CN114807166B - 一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因及其表达蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因及其表达蛋白和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过生物信息学工具对鹅掌楸bHLH家族序列进行分析，然后通过测序和同源比较，克隆得到编码bHLH转录因子的LcbHLH02399基因。对LcbHLH02399基因构建过表达载体，转化杂交鹅掌楸愈伤，通过液体培养，获得转基因杂交鹅掌楸；比较LcbHLH02399转基因杂交鹅掌楸植株和野生型植株在4℃光照培养箱中低温处理3d的表型，发现转基因植株的生长受到低温胁迫的影响较小，而野生型植株生长受到抑制，且叶片有萎蔫现象。结果表明鹅掌楸LcbHLH02399基因可以增强鹅掌楸植株对低温胁迫的耐受能力，在提高植物低温胁迫的分子育种中具有重要应用价值。

Description

一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因及其表达蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因及其表达蛋白和应用。

背景技术

中国鹅掌楸(Liriodendron Chinese)作为我国重要的珍稀树种(国家二级保护植物)，具有科研、经济、观赏、药用和生态等多方面的价值。主要体现在：1.对古植物学研究有重要科研价值；2.树干端直、树冠伞形、叶形奇特、花大而美丽，是优良的观赏树种；3.木材纹理直、干燥少开裂、轻软适中、易加工、少变形、无虫蛀，是室内装修、制作家具的优质材料(刘建平，2020)。中国鹅掌楸主要分布在我国长江流域以南地区，且喜温、喜湿润(方炎明，1994；郝日明等，1995)，属于冷敏感植物。由此可见，低温限制了中国鹅掌楸在我国北方地区的大面积推广。因此，培育耐低温品种具有重要的实践和理论意义(张欣，2010)。当前基因组测序技术的飞速发展推动了越来越多植物基因组的破译。鹅掌楸基因组的发布将为解析其基础生物学问题和重要性状的分子机制奠定了基础，同时也为分析鹅掌楸的基因家族提供了可能(Chen et al.，2019)。

鉴于植物bHLH转录因子家族保守且多样的结构域特点，且不同成员具有重要的生物学功能。鹅掌楸基因组也已发布，这为进行bHLH转录因子家族的全基因组分析提供了前提(Chen et al.，2019)。因此，开展鹅掌楸bHLH转录因子家族的鉴定、系统分化分析将有助于理解该基因家族在鹅掌楸内的结构特点，开展关键基因的克隆与功能分析将有助于解析不同成员的生物学作用和有助于选育抗逆性的种质。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

含有所述鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因的载体。

所述的鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因在增强植物对低温胁迫的耐受能力中的应用。

所述的应用，包括以下步骤：

1)构建所述鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因的载体；

2)将所构建的转录因子LcbHLH02399基因的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到对低温胁迫的耐受能力增强的植株。

所述的应用中，所述的植物是杂交鹅掌楸。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优势为：

本发明通过生物信息学工具对鹅掌楸bHLH家族序列进行分析，通过测序和同源比较，成功克隆出LcbHLH02399基因。对克隆到的LcbHLH02399基因构建过表达载体，转化杂交鹅掌楸愈伤，通过液体培养，获得转基因杂交鹅掌楸；将LcbHLH02399转基因杂交鹅掌楸植株和野生型植株同时放入4℃光照培养箱低温处理3d，表型观察发现转基因植株的生长受到低温胁迫的影响较小，而野生型植株生长受到抑制，且叶片有萎蔫现象。结果表明鹅掌楸LcbHLH02399基因可以增强杂交鹅掌楸对低温胁迫的耐受能力，在提高植物低温胁迫的分子育种中具有重要应用价值。

附图说明

图1是LcbHLH02399基因PCR扩增产物图，图中：M：Marker DL2000；1:PCR产物；

图2是pRI 101-AN-6Flag质粒图谱；

图3是野生型杂交鹅掌楸和转LcbHLH02399基因杂交鹅掌楸在常温下生长和在冷胁迫处理下的表型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例所采用的植物材料：植物材料鹅掌楸取材于南京林业大学校园内，于2019年4月取鹅掌楸幼嫩新鲜叶片，液氮冻存后-80℃保存备用。

菌种和载体：大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司；农杆菌EHA105感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；pMD-19T(Simple)克隆载体，购自大连宝生物工程有限公司；pRI101-AN-6Flag真核表达载体，为本实验室保存。

主要试剂：主要试剂有总RNA抽提试剂TRIZOL购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒、高保真酶和2×Taq Master Mix酶均购自Vazyme公司；凝胶回收试剂盒购自北京擎科生物有限公司；T4连接酶购自大连宝生物工程有限公司；其他试剂是分析纯试剂。

培养基：LB固液体培养基、LB/Amp平板培养基、Amp筛选培养基、Kan筛选培养基、1/2MS固体培养基等，具体配制方法参考苏江(2015)的方法。愈伤继代培养基(M13)：MS+2,4-D2mg/L+BA0.2 mg/L+LH 0.5g/L+Vc 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH＝5.7；愈伤筛选培养基(M14)：M13培养基+G41870mg/L，pH＝5.7；愈伤悬浮培养培养基(M15)：MS+2,4-D 2mg/L+BA0.2mg/L+LH 0.5g/L+Vc 5mg/L+蔗糖30g/L，pH 5.7；液体过渡培养基(Z36)：MS+KT 2mg/L+BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L+CH 0.5g/L+Vc 5mg/L+蔗糖30g/L，pH＝5.7；体胚诱导培养基(Z14)：MS+ABA 2mg/L+CH 0.5g/L+Vc 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH＝5.7；体胚再生植株继代培养基(Z9)：MS+Vc 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH＝5.7。

仪器与设备：高温高压灭菌锅，普通PCR扩增仪，凝胶电泳成像仪，涡旋震荡仪，高速低温离心机，4℃冰箱，-80℃超低温冰箱，恒温培养箱，摇床，超微量分光光度计等。

实施例1：鹅掌楸bHLH家族分析及LcbHLH02399基因的克隆

下载模式植物拟南芥(https://www.arabidopsis.org)和水稻(http://rapdb.dna.affrc.go.jp)数据库获得bHLH家族序列，为177和135条。再使用蛋白结构域比对软件HMMER3.0构建模型，找出鹅掌楸潜在的bHLH家族序列，再使用BLASTP比对鹅掌楸候选bHLH家族序列。通过测序和同源比较，克隆到了1个测序的序列与bHLH转录因子同源，命名为LcbHLH02399的转录因子。

1、总RNA的提取及质量检测

在提取总RNA之前，需要将提取过程中用到的所有容器做无RNase处理，目的是去除基因组DNA的干扰。将离心管等塑料器皿、研钵研杵等研磨工具、镊子在0.1％DEPC水中浸泡过夜，将水沥干后用报纸包好，高温高压灭菌；所有试剂的配制均用无RNase水。采用TRIZOL法提取总RNA，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA，用Nanodrop检测OD₂₆₀/OD₂₈₀。将提取的RNA电泳检测，显示RNA条带清楚，无降解现象，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝2.03，基本无蛋白质污染，RNA浓度为745ng/μl，RNA纯度和质量达到实验要求。

2、cDNA第一链的合成

采用Vazyme公司反转录提取试剂盒，进行鹅掌楸的cDNA合成。主要步骤如下：

(1)RNA模板变性

在RNase-free离心管中配配制混合液(RNase-free ddH₂O To 8.0μL，Oligo(dT)23VN(50μm)1.0μL，Total RNA50ng)。将配制的混合液65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

(2)反转录合成cDNA第一链

配制第一链cDNA合成反应液(上一步的混合液8.0μL，2×RTMix10μL，HiScriptⅡEnzyme Mix2.0μL，Total Volume20μL)，50℃反应45min，85℃反应5min。合成的cDNA可立即使用，或-20℃短期保存。

3、PCR引物的设计与合成

根据数据库中搜索到的拟南芥和水稻bHLH家族蛋白序列，序列比对后设计合成基因的特异引物如下：

Lch02399-F：5′-ATGCTGTCGAGGGTGAACG-3′，

Lch02399-R：5′-AAGCCTGTCGAAGCGAATG-3′。

4、PCR扩增目的基因序列片段

以鹅掌楸叶片cDNA第一链为模板(用量为1～5μL，不超过PCR反应总体积的1/10)，以基因的特异引物为上下游引物按照PCR反应体系(25μL 2×PhantaMax Buffer，1.0μLdNTP Mix(10mM each))，2.0μL模板cDNA，2.0μL引物1(10μM)，2.0μL引物2(10μM)，1.0μLPhanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，ddH₂O To 50μL)和PCR反应程序(95℃3min；95℃15s，50℃15s，72℃30-60sec/kb，25～35循环；72℃5min)进行PCR扩增，采用vazyme公司高保真酶扩增目的基因。

5、电泳检测并回收目的DNA片段

用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，根据擎科的凝胶回收试剂盒步骤回收。回收的DNA目的片段可立即使用，也可以-20℃短期保存备用。

1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示成功扩增到单一条带，且与Marker比较符合预期大小，LcbHLH02399扩增到的是一条约1600bp的DNA片段(图1)，则对PCR产物进行纯化回收。

6、目的DNA片段连接19-T载体

将高保真酶扩增的PCR产物纯化回收后，加入Taq酶实现加A反应，保证在产物两侧加上一个ATP接头，再与商品化的T载体pMD19，采用Takara公司T4连接酶进行连接反应。

将反应体系(2.0μL 10×T4 DNA Ligase buffer，20-100ng PMD-19T vector，1:1to 5:1molar ratio over vector目的基因DNA，1.0μL T4 DNALigase，ddH₂O to20μL)放入22℃恒温水浴锅中反应60min以上或者4℃过夜，反应结束后将离心管置于冰上。

7、连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

(1)在100μL大肠杆菌感受态细胞中加10μL连接产物，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴2min。加入800μLLB液体培养基，37℃摇床培养，200rpm复苏1h。；

(2)离心弃去上清，涂在含有100mg/LAmp的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；

(3)挑选白色单菌落，在96孔板中，每孔加入100μL含有Amp的LB液体培养基；

(4)将挑选的菌落加入液体培养基中摇床培养；

(5)取1μL菌液进行PCR阳性测定，并-20℃短期保存。

8、阳性菌落PCR检测

采用Vazyme公司2×Taq酶体系，按照反应体系(7.0μL ddH₂O，10μL 2×TaqMaster Mix，1.0μL菌液，1.0μL引物1(10μM)，1.0μL引物2(10μM))和反应程序(95℃5min；95℃30s，50℃30s，72℃60sec/kb，27循环；72℃5min)对菌液进行PCR扩增。

把扩增的菌液PCR取出进行凝胶电泳检测，将电泳图中条带和目的片段大小差不多且明亮清晰的菌液，即阳性克隆菌液取样送公司测序，测序通用引物M13-47/M13-48。测序结果用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)软件进行序列比对，看是否得到正确的目的基因。将TA克隆测序序列和参考序列一致的进行过表达载体构建。

9、阳性菌落PCR检测与分析：

菌检结果显示菌液PCR产物大小与目的片段大小基本一致，且无杂带，初步鉴定为重组子，LcbHLH02399是一条约1600bp的DNA片段，将阳性菌液测序。

10、TA克隆测序结果与分析：

将TA克隆测序，经比对分析后，载体构建的TA克隆测序的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。分析可知该克隆到的鹅掌楸LcbHLH02399基因属于bHLH转录因子家族的ICE亚家族。用克隆的鹅掌楸LcbHLH02399基因进行过表达载体构建。

实施例2：鹅掌楸LcbHLH02399基因表达载体的构建

1、酶切引物的设计

根据pRI-101-6Flag质粒图谱(图2)和LcbHLH02399基因编码区的特性，利用软件Primerpremier 5.0设计LcbHLH02399基因ORF包含酶切位点的引物。通过软件对LcbHLH02399基因ORF酶切位点查找发现，LcbHLH02399基因ORF内无XbaI、BamHI酶切位点，设计Nde I和Cla I双酶切引物如下：LchICE1-NdeI-F：5′-GGGAATTCCATATGCTGTCGAGGGTGAACGG-3′

LchICE1-Cla I-R：5′-CCCATCGATGAATTCGGCGTCGAGGAATTCAT-3′

2、PCR扩增目的基因酶切片段

同实施例1中“4、PCR扩增目的基因序列片段”

3、扩增产物电泳检测并回收

同实施例1中“5、电泳检测并回收目的DNA片段”

4、扩增产物与载体连接并转化大肠杆菌

同实施例1中“6、目的DNA片段连接19-T载体”和“7、连接产物转化大肠杆菌感受态细胞”

5、阳性菌落PCR检测

同实施例1中“8、阳性菌落PCR检测”

6、质粒提取

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

(4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。

(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(8)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。并重复一次。

(9)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

7、双酶切目的基因和载体质粒

根据载体构建原则，选用双酶切载体pRI-101-6Flag和引物中Nde I和Cla I酶切位点，分别双酶切所选择的TA克隆目的基因(表8)和载体pRI-101-6Flag(表9)。将反应体系混匀后，37℃放置2h，然后用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，180v电泳20min后，将胶置于凝成成像仪中照相，并在紫外割胶仪上割取目标片段，用擎科公司凝胶回收试剂盒纯化回收。其中，双酶切目的基因反应体系：2μL 10×K Buffer，15μL目的基因，2μL酶切位点1，2μL酶切位点2，ddH₂O补足至40μL。双酶切载体反应体系：2μL 10×KBuffe，5μL载体质粒，2μL酶切位点1，2μL酶切位点2，ddH₂O补足至40μL。

8、表达载体的连接

回收上一步骤中酶切正确的TA克隆目的片段与pRI-101-6Flag载体片段，连接目的基因片段和载体片段，连接反应体系同表3-6。将反应体系放入22℃恒温水浴锅中反应60min以上或者4℃过夜。

9、表达载体的转化

(1)在融化完毕的100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加10μL带有目的基因片段的表达载体质粒DNA；

(2)冰浴30min；

(3)42℃水浴热激90s；

(4)再冰浴2min；

(5)加入800μL LB液体培养基；

(6)37℃摇床培养30min；

(7)6000rpm离心3min，弃去上清，转化在大肠杆菌抗性筛选培养基为含有Kana25mg/L的LB固体培养基上，37℃培养2h；

(8)取1μL菌液进行PCR阳性测定，并送测序，检测表达载体是否构建成功。

10、植物表达载体质粒的提取

pRI-101-6Flag植物表达载体质粒提取步骤同本实施例“6、质粒提取”。

载体构建测序结果与分析：根据载体构建原则，LcbHLH02399基因选用双酶切载体pRI-101-6Flag和Nde I和Cla I两个酶切位点，分别对TA克隆的目的基因和载体pRI-101-6Flag进行双酶切反应，将两个反应体系混匀后电泳检测并回收，再进行TA克隆连接反应并准化大肠杆菌感受态细胞，转化子进行电泳PCR检测，挑选PCR阳性转化子摇菌培养提取质粒并测序。测序结果显示构建的过表达载体克隆测序序列与SEQ ID NO.1所示序列一致，说明目的基因已插入载体，表达载体构建准确。

实施例3：农杆菌介导的LcbHLH02399基因对杂交鹅掌楸的遗传转化

1、冻融法转入农杆菌

(1)将100μL农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上融化，加入2μL提取的植物表达载体质粒，枪头吹打混匀；

(2)冰浴5min，液氮冷冻5min，37℃水浴5min，冰浴5min；

(3)加入700μL LB液体培养基，28℃，200rpm，振荡培养3h；

(4)4000rpm离心3min，留少许上清；

(5)将转化后的剩余菌液混匀，涂在含有Kan的LB固体培养基上；

(6)28℃倒置培养3d

(7)阳性克隆鉴定。

阳性克隆鉴定结果与分析：将构建成功的LcbHLH02399基因表达载体转入农杆菌EHA105感受态细胞，挑选阳性菌落测序。利用基因比对软件DNAMAN进行序列比对，看构建的表达载体序列与参考序列是否一致，结果表明，两者序列相同，可进行后续试验。

2、侵染材料的培养

继代培养2周的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织，基因型编号为166302。

3、农杆菌侵染液的制备

(1)从-80℃中取出带有正确目的基因的农杆菌菌液并活化；

(2)涂平板后置于28℃中暗培养24h后，在1.5mL离心管里加入800μL的LB液体培养基(含Kan 50mg/L)，挑选单克隆菌液落入1.5mL离心管中震荡培养12h；

(3)在10ml离心管中加入2mL液体LB培养基(含Kan 50mg/L+AS100μmol/L)，吸取上一步小摇的阳性菌液于该离心管中，平放在恒温摇床内，28℃、220rpm培养12～16h。

(4)在250mL三角瓶中加入50mL液体LB培养基(含Kan 50mg/L+AS100μmol/L)，再倒入上一步培养的2mL菌液，置于恒温摇床内28℃、220rpm培养4～6h。当菌液OD值达到0.8时停止摇菌，准备侵染。

(5)量取上一步菌液40ml于50mL离心管中，5000rpm、10min、4℃离心收集菌液，弃上清液，加入适量的M13液体培养基，使得重悬液的OD值为0.8，轻摇混匀重悬菌液。

4、农杆菌侵染杂交鹅掌楸愈伤

取3皿左右愈伤于100mL三角瓶中，加入适量重悬的菌液，期间不时摇动三角瓶，侵染时间10-15min。用400目的筛子过滤菌液，镊子夹取无菌吸水纸从筛子底部吸干菌液，然后用镊子把愈伤转移到垫好滤纸的M13固体培养基(AS100μmol/L)上，共培养48h。

5、愈伤脱菌和筛选

(1)脱菌

共培养结束后，用100ml的三角瓶收集愈伤，用添加M13液体培养基(含Cef400 mg/L)洗3～4次，直至愈伤清洗液清澈，最后用无菌水洗一次，用400目的筛子收集愈伤，无菌吸水纸吸干滤液，将愈伤组织置于M13愈伤组织继代培养基(Cef400 mg/L)上增殖培养20d。

(2)筛选

将愈伤组织转移继代到筛选培养基上(含Cef400 mg/L、G41870mg/L的M13固体培养基)，每21天继代一次，直到在筛选培养基上长出新的转基因愈伤。

6、转基因阳性体胚苗的获得

用本实验室建立的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系获得转基因体胚再生植株。具体方法为：

(1)收集在筛选培养基上新长出来的抗性愈伤组织，按照固液比1:9，在250mL三角瓶中加入50mLM13液体培养基，在95rpm，23℃恒温摇床上培养7d，然后用新的M13液体培养基继代一次，继续在95rpm，23℃恒温摇床上培养7d。

(2)用100目的筛子过滤去除愈伤，400目的筛子过滤得到单细胞，用Z36液体培养基反冲400目筛子，收集单细胞，在95rpm，23℃恒温摇床上培养2d。

(3)吸取2mL的含单细胞的培养液，均匀的滴在铺了棉花的滤纸上，待棉花吸取多余的液体培养基之后，用镊子将滤纸夹到含Z14培养基的培养皿上，在23℃恒温培养箱中避光培养一个月。

(4)培养皿的滤纸上长出体胚苗的幼苗。将幼苗继代于含有Z9培养基的培养瓶中，在光照培养间培养一个月，待幼苗长出根系后再继代于新的含有Z9培养基的培养瓶中，继续培养一个月，此时苗高3cm左右且根系发达。将苗从Z9培养基中取出，在自来水下洗净，然后种植在含泥炭和珍珠岩2:1的营养钵中，在23℃恒温温室光照培养一个月。长到5片真叶以上，株高5cm左右，

阳性植株的检测：用CTAB法提取植株叶片的DNA，用PCR检测转基因苗。

7、转基因杂交鹅掌楸与野生型的表型及在低温胁迫下的表型观察

取上一步同步培养的杂交鹅掌楸LcbHLH02399转基因纯合株系与野生型WT，观察转基因株系和杂交鹅掌楸野生型植株生长状况。然后将转基因植株和野生型植株同时移到4℃光照培养箱里培养3d，拍照观察转基因植株和WT植株表型区别，初步分析这个基因在响应低温中的作用。

将同步培养的杂交鹅掌楸LcbHLH02399转基因株系和野生型植株在温室生长30d后，观察表型生长状况发现，转基因株系的长势与野生型植株无明显差别。

将LcbHLH02399转基因株系置于4℃低温培养箱胁迫3d记录观察，发现LcbHLH02399转基因株系的生长受到低温胁迫的影响较小，而野生型植株生长受到抑制，且叶片有萎蔫现象(图3)。由此表明鹅掌楸LcbHLH02399基因可以增强杂交鹅掌楸对低温胁迫的耐性。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因及其表达蛋白和应用

<130> 100

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1644

<212> DNA

<213> Liriodendron Chinese

<400> 1

atgctgtcga gggtgaacgg cgttgtttgg atggaagagg aaggagactc tgtttcttgg 60

agcagagacc cggaaaagcc cgacgaattg tctctctcca ctttcaaatc catgctcgaa 120

gacgactgga atggctatct caacccctcc aatcccaatc catctcccca cgattctgct 180

gccttccaaa cgctccattc ccacacccac cccgatatca aagaccttcc cttccctcca 240

aacccttctt ctcaagacaa cctcctcctc cagcccatcg actcctcttc ttctgtcttc 300

tccctcgacc cctcgagggc cccgcctttc gttcctccaa agaactgcct ctcatcgctc 360

ctcaacgccg tctgcaacaa ccctttcgac accgggttcg atctcggctg cgacgtgggg 420

ctgttccccc tgctgcccgc tgctgcgggc ccccagtcga attcctctgt tttgatgaac 480

aggggaggtg gggttttgca ggggtttaat agcttgggat cgaacagtca gatgggcacg 540

cctgatcttg gacccaacga ccaaatctcg actacccgtt tgctgccgct gcctgaaaat 600

gctgggctga atctgaatcc aatggggttc ccctgtttcg acggtgtttc tgggaattca 660

aacagccctc tgtttccaaa ccggccgaag gtgctgcggc cgcttgagat cttccctcca 720

gtcggcgtgc agccaacgct gttccagaag agagcggcac tgcgccagaa ttcagctgct 780

ggggccgaga aagttgggaa tttgggggct ttgggtttgg atggcagggg cggtcggatt 840

ctgccacagg ccgatgggat gagagattgg gaggaatggc atgagaaacg gaggaagtgc 900

agtgaggagg atgagtttga tgatgcgagc attgacgggt ccggattgaa ttacgattca 960

gatgaggcgg tgacagagaa tctgaacaag ggagaggaga acatgaagaa tggcgggaac 1020

aattcgaatg cgaacagtac tgtcacaggc ggagatcaga aagggaagaa gaagggactc 1080

cccgcaaaga atctgatggc agagaggcgg cgtcggaaga agctcaatga caggctctac 1140

atgctgaggt cggtcgttcc aaagatcagc aagatggata gagcttcaat cctcggcgat 1200

gcaattgagt acttgaagga gcttctgcaa aggatcaatg acctacacaa tgagctcgaa 1260

tcgacaccgt ccggttcttc gctgcccact actacaagct tccaccctct gacgcccaca 1320

ctgccttgcc gtgtcaagga ggaactctgc ccgagttcgc tgccgagccc cccttgccaa 1380

cctgcaaggg tggaagtcag agtgagggaa ggaagagcgg tcaacatcca catgttttgc 1440

gcccgtaggc ccggtctctt gctctccacg atgcgggcgc ttgatgggct tgggctcgac 1500

attcaacaag cggtcatcag ttgtttcaat ggtttcgctc tcgatgtttt ccgagctgag 1560

caatgcaagg aaggcccgga cgtactgccg gacgaaatca gggcggtact tttgcactct 1620

gcaggcttcc atggtacaat gtag 1644

<210> 2

<211> 547

<212> PRT

<213> Liriodendron Chinese

<400> 2

Met Leu Ser Arg Val Asn Gly Val Val Trp Met Glu Glu Glu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Ser Trp Ser Arg Asp Pro Glu Lys Pro Asp Glu Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Thr Phe Lys Ser Met Leu Glu Asp Asp Trp Asn Gly Tyr Leu Asn

35 40 45

Pro Ser Asn Pro Asn Pro Ser Pro His Asp Ser Ala Ala Phe Gln Thr

50 55 60

Leu His Ser His Thr His Pro Asp Ile Lys Asp Leu Pro Phe Pro Pro

65 70 75 80

Asn Pro Ser Ser Gln Asp Asn Leu Leu Leu Gln Pro Ile Asp Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Val Phe Ser Leu Asp Pro Ser Arg Ala Pro Pro Phe Val Pro

100 105 110

Pro Lys Asn Cys Leu Ser Ser Leu Leu Asn Ala Val Cys Asn Asn Pro

115 120 125

Phe Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Cys Asp Val Gly Leu Phe Pro Leu

130 135 140

Leu Pro Ala Ala Ala Gly Pro Gln Ser Asn Ser Ser Val Leu Met Asn

145 150 155 160

Arg Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Phe Asn Ser Leu Gly Ser Asn Ser

165 170 175

Gln Met Gly Thr Pro Asp Leu Gly Pro Asn Asp Gln Ile Ser Thr Thr

180 185 190

Arg Leu Leu Pro Leu Pro Glu Asn Ala Gly Leu Asn Leu Asn Pro Met

195 200 205

Gly Phe Pro Cys Phe Asp Gly Val Ser Gly Asn Ser Asn Ser Pro Leu

210 215 220

Phe Pro Asn Arg Pro Lys Val Leu Arg Pro Leu Glu Ile Phe Pro Pro

225 230 235 240

Val Gly Val Gln Pro Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Ala Leu Arg Gln

245 250 255

Asn Ser Ala Ala Gly Ala Glu Lys Val Gly Asn Leu Gly Ala Leu Gly

260 265 270

Leu Asp Gly Arg Gly Gly Arg Ile Leu Pro Gln Ala Asp Gly Met Arg

275 280 285

Asp Trp Glu Glu Trp His Glu Lys Arg Arg Lys Cys Ser Glu Glu Asp

290 295 300

Glu Phe Asp Asp Ala Ser Ile Asp Gly Ser Gly Leu Asn Tyr Asp Ser

305 310 315 320

Asp Glu Ala Val Thr Glu Asn Leu Asn Lys Gly Glu Glu Asn Met Lys

325 330 335

Asn Gly Gly Asn Asn Ser Asn Ala Asn Ser Thr Val Thr Gly Gly Asp

340 345 350

Gln Lys Gly Lys Lys Lys Gly Leu Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu

355 360 365

Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Asn Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser

370 375 380

Val Val Pro Lys Ile Ser Lys Met Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp

385 390 395 400

Ala Ile Glu Tyr Leu Lys Glu Leu Leu Gln Arg Ile Asn Asp Leu His

405 410 415

Asn Glu Leu Glu Ser Thr Pro Ser Gly Ser Ser Leu Pro Thr Thr Thr

420 425 430

Ser Phe His Pro Leu Thr Pro Thr Leu Pro Cys Arg Val Lys Glu Glu

435 440 445

Leu Cys Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Pro Cys Gln Pro Ala Arg Val

450 455 460

Glu Val Arg Val Arg Glu Gly Arg Ala Val Asn Ile His Met Phe Cys

465 470 475 480

Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Leu Ser Thr Met Arg Ala Leu Asp Gly

485 490 495

Leu Gly Leu Asp Ile Gln Gln Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe

500 505 510

Ala Leu Asp Val Phe Arg Ala Glu Gln Cys Lys Glu Gly Pro Asp Val

515 520 525

Leu Pro Asp Glu Ile Arg Ala Val Leu Leu His Ser Ala Gly Phe His

530 535 540

Gly Thr Met

545

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Lch02399-F引物序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctgtcga gggtgaacg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Lch02399-R引物序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcctgtcg aagcgaatg 19

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> LchICE1-Nde I-F引物序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggaattcca tatgctgtcg agggtgaacg g 31

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> LchICE1-Cla I-R引物序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccatcgatg aattcggcgt cgaggaattc at 32

Claims (5)

1.一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因的载体。

4.权利要求1所述的鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因在增强杂交鹅掌楸对低温胁迫的耐受能力中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建所述鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因的载体；

2)将所构建的转录因子LcbHLH02399基因的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到对低温胁迫的耐受能力增强的杂交鹅掌楸。

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