CN112626069A - 大豆gma-miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大豆gma‑miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用，属于基因工程技术领域。该大豆gma‑miR4359b基因的序列任选自如下(a)或(b)所述的序列之一：(a)具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(b)以序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为核心构建的核苷酸序列。通过250mM NaCl对转基因与对照复合体进行胁迫后发现，该gma‑miR4359b基因参与盐胁迫响应，在毛状根中过表达可以提高复合体大豆对盐胁迫抗性，在植物生长发育与盐胁迫应答过程中起到了重要作用，这也为大豆抵抗非生物胁迫提供理想候选基因。

Description

大豆gma-miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆gma-miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用

背景技术

大豆栽培历史悠久，是中国重要粮食作物之一。当今世界人们对大豆的需求量持续增加，而大豆属于甜土作物，所以盐胁迫成为影响大豆产量的主要原因。提高大豆对盐胁迫抗性尤为重要，然而传统育种对植物基因的改良，提高植物抗逆性效果有限，选育周期长，不能准确地对某个基因进行操作和选择，而转基因技术目标明确，具有良好的可控性，可以预期后代表现，所以利用转基因技术提高作物对非生物胁迫的抗性，已成为目前抗逆育种的主要方法。

MicroRNAs(miRNAs)是一类小的非编码调控RNAs，其长度为20-24个核苷酸，在转录后水平通过切割靶mRNAs或翻译抑制负调控目标基因，在细胞内具有多种重要的调节功能，是植物在基因调控、发育过程中抵抗生物胁迫与非生物胁迫的关键因素。miRNAs在大多数植物中是高度保守的，但在少数的物种中也存在一些非保守的miRNAs。这类非保守miRNAs具有更广泛的靶基因，包括活性酶和生理蛋白，并适应多种逆境条件。如果能够利用好这类调节因子，则对于加快大豆耐盐品种育种进程具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种大豆gma-miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用，该基因参与盐胁迫响应，在毛状根中过表达可以提高复合体大豆对盐胁迫抗性，在植物生长发育与盐胁迫应答过程中起到了重要作用，为大豆抵抗非生物胁迫提供理想候选基因。

为了达到上述目的，本发明提供了一种大豆gma-miR4359b基因，所述大豆gma-miR4359b基因的序列任选自如下(a)或(b)所述的序列之一：

(a)具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(b)以序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为核心构建的核苷酸序列。

本发明提供了一种含有上述技术方案所述的大豆gma-miR4359b基因的重组质粒，所述重组质粒是将上述技术方案所述的大豆gma-miR4359b基因插入pMD18-T表达载体得到的。

本发明提供了一种表达载体，以上述技术方案所述的重组质粒的DNA为模板、以gma-miR4359b-3301-F、gma-miR4359b-3301-R为引物扩增得到。

作为优选，所述gma-miR4359b-3301-F具体为：

5'-TTTCCATGGGATTTATTAACATCGGTTTTGGAC-3'；

所述gma-miR4359b-3301-R具体为：

5'-TTTAGATCTCAAATTAACTAATATCAAATAATTTATATAAATGTG-3'。

本发明提供了一种根据上述技术方案所述的大豆gma-miR4359b基因在培育抗干旱、耐高盐和/或耐ABA的转基因植物的应用。

本发明提供了一种根据上述技术方案所述的大豆gma-miR4359b基因在基因工程改善大豆耐盐性中的应用，过表达大豆gma-miR4359b基因能够显著提高大豆对盐胁迫抗性。

本发明提供了一种提取、扩增上述技术方案所述的大豆gma-miR4359b基因的PCR方法，包括以下步骤：

1)提取大豆毛状根DNA；

2)以大豆毛状根DNA为模板，利用克隆引物以及LA-Taq聚合酶进行PCR扩增；其中：

PCR反应体系为：模板DNA 1.0μL、正向引物1.0μL、反向引物1.0μL、10×PCRbuffer 5.0μL、dNTPs 4.0μL、LA-Taq聚合酶0.5μL和ddH₂O 35.5μL,总体积50μL。

作为优选，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s；55℃复性30s；72℃延伸45s；34个PCR循环，72℃延伸10min。

作为优选，所采用的克隆引物为：

正向引物：5'-GGATTTATTCTGAACATATTTTGTACG-3'

反向引物：5'-CAAATTAACTAATATCAAATAATTTATATAAATGTG-3'。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明对大豆非保守gma-miR4359b进行序列与表达量分析，构建了gma-miR4359b植物表达载体与沉默载体，利用发根农杆菌介导方法转化大豆产生毛状根，形成转基因复合体大豆。

2、本发明通过250mM NaCl对转基因与对照复合体进行胁迫后发现，gma-miR4359b过表达复合体大豆叶片和毛状根对NaCl胁迫具有更好的耐受性，而gma-miR4359b沉默复合体大豆叶片和毛状根受到严重NaCl迫害，并且转表达载体的复合体大豆存活率高于对照组，而转沉默载体的复合体大豆存活率低于对照。基于该数据表明，gma-miR4359b基因参与盐胁迫响应，在毛状根中过表达可以提高复合体大豆对盐胁迫抗性，在植物生长发育与盐胁迫应答过程中起到了重要作用，为大豆抵抗非生物胁迫提供理想候选基因。

附图说明

图1为本发明实施例提供的gma-miR4359b前体的茎环结构示意图；

图2为本发明实施例提供的gma-miR4359b启动子序列示意图；

图3为本发明实施例提供的gma-miR4359b基因在大豆毛状根、茎、叶中表达量分析示意图；

图4为本发明实施例提供的NaCl胁迫后gma-miR4359b基因在a大豆毛状根、b茎、c叶中表达量分析示意图；

图5为本发明实施例提供的gma-miR4359b-pCAMBIA3301植物表达载体构建示意图，其中M：DL2000；a：大豆gma-miR4359b前体序列扩增，1：PCR产物；b：PCR检测gma-miR4359b-pMD18-T重组质粒，2：gma-miR4359b-pMD18-T重组质粒PCR产物；c：PCR检测gma-miR4359b-pCAMBIA3301重组质粒，3：gma-miR4359b-pCAMBIA3301重组质粒PCR产物；

图6为本发明实施例提供的IPS-pCAMBIA3301植物沉默载体构建示意图，其中M：DL2000；a：拟南芥DNA以nIPS13301-F、nIPS13301-R引物扩增，1：PCR产物；b：以第一轮DNA为模板PCR扩增，2-3：以nIPS13301-F、nMIM4359b-R为引物PCR产物，4-5：以nMIM4359b-F、nIPS13301-R为引物PCR产物；c：以第二轮DNA为模板PCR扩增，6：以nIPS13301-F、nIPS13301-R为引物PCR产物；d：PCR检测IPS-pCAMBIA3301重组质粒，7：IPS-pCAMBIA3301重组质粒PCR产物；

图7为本发明实施例提供的植物表达载体gma-miR4359b-pCAMBIA3301转化K599示意图，其中M：DL2000；1-4：gma-miR4359b-pCAMBIA3301-K599；+：gma-miR4359b-pCAMBIA3301重组质粒PCR产物；-：水对照；

图8为本发明实施例提供的植物沉默载体IPS-pCAMBIA3301转化K599的示意图，其中M：DL2000；1-4：IPS-pCAMBIA3301-K599；+：IPS-pCAMBIA3301重组质粒PCR产物；-：水对照；

图9为本发明实施例提供的35S:gma-miR4359b毛状根DNA PCR检测示意图，其中M：DL2000；1-5：35S:gma-miR4359b DNA；6：gma-miR4359b-pCAMBIA3301质粒；7：pCAMBIA3301质粒；8：K599对照；-：水对照；引物：3301-35s-F、gma-miR4359b-3301-R；

图10为本发明实施例提供的35S:IPS毛状根DNA PCR检测示意图，其中M：DL2000；1-5：35S:IPS DNA；6：IPS-pCAMBIA3301质粒；7：pCAMBIA3301质粒；8：K599对照；-：水对照；引物：3301-35s-F、nIPS13301-R；

图11为本发明实施例提供的NaCl胁迫后转基因复合体大豆毛状根中gma-miR4359b表达量分析示意图，其中a：转基因复合体大豆毛状根RNA提取；b-c：以qt-4359b-F、qt-4359b-R引物通过RT-qPCR验证gma-miR4359b、IPS在转基因复合体大豆毛状根中的表达量；

图12为本发明实施例提供的转基因复合体大豆NaCl胁迫后的表型分析示意图，其中a：转基因复合体大豆胁迫后表型观察；b：转基因复合体大豆胁迫后存活率统计；

图13为本发明实施例提供的转基因复合体大豆NaCl胁迫后的表型分析示意图，其中a：转基因复合体大豆胁迫后表型观察；b：转基因复合体大豆胁迫后存活率统计；

图14为本发明实施例提供的NaCl胁迫复合体大豆生理指标测定示意图，其中a-c：转基因和对照组复合体大豆胁迫前后叶片中丙二醛(MDA)、蔗糖和过氧化物歧化酶(SOD)含量的测定。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1gma-miR4359b生物信息学分析

首先，利用植物miRNAs数据库PMRD获得gma-miR4359b前体序列和上游3000bp的启动子序列。利用DNAMAN软件预测gma-miR4359b前体序列二级结构，碱基组成。

结果表明，大豆gma-miR4359b前体序列的长度为67bp，定位在大豆7号染色体正向16796605-16796671，大豆gma-miR4359b的成熟序列长度为24bp，通过DNAMAN软件预测gma-miR4359b前体序列的二级结构，如图1所示，其中成熟序列中包括7个碱基A和7个碱基U各占29％、6个碱基G占25％、4个碱基C占16.7％。

随后，通过PMRD在线软件得到gma-miR4359b上游3000bp启动子序列。并利用在线软件TSSP预测发现gma-miR4359b的转录起始位点位于前体序列上游781bp处。通过Plant-CARE网站分析gma-miR4359b转录起始位点上游1066bp的启动子序列，发现在该区域存在基本启动子元件CAAT-box、TATA-box和TATA；与激素调控应答反应元件，包括响应赤霉素和乙烯脱落酸元件TATC-box；非生物胁迫应答元件，包括介导低温信号转导元件Unnamed_4、参与干旱胁迫和ABA应答元件MYB、与ERF结合的ERE元件，参与植物内源激素乙烯信号途径，应答多种生物胁迫；参与光应答元件，包括参与光响应保守DNA模块的一部分启动子元件Box4；伤害反应元件WUN-motif；参与调控侧生分生组织启动子元件MYB-like sequence和富含AT的DNA结合蛋白结合位点的启动子元件AT-rich element，如图2所示。

实施例2gma-miR4359b在盐胁迫下表达模式

(1)挑选饱满均一的Williams 82种于营养土中20天，将根上附着的营养土洗净，放入水中培养5天，再将大豆苗移入含有250mM NaCl的Hoagland(营养液)溶液中分别处理0h、2h、6h、12h、24h，采集处理后的大豆叶片、茎与毛状根组织，每个时间段取材进行三个生物重复。提取植物组织材料的总RNA，并将提取后的RNA进行浓度测定，通过天根生化有限公司购买的FastKing RT Kit(With gDNase)FastKing cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)，将提取的总RNA进行cDNA合成，其中gDNA去除反应体系和反转录反应体系如表1和表2所示。

表1 gDNA去除反应体系

振荡混匀后，瞬时离心，并置于PCR仪中42℃，孵育3min后放置冰上。

表2反转录反应体系

将反转录反应体系混成Mix加到gDNA去除反应液中，振荡混匀，42℃孵育15min，然后于95℃孵育3min之后放于-20℃低温保存，用于后续试验。

(2)实时荧光定量PCR

通过北京全式金生物技术有限公司订购的TransStart TipGreen qPCR SuperMix(+DyeⅡ)试剂盒进行gma-miR4359b在大豆胁迫前与胁迫不同时段的毛状根、茎、叶组织的定量分析，为保证试验结果的可信度，在反转录前将已提取的RNA浓度调整为2μg/μL。

根据目的基因序列，使用引物设计软件DNAMAN设计合成RT-qPCR引物qt-4359b-F：5'-CCGATGTTAAGTTAAACGCAG-3'和qt-4359b-R：5'-GATGTTAATGCATACACGTTAACATC-3'，荧光定量扩增体系如表3所示。

表3 RT-qPCR反应体系

检测每份样品的目的基因和内参基因Ct值(循环阈值)，试验设置3个重复，采用2^–ΔΔCt法分析基因的表达水平。

结果表明，gma-miR4359b在大豆毛状根、茎、叶中均有表达，其中该基因在毛状根中表达量最高，在茎与叶中表达量相近，如图3所示。

此外，NaCl胁迫2-6h时gma-miR4359b在毛状根中的表达量低于对照，随NaCl胁迫时间加长表达量逐渐升高，在NaCl胁迫12h表达量大幅度升高，24h表达量达到极值(图4a)。NaCl胁迫后gma-miR4359b在茎中表达量与在毛状根中表达量趋势相似(图4b)。在叶中NaCl胁迫2h时gma-miR4359b表达量低于对照，随胁迫时间加长表达量上升，在胁迫12h表达量大幅度上升并达到极值，在胁迫24h表达量低于12h(图4c)。上述结果表明gma-miR4359b基因可能在参与调控盐胁迫应答。

实施例3gma-miR4359b基因克隆

(1)通过新型植物基因组DNA提取试剂盒，进行大豆毛状根DNA提取，具体方法参照试剂盒说明书。根据大豆gma-miR4359b前体序列设计克隆引物gma-miR4359b-F：5'-GGATTTATTCTGAACATATTTTGTACG-3'和gma-miR4359b-R：5'-CAAATTAACTAATATCAAATAATTTATATAAATGTG-3'，以大豆毛状根系基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增50μL反应体系如表4所示。

表4 PCR扩增50μL反应体系

反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s；56℃复性30s；72℃延伸45s；34个循环，72℃延伸10min。通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。通过普通DNA凝胶回收试剂盒进行目的片段纯化回收，具体步骤参照说明书。将回收产物与pMD18-T载体连接，反应条件为上进行连接，充分混匀，短暂离心，16℃连接12h，连接体系如表5所示。

表5 pMD18-T载体连接体系

将连接产物通过热击转化法转入大肠杆菌中。挑取单克隆加入含有Amp的液体LB培养基中，37℃恒温振荡培养12h。以目的片段引物进行PCR检测，反应体系同表4所示的扩增50μL反应体系。将送测结果与目的片段进行比对，正确后通过SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒提取，提取步骤参照说明书，命名为gma-miR4359b质粒DNA。

实施例4gma-miR4359b植物表达载体构建

以克隆目的序列为基础，设计表达载体引物，并在引物中插入正向Nco I和反向Bgl II酶切位点，引物序列为：

gma-miR4359b-3301-F：

5'-TTTCCATGGGATTTATTAACATCGGTTTTGGAC-3'；

gma-miR4359b-3301-R：

5'-TTTAGATCTCAAATTAACTAATATCAAATAATTTATATAAATGTG-3'。以gma-miR4359b质粒DNA为模板进行扩增。扩增反应体系同表4所示的扩增50μL反应体系。然后通过普通DNA凝胶回收试剂盒进行目的片段纯化回收，具体步骤参照说明书。

利用限制性内切酶Nco I和Bgl II将回收产物与载体质粒(pCAMBIA3301)进行双酶切，反应条件为37℃、酶切12h，酶切反应体系如表6所示。

表6酶切反应体系

酶切后通过普通DNA产物回收试剂盒进行回收，并将回收产物与表达载体pCAMBIA3301进行连接，反应条件为22℃，连接8h，连接体系如表7所示。

表7表达载体连接体系

将上述连接产物转化大肠杆菌，具体操作步骤如下：

1)取50μl冰浴上融化的感受态细胞，加入10μL连接产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；

2)42℃水浴中热激45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管；

3)向离心管中加入500μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm，培养1h，使细菌复苏；

4)吸取500μl已转化的感受态细胞加到含kana抗生素的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。

提取大豆根系基因组DNA扩增大豆gma-miR4359b前体序列，得到大小为467bp的片段(图5a)，将该片段纯化回收，与pMD18-T载体链接，菌液PCR验证阳性克隆(图5b)，扩增得到带有酶切位点的467bp片段，纯化回收后亚克隆到植物表达载体pCAMBIA3301中，PCR验证得到大小为467bp的片段(图5c)，测序结果表明gma-miR4359b成功连接到pCAMBIA3301中，gma-miR4359b-pCAMBIA3301植物表达载体构建完成。

实施例5gma-miR4359b沉默载体构建

本实施例运用IPS1作用原理构建gma-miR4359b沉默载体IPS-pCAMBIA3301。gma-miR4359b沉默载体是以拟南芥DNA为模板通过三轮重叠PCR将拟南芥IPS1序列替换为目标序列。具体为：

以拟南芥基因序列与大豆gma-miR4359b前体序列为基础设计DNA扩增引物，具体为：

nIPS13301-F：5'-ATACCATGGAAAACACCACAAAAACAAAAG-3'；

nMIM4359b-R：

5'-GGGGAACCGAAGCTAACGCGTGATCGCATGTTAACATCGGTTTTCTAGAGG-3'；

nMIM4359b-F：

5'-CTAGAAAACCGATGTTAACATGCGATCACGCGTTAGCTTCGGTTCCCC-3'；

nIPS13301-R：5'-TTTAGATCTAAGAGGAATTCACTATAAAGAG-3'。

第一轮PCR以拟南芥DNA为模板，用nIPS13301-F、nIPS13301-R引物扩增目的条带，PCR反应体系参照表4。随后用第一轮PCR产物进行第二轮PCR，引物以nIPS13301-F、nMIM4359b-R和nMIM4359b-F、nIPS13301-R分别扩增目的条带，PCR反应体系参照表4。将第二轮PCR产物各取1μL进行第三轮PCR。用nIPS13301-F、nIPS13301-R引物扩增目的条带，PCR反应体系参照表4。每一次PCR扩增后均用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

采用同实施例4相同的方法进行载体构建。具体为：

第一轮PCR以拟南芥DNA为模板，用nIPS13301-F、nIPS13301-R引物扩增出了542bp的目的条带(图6a)，用第一轮PCR产物进行第二轮PCR，引物以nIPS13301-F、nMIM4359b-R和nMIM4359b-F、nIPS13301-R分别扩增出243bp和299bp条带(图6b)，第二轮PCR的产物各取1μL以nIPS13301-F、nIPS13301-R为引物进行第三轮PCR，扩增出了542bp条带(图6c)。对第三轮PCR产物进行验证。验证无误后，将第三轮PCR产物经过纯化后与pCAMBIA3301质粒进行双酶切反应，反应结束后进行连接转化大肠杆菌DH5α，待平板上长出单克隆后，挑取单克隆加入含有抗生素的液体LB培养基中进行振荡培养，提取质粒PCR验证得到524bp目的条带(图6d)，测序结果表明IPS成功连接到pCAMBIA3301中，IPS-pCAMBIA3301植物沉默载体构建完成。

实施例6gma-miR4359b在盐胁迫应答中的功能分析

(1)转化大豆毛状根：农杆菌K599由本实验室保存，将构建好的植物表达载体gma-miR4359b-pCAMBIA3301与沉默载体IPS-pCAMBIA3301转化K599农杆菌，通过PCR验证得到目的片段大小条带(图7、图8)。

挑选饱满均一的Williams 82种于营养土中4天，待子叶长出离土3cm时进行大豆转化，以转K599空载体作为对照组。将转化好的大豆放入保湿系统中进行生根培养5天，再将大豆移入营养液中水培15天，待毛状根长至8-10cm左右进行DNA提取，并用表达载体上游引物与自身下游引物进行PCR检测，反应体系参照表4。通过PCR验证得到相应目的片段条带(图9、图10)，证明植物表达载体与沉默载体成功转入大豆毛状根中，形成转基因复合体大豆。

(2)转基因复合体大豆胁迫后gma-miR4359b表达量分析

将转表达载体与沉默载体和对照组复合体大豆苗移入含有250mM NaCl的Hoagland溶液中胁迫24h，提取胁迫后大豆毛状根RNA，反转成cDNA作为模板，设计gma-miR4359b荧光定量引物：

qt-4359b-F：5'-CCGATGTTAAGTTAAACGCAG-3'；

qt-4359b-R：5'-GATGTTAATGCATACACGTTAACATC-3'，进行RT-qPCR，分析gma-miR4359b在转基因复合体大豆毛状根中的表达量。

如图11可见，gma-miR4359b在转表达载体的复合体大豆中表达量明显高于对照，在转沉默载体的复合体大豆中gma-miR4359b表达量低于对照，并且与对照相比较都具有显著性差异，证明在复合体大豆毛状根中成功使gma-miR4359b基因过表达与沉默。

实施例7转基因复合体大豆盐胁迫后表型分析

将转基因复合体大豆与对照组复合体大豆分别进行NaCl胁迫。一组将对照组、转表达载体、转沉默载体各60株复合体大豆种于营养土中正常生长15天后，洗净营养土转移水中培养3天，使用250mM NaCl胁迫24h，观察表型，统计存活率。

如图12a所示，根上部分转表达载体的复合体大豆小部分叶片卷曲，对照组大豆大部分叶片呈现卷曲状，转沉默载体的复合体大豆叶片全部卷曲并且叶片水分丧失严重。根下部分可以看出转沉默载体的复合体大豆毛状根系明显褐化严重，统计胁迫后大豆存活率，转表达载体的复合体大豆存活率为78.33％，对照组的复合体大豆存活率为51.67％，转沉默载体的复合体大豆存活率为35％，如图12b所示。

另一组将转基因复合体大豆各60株与对照组复合体大豆120株对半种于营养土中，转表达载体大豆与对照组大豆为一组，转沉默载体大豆与对照组大豆为一组，室温中生长2周，并在无水条件下生长5天，减少土壤中含水量，再通过250mM NaCl胁迫下生长3天。

如图13a所示，转表达载体的复合体大豆与对照组大豆进行比较，小部分叶片变干，色泽变暗。转沉默载体的复合体大豆与对照组大豆进行比较，大部分叶片变干，色泽变暗，受到NaCl胁迫严重。胁迫后统计存活率，转表达载体的复合体大豆存活率为73.33％，对照组的复合体大豆存活率为42.5％，转沉默载体的复合体大豆存活率为33.33％(图13b)，与第一组大豆胁迫后表型与存活率趋势相同，说明gma-miR4359b在毛状根中的过表达会提高复合体大豆耐盐性。

实施例8转基因复合体大豆生理指标测定

将转基因复合体大豆与对照组复合体大豆分别种于营养土中生长15天后停止浇水，在无水条件下生长5天，减少土壤中水分，再进行250mM NaCl胁迫3天，取胁迫前后大豆叶片进行MDA含量、蔗糖含量、SOD含量进行测定，具体方法参照说明书。

如图14所示，MDA含量在受到胁迫后上调，其中NaCl胁迫后转表达载体的复合体大豆MDA含量低于对照组大豆，转沉默载体的复合体大豆胁迫后MDA含量高于对照组大豆，说明gma-miR4359b在毛状根中过表达使复合体大豆在胁迫后植物质膜的氧化程度变低，对细胞膜起到保护作用。

蔗糖含量在复合体大豆受到胁迫后明显升高，其中转表达载体的复合体大豆胁迫后蔗糖含量低于对照组大豆，转沉默载体的复合体大豆胁迫后蔗糖含量高于对照组大豆，说明gma-miR4359b在毛状根中过表达使复合体大豆在胁迫后细胞内液渗透压相对变低。

SOD含量在复合体大豆受到胁迫后含量降低，其中转表达载体的复合体大豆胁迫后SOD含量高于对照组大豆，转沉默载体的复合体大豆胁迫后SOD含量低于对照组大豆，说明gma-miR4359b在毛状根中过表达使复合体大豆在胁迫后耐盐能力增强。

由上可以证明gma-miR4359b在毛状根中过表达会提高复合体大豆的耐盐性。

Claims (9)

1.大豆gma-miR4359b基因，其特征在于，所述大豆gma-miR4359b基因的序列任选自如下(a)或(b)所述的序列之一：

(a)具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(b)以序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为核心构建的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的大豆gma-miR4359b基因的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是将权利要求1所述的大豆gma-miR4359b基因插入pMD18-T表达载体得到的。

3.表达载体，其特征在于，以权利要求2所述的重组质粒的DNA为模板、以gma-miR4359b-3301-F、gma-miR4359b-3301-R为引物扩增得到。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述gma-miR4359b-3301-F具体为：

5'-TTTCCATGGGATTTATTAACATCGGTTTTGGAC-3'；

所述gma-miR4359b-3301-R具体为：

5'-TTTAGATCTCAAATTAACTAATATCAAATAATTTATATAAATGTG-3'。

5.根据权利要求1所述的大豆gma-miR4359b基因在培育抗干旱、耐高盐和/或耐ABA的转基因植物的应用。

6.根据权利要求1所述的大豆gma-miR4359b基因在基因工程改善大豆耐盐性中的应用，其特征在于，过表达大豆gma-miR4359b基因能够显著提高大豆对盐胁迫抗性。

7.提取、扩增权利要求1所述的大豆gma-miR4359b基因的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取大豆毛状根DNA；

2)以大豆毛状根DNA为模板，利用克隆引物以及LA-Taq聚合酶进行PCR扩增；其中：

PCR反应体系为：模板DNA 1.0μL、正向引物1.0μL、反向引物1.0μL、10×PCR buffer5.0μL、dNTPs 4.0μL、LA-Taq聚合酶0.5μL和ddH₂O 35.5μL,总体积50μL。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所采用的克隆引物为：

正向引物：5'-GGATTTATTCTGAACATATTTTGTACG-3'

反向引物：5'-CAAATTAACTAATATCAAATAATTTATATAAATGTG-3'。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s；55℃复性30s；72℃延伸45s；34个PCR循环，72℃延伸10min。

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