CN114438096B

CN114438096B - 一种苹果抗性相关基因MdERF-049、蛋白及用途

Info

Publication number: CN114438096B
Application number: CN202210090531.9A
Authority: CN
Inventors: 白团辉; 宋春晖; 郑先波; 王洪涛; 宋雪莲; 宋尚伟; 焦健; 王苗苗
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2022-01-21
Filing date: 2022-01-21
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-01-21
Also published as: CN114438096A

Abstract

本发明公开了一种苹果抗性相关基因MdERF‑049、蛋白及用途，所述MdERF‑049基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该基因导入目的植物，得到转基因植物，发现过表达基因MdERF‑049能够增强植物的抗旱性，增强对ABA的耐受力。在相同逆境处理下转基因植物，发现该转基因植物的抗旱性和对ABA的耐受力均比野生植株强。这说明MdERF‑049基因可用于调节植物抗逆性，并且本发明对于植物育种具有重大的应用价值。

Description

一种苹果抗性相关基因MdERF-049、蛋白及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及苹果抗性相关基因MdERF-049、蛋白及用途。

背景技术

苹果是我国主要栽培果树树种之一，其面积和产量均居世界首位。苹果在实际生产栽培中，经常遭受不同程度的干旱胁迫，导致苹果树叶片萎蔫、脱落，果实品质和产量下降，严重时甚至整株死亡，造成严重的经济损失，这已成为苹果生产栽培中亟待解决的重要问题。因此，挖掘苹果抗旱基因研究其功能，对苹果抗旱遗传改良及优质丰产栽培具有重要理论和实践意义。Ethylene responsive factor(ERF)转录因子是AP2/ERF大家族中的一个大的亚家族，仅含1个AP2/ERF结构域，每个成员都含有1个由大约60个氨基酸组成的非常保守的DNA结合域。研究表明，ERF具有调节植物生长发育、抗生物胁迫和非生物胁迫的作用等。在本研究中，我们鉴别发现了一个新的苹果ERF亚家族成员MdERF-049，其含有AP2保守结构域，能够响应干旱和ABA，过表达MdERF-049能增强愈伤组织的抗旱性和对ABA的耐受力，这对苹果抗旱遗传改良及抗逆新品种选育具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种苹果(Malus Domestica)抗性相关基因MdERF-049。

本发明的第二个目的是提供一种上述基因编码的蛋白。

本发明的最主要的一个目的在于提供该基因MdERF-049或蛋白的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

一种苹果抗性相关基因MdERF-049，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的核苷酸序列由657个碱基组成，或在严格条件下与SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的DNA分子。

上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述的序列由218个氨基酸残基组成。

上述MdERF-049基因编码的蛋白还可以包括将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个((如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个))氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白；或与(1)限定的蛋白序列有80％((较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高))以上同源性且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白。

也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述MdERF-049基因，还包括与SEQ ID NO：1具有较高同源性(如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因。

含有上述基因的表达盒、转基因细胞系、重组菌、重组病毒、重组载体、表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞及其构建方法也落入本发明的保护范围之内。

上述基因在提高苹果抗旱性以及提高苹果对ABA耐受力方面的用途。利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdERF-049基因的超量表达SAK载体转入苹果‘王林’愈伤组织中，从而获得转基因材料。实验证明，超量表达MdERF-049基因的转基因愈伤组织，其耐抗旱提高，对ABA的耐受力增强，说明MdERF-049基因在植株抗性中发挥重要作用。综上，本发明通过植物基因工程技术，从苹果组培苗中分离克隆出抗性相关基因完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，发现过表达之后转基因株系抗旱能力提高，同时增强了ABA的耐受力。

本发明还公开了一种培育转基因植物的方法，将MdERF-049基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的抗旱性增加，对ABA耐受力增强。

具体地，MdERF-049基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

具体地，为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，包括如下步骤(1)和/或(2)：

(1)通过增加目的植物中MdERF-049蛋白的活性，获得具有如下性状的植物：抗旱性以及对ABA耐受力强于所述目的植物/在逆境胁迫下的产量高于所述目的植物/在逆境胁迫下的生长状态优于所述目的植物；

(2)通过促进目的植物中MdERF-049基因的表达，获得具有如下性状的植物：抗旱性以及对ABA耐受力强于所述目的植物/在逆境胁迫下的产量高于所述目的植物/在逆境胁迫下的生长状态优于所述目的植物；

“促进目的植物中MdERF-049基因的表达″的实现方式可为如”下(1)或(2)或(3)：

(1)将MdERF-049基因导入目的植物；

(2)引入强启动子和/或增强子；

(3)本领域内的其它常见方法。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

作为一种实施方式，所述的“植物”包括但不限于：苹果，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。尤其适用于需要提高抗旱性的植物或者对ABA耐受力强的植物，在实际的应用过程中，对于需要提高抗旱性的植物，均可以通过转基因的方式培育转入该基因的株系。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

本发明从苹果中发现了MdERF-049蛋白及其基因，将其导入目的植物，得到转基因植物，在相同逆境处理下转基因植物，发现该转基因植物的抗旱性以及对ABA耐受力均比野生植株强，这说明MdERF-049基因可用于调节植物抗逆性，另外，GmPCBER4蛋白及其编码基因还可以增强植物对ABA的耐受力。

对于干旱地区，需要培育一些抗旱性的植物来适应该地区的生长，可以通过导入该基因的方式培育一些新品种，对于植物育种具有重大的应用价值。

附图说明

图1为MdERF-049 PCR扩增产物电泳图谱；

图2为qRT-PCR检测MdERF-049转基因愈伤组织的表达，其中WT为对照，MdERF-049-OE-1、MdERF-049-OE-2、MdERF-049-OE-3为3个过表达转基因株系；

图3对照WT和3个MdERF-049转基因愈伤组织细胞系(L1、L2、L3)在3％PEG6000处理下生长14天的状态；

图4为对照WT和3个MdERF-049转基因愈伤组织细胞系(L1、L2、L3)在100μMABA处理下生长14天的状态；

图5为对照WT和过表达MdERF-049转基因愈伤3个株系(MdERF-049-OE-1、MdERF-049-OE-2、MdERF-049-OE-3)在100μMABA处理和3％PEG6000处理下生长14天的鲜重；

图6为对照WT和过表达MdERF-049转基因愈伤3个株系(MdERF-049-OE-1、MdERF-049-OE-2、MdERF-049-OE-3)在100μMABA处理和3％PEG6000处理下生长14天的丙二醛含量；

图7为对照WT和过表达MdERF-049转基因愈伤3个株系(MdERF-049-OE-1、MdERF-049-OE-2、MdERF-049-OE-3)在100μMABA处理和3％PEG6000处理下生长14天的相对电导率。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：

“表达载体”，Expression vectors，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

“农杆菌介导转化法”，Agrobacterium-mediated transformation，指将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。

目的植物：target plant，本发明所述目的植物是苹果。

目的基因：target gene，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。

实施例

一、苹果MdERF-049基因的获取

(一)平邑甜茶实生苗叶片RNA提取及反转录

1、利用CTAB法提取总RNA

(1)称取约为1g经干旱处理的平邑甜茶叶片，在液氮中迅速研磨，转入1.5mL离心管中，依次加入1000μL CTAB裂解液和20μLβ-巯基乙醇，65℃水浴30min。加入1000μL三氯甲烷和异戊醇(24∶1)，涡旋仪混匀，8 000g、4℃离心10min后取600μL上清，加入300μL水饱和酚，混匀，静置5min，再加入450μL三氯甲烷和异戊醇(24∶1)，涡旋仪混匀，8000g、4℃离心10min。

表1.CTAB裂解液

(2)取600μL上清，依次20μL NaAc(3mol/L，pH 5.2)、60μL的无水乙醇，混匀后静置5min，8 000g、4℃离心10min；取450μL上清，加入150μL体积的LiCl(10mol/L)，-20℃静置2～3h；8 000g、4℃离心15min；弃上清，依次使用用75％乙醇洗涤沉淀2次，无水乙醇洗涤沉淀1次，室温晾干，将清洗后的沉淀溶于ddH2O(RNase free)中，-80℃保存。

表2其他组分及试剂

2、反转录cDNA

(1)使用诺唯赞HiScript III Q RT SuperMix for qPCR(+g DNA wiper)试剂盒按照说明进行反转录，取上一步RNA产物为模板，在0.2ml的微量离心管中进行两步反应，首先配制基因组gDNA去除混合体系，在离心管中依次加入4*gDNA wiper Mix 4μL，RNA模板1pg-1μg，加入RNase free ddH₂O定容至16μL，移液枪轻轻混打均匀，离心，PCR仪上42℃反应2min。

表3基因组gDNA去除混合体系

(2)将上一步反应产物取出加入5*HiScript III qRT SuperMix 4μL定量至20μL，用枪头轻轻混匀，将微量离心管放在PCR仪上37℃，15min；85℃，5s；产物即为cDNA，反应结束后取出待用或-20℃保存。

(二)cDNA全长序列的获得

设计兼并引物MdERF-049-F，MdERF-049-R，以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

MdERF-049-F：5’-ATGGTACAATCAAGGAAGTTCAGAG-3’，

MdERF-049-R：5’-TTAAATATTGTTTCCTTCTTGAACA-3’，

其中，PCR扩增体系见表4。

PCR反应程序：98℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s，35次循环；72℃延伸7min。

表4-PCR扩增体系

PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图谱如附图1所示。回收根据庄盟公司V-ELUTE Gel Mini Purification Kit操作，将回收产物使用庄盟零背景ZT4-Blunt(Amp+)快速载体克隆试剂盒连接至T载进行测序，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，将转化产物涂至加有氨苄抗素的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-16h；挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜、序列测定(由北京擎科生物科技有限公司有限公司进行序列测定)，得到MdERF-049基因序列，开放阅读框(ORF)为657bp，编码218个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。测序正确的单克隆，使用天根质粒提取试剂盒提取ZT4-Blunt-MdERF-049的质粒DNA，操作步骤按照天根质粒小提试剂盒说明，提取的质粒置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。

二、MdERF-049基因表达载体的构建

为研究MdERF-049基因的功能，根据用于扩基因MdERF-049的上下游引物，设计上下游引物分别加上酶切位点Kpn I和Xho I后，以ZT4-Blunt-MdERF-049质粒为模板进行RT-PCR扩SAK过表达MdERF-049片段，扩增回收目的条带，将SAK空载以Kpn I和Xho I酶切，将回收产物连接SAK过表达载体转化大肠杆菌DH5α，筛菌后进行测序，构成MdERF-049-OE过表达载体。将MdERF-049-OE过表达载体转入到农杆菌GV3101，备用。

三、MdERF-049过量表达苹果愈伤组织的获得

将准备侵染的野生型‘王林’苹果愈伤组织接种至液体培养基上，摇15天，颜色为金黄时可用于侵染。挑选生长状态良好的苹果愈伤组织，将愈伤组织放在置于农杆菌中浸泡15min，用灭菌的纱布吸干农杆菌菌液，接种到无抗生素的培养基上，暗培养2天。后用灭菌水加卡那(500mg L^-1)洗3次，时间5-8min，洗去多余的农杆菌。用灭菌的纱布将水吸干后，转移至加继代培养基上，铺成薄薄的一层。继代筛选3-5次后，提取DNA和RNA进行检测。

提取野生型和MdERF-049转基因苹果愈伤组织总RNA，应用qRT-PCR检测MdERF-049基因在野生型和三个转基因苹果愈伤组织中的表达量，如附图2所示，与对照相比，MdERF-049的转录水平在三个转基因株系MdERF-049-OE-1、MdERF-049-OE-2、MdERF-049-OE-3中显著升高，表明成功获得了MdERF-049过量表达的转基因苹果愈伤组织。

四、MdERF-049转基因愈伤组织抗旱性鉴定

如附图4所示，在对照培养基上，WT与3个转基因愈伤组织大小相似(L1、L2、L3)，而在3％PEG处理后，发现转基因愈伤组织L1、L2、L3三个株系长势明显好于WT(图3)。相比于WT，鲜重明显增加(图5)，丙二醛含量明显降低(图6)，相对电导率明显下降(图7)，并且通过和野生型空载对照相比，同样出现，鲜重明显增加，丙二醛含量明显降低，相对电导率明显下降，表明MdERF-049基因在抗旱中起到正调控的作用。

五、MdERF-049转基因愈伤组织对ABA耐受性分析

将生长状态好的野生型及转入MdERF-049的3个转基因愈伤组织分别置于MS+6-BA0.4mg·L^-1+2，4-D 1.5mg·L^-1、MS+6-BA 0.4mg·L^-1+2，4-D 1.5mg·L^-1+100μmol·L^-1ABA培养基上，并在25℃暗室进行培养。两周后观测表型，测定鲜重，应用SPSS22.0进行方差分析。结果发现，在对照培养基上，WT长势与3个转基因愈伤组织细胞系(L1、L2、L3)相似，而在100μMABA处理后，发现转基因愈伤组织细胞系L1、L2、L3长势相比于WT好，如附图4所示。ABA处理愈伤组织后，转基因愈伤组织细胞系L1、L2、L3相比于WT，鲜重明显增加(图5)，丙二醛含量明显降低(图6)，相对电导率明显降低(图7)，并且通过和野生型空载对照相比，同样出现，鲜重明显增加，丙二醛含量明显降低，相对电导率明显下降。这表明过表达MdERF-049能增强愈伤组织增强了对ABA的耐受力，

综上，从苹果中分离到了MdERF-049基因，通过苹果愈伤组织中转基因功能验证分析发现，过表达MdERF-049能增强愈伤组织的抗旱性，增强了对ABA的耐受力，对苹果抗旱遗传改良及抗逆新品种选育具有重要意义。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种苹果抗性相关基因MdERF-049、蛋白及用途

<130> 2022

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 657

<212> DNA

<213> Malus Domestica

<400> 1

atggtacaat caaggaagtt cagaggagtc aggcagcgac agtggggctc ttgggtgtca 60

gaaattcgcc acccattact taagaggagg gtgtggctag ggacatttga gacagcagag 120

gcagcagcaa gagcatatga ccaagcagca attttgatga acggacagaa tgccaagacc 180

aattttccga tattgaacaa caacaattcc gaccaagaca cgaaatcccc cactgaccaa 240

gacaccccat ggtctccaaa agcactttcc gagctactca gggccaagct cagaaaatgc 300

tgcaaagacc catcgccctc cctgacttgc cttcgactcg acaatgacaa ttcccacatt 360

ggggtctggc agaagcgccc ggccggatcg cgggcgagct ccaattgggt catgaggatt 420

gagcttggga agaagaagaa gcagggttct aatcatgata atcaagagga attgatgtcg 480

tccttgtcat cgtcgtcgag ttcatcgtca atggtggggt tgactgaggg tggagtgagt 540

gtggcagaac cggatgaaga ggataaactt gcaatgcaga tgatagaaga gttgctgaat 600

tggaattatc caacgcctcc acccacaggt aatgttcaag aaggaaacaa tatttaa 657

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> Malus Domestica

<400> 2

Met Val Gln Ser Arg Lys Phe Arg Gly Val Arg Gln Arg Gln Trp Gly

1 5 10 15

Ser Trp Val Ser Glu Ile Arg His Pro Leu Leu Lys Arg Arg Val Trp

20 25 30

Leu Gly Thr Phe Glu Thr Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Gln

35 40 45

Ala Ala Ile Leu Met Asn Gly Gln Asn Ala Lys Thr Asn Phe Pro Ile

50 55 60

Leu Asn Asn Asn Asn Ser Asp Gln Asp Thr Lys Ser Pro Thr Asp Gln

65 70 75 80

Asp Thr Pro Trp Ser Pro Lys Ala Leu Ser Glu Leu Leu Arg Ala Lys

85 90 95

Leu Arg Lys Cys Cys Lys Asp Pro Ser Pro Ser Leu Thr Cys Leu Arg

100 105 110

Leu Asp Asn Asp Asn Ser His Ile Gly Val Trp Gln Lys Arg Pro Ala

115 120 125

Gly Ser Arg Ala Ser Ser Asn Trp Val Met Arg Ile Glu Leu Gly Lys

130 135 140

Lys Lys Lys Gln Gly Ser Asn His Asp Asn Gln Glu Glu Leu Met Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Met Val Gly Leu Thr Glu

165 170 175

Gly Gly Val Ser Val Ala Glu Pro Asp Glu Glu Asp Lys Leu Ala Met

180 185 190

Gln Met Ile Glu Glu Leu Leu Asn Trp Asn Tyr Pro Thr Pro Pro Pro

195 200 205

Thr Gly Asn Val Gln Glu Gly Asn Asn Ile

210 215

Claims

1.MdERF-049基因或编码所述MdERF-049基因的蛋白质在提高苹果对ABA耐受力方面的用途，所述MdERF-049基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示。

2.一种培育对ABA耐受力增强的转基因植物的方法，其特征在于，将MdERF-049基因导入目的植物，得到转基因植物，所述MdERF-049基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述目的植物为苹果。