CN102191254A

CN102191254A - 调节植物胁迫抗性的cbf转录因子及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102191254A
Application number: CN2011100952684A
Authority: CN
Inventors: 程红梅; 郭惠明; 张晗
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2011-09-21

Abstract

本发明公开了调节植物胁迫抗性的CBF转录因子及其编码基因和应用。本发明采用 RACE策略从沙冬青中克隆并鉴定了一个CBF全长基因，半定量RT-PCR实验证明该基因受低温诱导在冷处理1h开始有表达，2h后表达量达最高。经生物信息学分析，AmCBF基因编码蛋白具有AP2结构域和CBF家族中保守特征多肽序列，属于AP2/EREBP类转录因子家族中的CBF基因家族。与野生型烟草相比，在冷处理后转AmCBF基因烟草叶片的电解质渗漏率明显降低，脯氨酸含量、可溶性糖含量都有明显提高，证明耐寒性增强。耐旱性实验表明,转基因烟草的干旱耐受能力也有很大提高。实验结果表明AmCBF能够响应逆境信号并发挥作用。

Description

调节植物胁迫抗性的CBF转录因子及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及与植物抗逆性相关的CBF转录因子及其编码基因，尤其涉及从沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中所分离到的调节植物胁迫抗性的CBF转录因子基因及其编码蛋白，本发明还涉及它们在提高植物胁迫抗性中的应用，属于与植物耐逆性相关的转录因子领域。

背景技术

低温和干旱是全球性的影响植物生长、限制作物产量的非生物胁迫因子。低温寒害是农业生产中的一种严重自然灾害，世界每年因此造成的损失十分巨大，据估计达2000亿美元。植物抗寒性机理研究不仅在理论上有重要意义，在生产上也有广泛的应用价值。通过低温寒害的研究不仅可以知道植物是如何感受环境因子的变化并产生相对应的抗性，而且对于农业生产实践具有重要的指导作用。因此，培育具有抗寒能力的作物成为农业上的一个重要课题。传统的植物育种方法培育出了许多的抗寒品种，以化学调控的方法来提高植物的抗寒力也有一定的效果，而植物基因工程的发展则为培养抗寒作物提供了一条崭新的途径。在植物抗寒分子生物学研究中，人们鉴定和分离了一些抗寒基因和蛋白，如拟南芥中的COR15a，苜蓿的cas15，小麦的wca120，大麦的HVA1(Thomashow MF.Plant cold acclimation：Freezing tolerance genes and regulation mechanisms.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 1999，50：571～599.)，以及从北极海域鱼类分离的抗冻基因AFP(Chakrabartty A，et al.Structure-function relationships in a winter flounder antifreeze polypeptide.J Biol Chem 1989，264(18)：11307～11312)。人们将这些基因转入植物中希望能提高作物的抗寒能力，但单个基因的转入往往结果不理想，仅能部分改善抗寒能力。作物的抗寒性状是由多基因控制的，只有成簇抗性相关基因的转录激活，才能有效提高作物的抗寒能力，因此克隆并鉴定调控抗寒功能基因表达的转录因子成为这一研究领域的热点。

转录因子，也称反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制其他基因转录。转录因子有两种不同的类型。一种叫做普遍性转录因子(general transcription factor)，能激活所有启动子的转录活性，另一种叫做特异性转录因子(specific transcription factor)，只能激活特定基因启动子的转录活性。植物许多诱导型基因定时、定量及定位表达，都由特定的转录因子与特定的顺式作用元件相互作调控。近年来，相继从高等植物中分离出一系列调控低温、干旱、高盐、激素、病原反应及发育等相关基因表达的转录因子。从蛋白质结构分析，转录因子一般由DNA结合区(DNA-binding domain)、转录调控区(transcription regμlation domain)、寡聚化位点(oligomerization site)以及核定位信号(nuclear localization signal，NLS)四个功能区组成(吴乃虎.基因工程原理(下册)(第二版).北京：科学出版社.2002)。这些功能区决定转录因子的功能、特性、核定位以及调控作用等，通过这些功能区与启动子顺式作用元件结合或与其它蛋白的相互作用来激活或抑制基因的表达。CBFs(C-repeat Binding Factors)就是这样的一类转录因子，通过在植物冷驯化过程中的表达来提高植物的抗寒能力。

CBF转录因子能够识别CRT/DRE元件，调控多个与同类性状有关的基因表达，在提高植物对环境胁迫耐性的分子育种中，改良或增强一个关键转录因子的调控能力，可以使植物的耐逆性得到较为综合的改良。许多热带起源的植物，如西红柿、玉米、水稻、棉花，都不能忍受冷环境，0℃～12℃就能造成伤害，这些植物中也相继证实有CBF基因存在。CBF是一个基因家族，其成员的表达机制不同。CBF/DREB转录因子特异识别结合CRT/DRE元件，调控一系列干旱低温应答基因表达，这些基因所编码的产物使植物适应或抵御逆境。另外，超表达CBF3的拟南芥耐旱耐寒，而耐性的提高，不仅与CRT/DRE基因的表达增强有关，还与脯氨酸和糖含量的升高有关。

植物在长期的进化过程中，在低温、干旱等环境胁迫下，会诱导多种基因表达并发生一系列的生理生化变化，从而对胁迫作出积极反应。逆境胁迫诱导表达的基因产物，按其作用可分成两大类。作物的抗寒和耐旱性状由多基因控制，只有成簇抗性相关基因的转录激活，才能有效提高作物的抗寒和耐旱能力。CBF转录因子在逆境胁迫下激活，调控一系列低温干旱应答基因表达，使植物适应或抵御逆境。有研究证明，CBF冷反应途径的组成因子在开花植物中高度保守，转CBF的转基因植株对低温、干旱和盐胁迫的抗性明显增强。

中国北方寒冷地区主要的粮食作物(如：水稻、小麦)、经济作物(如棉花、烟草)在生长发育期都存在低温寒害问题，而这些作物的抗寒机制的研究非常有限。研究CBF在这些作物中家族成员数量，不同CBF基因问如何相互作用以及与冷、干旱等逆境的关系，CBF启动子区域有哪些基元和核心序列等方面开展研究将对实际生产有很重要的现实指导意义。

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是一种国家重点保护的珍稀濒危豆科植物，也是迄今为止中国温带荒漠的唯一珍贵常绿灌木。沙冬青是优良的固沙植物，具有抗热、抗旱、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠、耐沙埋、抗风蚀等特性，适应性很强，能在地表温度高达70℃，气温在-20～-30℃，年降雨量不足200mm的环境中正常生长，因此是珍贵的抗旱耐冻遗传资源，是进行抗寒/抗旱研究的理想材料。目前关于沙冬青的研究主要在生理生化层面上，还没有关于基因调控的报道。针对它开展CBFs基因的研究，并与喜温作物棉花的CBFs基因相比较，预计有可能解析和发现一些新的基因、调控元件和调控机理，对了解不同植物的CBFs基因及其调控网络以及通过基因工程改良作物的抗逆能力有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明目的之一是提供一种来源于沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)能够识别CRT/DRE元件、提高植物对环境胁迫抗性的CBF转录因子及其编码基因。

本发明目的之二是提供含有上述编码基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的转录因子及其编码基因应用于提高或改善植物的抗逆性。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种从沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中所分离的CBF转录因子基因，其核苷酸为(a)、(b)或(c)所示：

(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸；

(b)、编码SEQ ID No.2所示氨基酸的核苷酸；

(c)、与SEQ ID NO：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸，该核苷酸所编码蛋白质的氨基酸为SEQ ID NO：2所示。

所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen，Techniques in Biochemistry and Moolecular Biology Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

优选的，本发明所述的从沙冬青中所分离的CBF转录因子基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸。

本发明目的之二是提供由上述转录因子基因所编码的能够识别CRT/DRE元件、提高植物对环境胁迫抗性的CBF转录因子，其氨基酸为(a)或(b)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的氨基酸；

(b)、将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No.2所示CBF转录因子功能或活性的蛋白变体；

优选的，本发明所述的CBF转录因子为SEQ ID No.2所示的氨基酸。

所述的“多个”通常意味着28个，优选为24个，这取决于CBF转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备CBF转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

因此，本发明所述的CBF转录因子及其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性，蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。

本发明提供了一种提高植物对环境胁迫抗性的方法，包括：将本发明CBF转录因子基因引入到植物或植物细胞中，能够有效提高目标植物对环境胁迫的抗性；例如。可以将本发明CBF转录因子基因引入到目标植物细胞中，培育筛选得到对环境胁迫的抗性提高的转基因植物，其中，所述的环境胁包括干旱、低温等逆境。

本发明还提供了含有所述CBF转录因子基因的植物表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

将所述CBF转录因子基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该基因的植物表达载体。“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

该植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQ ID No.1所示的核苷酸和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达。例如。可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达。

该植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明还涉及将所述的CBF转录因子基因引入到植物中以提高植物的胁迫抗性；所述的“引入”指将CBF转录因子基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的CBF转录因子基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的CBF转录因子基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的CBF转录因子基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.Plant Cell Reports.1986.5：81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是玉米、水稻、高梁、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等。

本发明一个最优选的整体技术方案的详述

本发明采用RACE策略，克隆并鉴定了一个沙冬青CBF全长基因(AmCBF)(SEQ ID NO.3)，半定量RT-PCR实验证明该基因受低温诱导，在冷处理1h开始有表达，2h后表达量达最高。经过生物信息学分析，AmCBF基因编码蛋白(SEQ ID NO.2)具有AP2结构域和CBF家族中保守特征多肽序列，属于AP2/EREBP类转录因子家族中的CBF基因家族。根据蛋白比对和蛋白二级和三级结构预测结果，AmCBF与CBF在AP2结构域存在个别氨基酸位点的差异，推测可能会影响CBF转录因子与DNA结合能力。

将AmCBF基因构建到CaMV35S启动子驱动的植物表达载体，以叶盘法转化烟草，并进行转基因分子鉴定。在冷处理后，转AmCBF基因烟草的脯氨酸和可溶性糖含量都比野生型有明显的提高。这说明AmCBF的表达促进COR等基因的转录，进而引起脯氨酸和可溶性糖这样的渗透调节物质的合成。脯氨酸和可溶性糖都是渗透调节剂，可以提高原生质的渗透压，防止水分散失，防止细胞内各种酶蛋白在渗透胁迫下脱水，维持细胞膜和蛋白质正常功能和活性，进而增强植物耐逆性。实验结果表明，转基因烟草电解质渗漏率在0～-6℃一直低于野生型烟草，在-8℃大幅度上升，表明在-8℃转基因烟草细胞膜开始受到破坏，细胞内溶物释放，胞外溶液电导率大幅提高。而野生型烟草在-6℃电导率就已经很高，细胞膜已经受破坏。说明转AmCBF烟草耐冷性有明显提高。

转AmCBF基因烟草的耐旱性试验表明，转基因植株的干旱耐受性明显比野生型强。在PEG模拟的干旱条件，无论是强启动子还是弱启动子的转基因烟草都表现出比野生型更强的耐干旱能力。业已证明低温和脱水反应的信号传导途径具有许多共同之处，形成复杂的相互联系的信号网络(Yang TW，Zhang LJ，Zhang TG，Zhang H，Xu SJ，An LZ.Transcriptional regulation network of cold-responsive genes in higher plants.Plant Science 2005，196(6)：987～995.)。因此，在转基因烟草植株中AmCBF超表达综合地激活了低温驯化反应中的多个组分的表达，脯氨酸等渗透调节物质含量也明显上升，使转基因植株的耐旱性有明显的提高。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等人，(1992)；Rossolini等人，Mol Cell.Probes 8：91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

附图说明

图1 3’race的片段M：100bp Ladder，1：3’race第一轮扩增片段，2：3’race第二轮扩增片段。

图2 5’race的片段M：100bp Ladder，1：5’race第一轮扩增片段，2：5’race第二轮扩增片段。

图3沙冬青CBF全长基因序列及DNAMAN分析得到的蛋白质序列。

图4CBF蛋白保守序列比对结果；黑点所示为CBF保守特征序列，直线所示为AP2结构域。

图5沙冬青CBF系统发育树。

图6沙冬青CBF低温诱导下半定量RT-PCR结果；(A)AmCBF基因3’端片段扩增结果(B)β-actin扩增结果。

图7植物表达载体的构建示意图。

图8GUS组织化学染色；1-4：35S:AmCBF转基因烟草；5：野生型对照。

图9转基因烟草的PCR鉴定；1-8：35S:AmCBF转基因植株；9：质粒对照；10：野生型烟草对照；11：水对照。

图10转基因烟草的半定量RT-PCR鉴定；1-5：35S:AmCBF转基因植株；6：野生型对照。

图11相对电导率法检测转基因植株的耐寒性。

图12游离脯氨酸含量检测结果。

图13可溶性糖含量检测结果。

图14转基因烟草的耐旱性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

1.1实验材料

1.1.1植物材料

植物材料为蒙古沙冬青幼苗，种子由中国农业科学院生物技术研究所裴新梧研究员提供。种子经50～60℃温水浸种24h，去除秕粒，冷水浸泡1昼夜，期间换清水2～3次。吸胀后种子捞至0.5％KMnO4溶液浸泡消毒30min，清水洗净，放入育苗培养箱，上覆纱布。每天向纱布喷水2～3次，经常翻动种子，使之出芽均匀，保持温度20～25℃，4～6天全部出芽完毕。挑选种子播种于育苗容器，每盆2～3粒，上覆蛭石1～1.5cm，适量补水，7～10天后出苗完成。将沙冬青幼苗放置于低温光照培养箱，在温室中生长14d的沙冬青幼苗，放入低温培养箱，光照强度300lux，分别在4℃处理0，15min，30min，1h，2h，4h，8h，16h，24h，各提取总RNA进行反转录，所得cDNA为模板，在3’端附近片段设计特异引物进行RT-PCR扩增实验，内参基因为β-actin。由实验室保存的栽培型烟草NC89作为植物转化材料。

1.1.2引物和测序

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(1)，测序工作由三博远志生物技术有限公司和中国农业科学院重大科学工程楼开放实验室完成。

表1合成引物列表

1.1.3实验菌株和载体

农杆菌LBA4404，大肠杆菌DH5α由本发明人实验室保存；pCAMBIA2301植物表达载体，改造的pBI121植物表达载体(带有GUS报告基因)由实验室保存(拜尔迪公司购买)；pMD18-T载体购自Takara公司。

1.1.4酶及其他化学试剂

限制性内切酶、Taq酶、T₄ DNA连接酶等常用酶类购自Takara等公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京中科瑞泰科技有限公司；TRIzol Reagent，SuperScriptIII反转录酶购自Invitrogen(USA)公司；GeneRacer RLM-RACE Kit购自Invitrogen(USA)公司，其它培养基等试剂均购自北京拜尔迪生物技术公司和北京钧瑶伟业生物工程公司。

1.2实验方法

1.2.1常用分子生物学实验方法

1.2.1.1质粒提取

(1)接单菌落于3-5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇(200r/min)，培养过夜；

(2)将2ml培养物倒入离心管中，12000rpm离心5min，倒掉培养液，尽可能清除残余液；

(3)重复步骤2，再收集2ml菌液，离心，沉淀菌体细胞；

(4)小心除去剩余的少量残液，将细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))中，吸打混匀；

(5)加入400μl新配置的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，盖紧管口，快速颠倒离心管1～2次，混匀内容物；

(6)加入300μl冰预冷的溶液III(5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，盖紧管口，快速颠倒离心管1～2次，混匀内容物，然后置于冰上5min；

(7)12000rpm离心10min，转移上清至另一离心管中，加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀；

(8)12000rpm离心10min，将上清转移到另一离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，冰上沉淀15min；

(9)12000rpm离心10min；

(10)小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽；

(11)75％乙醇洗涤DNA沉淀2次；

(12)风干DNA，将其溶于20μl TE缓冲液或无菌双蒸水中；

1.2.1.2大肠杆菌感受态的制备

(1)挑取在LB固体培养基上生长的受体菌DH5α单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜(200r/min)；

(2)按1％接种量转接到100ml LB液体培养基中，于37℃，300r/min摇约3hr，可通过测量OD₆₀₀值(0.4～0.6)来检测培养物生长状况；

(3)在无菌条件下，将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；

(4)4000rpm、4℃离心10min，回收菌体细胞，除尽培养液；

(5)用10ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份细胞沉淀，放置于冰上30min；

(6)4000rpm、4℃离心10mm，回收细胞，除尽培养液，5，6步骤可重复一次；

(7)每50ml初始培养物，用1ml冰预冷的0.2M CaCl₂和1ml30％甘油，重悬每份细胞沉淀；

(8)每管200μl分装，置于液氮中，-70℃保存备用。

1.2.1.3大肠杆菌的转化(热击法)

(1)在100μl感受态细胞中加入待转化的DNA，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min；

(2)将离心管放至42℃的循环水浴中90sec；

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却至室温；

(4)每管加800μl LB液体培养基，37℃保温45min；

(5)取50、100、200μL转化的感受态细胞，分别转移到含相应抗生素的LB固体培养基上(如要检测α-互补，应预先在平板上涂好X-gal和IPTG)，用一无菌的弯头玻璃棒将菌液涂满整个平板表面；

(6)将平板置于室温下至液体被吸收；

(7)倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。

1.2.1.4根癌农杆菌LBA4404感受态的制备

(1)在平板上挑取单菌落，接种到5ml YEB液体培养基(含链霉素Str 250mg/L)，28℃、200rpm培养过夜。

(2)取2ml菌液，加入50ml YEB液体培养基(含链霉素Str250mg/L)中，28℃、200rpm培养至OD600约0.6左右。

(3)将菌液转至50ml无菌离心管中，冰浴30min，5000rpm离心5min。

(4)弃上清，沉淀用2ml 20mM CaCl₂悬浮，每份100μl分装到1.5ml离心管中，液氮中速冻后保存备用。

(5)若制备用于电击转化的感受态时，上述沉淀要用灭菌蒸馏水洗涤，然后离心收集沉淀再洗涤，重复3次。最后用1.2M冰冷的山梨醇溶液溶解沉淀，分装保存于-70℃冰箱中备用。

1.2.1.5重组质粒DNA冻融法转入农杆菌LBA4404

(1)将大约1μg的质粒DNA加入到100μl LBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5min。

(2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37℃温箱中保温5min(如果没有彻底化开，可以适当延长保温时间)。

(3)加入1ml YEB液体培养基，在28℃摇床上200rpm复苏4～5h。

(4)取适量菌液涂布到含Str(链霉素)250mg/L、Rep(利复平)250mg/L和相应质粒抗性的YEB固体培养基上，倒置于28℃培养箱培养24～48h。

1.2.1.6总RNA的提取(酚法)

(1)液氮研磨适量保存于-80℃冰箱的沙冬青组织，取适量粉末于1.5ml离心管中，加入200μl Tris-饱和酚(pH8.0)和200μl 100mM Tris-Cl(pH8.0)，迅速涡旋30s；

(2)12000rpm、室温离心10min，取上清与一新离心管中；

(3)加入等体积氯仿，充分涡旋，12000rpm、4℃离心10min，取上清于一新离心管中；

(4)加入1/10体积3mol/LNaAc(pH 5.2)，2倍体积的乙醇，混匀，-20℃沉淀20～30min；

(5)12000rpm、4℃离心10min，弃上清，75％乙醇洗沉淀2次；

(6)真空干燥，溶于适量RNase-free水中；

(7)1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，-80℃保存备用。

1.2.1.7总RNA的纯化

用酚法提取的RNA样品需要利用DNase去除混杂的DNA的影响。其操作步骤如下：

(1)在以下体系中消化DNA

总RNA	50μl
		10×缓冲液	10μl
DNaseI(1U/μl)	15μl
		ddH₂O	upto 100μl

轻轻混匀，37℃保温30min。

(2)加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，12000rpm、4℃离心10min，取上清；

(3)加入1/10体积3mol/LNaAc(pH 5.2)，2倍体积的乙醇，混匀，-20℃沉淀20～30min；

(4)12000rpm、4℃离心10min，弃上清，75％乙醇洗沉淀2次；

(8)真空干燥，溶于适量RNase-free水中；

(9)紫外分光光度计测定OD260/OD280，检测纯度和浓度

(10)1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，-80℃保存备用。

1.2.1.9基因组DNA的提取(CTAB法)

(1)取适量沙冬青植物组织，在液氮中快速研磨成粉末状，迅速装入预冷的10mL离心管中，放入冰盒中待用。

(2)每个样品加入4mL预热的(65℃)CTAB裂解液(1.4M NaCl，100mM Tris-Cl，20mM EDTA)，轻摇混匀。

(3)65℃水浴1h，每隔15～20min轻摇一次，使其充分混匀。

(4)冷却至室温后，加等体积氯仿/异戊醇(v/v＝24∶1)，轻摇使之充分混匀。

(5)12000rpm、4℃离心10min，将上层水相转入新的离心管中，加2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇，静置，待沉淀析出后用枪头挑出沉淀，转入新的离心管中。

(6)用75％乙醇洗涤沉淀两次，超净台吹干，加入500μl ddH₂O溶解。

1.2.1.10农杆菌介导的烟草的遗传转化方法

1)农杆菌的活化

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5ml YEB液体培养基中(Kan 100mg/L，Str 125mg/L)，振荡培养过夜，取1ml菌液接种到50ml YEB液体培养基(Kan 100mg/L，Str 125mg/L)中，振荡培养至OD₆₀₀为0.4～0.5(约3～4h)，5000rpm离心5min，菌体用MS₀培养基重悬，使OD₆₀₀为0.1～0.2。

2)烟草的遗传转化

将种在MS基本培养基上的无菌的烟草，切去叶片边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm大小；将切好的外植体在上述OD₆₀₀为0.1～0.2的农杆菌菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，将小叶片摆放在铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2mg/L)上进行共培养，25℃暗培养3天；将经过共培养的烟草外植体转移到含有抗生素的抗性芽筛选培养基(MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中进行培养，光照周期为16hr光照/8hr黑暗，2～3周后即可生芽；待抗性芽生长至1～2cm高时，切下小芽转入生根培养基(MS+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中诱导生根，1～2周后就会有不定根形成。

1.2.2转基因烟草的鉴定方法

1.2.2.1PCR鉴定

以转基因烟草基因组DNA为模板，采用AmCBF基因全长引物进行PCR鉴定。PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.2.2.2半定量RT-PCR方法

使用反转录酶SuperscriptIII将提取的总RNA反转录成cDNA，具体方法如下

(1)在去除RNase的离心管中加入以下试剂：

OligodT	1μl
		总RNA(1μg～5μg)	11μl
dNTP(10mM each)	1μl
		DEPCH₂O	1μl
Total	13μl

(2)加热65℃，5min，冰上冷却，短时离心，加入以下试剂

5×First Strand Buffer

4μl

0.1MDTT	1.3μl
		RNase OUT(40U/μl)	1μl

(3)加入0.7μl SuperscriptIII反转录酶，吸打混匀

(4)50℃50min，70℃15min。

至此反转录完成，得到的cDNA可以进行PCR操作了。1.2.2.3GUS组织化学染色方法

(1)GUS染液的配制

0.1M磷酸缓冲液pH7.0	750μl
		5mM K₃[Fe(CN)₆]	10μl
5mM K₃[Fe(CN)₆]·3H₂O	10μl
		0.5mM EDTA	20μl
甲醇	200μl
		Triton-X100	1μl
X-Gluc(5mg/50μl)	10μl
		Total	1000μl

(2)待测材料剪成小块放于50～80μl染液中，28℃～37℃过夜，再转入70％乙醇脱色2～3次，直至阴性对照呈白色，白色背景下蓝色小点即为GUS表达位点。

1.2.3转AmCBF基因烟草生理检测方法

1.2.3.1电导率法测定抗寒性

选T2转基因烟草，空载体烟草和野生型烟草植株，放入低温培养箱(0，-2，-4，-6，-8，-10℃)放置2小时后取出，每组称取叶片0.4g放于100ml三角瓶中，加入40ml ddH₂O，以120r/min的速度在摇床上振荡2小时。用电导率仪测定电解质渗透率。测完后，沸水浴中煮沸10分钟。在120r/min的摇床上振荡2小时，冷却至室温后再测定电解质渗透率。

1.2.3.2可溶性糖含量测定

(1)标准曲线的制作：取大试管11支，从0～10分别编号，按下表加入100mg/L蔗糖溶液和水，配成从10～15mg/L的系列标准液，除空白外，各浓度均重复二次。

加完溶液后，按顺序向试管内加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸。浓硫酸要沿管壁缓缓加入，然后将试管轻摇一下，待乙酸乙酯水解后，再充分摇动试管数次(注意勿将硫酸浅出)，使液体混匀，立即放入沸水浴中准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。并求出标准曲线的直线的方程。

管号	0	1-2	3-4	5-6	7-8	9-10
							100mg/L蔗糖(ml)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
水(ml)	2.0	1.8	1.6	1.4	1.2	1.0
							蔗糖加入量(μg)	0	20	40	60	80	100

(2)可溶性糖的提取：取新鲜植物叶片，擦净表面污物，称取0.1～0.3g叶片，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

(3)样品测定：准确吸取样品提取液或水解液2ml于大试管中，2ml样品液中总含糖量应在20-100μg之间，若超出此值，则应稀释样品液(或减少样品液用量，然后加水使液体总量达到2m1)，以下步骤与标准曲线测定相同。根据所测光密度查标准曲线，即可得出每ml样品液中碳水化合物总量。

1.2.3.3脯氨酸含量测定

(1)脯氨酸的提取：选T2转基因烟草和野生型烟草植株，-4℃冷处理2h，各取0.3g叶片，加入5mL 3％的磺基水杨酸溶液，沸水浴加热15min，冷却后过滤，滤液4℃保存。

(2)脯氨酸含量测定：取2mL滤液于具塞玻璃试管中，加入2mL冰乙酸和2mL酸性茚三酮显色液，沸水浴加热30min。冷却后加入4mL甲苯，振荡30s后静置片刻，取上层甲苯萃取液于10mL离心管中，3000rpm离心5min。取甲苯上清萃取液，以甲苯为空白对照，测定520nm波长处的OD值，3次重复，取平均值。将获得的OD值与标准曲线相比较得出脯氨酸的含量。

1.2.3.4耐旱性测定

将烟草小苗的根置于10％PEG6000的1/10MS培养液中模拟干旱条件，放入人工气候箱培养，光周期16h/8h。在24h，36h，48h三个时间点对转基因烟草小苗(20棵)和野生型小苗(20棵)进行观察和计数，以叶片萎蔫为标准区分耐干旱和不耐干旱小苗。存活率的计算是耐干旱小苗/处理组小苗总数×100％。

1.2.4CBF核心区的PCR扩增及测序

(1)根据NCBI网站上搜索得到的CBF保守区序列，根据不同物种CBF保守区序列，设计简并引物，引物设计软件为PrimerPremier5.0和DNAMAN。

(2)PCR反应体系

10×ExTaq Buffer	5μl
		dNTP Mixture(2.5mmol/L each)	4μl
TakararTaq(5U/μl)	0.5μl
		Primer L(10μmol/L)	1μl

Primer R(10μmol/L)	1μl
		沙冬青基因组DNA	0.5μl
ddH₂O	38μl
		Total	50μl

(3)PCR反应条件：

94℃变性5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

(4)电泳检测，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收200bp左右的DNA目的片段，并与pMD18-T克隆载体连接，连接体系如下：

pMD18-T载体	0.5μl
		Solution I	5μl
PCR产物回收液	4μl
		H₂O	0.5μl
Total Volume	10μl

热击法转化DH5α，筛选鉴定阳性克隆并测序。

1.2.5RACE技术获取沙冬青CBF基因全长

使用由Invitrogen(USA)公司提供的GeneRacer RLM-RACE Kit，进行RACE实验获取基因全长。

1.2.5.1去磷酸化反应

用试剂盒中的试剂配制下列反应液，装于1.5ml的RNase-free离心管中，置于冰上。总RNA用量1-5μg。

RNA	6μl
		10×CIP缓冲液	1μl
RnaseOutTM(40U/μl)	1μl
		CIP(10U/μl)	1μl
DEPC water	1μl
		总体积	10μl

(1)用枪头轻轻混匀，简单涡旋，离心收集，50℃温浴1小时，简单离心并置于冰上

(2)沉降RNA时，加90μl DEPC水及100μl的酚/氯仿，剧烈震荡30秒

(3)室温12000转离心5分种，取上清至一新的离心管中(约100μl)

(4)加2μl的10mg/ml的糖原(glycogen，沉淀辅助剂)，10μl3M的醋酸钠(pH5.2)，混匀后加入220μl95％的乙醇，简单涡旋，-20度30分钟

(5)4℃12000转离心20分钟收集RNA沉淀，注意沉淀的位置，用枪取走上清，小心不要接触沉淀

(6)加500μl70％的乙醇，颠倒几次，4℃12000转离心2分钟

(7)注意沉淀位置，用移液器小心取走乙醇，离心收集余下的乙醇

(8)用移液器仔细的取走余下的乙醇，室温风干沉淀1-2分钟，用7μl DEPC水重悬沉淀

1.2.5.2去帽反应

将10μl装有去帽反应液的1.5ml离心管放在冰上，加入试剂盒中相应的试剂

Dephosphorylated RNA	7μl
		10×TAP缓冲液	1μl
RNaseOut^TM(40U/μl)	1μl
		TAP(0.5U/μl)	1μl
总体积	10μl

(1)用移液器轻轻混匀，简单涡旋，简单离心收集液体。37℃温浴1小时，简单离心，置于冰上。

(2)温浴1小时后，加入90μlDEPC水及100μl酚氯仿，剧烈震荡30秒

(3)室温12000转离心5分钟

(4)将上清相转移到新的离心管中(约100μl)

(5)加2μl的10mg/ml的糖原(glycogen，沉淀辅助剂)，10μl3M的醋酸钠(pH5.2)，混匀后加入220μl95％的乙醇，简单涡旋

(6)-20℃冷冻10分钟，4℃12000转离心20分钟收集RNA沉淀

(7)注意沉淀的位置，用枪取走上清，小心不要接触沉淀

(8)加500μl70％的乙醇，颠倒几次，简单涡旋

(9)4℃12000转离心2分钟

(10)注意沉淀位置，用移液器小心取走乙醇，离心收集余下的乙醇

(11)仔细的吸走余下的乙醇，室温风干沉淀不超过1-2分钟，用7μl DEPC水重悬沉淀

1.2.5.3连接反应

7μl去磷酸化的、脱帽的RNA加至预先分装的、冷冻的GeneRacer^TM RNA Oligo中(0.25μg)，用移液器上下吸打几次并重悬RNA Oligo。简单离心收集管底溶液。65度温浴5分钟，使RNA的二级结构松开(注意：温浴后，总体积将因蒸发减少约1μl)。冰上冷却约2分钟，简单离心，在管中加入下列试剂，用枪混匀后，简单离心。

10×Ligase Buffer	1μl
		10mM ATP	1μl
RNaseOut^TM(40U/μl)	1μl
		T4 RNA ligase(5U/μl)	1μl
总体积	10μl

(1)37度温浴1小时，加入90μl DEPC水及100μl酚氯仿，剧烈震荡30秒

(2)室温12000转离心5分钟

(3)将上清相转移到新的离心管中(约100μl)

(4)加2μl的10mg/ml的糖原(glycogen，沉淀辅助剂)，10μl3M的醋酸钠(pH5.2)，混匀后加入220μl95％的乙醇，简单涡旋

(5)-20℃冷冻10分钟，4℃12000转离心20分钟收集RNA沉淀

(6)注意沉淀的位置，用枪取走上清，小心不要接触沉淀

(7)加500μl70％的乙醇，颠倒几次，简单涡旋

(8)4℃12000转离心2分钟

(9)注意沉淀位置，用移液器小心取走乙醇，离心收集余下的乙醇

(10)仔细的吸走余下的乙醇，室温风干沉淀不超过1-2分钟，用10μlDEPC水重悬沉淀

1.2.5.4反转录mRNA

加入下列试剂于10μl已连接的RNA

Primers	1μl
		dNTPMix	1μl
Sterile，distilled water	1μl

65度温浴5分钟，以去掉RNA的所有的二级结构。冰上冷却至少1分钟，简单离心，将下列试剂加入13μl-连接的RNA与引物的混和物中：

5×First Strand Buffer	4μl
		0.1M DTT	1μl
RNaseOut^TM(40U/μl)	1μl

SuperScript^TM III RT(200U/μl)	1μl
		Total Volume	20μl

(1)用移液器上下吸打混匀，简单离心，55℃温浴30-60分钟。

(2)70℃15分钟停止RT反应。冰上放置2分钟，12000转简单离心。

(3)加1μl RNaseH(2U)于混合液中。

(4)37度温浴20分钟。

(5)简单离心并立即使用或存于-20度。

至此，沙冬青总RNA已经反转录成为cDNA，可以进行下一步的实验。

1.2.5.5 3’末端序列的扩增

根据前面实验获得的沙冬青CBF核心区204bp序列，设计3’末端引物和巢式引物SDQFP和SDQFNP；SDQFP与Gene Racer 3’primer，SDQFNP与Gene Racer 3’nested primer相搭配分别组成两对引物，PCR扩增3’末端。

(1)按下表加入各试剂，进行3’RACE第一轮扩增。

10×Ex Taq Buffer	5μl
		dNTP Mixture(2.5mmol/L)	4μl
TaKaRa EX Taq(5U/μl)	0.5μl
		SDQFP(20μmol/L)	1μl
Gene Racer^TM 3’primer(20μmol/L)	3μl
		沙冬青cDNA	1μl
ddH₂O	35.5μl
		Total	50μl

3’RACE第一轮扩增引物对：

SDQFP：AGTGGGTTTGTGAAGTGAGGGAGC

Gene Racer 3’primer：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG

(2)以第一轮扩增得到的PCR稀释液为模板，加入各试剂，进行3’RACE第二轮扩增。

3’RACE第二轮扩增引物对：

SDQFNP：GACAAGGATCTGGCTCGGGACTTT

Gene Racer 3’primer：CGCTACGTAACGGCATGACAGTG

两次扩增的PCR反应程序为：94℃5min；94℃30sec，62℃45sec，72℃1min，3个循环；94℃30sec，58℃1min，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min。

1.2.5.6 5’末端序列的扩增

根据前面实验获得的沙冬青CBF核心区204bp序列和3’末端序列，设计5’末端引物和巢式引物SDQRP和SDQRNP；SDQRP与Gene Racer 3’primer，SDQRNP与Gene Racer 5’nested primer相搭配分别组成两对引物，进行PCR反应扩增5’末端。

(1)加入各反应试剂，进行5’RACE第一轮扩增。

5’RACE第一轮扩增引物对：

SDQRP：GTGAGCCCTTGCCGCCATTTCC

Gene Racer 5’primer：CGACTGGAGCACGAGGACACTGA

(2)以第一轮扩增得到的PCR稀释液为模板，加入各反应试剂，进行5’RACE第二轮扩增。

5’RACE第二轮扩增引物对：

SDQRNP：GACAAGGATCTGGCTCGGGACTTT

Gene Racer 5’nested primer：CGCTACGTAACGGCATGACAGTG

两次扩增的PCR反应程序为：94℃5min；94℃30sec，60℃45sec，72℃1min，3个循环；94℃30sec，56℃45sec，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min。

1.2.6沙冬青CBF序列分析及功能预测方法

1.2.6.1核苷酸序列分析

用DNAMAN软件分析所克隆cDNA序列的开放性读框。利用网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的blastx在线工具搜索数据库，进行相似性比较。

1.2.6.2蛋白质序列分析

(1)相似性搜索

通过网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastBlast.cgi)对克隆序列的最长读框蛋白进行blastp相似性搜索。

(2)BLOCKS分析和功能结构域确定

通过网站httpL://blocks.fhcrc.org/blocks，按同源性导出的蛋白质二级结构数据库对克隆序列的最长读框蛋白进行蛋白质模块分析。利用Pfam在线工具(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam)对功能域进行预测。

(3)疏水性分析

疏水性分析是蛋白质二级结构以后三级结构预测中的一个必要的过程，通过网站http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl进行分析。

(4)核定位信号分析

通过PredictNLS对最长读框蛋白进行核定位信号预测，预测网站为http://cubic.bioc.Columbia.edu/cgi/var/nair/resonline.pl

(5)信号肽预测

使用SignalP在线工具对蛋白质进行信号肽预测，网站为http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP

(6)卷曲螺旋预测

卷曲螺旋是控制蛋白质寡聚化的元件，通过网站http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html进行预测。

(7)跨膜结构预测

跨膜结构是跨膜蛋白的特征结构，一般在蛋白质中序列相似性不大，但结构及其相似，通过网站http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html进行预测。

(8)二级结构预测

针对克隆序列得到的最长读框蛋白，应用http://npsa-pbil.ibcp.fr/网站提供的在线工具进行二级结构预测。

(9)三级结构预测

通过http://www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw/提供的工具以同源建模法对克隆序列的最长读框蛋白进行三级结构预测。

(10)系统发育分析

使用软件ClustalX和PHYLIP，对沙冬青CBF同部分目前已获得序列的CBF进行比对并做出进化树，从而获得沙冬青CBF在进化上的分类地位。

(11)亚细胞定位和蛋白质功能预测

使用http://www.psort.org/网站的在线工具进行亚细胞定位预测，使用http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/网站的ProtFun 2.2在线工具进行蛋白质功能预测。

1.2.7植物表达载体的构建

根据得到的沙冬青CBF全长序列ORF设计合成引物，为方便载体构建，在5’引物和3’引物分别引入酶切位点XbaI和BamHI：

5’TGCTCTAGAATGTTTTCCTTCAATCATTT 3’

5’CGCGGATCCTCAAATTGAATAACTCCACA 3’

PCR扩增沙冬青CBF全长cDNA的编码区序列，反应程序为：94℃5min；94℃30sec，62℃1min，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min。电泳检测，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA，并与pMD18-T克隆载体连接，热击法转化DH5α，筛选鉴定阳性克隆并测序。构建植物表达载体pBI121-AmCBF：

(1)分别用XbaI和BamHI双酶切pMD-AmCBF和pBI121载体，酶切体系为：

10×K buffer	2μl
		RNaseA(1mg/ml)	4μl
pMD-AmCBF	16μl
		XbaI(5U/μl	1μl
BamHI(5U/μl)	1μl
		H₂O	16μl
总体积	40μl

混匀后短暂离心，37℃酶切反应6h。

(2)电泳检测，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切pBI121的约11kb片段和pMD-AmCBF的约600bp片段连接体系为：

10×ligase buffer	1μl
		11kb片段	1μl
600bp片段	7μl
		T4 ligase(35U/μl)	1μl
H₂O	0μl
		总体积	10μl

混匀后短暂离心，16℃水浴连接反应过夜。热击法转化DH5α，筛选鉴定阳性克隆，保存菌株。

(3)重组质粒DNA冻融法转入农杆菌LBA4404，鉴定正确，保存菌株。

2实验结果

2.1沙冬青CBF基因全长的克隆

经过NCBI上的搜索，根据已知几种植物的CBF保守区序列，设计简并引物，目前已知的大部分CBF基因都没有内含子，因此以沙冬青基因组DNA为模板PCR扩增，得到两段均为204bp的沙冬青CBF核心区片段。根据这两段核心区序列分别设计巢式引物，应用RACE技术获取全长基因。

2.1.1 3’末端序列的获得

如图1，以反转录得到的cDNA液为模板，3’巢式PCR两轮扩增后得到一条约500bp的片段，回收该片段连接T载体，转化DH5α后测序，该序列(550bp)与已知的核心区片段重叠部分的相似性达到92％，并且其3’末端存在PolyA尾巴，证明得到沙冬青CBF基因的3’末端。

2.1.2 5’末端序列的获得

如图2，以反转录得到的cDNA液为模板，5’巢式PCR两轮扩增后发现有一条约500bp的小片段和一条约600bp的大片段，分别回收两条片段连接T载体，转化DH5α后测序。结果表明，大片段(625bp)与已知核心区片段相似性很低仅22.02％，因此不是目的片段；而小片段(506bp)与已知的核心区片段重叠部分的相似性达到90.5％，证明是沙冬青CBF基因的5’末端序列。

2.1.3沙冬青CBF全长基因序列的获得

将获得的3’末端序列和5’末端序列与核心区序列比对，拼接得到一段5’含有ATG起始密码子、3’含有TGA中止密码子的序列(沙冬青CBF全长基因的序列为SEQ ID No.3所示)。经DNAMAN软件初步分析，该序列具有完整的开放阅读框架(其开放阅读框的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示)，可以翻译成含有221个氨基酸残基的蛋白(其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示)(图3)，分子量大约为25KD，而且经初步的蛋白序列比对与拟南芥CBF(DREB1)家族有较高的相似性。同时我们在蛋白质的序列比对结果中发现了CBF蛋白特征序列，即PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段保守短多肽序列，如图4黑点所示。

2.2沙冬青CBF全长基因的序列分析与功能预测

2.2.1相似性搜索结果

NCBI网站Blastx分析所得结果表明，本发明扩增所得的cDNA序列编码蛋白与AP2/EREBP类蛋白有一定同源性，说明该cDNA序列编码蛋白可能是CBF家族成员。

使用NCBI网站上blastp工具对最长读框蛋白进行进一步相似性搜索分析，显示目的蛋白有个潜在的保守区域AP2结合域。

2.2.2BLOCKS分析和功能结构域分析

根据BLOCKS的分析结果，可以知道沙冬青CBF最长读框蛋白序列与IPB001471 Ethylene responsive element binding家族中的3个模板都匹配上了。Pfam数据库基于隐马尔可夫模型，通过Pfam数据库对最长读框蛋白进行蛋白质搜索，结果证实其中包括AP2结构功能域，该功能域为植物所特有，都含有GCC box结构，存在于拟南芥蛋白APETALA2(AP2)、乙烯应答元件结合蛋白(ethylene-responsive element binding protein，EREBP)以及许多其它功能未知的植物蛋白中。它由大约60个氨基酸残基组成，在不同植物中非常保守。BLOCKS分析的文字结果：

2.2.3疏水性分析

疏水性分析一方面为三级结构预测结果提供参考，另一方面为结构域以及功能域的划分提供依据。通过ProtScal对最大读框蛋白质序列进行分析。可以看出整个蛋白质中疏水性最大值是1.444，最小值为-3.456，其中在N端30-40区域和80-140左右的氨基酸都表现出较为强烈的疏水性，这和已知物种CBF基因推测的α螺旋所在区域相近。此外，该蛋白在160-170狭窄区域内也表现出了很强的疏水性，此区域位于蛋白的酸性氨基酸区域内，可能与该蛋白的催化活性相关。

2.2.4核定位信号分析

虽然对最长ORF读框蛋白用PredictNl.S预测结果显示没有核定位信号区域，但已知CBF蛋白N端的保守序列PKK/RPAGRxKFxETRHP富含碱性氨基酸，与蛋白的核定位相关，起着核定位信号的作用。沙冬青CBF的N端序列也具有这一保守序列，认为也可以看作是起着核定位信号作用的序列，这需要以后通过细胞生物学实验加以证明。

2.2.5信号肽预测

利用SignalP进行信号肽预测，分析结果科见：只有当C，Y，S值的计算结果均为“YES”，平均值在0.5以上时，才可能存在信号肽。但是从文字分析结果中可以看出，结果均为“NO”且所有值都普遍远低于0.5。而且蛋白质氨基端的氨基酸区域的平均值非常低且没有显著的可能性，因此可以认为这个蛋白很有可能不具备信号肽，当然这个结论需要进一步的试验加以证实。

2.2.6卷曲螺旋预测

通过window＝14，21，28的搜索，将最长读框蛋白氨基酸序列与数据库中已知的平行双链卷曲螺旋比较，各部分发生卷曲螺旋的可能性如趋势线所示，在150-180位氨基酸区域存在卷曲螺旋的可能，计算的可能性平均值小于50％，说明有有存在卷曲螺旋的可能性不大。

2.2.7跨膜螺旋结构预测

通过将目的蛋白与跨膜蛋白质数据库Tmbase中的模板进行比较，可以发现没有从内向外或者从外向内的跨膜螺旋出现，与已知的CBF均为非膜蛋白相符。

2.2.8三级结构预测

通过对蛋白质结构数据库PDB的搜索，本发明克隆的沙冬青CBF、海岛棉CBF都与GCC盒结合蛋白(PDB ID为3gcc)有着结构上的相似性。以此结构为模板预测出最长读框蛋白沙冬青CBF的三级结构。预测的蛋白三级结构同前面疏水性分析，卷曲螺旋预测，二级结构预测的结果相符合。

2.2.9系统发育分析

目前在许多植物中发现了CBF转录因子的存在，本发明选取了拟南芥，番茄，大豆，马铃薯，辣椒，陆地棉，蒺藜苜蓿，葡萄，黑杨，橡胶树，紫茎泽兰，樱桃十二种植物的十四条蛋白序列(AAC49662，AAC99371，BAA33434，AAS77821，AAQ02703，ABI74671，AAQ88400，ABD65473，ABB72792，ABE96792，ABO48363，AAY43213，ABN58746，BAC20183)，在ClustalX软件中与沙冬青和海岛棉CBF进行蛋白比对，然后使用PHYLIP软件以邻位相连法建立系统发育树。如图5，可以看出沙冬青CBF(AmCBF)与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula，ABB72792)和大豆(Glycine max，AAQ02703)CBF有相近的起源，海岛棉CBF(GbCBF)与陆地棉(Gossypium hirsutum，ABD65473)CBF有很近的起源。而这样的结果也符合分类学上沙冬青、蒺藜苜蓿和大豆同属于豆科，海岛棉和陆地棉同属于棉属这一事实。

2.2.10沙冬青CBF编码蛋白的亚细胞定位和蛋白质功能

分类用Psort分析沙冬青CBF编码蛋白的亚细胞定位。通过实验结果可知，该蛋白最终定位于细胞核的可能性为94％，定位于叶绿体基质的可能性均为47.9％，定位于微体(过氧化酶体)的可能性为36.5％，定位于叶绿体的类囊体膜的可能性为13.1％。从而推断该蛋白可能定位于细胞核内。

2.3低温下沙冬青CBF基因表达情况

考虑到可能存在的CBF基因家族其他成员也有可能响应低温诱导，而且已知CBF基因家族成员在3’末端序列差异较大，本发明选择在已获得的沙冬青CBF 3’末端附近区域设计特异引物，以保证扩增的特异性。进行RT-PCR扩增，内参基因为沙冬青β-actin。如图6，低温处理0-30min检测不到沙冬青CBF的表达，从1h开始沙冬青CBF才有可检测到的表达，2h达到最高，4h开始表达量开始下降，8h-24h表达量持续下降到比较低的水平。

2.4植物表达载体构建

PCR扩增得到沙冬青CBF全长基因片段，连接pMD18-T载体测序正确后，用以构建植物表达载体，构建过程如图7所示。

2.5烟草遗传转化

将构建好的植物表达载体转入根癌农杆菌LBA4404，鉴定正确后以转化烟草。

2.6转AmCBF基因烟草的检测

2.6.1转基因烟草的GUS活性检测

构建的植物表达载体带有GUS报告基因，使用GUS组织化学染色法鉴定转基因植株。如图8，转基因烟草叶块经GUS染色后表面显现出明显的蓝色，结果都为阳性，而野生型对照GUS染色结果为阴性。表明外源基因在转基因植株叶片中可以表达。

2.6.2转基因烟草的PCR及RT-PCR鉴定

随机选取8株T₀代抗性植株进行PCR检测表明，在阳性质粒及转基因植株中均扩增出666bp的特异性条带(图9)，而野生型烟草和水对照中均未扩增出相应的片段，说明AmCBF已经导入到这些T₀代烟草中。继而对随机选取的5株PCR检测阳性植株进行RT-PCR检测，β-actin作为内参照基因，结果表明：外源的AmCBF基因能够在烟草中能够正常的转录并表达(图10)。

2.6.3相对电导率法测定转基因烟草的耐冷性

低温胁迫会促进植物细胞中活性氧的产生。活性氧会导致膜脂过氧化作用，该作用的加剧引起质膜透性增大，电解质和某些小分子有机物大量渗漏，电导率就会增大。

转基因烟草和野生型烟草植株在0，-2，-4，-6，-8，-10℃处理2h，比较它们在耐冷性上的差异。如图11所示，转基因烟草35S:AmCBF的相对电导率均低于野生型烟草。说明转基因烟草在低温下电解质渗漏率低，比野生型烟草有更好的耐冷性。从0～-6℃，转基因烟草和野生型烟草植株的相对电导率持续上升；从-8～-10℃，相对电导率达到最高值且相对稳定。

2.6.4低温条件下转基因烟草游离脯氨酸的含量测定

游离脯氨酸能促进蛋白质水合作用，可维持细胞结构、细胞运输和调节渗透压，在低温胁迫时它对植物有一定的保护作用。图12显示的是冷处理前和0℃冷处理2.5h后，转基因和野生型烟草的游离脯氨酸含量的差异。冷处理前，转基因烟草35S:AmCBF的脯氨酸含量大约是野生型的20倍；而冷处理后，野生型烟草的脯氨酸含量上升到处理前的12.29倍，转基因烟草35S:AmCBF的脯氨酸含量也有所上升，是野生型的3.54倍。可以看出，同野生型烟草相比，冷处理前后转基因烟草始终保持着较高水平的脯氨酸含量。

2.6.5低温条件下转基因烟草可溶性糖的含量测定

低温胁迫时，植物中单糖、二糖等可溶性糖含量增多。可溶性糖能增加细胞的渗透压，在抵抗环境胁迫上具有一定的保护作用。研究证实，可溶性糖类的含量与植物抗寒性之间呈正相关。如图13所示，冷处理前和冷处理2.5h后，转基因烟草35S:AmCBF的可溶性糖含量在冷处理前与野生型烟草差别不大，在冷处理2.5h后是野生型烟草的1.7倍。

2.6.6转基因烟草的耐旱性

以烟草叶片焉萎确定的存活率为耐干旱指标，实验结果如图14所示。10％PE6000G处理24h后，野生型烟草苗就有大量的叶片焉萎现象，统计存活率为60％；而转基因烟草35S:AmCBF和存活率达到90％。在10％PEG处理36h和48h，转基因烟草存活率仍远高于野生型烟草。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 调节植物胁迫抗性的CBF转录因子及其编码基因和应用

<130> dqzl0010

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 666

<212> DNA

<213> Ammopiptanthus mongolicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(666)

<400> 1

atg ttt tcc ttc aat cat ttt tcc gat cca cat acc ggc aac tcc gat 48

Met Phe Ser Phe Asn His Phe Ser Asp Pro His Thr Gly Asn Ser Asp

1 5 10 15

att tac tca tcg tgg ccg gtg tca gac ggc agc agc ggt tct cgc cca 96

Ile Tyr Ser Ser Trp Pro Val Ser Asp Gly Ser Ser Gly Ser Arg Pro

20 25 30

gcg gcg gtc tcg gac gag gtg ctg ctg gcg gcg agc cac ccg aag aag 144

Ala Ala Val Ser Asp Glu Val Leu Leu Ala Ala Ser His Pro Lys Lys

35 40 45

cgt gcc ggg agg aag aag ttc agg gag acg cgc cac ccg gtg tac cgc 192

Arg Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr Arg

50 55 60

ggc gtg agg cgg agg aac tcc ggc aag tgg gtt tgt gag gtg cgt gag 240

Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys Glu Val Arg Glu

65 70 75 80

ccc aac aag aag acc agg att tgg ctc ggg acc ttc ccc acg gcg gat 288

Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Asp

85 90 95

atg gcg gcg cgt gcg cac gac gtg gcg gcg att gct ctt agg ggt agg 336

Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg

100 105 110

tcc gcc tgc ctt aac ttt gcg gat tca ggt tgg cgg ctt ccg gtg ccg 384

Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Gly Trp Arg Leu Pro Val Pro

115 120 125

gcg acg tcg gag gca agg gac ata cag aag gcg gcg gcg gag gcg gcg 432

Ala Thr Ser Glu Ala Arg Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala

130 135 140

gag gcg ttt cgc ccg gga aag gag tcg gag acg gat gaa agg aag agg 480

Glu Ala Phe Arg Pro Gly Lys Glu Ser Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg

145 150 155 160

gaa aat gag atg gcg tta gca gcg gcg gca acg acg acg gag gag caa 528

Glu Asn Glu Met Ala Leu Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Glu Glu Gln

165 170 175

gaa gaa gaa gag tcg gtg ccg gag tgg ctg agg aac atg gag ttg atg 576

Glu Glu Glu Glu Ser Val Pro Glu Trp Leu Arg Asn Met Glu Leu Met

180 185 190

tcg cca aca cat tac ttt ggt act gac tat ggt ggt gct gac gtg gaa 624

Ser Pro Thr His Tyr Phe Gly Thr Asp Tyr Gly Gly Ala Asp Val Glu

195 200 205

ttt gat gat gct gaa gtt tca ttg tgg agt tat tca att taa 666

Phe Asp Asp Ala Glu Val Ser Leu Trp Ser Tyr Ser Ile

210 215 220

<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<213> Ammopiptanthus mongolicus

<400> 2

Met Phe Ser Phe Asn His Phe Ser Asp Pro His Thr Gly Asn Ser Asp

1 5 10 15

Ile Tyr Ser Ser Trp Pro Val Ser Asp Gly Ser Ser Gly Ser Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Val Ser Asp Glu Val Leu Leu Ala Ala Ser His Pro Lys Lys

35 40 45

Arg Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr Arg

50 55 60

Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys Glu Val Arg Glu

65 70 75 80

Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Asp

85 90 95

Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg

100 105 110

Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Gly Trp Arg Leu Pro Val Pro

115 120 125

Ala Thr Ser Glu Ala Arg Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala

130 135 140

Glu Ala Phe Arg Pro Gly Lys Glu Ser Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg

145 150 155 160

Glu Asn Glu Met Ala Leu Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Glu Glu Gln

165 170 175

Glu Glu Glu Glu Ser Val Pro Glu Trp Leu Arg Asn Met Glu Leu Met

180 185 190

Ser Pro Thr His Tyr Phe Gly Thr Asp Tyr Gly Gly Ala Asp Val Glu

195 200 205

Phe Asp Asp Ala Glu Val Ser Leu Trp Ser Tyr Ser Ile

210 215 220

<210> 3

<211> 900

<212> DNA

<213> Ammopiptanthus mongolicus

<400> 3

gaaaaattac cattttccct cccaaaacca gaaaagcaca acactccaac tatcataaca 60

acagacacta actaaccctt ttccacacac tgttccattc actaccccaa cttcaaagaa 120

ccaaactttt catccattaa catgttttcc ttcaatcatt tttccgatcc acataccggc 180

aactccgata tttactcatc gtggccggtg tcagacggca gcagcggttc tcgcccagcg 240

gcggtctcgg acgaggtgct gctggcggcg agccacccga agaagcgtgc cgggaggaag 300

aagttcaggg agacgcgcca cccggtgtac cgcggcgtga ggcggaggaa ctccggcaag 360

tgggtttgtg aggtgcgtga gcccaacaag aagaccagga tttggctcgg gaccttcccc 420

acggcggata tggcggcgcg tgcgcacgac gtggcggcga ttgctcttag gggtaggtcc 480

gcctgcctta actttgcgga ttcaggttgg cggcttccgg tgccggcgac gtcggaggca 540

agggacatac agaaggcggc ggcggaggcg gcggaggcgt ttcgcccggg aaaggagtcg 600

gagacggatg aaaggaagag ggaaaatgag atggcgttag cagcggcggc aacgacgacg 660

gaggagcaag aagaagaaga gtcggtgccg gagtggctga ggaacatgga gttgatgtcg 720

ccaacacatt actttggtac tgactatggt ggtgctgacg tggaatttga tgatgctgaa 780

gtttcattgt ggagttattc aatttaattc aaggttatcg gtatagtgtg ttaaaaagta 840

gagggtttgg atatcctaaa ttcaatcaga atgtgacatc tcaattaatt ggatcatgtg 900

Claims

1.分离的CBF转录因子基因，其特征在于，其核苷酸为（a）、（b）或（c）所示:

（a）、SEQ ID No.1所示的核苷酸；

（b）、编码SEQ ID No.2所示氨基酸的核苷酸；

（c）、与SEQ ID NO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸，该核苷酸所编码蛋白具有CBF转录因子功能或活性。

2.分离的CBF转录因子全基因，其特征在于：其为SEQ ID No.3所示的核苷酸。

3.权利要求1所述CBF转录因子基因所编码蛋白，其特征在于，其氨基酸为（a）或（b）所示:

（a）、SEQ ID No.2所示的氨基酸；

（b）、将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No.2所示CBF转录因子功能或活性的蛋白变体。

4.含有权利要求1或2所述基因或全基因的表达载体。

5.按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是植物表达载体。

6.含有权利要求4或5所述表达载体的宿主细胞。

7.权利要求1所述的基因或权利要求2所述全基因在提高植物对环境胁迫抗性中的应用。

8.按照权利要求7所述的应用，包括：构建含有权利要求1所述基因或权利要求2所述全基因的植物表达载体；将所构建的植物表达载体引入到植物或植物细胞中，培育筛选得到对环境胁迫抗性提高的转基因植物。

9.权利要求3所述的蛋白在提高植物对环境胁迫抗性中的应用。

10.按照权利要求7、8或9所述的应用，其特征在于：所述的环境胁迫包括干旱或低温。