CN104130320A - 香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用 - Google Patents

香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104130320A
CN104130320A CN201410346982.XA CN201410346982A CN104130320A CN 104130320 A CN104130320 A CN 104130320A CN 201410346982 A CN201410346982 A CN 201410346982A CN 104130320 A CN104130320 A CN 104130320A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cbf
camphor tree
fragrant camphor
low temperature
transcription factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410346982.XA
Other languages
English (en)
Inventor
杜丽
李勇鹏
姚瑶
张力维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanyang Normal University
Original Assignee
Nanyang Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanyang Normal University filed Critical Nanyang Normal University
Priority to CN201410346982.XA priority Critical patent/CN104130320A/zh
Publication of CN104130320A publication Critical patent/CN104130320A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Abstract

本发明公开一种香樟低温诱导CBF-like转录因子(包括CcCBFa基因和CcCBFb基因)及其编码的氨基酸序列，CcCBFa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；CcCBFb基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用香樟CcCBFa和CcCBFb基因构建植物表达载体，通过遗传转化可获得抗逆性改良，特别是抗寒性改良的转基因新种质。本发明的内容对了解CBF基因在植物抗冷和其他逆境因子中的作用，对园林树木抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。

Description

香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学及园林植物育种技术领域，具体涉及一种香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用。
背景技术
樟树又名香樟、乌樟，樟科樟属Cinnamomum camphora L.；其树冠广展，浓荫遍地，气势雄伟，是优良的行道树及庭荫树；香樟在我国的分布大体以长江以北为界，南至两广及西南，以江西，浙江、福建等东南沿海省份为多，因而在栽培范围上受到低温的限制。近年来，为丰富北方园林的树种组合，改善冬季园林植物景观，香樟被引种栽植到黄河流域的一些省分。然而北方漫长而寒冷冬季往往导致香樟生长受损，严重时甚至树体死亡，造成巨大的经济损失。因此，防治冻害就成为这一优良树种在北方城市顺利推广及应用的一个亟待解决的问题，解决这一问题的主要方法可采取加强栽培管理和选育抗寒新品种，而后者是根本途径，但目前没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供香樟低温诱导CBF-like转录因子，具体涉及2个香樟抗逆相关的低温诱导CBF-like转录因子a(GenBank登录号为KJ958932)和b(GenBank登录号为KJ958933)(Cinnnamomumcamphora CBF-like transcription factor,CcCBFa and CcCBFb)基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。为进一步研究香樟CBF-like基因的功能，以及CBF基因改良作物抗逆性，特别是改良抗寒性的应用奠定良好的基础。
本发明的另一目的是提供一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的编码蛋白。
本发明的另一目的是提供一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的克隆方法。
本发明的另一目的是提供一种上述的香樟低温诱导CBF-like转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。
本发明所采用的第一技术方案是，一种香樟低温诱导CBF-like转录因子，包括香樟低温诱导CBF-like转录因子a(CcCBFa基因)和香樟低温诱导CBF-like转录因子b(CcCBFb基因)，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述香樟低温诱导CBF-like转录因子b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所采用的第二技术方案是，一种香樟低温诱导CBF-like转录因子编码蛋白，包括香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白和香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明所采用的第三技术方案是，一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的克隆方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、香樟总RNA的提取；采用EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取香樟总RNA，所提RNA加入30-50ul DEPC处理水，充分溶解后于-80℃保存；
步骤2、反转录PCR；
步骤3、香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；
其中，香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆的反应条件为：
UPM＝UPL(10uM)2ul+UPS(10uM)10ul+ddH2O38ul
a).反应体系为50ul：
b).反应条件：
94℃预变性4min； 5个循环；30个循环；72℃总延伸10min。
分别取上述PCR产物1ul溶于49ul ddH2O中，充分溶解混匀，做巢式PCR的模板(Template)。
c).3’/5’RACE的巢式PCR扩增，反应体系为50ul：
d).巢式PCR反应条件：
94℃预变性4min；35个循环；72℃总延伸10min；
步骤4、PCR产物的胶回收，具体为：琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收；
步骤5、PCR产物的克隆，A-T克隆；
步骤5.1、回收的目的产物与TaKaRa公司生产的pMD19-TVector16℃连接过夜，反应体系如下：
步骤5.2、大肠杆菌感受态细胞的转化
将上述连接产物加于50ulTrans5α大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，缓慢加入400ul新鲜液体LB，37℃，180rpm50min，吸取100ul菌液涂于添加有Amp100mg/L的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中，倒置过夜培养12-16h；
步骤6、阳性重组子的筛选及鉴定；随机挑取上述转化平板中的阳性菌以pMD19-T载体通用引物M13上、下游引物进行菌落PCR，将PCR扩增产物置于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，将检测正确的阳性菌接种于1ml添加有Amp100mg/L的液体LB中摇菌培养，送往上海生工生物工程有限公司测序，从而获得2个香樟CBF-like基因的全长cDNA(CcCBFa和CcCBFb)序列，其核苷酸序列分别为：SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2；
步骤7、对步骤6中的香樟低温诱导CBF-like转录因子a和香樟低温诱导CBF-like转录因子b使用DNAman分子软件分析，得香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白序列和香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白序列，其氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
本发明的特点还在于，
用于扩增香樟CBF-like基因全长cDNA序列所用的引物：
CcCBF3’GSP1：TCGGCGTGGCTCTTGCCAAT，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.5所示；
CcCBF3’GSP2：TCTGCTAGCGCCAAGGACAT，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.6所示；
CcCBF5’GSP1：ATGTCCTTGGCGCTAGCAGA，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.7所示；
CcCBF5’GSP2：ATTGGCAAGAGCCACGCCGA，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.8所示。
本发明所采用的第四技术方案是，如上述的香樟低温诱导CBF-like转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。
本发明的有益效果是：本发明所获得的2个香樟CBF-like基因是利用同源克隆的方法获得香樟CBF基因的一段核心片段序列，结合RACE技术获得该基因的3’及5’核苷酸序列，进行拼接从而获得2个香樟CBF-like基因的全长cDNA(CcCBFa和CcCBFb)序列，本发明的内容对了解CBF基因在植物抗冷和其他逆境因子中的作用，对园林树木抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。本发明的重要应用前景在于：利用香樟CcCBFa和CcCBFb基因构建植物表达载体，通过遗传转化可获得抗逆性改良，特别是抗寒性改良的转基因新种质。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，如无特别说明为常规方法。
本发明的思想是：很多植物在经历一段时间的非冰冻低温胁迫后，其对低温的耐性会得到提高，这一现象称为冷驯化(Coldacclimation，CA)。冷驯化是植物长期进化的结果，当外界温度下降时，植物感受低温信号，引起许多基因表达的变化。在植物冷驯化过程中，CBF/DREB1(CRT/DRE binding factor)是一种调控植物冷驯化相关基因表达的转录因子，它能感受上游传递的低温信号，在低温诱导下迅速合成，并与位于抗寒相关基因启动子上游的相应的顺式作用元件CRT/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)结合，促进下游抗逆基因的转录，进而合成糖类、脯氨酸和膜稳定蛋白等物质，提高植物的耐寒性。CBF/DREB1转录因子能够在转录水平上能够调控多个抗逆基因，这一发现为用基因工程手段提高植物耐寒性提供了一条新途径。
CBF途径在植物抵抗低温等逆境胁迫中具有非常重要的作用，对于香樟这种冷敏感植物，了解CBF基因在其抗冷和其他逆境因子中的作用，对香樟抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。因此，对香樟CBF基因的克隆，以及它们对低温等逆境因子的响应研究，是深入研究这些基因功能并在分子育种工作中加以利用的基础。本发明香樟低温诱导CBF-like转录因子(Cinnnamomum camphora CBF-liketranscription factor,CcCBF)属于DREB1/CBF家族，所编码的蛋白属于一种和低温诱导相关的CBF转录因子。到目前为止，还未见从香樟中克隆到CBF基因的相关报道，对该基因的功能还不清楚。本研究首次获得了2个香樟CBF-like基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。在本发明的基础上，构建香樟CBF-like基因的植物表达载体，将其转入烟草和香樟中，可以对香樟CBF-like基因的功能进行分析，有助于进一步揭示该基因在植物抗寒过程中的功能，从而进行作物品种改良。
实施例1
1.植物CBF基因进化分析：
所得香樟CcCBFa基因cDNA序列总长909bp，经DNAman分子软件分析，该序列含有完整开放阅读框，ORF为714bp，起始密码子(ATG)位于转录起始位点后72bp，终止密码子(TAG)后还有一段124bp的非编码序列，并带有真核生物典型的polyA尾巴；该基因编码237个氨基酸，分子量为26.2kD，等电点PI为5.01(ht tp://web.expasy.org/compute_pi/)。香樟CcCBFb基因cDNA序列总长941bp，经DNAman分子软件分析，该序列含有完整开放阅读框，ORF为729bp，起始密码子(ATG)位于转录起始位点后67bp，终止密码子(TAG)后还有一段146bp的非编码序列，同样带有真核生物典型的polyA尾巴，该基因编码242个氨基酸，分子量为26.5kD，等电点PI为5.11(http://web.expasy.org/compute_pi/)。将所得香樟CcCBFa和CcCBFb所编码的核苷酸序列氨基酸序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行“protein blast”分析，结果表明所得香樟CBF-like基因与杨树CBF序列最为相似，蛋白质结构中含有AP2结构域，属于AP2超家族中的DREB1/CBF家族。
经NCBI网站对香樟2个基因进行序列比对分析，香樟CcCBFa和CcCBFb基因具有很高的核苷酸序列同源性，其同源性为83％(nucleotide blast)；2个基因的氨基酸序列同样具有较高的同源性，CcCBFa基因编码237个氨基酸，香樟CcCBFb基因编码242个氨基酸，2种蛋白有有88％的氨基酸相同，相似性达91％(protein blast)。
2.香樟总RNA的提取：
香樟总RNA的提取采用EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱公司)说明书进行操作，涉及RNA的实验用枪头和离心管均为RNase Free(Axygen公司)。
所提RNA加入30-50ul DEPC处理水，充分溶解后于-80℃保存。
3.RT-PCR(反转录PCR)：
参照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)使用说明书，进行反转录，分别合成5’-RACE-Ready cDNA和3’-RACE-Ready cDNA；实验所用反转录酶为SMART ScribeTM ReverseTranscriptase(Clontech公司)，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
RACE通用引物：UPL、UPS、NUP由SMARTer RACE cDNAAmplification Kit提供(Clontech公司)。
香樟CBF-like基因的全长cDNA序列，是用简并引物首先获得香樟CBF-like基因核心片段，根据核心片段设计了下列基因特异引物Cc3’GSP1、Cc3’GSP2、Cc5’GSP1、Cc5’GSP2，利用3’/5’RACE(Rapid Amplification of CDNA Ends)技术获得：
用于扩增香樟CBF-like基因全长cDNA序列所用的引物：
CcCBF3’GSP1：TCGGCGTGGCTCTTGCCAAT，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.5所示；
CcCBF3’GSP2：TCTGCTAGCGCCAAGGACAT，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.6所示；
CcCBF5’GSP1：ATGTCCTTGGCGCTAGCAGA，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.7所示；
CcCBF5’GSP2：ATTGGCAAGAGCCACGCCGA，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.8所示。
4.香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆
UPM＝UPL(10uM)2ul+UPS(10uM)10ul+ddH2O38ul
a).反应体系为50ul：
b).反应条件：
94℃预变性4min； 5个循环；30个循环；72℃总延伸10min。
分别取上述PCR产物1ul溶于49ul ddH2O中，充分溶解混匀，做巢式PCR的模板(Template)。
c).3’/5’RACE的巢式PCR扩增，反应体系为50ul：
d).巢式PCR反应条件：
94℃预变性4min；35个循环；72℃总延伸10min。
5.用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DL2000为TaKaRa公司生产。
6.PCR产物的胶回收
琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，所用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒为北京艾德莱公司生产。
7.PCR产物的克隆，A-T克隆
(1)连接反应
回收的目的产物与TaKaRa公司生产的pMD19-T Vector16℃连接过夜，反应体系如下：
(2)大肠杆菌感受态细胞的转化
将上述连接产物加于50ul Trans5α大肠杆菌感受态细胞(北京全式金公司)中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，缓慢加入400ul新鲜液体LB，37℃，180rpm50min，吸取100ul菌液涂于添加有Amp100mg/L的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中，倒置过夜培养12-16h。
(3)阳性重组子的筛选及鉴定
随机挑取上述转化平板中的阳性菌以pMD19-T载体通用引物M13上、下游引物进行菌落PCR，将PCR扩增产物置于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，将检测正确的阳性菌接种于1ml添加有Amp100mg/L的液体LB中摇菌培养，送往上海生工生物工程有限公司测序。生工生物工程(上海)股份有限公司
8.测序结果经拼接获得香樟CBF基因的全长cDNA序列分析：
将测序结果进行拼接，从而获得2个香樟CBF-like基因的全长cDNA(CcCBFa和CcCBFb)序列，所得香樟CcCBFa基因cDNA序列总长909bp，经DNAman分子软件分析，该序列含有完整开放阅读框，ORF为714bp，起始密码子(ATG)位于转录起始位点后72bp，终止密码子(TAG)后还有一段124bp的非编码序列，并带有真核生物典型的polyA尾巴；该基因编码237个氨基酸，分子量为26.2kD，等电点PI为5.01(http://web.expasy.org/compute_pi/)。香樟CcCBFb基因cDNA序列总长941bp，经DNAman分子软件分析，该序列含有完整开放阅读框，ORF为729bp，起始密码子(ATG)位于转录起始位点后67bp，终止密码子(TAG)后还有一段146bp的非编码序列，同样带有真核生物典型的polyA尾巴，该基因编码242个氨基酸，分子量为26.5kD，等电点PI为5.11(http://web.expasy.org/compute_pi/)。将所得香樟CcCBFa和CcCBFb所编码的核苷酸序列氨基酸序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行“protein blast”分析，结果表明所得香樟CBF-like基因与杨树CBF序列最为相似，蛋白质结构中含有AP2结构域，属于AP2超家族中的DREB1/CBF家族。

Claims (5)

1.一种香樟低温诱导CBF-like转录因子，其特征在于，包括香樟低温诱导CBF-like转录因子a(CcCBFa基因)和香樟低温诱导CBF-like转录因子b(CcCBFb基因)，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述香樟低温诱导CBF-like转录因子b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的编码蛋白，其特征在于，包括香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白和香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的克隆方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、香樟总RNA的提取；采用EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取香樟总RNA，所提RNA加入30-50ul DEPC处理水，充分溶解后于-80℃保存；
步骤2、反转录PCR；
步骤3、香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；
其中，香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆的反应条件为：
UPM＝UPL(10uM)2ul+UPS(10uM)10ul+ddH2O38ul
a).反应体系为50ul：
b).反应条件：
94℃预变性4min； 5个循环；30个循环；72℃总延伸10min；
分别取上述PCR产物1ul溶于49ulddH2O中，充分溶解混匀，做巢式PCR的模板(Template)；
c).3’/5’RACE的巢式PCR扩增，反应体系为50ul：
d).巢式PCR反应条件：
94℃预变性4min；35个循环；72℃总延伸10min；
步骤4、PCR产物的胶回收，具体为：琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收；
步骤5、PCR产物的克隆，A-T克隆；
步骤5.1、回收的目的产物与TaKaRa公司生产的pMD19-TVector16℃连接过夜，反应体系如下：
步骤5.2、大肠杆菌感受态细胞的转化
将上述连接产物加于50ul Trans5α大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，缓慢加入400ul新鲜液体LB，37℃，180rpm50min，吸取100ul菌液涂于添加有Amp100mg/L的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中，倒置过夜培养12-16h；
步骤6、阳性重组子的筛选及鉴定；随机挑取上述转化平板中的阳性菌以pMD19-T载体通用引物M13上、下游引物进行菌落PCR，将PCR扩增产物置于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，将检测正确的阳性菌接种于1ml添加有Amp100mg/L的液体LB中摇菌培养，送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果进行拼接，从而获得2个香樟CBF-like基因的全长cDNA(CcCBFa和CcCBFb)序列，其核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
步骤7、对步骤6中的香樟低温诱导CBF-like转录因子a和香樟低温诱导CBF-like转录因子b使用DNAman分子软件分析，得香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白序列和香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白序列，其氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。
4.根据权利要求2所述的香樟低温诱导CBF-like转录因子的克隆方法，其特征在于，通过RACE技术采用于下述的引物，获得所述基因的3’及5’核苷酸序列，拼接后获得2个香樟CBF-like基因的全长cDNA序列：
CcCBF3’GSP1：TCGGCGTGGCTCTTGCCAAT，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.5所示；
CcCBF3’GSP2：TCTGCTAGCGCCAAGGACAT，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.6所示；
CcCBF5’GSP1：ATGTCCTTGGCGCTAGCAGA，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.7所示；
CcCBF5’GSP2：ATTGGCAAGAGCCACGCCGA，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.8所示；。
5.一种如权利要求1所述的香樟低温诱导CBF-like转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。
CN201410346982.XA 2014-07-21 2014-07-21 香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用 Pending CN104130320A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410346982.XA CN104130320A (zh) 2014-07-21 2014-07-21 香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410346982.XA CN104130320A (zh) 2014-07-21 2014-07-21 香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104130320A true CN104130320A (zh) 2014-11-05

Family

ID=51803211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410346982.XA Pending CN104130320A (zh) 2014-07-21 2014-07-21 香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104130320A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191254A (zh) * 2011-04-15 2011-09-21 中国农业科学院生物技术研究所 调节植物胁迫抗性的cbf转录因子及其编码基因和应用
WO2012145269A1 (en) * 2011-04-18 2012-10-26 Mendel Biotechnology, Inc. Yield and stress tolerance in transgenic plants
CN103387609A (zh) * 2012-05-11 2013-11-13 中国科学院上海生命科学研究院 一种提高植物抗逆境能力的基因及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191254A (zh) * 2011-04-15 2011-09-21 中国农业科学院生物技术研究所 调节植物胁迫抗性的cbf转录因子及其编码基因和应用
WO2012145269A1 (en) * 2011-04-18 2012-10-26 Mendel Biotechnology, Inc. Yield and stress tolerance in transgenic plants
CN103387609A (zh) * 2012-05-11 2013-11-13 中国科学院上海生命科学研究院 一种提高植物抗逆境能力的基因及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102659934B (zh) 植物的一个锌指蛋白转录因子及其编码基因与应用
CN101519441B (zh) 一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用
CN101775398A (zh) 菊花NAC蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程应用
CN102604974B (zh) 稻瘟病抗性基因Piym2及其应用
CN102010869B (zh) 一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因及其抗低温应用
CN105838723B (zh) 一种紫花苜蓿抗寒基因MsZFP及其编码蛋白与应用
Han et al. The cold-stress responsive gene DREB1A involved in low-temperature tolerance in Xinjiang wild walnut
CN102181454A (zh) 大豆锌指蛋白基因sctf-1及其应用
CN104130320A (zh) 香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用
CN101712718B (zh) 一种与植物抗旱相关的蛋白及其编码基因与应用
CN102050870A (zh) 胡杨scl7基因的鉴定及其功能研究
CN107142270B (zh) 桑树白粉病相关基因及其应用
CN103570812B (zh) 来源于羊草与耐低温相关的转录因子及其编码基因与应用
CN113046366B (zh) StCAD7基因及其编码蛋白作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的应用
CN107904238A (zh) 厚藤高盐、干旱诱导型启动子IpLEA‑PRO及其应用
CN105505946B (zh) 一种提高水稻穗瘟抗性的基因GF14e、蛋白及其应用
CN103014062A (zh) 一种水稻OsICE1基因双元载体及其应用方法
CN104004773A (zh) 一种小麦wrky转录因子基因及其在改变拟南芥根系发育中的应用
CN103882031A (zh) 柑橘溃疡病感病基因CsLOB
CN1982333A (zh) 胡杨PeCBL1基因及应用
CN103361358A (zh) 一种抗盐胁迫基因CbCRT1、制备方法以及其编码产物的氨基酸序列
CN107384935A (zh) 一种冰缘植物蛋白及其编码序列与应用
CN103626857A (zh) 一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用
CN108611334B (zh) 桑树类糖原合成酶激酶基因及其检测和应用
CN114181946B (zh) 与植物耐低氮胁迫相关的基因、启动子及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20141105