CN102250946A - 玉米转录因子ZmWRKY33基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种与玉米耐盐相关的转录因子基因及其应用。该基因为玉米WRKY家族转录因子基因ZmWRKY33,该玉米ZmWRKY33基因用于植物转化，提高植物的耐盐能力。可用于其他作物的抗逆转基因应用。该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。

Description

玉米转录因子ZmWRKY33基因的应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及玉米转录因子ZmWRKY33基因的功能及其应用。

背景技术

全世界约有三分之一的土地为盐碱地，在盐胁迫下，植物生长缓慢，新陈代谢受到强烈抑制，严重时出现盐斑，萎蔫，甚至是植株死亡的情况，显而易见,土壤盐渍化严重影响了农业生产和生态环境。干旱、高盐会造成植物不同程度的脱水，引起植物体内一系列的生理代谢变化，所以又将干旱、高盐等非生物胁迫称为水分胁迫，或渗透胁迫。植物应答渗透胁迫的过程是一个涉及到多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程，大体上可将这些基因及其表达产物分成两类,即功能蛋白和调节蛋白。功能蛋白是指在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质；而调节蛋白是在逆境中参与各种信号转导或调控基因表达，间接起保护作用的蛋白，主要包括：传递信号和调控基因表达的转录因子等。

植物在逆境胁迫下可诱导合成大量抗逆的化合物和蛋白质，这些与抗逆境相关的化合物和蛋白质又受转录因子在转录水平上的调控.转录因子可以通过与顺式作用元件结合，启动抗逆相关功能基因的转录，通过抗逆功能基因的表达使植物作出适应逆境胁迫的代谢调整。近年来，在提高作物抗逆性的分子育种中，研究重点已逐渐从改良个别基因转到改良或增强一个或多个发挥关键作用的转录因子上，这样能促使多个功能基因发挥作用，以期获得综合抗逆性状改良的植物。

植物WRKY家族转录因子能够与(T)TGAC(C/T)序列(又称W-box)发生特异性作用，调节启动子中含W-box元件的功能基因或调控基因的表达，从而参与植物的各种抗逆性反应。目前有关WRKY家族转录因子的研究大部分来自水稻和拟南芥，而其它物种的研究报道不多。

电子克隆(in silico cloning)是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆的新方法。其原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，再利用RT-PCR的方法快速地获得新基因。

本发明以玉米为研究材料，以拟南芥中与抵抗高盐有关的转录因子WRKY33为查询序列，同源搜索玉米核苷酸数据库，通过生物信息学的方法找到玉米中与抵抗非生物胁迫有关的WRKY转录因子基因。

发明内容

本发明的目的是提供玉米转录因子ZmWRKY33基因的序列及功能，并进一步公开了该基因的应用。

本发明通过对ZmWRKY33基因在玉米受高盐胁迫时的表达模式判断，该基因可能参与植物抗逆途径。根据该基因的序列设计引物，利用RT-PCR技术从玉米品种郑单958总cDNA中扩增得到ZmWRKY33基因。利用农杆菌蘸花法转化到野生型拟南芥植株中，并研究其在拟南芥体内的抗逆功能，为ZmWRKY33基因在其他植物上的应用提供了很好的基础。

本发明所述的玉米ZmWRKY33基因可用于植物转化，提高植物的耐盐能力。

本发明还公开了一种提高植物耐盐能力的方法，即利用玉米ZmWRKY33基因转化目标植物，从而获得转基因植物。

所述的提高植物耐盐能力的方法，包括下述步骤：

（1）用电子克隆的方法获得玉米转录因子基因ZmWRKY33，

（2）用RT-PCR获得玉米ZmWRKY33基因片段，

（3）将ZmWRKY33基因片段构建到质粒载体中，

（4）利用电击法将步骤（3）得到的带有ZmWRKY33的质粒转化农杆菌，

（5）将带有转化质粒的农杆菌采用蘸花法转化目标植物，

（6）目标植物转基因阳性苗的鉴定。

本发明步骤（2）是：根据ZmWRKY33基因的序列设计如下引物：

L3：5’-ATGGCGTCCTCCACGGGGAGCTT-3’ （SEQ ID NO.1），

R3：5’-CTAGCAGAGGAGCGAGTCGACGAAC-3’ （SEQ ID NO.2）；

利用RT- PCR技术从玉米总cDNA中扩增得到ZmWRKY33基因全长cDNA（开放阅读框部分）。

    本发明根据ZmWRKY33基因的cDNA序列设计如下检测引物：

1497JL : 5’-GTGGTCCAGACGATGAGCGACAT -3’（SEQ ID NO.3），

1497JR: 5’- GCTGCTCAGCATCTCCAGGGTGT -3’（SEQ ID NO.4）。

检测玉米经过NaCl处理后体内ZmWRKY33基因的表达情况。结果表明ZmWRKY33受NaCl诱导表达。

本发明步骤（3）是将扩增得到的ZmWRKY33基因片段克隆到pCAMBIA-1304（AF234300.1）（购买于上海皓嘉生物科技有限公司）载体中，构建的新载体命名为pZmWRKY33。为了更好的表达外源基因，还可在pZmWRKY33载体的多克隆位点处两侧插入了烟草的染色质附着SAR序列，这有利于转基因的稳定遗传及表达；外源基因的表达单元内，在目的基因的两侧导入了BamH I和Sac I酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV 35S启动子+ TMV Omega leader sequence控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence控制Hyg抗性基因的表达，作为转基因植物的筛选标记基因。

本发明利用电击法将构建好的双元载体pZmWRKY33导入根癌农杆菌中，根癌农杆菌菌株为EHA105。通过农杆菌蘸花法将耐盐相关的转录因子ZmWRKY33基因转化到拟南芥中，然后验证了转基因拟南芥对盐胁迫的耐受能力得到提高。

本发明的ZmWRKY33基因是能够针对性调控植物耐盐能力提高的转录因子基因；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。

本发明通过对ZmWRKY33基因转化拟南芥进行该基因的功能研究，获得效果如下：

1.获得了对盐胁迫有较高耐受性的转基因拟南芥植株。

2. ZmWRKY33基因具有抵抗盐胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1  ZmWRKY33与其它物种WRKY家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对。完全相同的氨基酸用黑色方框表示，WRKY结构域以下划线所示。

图2  ZmWRKY33与其它WRKY转录因子氨基酸序列比对后所作进化树。ZmWRKY33与其它单子叶植物的WRKY转录因子，如水稻的OsWRKY53和小麦的TaWRKY14分在一个分支；与ZmWRKY33亲缘关系最近的双子叶植物WRKY转录因子是拟南芥的AtWRKY33和烟草的NtWRKY1、NtWRKY2

图3  ZmWRKY33基因在高盐诱导时的表达谱变化情况。ZmWRKY33基因在受到盐胁迫1小时后表达量开始升高，到12小时到达顶峰。

图4  T₁代转基因拟南芥植株的PCR检测。M：DL2000 Marker；1,2：野生型植株； 3-14：T₁代转基因植株。

图5 野生型和转基因拟南芥对200mM NaCl胁迫的反应。左边为野生型植株，白线右边为转基因植株。

图6 野生型和转基因拟南芥对50mM NaCl胁迫的反应。黑线左边为野生型植株，黑线右边为转基因植株。

具体实施方式

实施例1：玉米转录因子ZmWRKY33的电子克隆

登陆公共数据库NCBI主页（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），搜索到拟南芥中与抵抗高盐胁迫有关的转录因子WRKY33的氨基酸序列，以此氨基酸序列为查询探针，用NCBI的tblastn程序同源搜索NCBI的玉米EST数据库。将在玉米EST数据库中得到高度同源EST序列用CAP程序拼接成重叠群（contig）；以此重叠群作为查询探针，重新搜索NCBI的玉米EST数据库，将获得的同源EST与原重叠群重新拼接为新的重叠群，从而使原重叠群的两端得到延伸；重复上述过程，直至重叠群不能再往两端延伸；将最后得到的重叠群用NCBI的ORF finder程序预测ORF（开放阅读框）的可能范围，从而获得全长cDNA序列中编码蛋白质的序列。由电子克隆得到的玉米转录因子ZmWRKY33的核苷酸序列和推测的氨基酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

实施例2：玉米转录因子ZmWRKY33的分子克隆

取三叶一芯期玉米幼苗，品种为郑单958（购于扬州市田源种业有限公司），液氮速冻，放置-70℃冰箱中保存以备提取总RNA。总RNA抽提采用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取. 玉米cDNA的合成按Fermentas公司的 Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的L3 5’- ATGGCGTCCTCCACGGGGAGCTT -3’（SEQ ID NO.1） 和R3 5’-CTAGCAGAGGAGCGAGTCGACGAAC -3’ （SEQ ID NO.2）为引物，利用RT-PCR 进行cDNA扩增，扩增条件为：94℃ 预热1 min；94℃, 40 s, 58℃, 30 s, 72℃,2 min，共35个循环。PCR结束后进行电泳分析， 采用百泰克公司的DNA回收试剂盒回收约1500 bp 的扩增片段。将扩增片段连接到TaKaRa公司的PMD19-T载体，转化感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到英俊公司测序。

根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与WRKY家族转录因子同源关系最近，和拟南芥转录因子WRKY33有较高同源性，因此我们将其归入WRKY类转录因子，由于该基因是从玉米中克隆出来的，因此将其命名为ZmWRKY33。 ZmWRKY33与WRKY类转录因子保守的DNA结合域比对及进化树分析如图1和图2所示。最终获得与拟南芥转录因子WRKY33具有较高同源性的玉米转录因子基因ZmWRKY33。

实施例3：转录因子基因ZmWRKY33在逆境胁迫时的表达谱分析

将生长到四叶一芯期的水培玉米幼苗用于高盐处理，将玉米幼苗置于250 mM/L的氯化钠溶液中，分别于0, 1, 6, 12, 24小时剪取幼苗叶片，每个时间点至少取10株幼苗，每株幼苗取第四片充分展开的叶子的叶尖部分（约5厘米），迅速置于液氮中速冻，并转移到-70°C冰箱保存，直至RNA抽提。RNA抽提和cDNA的合成如实施例2所述。荧光定量PCR在ABI公司的7500定量PCR仪上进行，以设计的1497-JL：   5’-GTGGTCCAGACGATGAGCGACAT -3’（SEQ ID NO.3）和1497-R：5’- GCTGCTCAGCATCTCCAGGGTGT -3’（SEQ ID NO.4）为引物进行荧光定量PCR，反应条件为：94℃ 30s; 94℃, 10 s, 63℃, 20 s, 72℃, 34s，采集荧光信号，共40个循环； 60oC to 95oC,每1oC 采集一次荧光信号, 持续1s。

反应结束后，用ABI 7500自带的软件进行分析及绘图。高盐处理的表达谱如图3所示，经过高盐处理1小时后，ZmWRKY33基因的表达量开始增加，处理12小时后该基因强烈表达，表达量约为未处理时的60倍。 

实施例4：转录因子基因ZmWRKY33植物表达载体的构建

将玉米cDNA用含BamHI酶切位点的基因扩增引物ML3：5’-CGCGGATCCATGGCGTCCTCCACGGGGAGCTT-3’（SEQ ID NO.7）和含

SacI酶切位点的基因扩增引物MR3：5’-TTCGAGCTCGTTCTAGCAGAGGA

GCGAGTCGACGAAC-3’（SEQ ID NO.8）进行RT-PCR扩增。扩增条件为：94℃ 预热1 min；94℃, 40 s, 58℃, 30 s, 72℃,2 min，共35个循环。PCR结束后进行电泳分析，采用百泰克公司的DNA回收试剂盒回收约1497 bp（SEQ ID NO.5）左右的扩增片段。回收产物用BamHI＋SacI双酶切后，进行电泳分析，再回收约1497 bp（SEQ ID NO.5）左右的目的片段，将此片段与相应酶切的pCAMBIA-1304载体（AF234300.1）（购买于上海皓嘉生物科技有限公司）相连，获得的载体命名为pZmWRKY33。

为了更好的表达外源基因，在pZmWRKY33载体的多克隆位点两侧插入了烟草的染色质附着SAR序列，这有利于转基因的稳定遗传及表达；外源基因的表达单元内，在目的基因的两侧导入了BamH I和Sac I酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV 35S启动子+ TMV Omega leader sequence控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence控制Hyg抗性基因的表达，作为转基因植物的筛选标记基因。

实施例5：农杆菌培养和植物转化

农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。质粒pZmWRKY33经电击法导入农杆菌中。挑取单菌到25 ml YEB培养基（50mg/l 利福平）培养过夜，取5 ml菌液转接到100 ml YEB培养基（50mg/l 利福平），培养至OD600 = 0.7-0.8，菌液冰上放置10 min，5000 rpm离心10 min ，4℃，收集菌体，加入100 ml 无菌双蒸水清洗两次。加入4 ml 10%甘油悬浮菌体，转到50 ml离心管。5500 rpm离心10 min ，4℃。收集菌体，加入500 μl 10%甘油悬浮菌体，转到1.5 ml离心管。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒pZmWRKY33。用去头的枪头混匀，转到0.1cm 电击杯中。电击参数：200Ω，1.7 KV， 2.5F，电击后立即加入800μl SOC 培养液。培养1小时后，取100μl 涂抗性板筛选转化子，28℃培养。

植物转化采用蘸花法将含目的质粒的农杆菌单菌落接种在5 ml含对应抗生素的LB培养基中28℃培养2天。取5 ml菌液转到500 ml的液体LB培养基中28℃培养16-24 h（OD=1.5-2.0）。液体可以在4℃保存30天。室温下离心收集菌体，4000 g 离心10 min。用等体积5%的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0.02%的Silwet-77混匀后置于烧杯中。转化时将拟南芥倒置后浸入菌液中约10 s，莲座和花序都要侵染，侵染后使吸附于植株上的菌液空气干燥3-5秒，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22℃下避光培养，24 h后去掉保鲜膜直立培养。农杆菌菌株用300 ml转化，转2-3盆。隔7天后再转化1次。转化后不要放置在高温和强光下, 揭开保鲜膜后要保持一定湿度，再生长1个月后收种子。利用50 μg/mL 潮霉素对收获的种子进行转化植株筛选，获得T₀代转基因植株，用同样的方法筛选获得T₁代转基因植株。

实施例6：转基因拟南芥阳性植株的鉴定

采用SDS酚-氯仿法微量提取拟南芥基因组DNA, 其步骤如下：

1.取两片幼嫩叶片(约0.2g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用筷子捣碎至粉末状；

2.加入700μl的抽提缓冲液A，轻轻混匀后，于65℃水浴30min(每5min上下颠倒混匀一次)；

3.取出稍冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿(各350μl)，上下颠倒充分混匀，抽提10min；

4. 12000rpm，离心5min，吸取上清到一新的离心管中；

5.加0.7倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀；

6. 12000rpm，离心10min，弃去上清；

7. 加入700μl的70%的乙醇清洗沉淀；

8. 12000rpm，离心5min，弃去上清；

9. 室温下晾干；

10. 加入30μl的TE溶液溶解，37℃温浴60min后，-20℃保存。

取1μl DNA作为模板，以实施例2中的引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃ 预热1 min；94℃, 40 s, 58℃, 30 s, 72℃,2 min，共35个循环。如图4所示，以T₁转基因拟南芥DNA为模板，能扩增出长度为1497bp的目的片段，证明目的基因ZmWRKY33已经整合入拟南芥基因组中。

实施例7：转录因子基因ZmWRKY33转化拟南芥后的耐盐性分析

在进行高盐处理时，先将在固体MS培养基上生长了一个月的拟南芥植株转移到含有1/10液体MS培养液的水培装置缓苗7天，待其充分适应水培环境后，再用200mM NaCl溶液取代培养液，对野生型和转基因植株进行高盐胁迫。如图5所示，在盐胁迫30分钟后，野生型植株均已经发生萎蔫并呈现出倒伏状，而转基因植株则影响相对较小，呈现出轻微的倾斜但没有倒伏，直到盐胁迫90分钟后，转基因植株才发生倒伏。将倒伏后的野生型植株和转基因植株放回清水中恢复生长，转基因植株在清水中恢复生长15分钟后就已经从倒伏状态恢复成直立状态，转基因植株比野生型植株表现出更快的恢复速度，而此时的野生型植株则刚刚开始表现出恢复的迹象，但仍然处于倒伏的状态，直到在清水中恢复生长70分钟后，才恢复到原来的直立状态。上述试验结果表明，在遭受到高盐胁迫时，转基因拟南芥比野生型拟南芥表现出更强的胁迫耐受性，而且在盐胁迫处理终止后，转基因拟南芥比野生型拟南芥表现出更快的恢复速度。

此外还采用浓度为50mM的NaCl溶液对水培条件下的野生型和转基因植株进行较长时间的盐胁迫处理，盐胁迫7天后，将它们重新置于清水环境中进行恢复培养。如图6所示，在遭受50mM NaCl溶液胁迫7天后，野生型植株的叶片表现出严重的萎黄现象,部分植株并已死亡，而转基因植株虽有部分叶片发生萎黄，但大部分植株的叶片及茎干仍保持绿色并在盐胁迫后存活了下来。

Claims (5)

1.玉米ZmWRKY33基因用于植物转化，提高植物的耐盐能力。

2.一种提高植物耐盐能力的方法，是用玉米ZmWRKY33基因转化目标植物，获得转基因植物。

3.根据权利要求2所述的提高植物耐盐能力的方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）用电子克隆的方法获得玉米转录因子基因ZmWRKY33，

（2）用RT-PCR方法获得玉米ZmWRKY33基因片段，

（3）将ZmWRKY33基因片段构建到质粒载体中；

（4）利用电击法将步骤（3）得到的带有ZmWRKY33的质粒转化农杆菌，

（5）将带有转化质粒的农杆菌采用蘸花法转化目标植物，

（6）目标植物转基因阳性苗的鉴定。

4.根据权利要求3所述的提高耐盐能力的方法，其特征在于步骤（3）是将ZmWRKY33基因片段克隆到pCAMBIA-1304载体中，得到载体pZmWRKY33。

5.根据权利要求3所述的提高耐盐能力的方法，其特征在于所述的目标植物是拟南芥。

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