CN102181454A - 大豆锌指蛋白基因sctf-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆锌指蛋白基因SCTF-1，是大豆中新发现的与低温相关的C2H2型锌指蛋白基因。经实验表明，SCTF-1编码的蛋白能够定位到细胞核中，该基因过量表达后能够明显提高转基因植物的抗冷性，具有提高植物综合耐逆性的功能，本发明的基因来源于大豆，具有适合于大豆等双子叶植物的优化密码子，其基因工程受体主要适合于双子叶植物的大豆、烟草、棉花等，此外也适合于水稻、小麦、玉米等单子叶植物。

Description

大豆锌指蛋白基因SCTF-1及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及植物低温胁迫应答的转录因子，确切地说是大豆锌指蛋白基因SCTF-1及其应用。

技术背景

C2H2型锌指蛋白广泛的存在于各种植物中，国内外有关植物C₂H₂型锌指蛋白的研究逐步增多，尤其是对拟南芥(Arabidopsis thaliana)，矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)以及水稻(Oryza sativa)等植物的研究较多。研究发现了多种与植物胁迫耐受相关的植物C₂H₂型锌指蛋白，例如，在拟南芥中发现了一个STZ基因，该基因能够编码一种双锌指结构的C₂H₂型锌指蛋白，转STZ基因的烟草明显提高了对冷及高盐条件的耐受能力(Sakamoto et al.，2000)；在矮牵牛中获得的锌指蛋白基因ZPT2-3，其翻译产物同样也含是具有双锌指结构的C₂H₂型锌指蛋白，转ZPT2-3基因的烟草对干旱的耐受能力也得到明显提高。国内对植物C₂H₂型锌指蛋白研究较多的集中在水稻上，例如RZF71基因，RZF5基因等，这两个基因所编码的锌指蛋白都能够提高植物对渗透胁迫的耐受能力(郭书巧等，2007；郭书巧，2006)。但是国内外对于大豆锌指蛋白的研究还比较少，分析较为明确的只有SCOF-1，其编码的锌指蛋白是典型的双锌指结构的C₂H₂型锌指蛋白，能明显提高转基因拟南芥对低温的耐受能力(Kim et al.，2001)。我们可以依据C₂H₂型锌指蛋白的特性利用基因工程技术定向的提高植物对逆境的耐受能力，为稳定农作物的生长具有重要价值和意义。

大豆是我国重要的油料作物，低温情况下对大豆的出苗率，生长情况，产量都有非常重要的影响。至今从大豆中鉴定出来的C₂H₂型锌指蛋白基因并不多，而研究较为透彻的只有大豆耐冷锌指蛋白基因SCOF-1。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的大豆基因，大豆C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1。

大豆锌指蛋白基因SCTF-1，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1或2所示；

碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示的大豆锌指蛋白基因SCTF-1，它编码的蛋白其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示的大豆锌指蛋白基因SCTF-1，它是采用下述方法获得的：

1)、提取大豆品种“吉农18”总RNA，反转录成cDNA，以其为模板；

2)、用人工合成的引物：

P1：CACAAGCATAAGCACAAGC，

P2：TGGATCTATGGATCAGTATTGAGG；

3)、采用PCR的方法进行cDNA克隆。

碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示的大豆锌指蛋白基因SCTF-1，它是：

1)以碱基序列如序列表SEQ ID NO.1的大豆锌指蛋白基因SCTF-1为模板；

2)用引物：

P1：GGGTCTAGAATGGCTTTGGAAGCTCTTCA，

P2：TTTGAGCTCGTATTGAGGGATTTCAATCTTGGGT；

3)采用PCR方法扩增获得的。

一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了大豆锌指蛋白基因SCTF-1。

本发明的另一个目的是大豆锌指蛋白基因SCTF-1，在培养耐低温转基因植物新品种中的应用。

本发明提供的大豆锌指蛋白基因SCTF-1，是大豆中新发现的与低温相关的C2H2型锌指蛋白基因。经实验表明，SCTF-1编码的蛋白能够定位到细胞核中，该基因过量表达后能够明显提高转基因植物的抗冷性，具有提高植物综合耐逆性的功能，本发明的基因来源于大豆，具有适合于大豆等双子叶植物的优化密码子，其基因工程受体主要适合于双子叶植物的大豆、烟草、棉花等，此外也适合于水稻、小麦、玉米等单子叶植物。

附图说明

图1为倒置荧光显微镜下照片，其中：a是pBI121-GFP在洋葱表皮细胞中的瞬时表达；b是pBI121-GFP-SCTF-1在洋葱表皮细胞中的瞬时表达；

图2为转基因植株耐冷性实验照片，其中：a是4℃处理24h后的对照烟草，b是4℃处理24h后的转基因烟草；

图3为对照烟草和转基因烟草-10℃处理后，经25℃恢复培养12h后的照片。

具体实施方式

实施例1

选用大豆品种“吉农18”，待幼苗生长一周后，4℃培养24h，取叶片，用液氮研磨，加入含有裂解液的1.5ml的EP管中，震荡混匀后，使用试剂盒RNAiso Plus提取总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定RNA质量，然后用分光光度计测量RNA的浓度；按照美国FERMENTAS公司的反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA第一链；以植物C2H2型锌指蛋白的保守序列为探针搜索大豆基因组数据库，经过比对和序列拼接得到一个全长为802bp的大豆C2H2型锌指蛋白序列，根据此序列分别设计两边引物：CACAAGCATAAGCACAAGC，TGGATCTATGGATCAGTATTGAGG，采用RT-PCR的方法进行cDNA克隆，PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，54.5℃复性40s，72℃延伸40s，32个循环，72℃后延伸10min；将PCR产物克隆至PMD-18T载体上，测序后获得具有完整编码区的大豆C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1，其碱基序cDNA如序列表SEQ ID NO.1。

SCTF-1全长802bp，开放阅读框在89-787bp处，DNAMAN软件分析表明SCTF-1共编码233个氨基酸，有两个典型的C2H2型锌指结构，两个锌指结构间由28个氨基酸隔开。锌指结构中有植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH。经DNAMAN软件分析，估算其等电点pI＝8.33，分子量MW＝24.9kDa。利用GENEBANK中BLAST搜索大豆基因组数据库，发现SCTF-1是一个新的大豆C2H2型锌指蛋白基因。

实施例2

根据大豆C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1的cDNA序列，设计扩增充整编码阅读框的引物，在上游添加Xba I酶切位点，下游添加Sac I酶切位点，上游引物：GGG TCTAGAATGGCTTTGGAAGCTCTTCA，下游引物：TTT GAGCTC GTATTGAGGGATTTCAATCTTGGGT，以实施例1中获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将SCTF-1的cDNA克隆到PMD-18T载体上，进一步克降到双元表达载体pBI121上；经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所表达的蛋白其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；将GFP基因链接到上面的载体上，构建成pBI121-SCTF-1-GFP载体，将pBI121-SCTF-1-GFP通过农杆菌侵染的方法转入到洋葱表皮细胞中进行瞬时表达，通过激光共聚焦纤维镜管擦，发现pBI121-SCTF-1-GFP基因嵌合产物定位于细胞核内，表明大豆SCTF-1基因是定位于细胞核内的转录因子，见图1，其中a是pBI121-GFP在洋葱表皮细胞中的瞬时表达，b是pBI121-GFP-SCTF-1在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。a、b是在倒置荧光显微镜下的观察，通过显微镜观察，图a可以看出在转入pBI121-GFP的洋葱表皮细胞中整个细胞都有绿色荧光，而图b转入pBI121-GFP-SCTF-1的洋葱表皮细胞只有细胞核能检测到绿色荧光，说明SCTF-1编码的蛋白能够定位到细胞核中。

实施例3

将表达载体pBI121-SCTF-1-GFP转入农杆菌，利用农杆菌侵染的方法，进一步转入烟草中，对获得的转基因植株进行PCR、RT-PCR、Southern杂交检测后，对转基因植株的T2代和对照植株进行耐逆性分析；耐冷性转基因植株的获得：将转SCTF-1基因的烟草和对照放入4℃培养箱中连续培养30d，之后再恢复25℃常温培养12h。再将转基因烟草和对照放入-10℃环境中低温胁迫30min，再恢复25℃常温培养12h。

将转基因烟草和对照放入4℃培养箱中连续培养30d，观察和记录生长情况，发现在低温胁迫24小时后，转基因烟草生长状况正常，而对照叶片均有不同程度萎缩，打蔫。在低温胁迫2d后，对照部分植株开始出现冻斑，叶子开始枯黄，胁迫7d后，对照植株叶片大量出现冻斑和打卷现象，胁迫30d后，转基因烟草生长基本正常，而对照植株的大面积叶片出现枯黄，打蔫，打卷现象，而转基因植株基本正常。在恢复25℃常温培养12h后，转基因植株恢复情况要明显优于对照组。再将转基因烟草和对照放入-10℃环境中进行低温胁迫30min，再恢复25℃常温培养12h，对照烟草大部分死亡，而转基因烟草也有一部分冻伤，但是基本都存活下来。见图2、3所示

上述实验表明本发明中克隆的大豆C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1，为大豆中新发现的与低温相关的C2H2型锌指蛋白基因。实施例3表明，该基因过量表达后能够明显提高转基因植物的抗冷性，具有提高植物综合耐逆性的功能。本发明的基因来源于大豆，具有适合于大豆等双子叶植物的优化密码子，其基因工程受体主要适合于双子叶植物的大豆、烟草、棉花等，此外也适合于水稻、小麦、玉米等单子叶植物。

Claims (7)

1.大豆锌指蛋白基因SCTF-1，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1。

2.大豆锌指蛋白基因SCTF-1，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求2所述的大豆锌指蛋白基因SCTF-1，其特征在于：它编码的蛋白其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的大豆锌指蛋白基因SCTF-1，它是采用下述方法获得的：

1)、提取大豆品种“吉农18”总RNA，反转录成cDNA，以其为模板；

2)、用人工合成的引物：

P1：CACAAGCATAAGCACAAGC，

P2：TGGATCTATGGATCAGTATTGAGG；

3)、采用PCR的方法进行cDNA克隆。

5.根据权利要求2所述的大豆锌指蛋白基因SCTF-1，它是：

1)以碱基序列如序列表SEQ ID NO.1的大豆锌指蛋白基因SCTF-1为模板；

2)用引物：

P1：GGGTCTAGAATGGCTTTGGAAGCTCTTCA，

P2：TTTGAGCTCGTATTGAGGGATTTCAATCTTGGGT；

3)采用PCR方法扩增获得的。

6.一种植物表达载体，其特征在于：它是在植物表达载体中插入了大豆锌指蛋白基因SCTF-1。

7.大豆锌指蛋白基因SCTF-1，在培养耐低温转基因植物新品种中的应用。

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