了鉴定，将对应的阳性克隆送样测序，获得NtDAD2基因序列。

测序分析结果表明，NtDAD2基因编码区长度为807bp个核苷酸，具体如SEQ IDNO.1所示；对该基因分析后可知，其所编码的NtDAD2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

试验例2 烟草不同组织、器官中NtDAD2基因的表达模式分析

采集烟草（红花大金元）不同组织、器官，利用荧光定量PCR对NtDAD2基因的表达模式进行了分析，相关实验过程如下所示。

采集现蕾期烟草的根、茎、叶、腋芽和花作为样品，经液氮速冻后置于－80℃冰箱中，保存备用。

将所保存的材料提取RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA后（参考试剂盒说明书操作即可），以烟草NtL25基因为内参，进行荧光定量PCR检测，检测时，引物序列设计如下：

检测NtDAD2基因的荧光定量引物，引物序列为：

NtDAD2-q-F：5’- GCAAATTACGAGGCATGGGT-3’（如SEQ ID NO.5所示）；

NtDAD2-q-R：5’- TACAGAGTGGTCCCTTGCTG-3’（如SEQ ID NO.6所示）。

检测烟草NtL25基因时，具体引物为：

NtL25-F：5’-CAAAAGTTACATTCCACCG-3’（如SEQ ID NO.7所示）；

NtL25-R：5’-TTTCTTCGTCCCATCAGGC-3’（如SEQ ID NO.8所示）。

荧光定量PCR的条件为：第一步预变性，95℃ 10 s；第二步PCR反应，95℃ 5 s， 60℃ 30 s，39个循环；第三步溶解曲线。

每个样品进行3次生物学重复，通过2^-△△CT方法分析相对基因表达差异。分析结果如图1所示，结果表明NtDAD2基因在花中的表达量最高，叶片、腋芽和茎中均有较高的表达量。

试验例3 基因编辑载体的构建

为进一步了解NtDAD2基因在植株分枝中的作用，构建了用于敲除NtDAD2基因的CRISPR/Cas9表达载体，下面就构建过程简要介绍如下。

首先，根据试验例1所知的NtDAD2基因组和编码区序列，根据靶位点设计的标准，在NtDAD2基因的第一外显子序列上设计20bp长度的靶位点（示意图如图2所示），设计敲除引物序列NtDAD2-K-F和NtDAD2-K-R如下：

NtDAD2-K-F：5’- GATTGCTCTGAACGTACGAGTCGT-3’（如SEQ ID NO.9所示）；

NtDAD2-K-R：5’-AAACACGACTCGTACGTTCAGAGC-3’（如SEQ ID NO.10所示）。

设计反应体系，以获得靶位点的DNA双链（退火），20μL反应体系设计如下：Annealing Buffer for DNA OLigos (5×)，4 μL；上下游引物（NtDAD2-K-F、NtDAD2-K-R），各4 μL（50 μmoL/μL）；Nuclease-free water 补充至20μL。

反应程序为：95℃ 5 min，每8 s下降0.1℃，降至25℃；反应产物4℃保存备用，或者直接进行后续反应。

将上述退火产物与BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体进行连接，并筛选获得用于敲除NtDAD2基因的CRISPR/Cas9表达载体，20μL连接体系设计如下：退火产物，6μL；酶切产物（BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体），3 μL；10× T4 DNA Ligase Buffer，2 μL；T4 DNALigase，1 μL；灭菌水补充至20 μL，37℃连接3h。

然后将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过挑取阳性克隆、扩大培养，提取质粒后，经PCR确认载体构建成功后，低温保存，用于农杆菌转化。

试验例4 NtDAD2基因敲除的转基因植株的获得

将试验例3中所构建CRISPR/Cas9表达载体转化农杆菌，并进而转化烟草植株，构建NtDAD2基因敲除的转基因植株，具体实验过程如下所示。

（1）农杆菌的转化

从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，在冰上冻融，待即将解冻时加入6 μL试验例3所制备CRISPR/Cas9表达载体，轻弹混匀；将混合物置于预冷的电转杯中，冰上放置5min。

将电转仪参数调至：电压2.5 kV，电容25 μF，电阻200 Ω；然后用吸水纸将电转杯外壁上的水滴吸除干净后，把电转杯放入电击槽中，电击5 ms；迅速加入800 μL的预热至28℃的YEB液体培养基，220 rpm、28℃振荡复苏3 h；然后将菌液4500 rpm离心1 min，弃一半体积的上清，重新悬浮后均匀涂于含有Rif（100 μg/mL）、Str（50 μg/mL）和Kan（50 μg/mL）的YEB固体培养基上，28℃倒置培养约2~3 d，直至单菌落形成。

挑取单菌落，扩培后对菌液进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性克隆菌株，即为转化正确的工程菌。

（2）转化烟草植株

取生长一个月左右的烟草无菌苗叶片，用打孔器将叶片处理成直径0.5 cm大小的叶盘，将处理后叶盘在MS固体培养基上预培养3 d。

将上述所制备转化后农杆菌工程菌，培养至OD₆₀₀=0.6左右，4000 rpm离心5 min收集菌体，再用20 mL的MS液体培养基悬浮菌体；然后将上述预培养后叶盘置于菌液中，浸染10 min。

用无菌的滤纸吸干浸染后叶盘周围多余的菌液，在MS+6-BA（2 mg/L）+NAA（0.5mg/L）的固体培养基上暗培养3 d。

用含有Cef（400 mg/L）的无菌水清洗叶盘，并用无菌滤纸吸去多余的液体，将叶盘转到含有6-BA（2 mg/L）、NAA（0.5 mg/L）、Cef（200 mg/L）和Kan（50 mg/L）的MS固体筛选培养基上，28℃光照培养。

待不定芽长到0.5cm时，转移到含Cef（200 mg/L）和Kan（50 mg/L）的MS固体培养基上生根。

待生长一个月左右，取少量叶片，参照植物基因组提取试剂盒说明书提取DNA，通过PCR扩增、克隆、测序的方法，检测阳性转基因株系和突变形式。具体鉴定方法为：

在NtDAD2基因靶位点上下游序列上，设计一对检测引物，该引物位于敲除靶位点的两侧，具体为：

NtDAD2-J-F：5’-TAACAAAAGCGGAAAAAAAAAAAGA-3’（如SEQ ID NO.11所示）；

NtDAD2-J-R：5’-GATCAATACCAAGAGCATCAAGAAT-3’（如SEQ ID NO.12所示）。

以T0代转基因株系DNA模板，进行PCR扩增；PCR条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共25个循环；再72 ℃终延伸10 min；

将PCR扩增产物纯化之后，连接至pEASY-T1载体上，通过转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落进行PCR扩增验证，并送测序。

测序分析结果如图3所示，在T0代植株中，检测到NtDAD2基因主要有3种形式的突变，分别是1个碱基的增加、4个碱基的删除、2个碱基的增加，这些突变均发生在敲除的靶位点上，而野生型植株的NtDAD2基因未检测的任何突变。这说明在T0代植株中已经成功实现了对NtDAD2基因进行了突变。

（3）转基因株系dad2突变体表型变化情况

分别将野生型和转基因株系的T0代植株移栽至盆中，温室培养6周左右，表型观察结果显示，与野生型烟草相比较，阳性植株的腋芽生长加快。当生长至10周时（如图4所示），转基因阳性株的分枝表型更加显著，腋芽生长明显。

综上，通过调控NtDAD2基因的表达情况可以控制烟草的腋芽及分枝的增生情况，从而为烟草株型调控及最终烟草产量奠定应用基础。

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草SLs信号转导蛋白NtDAD2及其编码基因，重组表达载体、基因编辑载体及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 807

<212> DNA

<213> 烟草

<221> NtDAD2基因

<400> 1

atgggtcaga cacttttgga tgctctgaac gtacgagtcg tcggttcagg tgagagattt 60

ttggtgttag ctcatggctt tggaacagac caatcagctt ggaatcgaat tcttcctttt 120

tttctccgag attaccgtgt tgttctttac gaccttgtct gtgccggcag tgtgaatcct 180

gatttcttcg atttccgacg ttatactaca cttgaccctt atgtcgatga cctccttcat 240

attcttgatg ctcttggtat tgatcgttgt gcttatgttg gccactctgt ctccgccatg 300

atcggaattc tcgcctccat tcgccgccct gaactcttct ccaaactcat cctcatcggt 360

gcttctccca ggttcttgaa tgatgaagac taccacggtg gatttgaaca aggagagata 420

gagaaagtat tttcagcaat ggaggcaaat tacgaggcat gggtcaatgg ttttgctccg 480

ttagctgtcg gagcagatgt tccggctgcg gtacgagaat ttagcaggac attgtttaat 540

atgagaccgg acataacatt gtttgtgtca aggacagttt tttataacag tgacatgagg 600

ggagttttag gccttgtgaa agttccatgc catatatttc agacagcaag ggaccactct 660

gtacctgcat cagtggctac gtacctaaag aaccacctag gtggtcggaa tacagtgcat 720

tggttgaata ttgaaggtca tttgccccac cttagtgccc ctactttatt ggctcaagag 780

cttagaagag ctctttctca taggtga 807

<211> 268

<212> PRT

<213> 烟草

<221> NtDAD2蛋白

<400> 2

MET Gly Gln Thr Leu Leu Asp Ala Leu Asn Val Arg Val Val Gly

1 5 10 15

Ser Gly Glu Arg PheLeu Val Leu Ala His Gly Phe Gly Thr Asp

20 25 30

Gln Ser Ala Trp Asn Arg Ile Leu Pro Phe Phe Leu Arg Asp Tyr

35 40 45

Arg Val Val Leu Tyr Asp Leu Val Cys Ala Gly Ser Val Asn Pro

50 55 60

Asp Phe Phe Asp Phe Arg Arg Tyr Thr Thr Leu Asp Pro Tyr Val

65 70 75

Asp Asp Leu Leu His Ile Leu Asp Ala Leu Gly Ile Asp Arg Cys

80 85 90

Ala Tyr Val Gly His Ser Val Ser Ala MET Ile Gly Ile Leu Ala

95 100 105

Ser Ile Arg Arg Pro Glu Leu Phe Ser Lys Leu Ile Leu Ile Gly

110 115 120

Ala Ser Pro Arg Phe Leu Asn Asp Glu Asp Tyr His Gly Gly Phe

125 130 135

Glu Gln Gly Glu Ile Glu Lys Val Phe Ser Ala MET Glu Ala Asn

140 145 150

Tyr Glu Ala Trp Val Asn Gly Phe Ala Pro Leu Ala Val Gly Ala

155 160 165

Asp Val Pro Ala Ala Val Arg Glu Phe Ser Arg Thr Leu Phe Asn

170 175 180

MET Arg Pro Asp Ile Thr Leu Phe Val Ser Arg Thr Val Phe Tyr

185 190 195

Asn Ser Asp MET Arg Gly Val Leu Gly Leu Val Lys Val Pro Cys

200 205 210

His Ile Phe Gln Thr Ala Arg Asp His Ser Val Pro Ala Ser Val

215 220 225

Ala Thr Tyr Leu Lys Asn His Leu Gly Gly Arg Asn Thr Val His

230 235 240

Trp Leu Asn Ile Glu Gly His Leu Pro His Leu Ser Ala Pro Thr

245 250 255

Leu Leu Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ala Leu Ser His Arg

260 265 268

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtDAD2-F

<400> 3

atgggtcaga cacttttgga tgctc 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtDAD2-R

<400> 4

tcacctatga gaaagagctc ttcta 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtDAD2-q-F

<400> 5

gcaaattacg aggcatgggt 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtDAD2-q-R

<400> 6

tacagagtgg tcccttgctg 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtL25-F

<400> 7

caaaagttac attccaccg 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtL25-R

<400> 8

tttcttcgtc ccatcaggc 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtDAD2-K-F

<400> 9

gattgctctg aacgtacgag tcgt 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtDAD2-K-R

<400> 10

aaacacgact cgtacgttca gagc 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtDAD2-J-F

<400> 11

taacaaaagc ggaaaaaaaa aaaga 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> NtDAD2-J-R

<400> 12

gatcaatacc aagagcatca agaat 25

Claims

1.基因编辑载体在植物品种育种中的应用，其特征在于：在获得植物分枝和腋芽的增长受到促进的植物品种中的应用；

所述植物品种为烟草；

所述基因编辑载体中包含根据NtDAD2基因所设计的靶位点敲除序列，所述NtDAD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：

NtDAD2-K-F： 5’- GATTGCTCTGAACGTACGAGTCGT-3’；

NtDAD2-K-R： 5’-AAACACGACTCGTACGTTCAGAGC-3’。