CN103305530A - 玉米转录因子ZmWRKY44及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物抗逆领域，具体地涉及玉米转录因子ZmWRKY44及其应用。核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。根据本发明的技术方案，观察转ZmWRKY44拟南芥植株中的耐逆基因在盐胁迫条件下的表达情况，在盐胁迫下，转ZmWRKY44基因拟南芥的种子发芽率的影响降低，植株生长收到抑制，因此，转基因植株对盐胁迫表现出了一定的敏感性，上述转录因子ZmWRKY44可以用于提供植物的耐盐特性。

Description

玉米转录因子ZmWRKY44及其应用

技术领域

本发明涉及植物抗逆领域，具体地涉及玉米转录因子ZmWRKY44及其应用。

背景技术

玉米作为我国重要的粮食、饲料和经济三元作物，生长过程中受到病虫害、干旱、盐害、冷害、高温等多种不良的外界环境的影响，从而抑制其生长发育。应用现代分子生物学技术，挖掘重要的抗逆基因并将其进行遗传转化或通过分子标记辅助选择将其与其他优良性状聚合，不失为得到耐逆性强的玉米品种以及提高玉米产量的有效方法之一。对胁迫相关的基因进行功能研究是开发利用这些基因的前提。WRKY转录因子在植物的生物胁迫、非生物胁迫应答以及生长发育过程中发挥了重要的调控作用。WRKY转录因子能够参与多种不同的信号途径，功能具有多样性。因此，WRKY基因及其调控的靶基因都是潜在的重要抗逆基因。

植物在生长过程中会受到病虫害、干旱、盐害、冷害、高温、土壤pH、矿质营养物质匮乏等多种不良的外界环境的影响，从而抑制了植物的生长发育，导致了植物分布的区域局限性。同时植物在长期进化过程中形成了一系列机制以适应和抵御各种逆境胁迫。植物受到逆境胁迫时，胞外的这种刺激信号通过级联信号转导进入胞内，激活转录因子，促进其与下游靶基因结合并在转录水平上促进该基因的表达，从而响应植物的应答反应。目前，在高等植物中共发现了十个大的转录因子家族，WRKY基因家族作为其中之一，除了调控植物的激素信号转导途径以外，还广泛参与了植物的生物胁迫和非生物胁迫应答、糖类合成、器官发育和植物衰老等一系列生理活动。

由于耐逆抗病等种质资源有限并且其遗传机制十分复杂，在常规育种过程中很难将抗病耐逆性状与农作物的产量、品质等有机结合，培育出满足农业生产需要的抗性品种的农作物。现代分子生物学技术的飞速发展为解决这个问题提供了良好的契机。因此，应用现代分子生物学技术挖掘重要的植物抗病抗逆基因并将其进行遗传转化，是得到耐逆性强的作物品种以及解决和提高农业产量问题的有效方法之一。WRKY转录因子是高等植物中十个大的转录因子家族之一。WRKY转录因子参与植物的多种逆境胁迫应答，并在植物的生长发育过程中发挥着重要的调控作用，因此WRKY基因及其调控的靶基因都是潜在的重要抗逆基因。迄今为止，玉米WRKY转录因子参与植物盐害胁迫的报道极少。玉米的WRKY转录因子家族在非生物胁迫中的研究还处于初级阶段。目前，发现玉米WRKY基因与玉米病害有关，但与盐胁迫相关报道甚少。

发明内容

本发明的目的是提供玉米转录因子ZmWRKY44。

本发明的再一目的是提供上述玉米转录因子ZmWRKY44的应用。

根据本发明的玉米转录因子ZmWRKY44，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

ATCCCGGCAGAAAGTCAGGGTAGGGAGAAGGATGGCGATGGCGATGGCAAGTATGCCGCCGGCTTGTGCGGCAACCGAGCTGGTGGCCAAGGGGAGGGAGTCGGCTGCAGTTCTCAAGGCCATGCTCGGCCAGCTTCCTGCGGCGGCGACGCCCCATGATGGTCTCCGGGATCTGGCCGAGCAGGTCCTCCGCTGCTGCGACCGAGCTCTGGCGGCCTTGCTCAGAGGCGCGGCAACGGAGGAGGCTGCCTGCAGCAGTTCGGCCAGGAAGCGCCGCAAGCAGCCAGCAGAGCGGCAGGGCGGCCTGGCTCCTCCTCCTCCTTCTCCTGCTGCGACGGGATCCAAGACCAAGAGGATGAGGTAATTACTACTATGCAGCATAGCTCCTTTTGAGCTAATTACCAGCTTAAGTATACAACGTATAATCATCTACTACTGAATCTGCAGGATGAGCCGTGGAGAGCGGGGGACACGAGCGGAGAAGAAAGAAACAATGGAGGACGGCTTCATCTGGAGGAAGTACGGCCAGAAGGACATCCACGGCAGCAACTACCCCAGGTCTGTCCGTCTGTCTGAACTCTGAACCAACATCCGAATCAACCAAGACAGCTCGCATTATATTCATGGATCGTCGTTCGTCGATCAGTCTACTCTCTACTGCTGGATCACAATTCACAAACGTGACCAACCATCCAGGCTCTACTTCCGCTGCACCTACAAGGACGACCGCGGCTGCGAGGCCCGGAGGCAGGTGCAGCGGTCGGACACCGACCCCTGCGCGGCCTACCTCATCACCTACTTCGGCGAGCACACCTGCTGCTGCCGCGACGACGCCGTCGAGGCGCCAGCGCCATTCGTCATCGACTTCGGCTTGAGCGCCGCTGCCTGTGACGACGGCCTGCAGCTGCCGCAATACGGTTCGCCTTGGCCGTCTTGCGACGACGACGGCCCGGGCCCGGTGGAATTGCAAACGCCGCCGCCGCGCACATCAGCTGATCTGTGCAGTTCACCGCCGGAGGAGGAGTTGCGGGCTGGCGCGTGCGACGTGGCTGAGTTCGTCGCCGAGCAGTCAACGACGGTGACAGCAGAGCTCATGGGTAGGATAACCTCGCCGGAGTGGGACGGGTGCTTGGACTGGGAGTTGGGCGAAGGCGACAGCTCACTCGACGTTGACGGTTTCGACAGATACTACTTCGATTACAGTGATCTGCTTTAGAGCCTGTACAATCTATTAATCTAATTAAATAAGGAGTTTTTTTGAGCGGTCTCTAGAAGAGACAGATTCTTCCCCGGGAT

根据本发明的技术方案，观察转ZmWRKY44拟南芥植株中的耐逆基因在盐胁迫条件下的表达情况，在盐胁迫下，转ZmWRKY44基因拟南芥的种子发芽率的影响降低，植株生长收到抑制，因此，转基因植株对盐胁迫表现出了一定的敏感性，上述转录因子ZmWRKY44可以用于提供植物的耐盐特性。

本申请通过遗传转化实验，直接证明ZmWRKY44基因能够降低转基因植株35S::WRKY44的耐盐性，并且调控了一些下游抗逆相关的基因，说明WRKY44参与盐胁迫的调控途径具有多样性和复杂性。

本申请研究该基因的耐盐功能时，不局限于基因克隆、其表达分析以及遗传转化，还对其进行亚细胞定位，转录激活等辅助验证，并对其可能的调控途径进行大胆猜测，其结果也验证了ZmWRKY44基因确实调控多种下游基因，参与植物的盐胁迫应答。

盐胁迫是一种重要的非生物胁迫，其研究焦点集中于分子调控机制。WRKY作为一种转录因子，参与多种胁迫应答。本申请提供了一个重要的有关盐胁迫应答的玉米WRKY转录因子，为后期的玉米耐盐性研究具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1显示图1ZmWRKY44基因的克隆，M：DL2000；2：ZmWRKY44的PCR产物；

图2显示，ZmWRKY44在烟草叶片的亚细胞定位，A：GFP空载体在烟草叶片的亚细胞定位；B：ZmWRKY44在烟草叶片的亚细胞定位；

图3显示ZmWRKY44的转录激活功能验证；

图4显示NaCl对ZmWRKY44基因表达的影响；

图5显示ABA条件下ZmWRKY44基因的表达情况；

图6显示植物表达载体pCBP-ZmWRKY44的酶切和PCR检测，M1：DL2000；M2：DL10000；1：XbaI单酶切pMD19-T-ZmWRKY44；2：XbaI单酶切pCBP；3-5：pCBP-ZmWRKY44的PCR检测；6：XbaI单酶切检测pCBP-ZmWRKY44；7：BamHI单酶切检测pCBP-ZmWRKY44；

图7显示pCBP-ZmWRKY44转化农杆菌后的PCR检测；

图8显示35S::ZmWRKY44植株的筛选与检测，A：Basta对T0代植株的筛选；B2-12：部分ZmWRKY44转基因拟南芥；B1：ZmWRKY44阳性对照；B13:ddH2O阴性对照；B14：野生型拟南芥阴性对照；D：Basta筛选纯合T3植株；

图9显示ZmWRKY44基因在纯合转基因株系中的表达量分析，L1-L11：纯合转基因株系；Col-0：对照；

图10显示盐胁迫对35S::ZmWRKY44植株发芽率的影响，A：0mM NaCl；B：50mM NaCl；C：100mM NaCl；D：150mM NaCl；WT：野生型拟南芥；L6：35S::ZmWRKY44株系6；L8：35S::ZmWRKY44株系8；

图11显示盐胁迫对35S::ZmWRKY44植株生长的影响，WT：野生型拟南芥；L6：35S::ZmWRKY44株系6；L8：35S::ZmWRKY44株系8；

图12显示盐胁迫条件下抗逆相关基因在野生型和转基因株系中的表达情况，A:NaCl条件下ZmWRKY44基因在OE中的表达情况；B-D、F：分别是NaCl条件下AtSTZ、DREB2A、RD29B、AtABF2基因在OE和WT中的表达情况；E：STZ、DREB2A、RD29B基因在OE和WT中的表达情况；F：NaCl条件下AtABF2基因在OE中的表达情况。

具体实施方式

实施例1

1、ZmWRKY44基因的克隆

使用ZmWRKY44的特异性引物W44F/R从玉米自交系178中扩增这基因的cDNA，得到了ZmWRKY44基因1282bp的目的条带（如图1）。将其回收测序，进一步证明克隆片段为ZmWRKY44基因。

W44F：atCCCGGGCAGAAAGTCAGGGGTAGGGAGA

W44R：atCCCGGGGAAGAATCTGTCTCTTCTAGAGACCG

ZmWRKY44基因序列：

ATCCCGGCAGAAAGTCAGGGTAGGGAGAAGGATGGCGATGGCGATGGCAAGTATGCCGCCGGCTTGTGCGGCAACCGAGCTGGTGGCCAAGGGGAGGGAGTCGGCTGCAGTTCTCAAGGCCATGCTCGGCCAGCTTCCTGCGGCGGCGACGCCCCATGATGGTCTCCGGGATCTGGCCGAGCAGGTCCTCCGCTGCTGCGACCGAGCTCTGGCGGCCTTGCTCAGAGGCGCGGCAACGGAGGAGGCTGCCTGCAGCAGTTCGGCCAGGAAGCGCCGCAAGCAGCCAGCAGAGCGGCAGGGCGGCCTGGCTCCTCCTCCTCCTTCTCCTGCTGCGACGGGATCCAAGACCAAGAGGATGAGGTAATTACTACTATGCAGCATAGCTCCTTTTGAGCTAATTACCAGCTTAAGTATACAACGTATAATCATCTACTACTGAATCTGCAGGATGAGCCGTGGAGAGCGGGGGACACGAGCGGAGAAGAAAGAAACAATGGAGGACGGCTTCATCTGGAGGAAGTACGGCCAGAAGGACATCCACGGCAGCAACTACCCCAGGTCTGTCCGTCTGTCTGAACTCTGAACCAACATCCGAATCAACCAAGACAGCTCGCATTATATTCATGGATCGTCGTTCGTCGATCAGTCTACTCTCTACTGCTGGATCACAATTCACAAACGTGACCAACCATCCAGGCTCTACTTCCGCTGCACCTACAAGGACGACCGCGGCTGCGAGGCCCGGAGGCAGGTGCAGCGGTCGGACACCGACCCCTGCGCGGCCTACCTCATCACCTACTTCGGCGAGCACACCTGCTGCTGCCGCGACGACGCCGTCGAGGCGCCAGCGCCATTCGTCATCGACTTCGGCTTGAGCGCCGCTGCCTGTGACGACGGCCTGCAGCTGCCGCAATACGGTTCGCCTTGGCCGTCTTGCGACGACGACGGCCCGGGCCCGGTGGAATTGCAAACGCCGCCGCCGCGCACATCAGCTGATCTGTGCAGTTCACCGCCGGAGGAGGAGTTGCGGGCTGGCGCGTGCGACGTGGCTGAGTTCGTCGCCGAGCAGTCAACGACGGTGACAGCAGAGCTCATGGGTAGGATAACCTCGCCGGAGTGGGACGGGTGCTTGGACTGGGAGTTGGGCGAAGGCGACAGCTCACTCGACGTTGACGGTTTCGACAGATACTACTTCGATTACAGTGATCTGCTTTAGAGCCTGTACAATCTATTAATCTAATTAAATAAGGAGTTTTTTTGAGCGGTCTCTAGAAGAGACAGATTCTTCCCCGGGAT

2、ZmWRKY44蛋白的亚细胞定位

WRKY蛋白是一种转录因子，能够调控一些基因的表达，因此WRKY蛋白通常定位在细胞核中。因此，ZmWRKY44蛋白定位在细胞核。将ZmWRKY44基因的GFP融合载体转化到烟草叶片中，以CHF3-GFP载体作为对照，通过激光共聚焦显微镜观察定位情况。如图2所示，阳性对照CHF3-GFP在烟草细胞的细胞质和细胞核中都有荧光发出，说明CHF3-GFP不仅定位在细胞核中，还定位在细胞质中。而pCHF3-ZmWRKY44-GFP只在细胞核部位发出荧光，说明ZmWRKY44蛋白定位在细胞核。

3、ZmWRKY44的转录激活功能验证

ZmWRKY44是玉米WRKY转录因子家族的成员，具有转录激活的作用。因此本试验通过酵母转录激活实验验证ZmWRKY44的转录激活作用。ZmWRKY44分别作为转录因子激活了报告基因β-半乳糖苷酶的转录，与培养基中的X-α-GAL反应呈现蓝色菌落。正如图3所示，含有pGBKT7-ZmWRKY44质粒的酵母在SD/-Trp-His-Ade/X-α-GAL固体培养基上生长3d后，其菌落全都呈现蓝色（图3），而含有pGBKT7阴性对照的酵母生长受到抑制，并且无突起的菌落，说明ZmWRKY44具有转录激活的作用。

4、ZmWRKY44基因在非生物胁迫下的表达分析

（1）盐胁迫条件下ZmWRKY44基因的表达情况

150mM NaCl对幼苗期的玉米自交系178处理0h、12h、24h、48h、72h。通过RT-qPCR分析发现，ZmWRKY44基因的表达的总趋势明显受到盐胁迫的抑制。但是在最初的12h内受到NaCl的诱导，24h后明显受到抑制，表达量下降约0.6倍。48h时其表达量继续下降，直到72h时其表达量达到最低，降低了0.9倍，约是对照的0.1倍。因此，ZmWRKY44基因可能参与盐胁迫的负调控。图4显示NaCl对ZmWRKY44基因表达的影响。

（2）脱落酸（ABA）处理条件下ZmWRKY44基因的表达情况

研究表明，非生物胁迫条件下植物体内的ABA含量会大幅升高，并能够诱导或抑制一些耐逆相关基因的表达，从而调控植物非生物胁迫应答。100μM的ABA对玉米自交系178进行0h、2h、6h、12h、24h的处理。如图5所示，ZmWRKY44基因的表达受到ABA的强烈抑制，其表达量下降了0.82-0.9倍。2h时，ZmWRKY44基因的表达量明显下降约0.85倍。随后其表达量继续下降，到12h时，表达量下降0.9倍，约为对照的1/10，并且在6h时表达量达到最低，约为对照的1/20。这说明ZmWRKY44基因对ABA信号途径进行负调控，或者参与一些ABA介导的非生物胁迫途径的负调控。图5显示ABA条件下ZmWRKY44基因的表达情况。

5、ZmWRKY44基因的遗传学功能研究

（1）pCBP-ZmWRKY44过量表达载体的构建

构建过量表达载体，使用XbaI将pMD19-T-ZmWRKY44和pCBP进行单酶切，得到大小为1280bp左右的酶切片段和10kb左右的pCBP载体酶切片段。将回收的ZmWRKY44酶切片段分别和相应的pCBP酶切片段进行连接，并转化大肠杆菌后，菌液PCR检测得到1280bp的条带。进一步提取阳性质粒进行相应的酶切验证，得到1300bp左右的条带，说明构建载体正确。另外，BamHI进行单酶切验证pCBP-ZmWRKY44载体，得到950bp左右的条带，说明连接方向正确。图6显示植物表达载体pCBP-ZmWRKY44的酶切和PCR检测。

（2）pCBP-ZmWRKY44过量表达载体对拟南芥的转化

pCBP-ZmWRKY44过量表达载体转化农杆菌

将pCBP-ZmWRKY44过量表达载体转化到农杆菌EHA105感受态细胞中，在YEB(含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平)培养板，28℃培养约48h后，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定。得到1282bp的ZmWRKY44条带。说明pCBP-ZmWRKY44过量表达载体已经成功转化入农杆菌。图7显示pCBP-ZmWRKY44转化农杆菌后的PCR检测。

（3）农杆菌介导的拟南芥花序转化以及转基因植株的分子检测

用农杆菌介导的花序侵染法将ZmWRKY44基因转化到Columbia生态型(col-0)拟南芥中，并用15mg/L的Basta进行初步筛选（图8A），然后通过设计基因特异性引物对转基因植株进行PCR检测，得到340bp左右的目的片段（图8B，C）。35S::ZmWRKY44植株得到11个阳性转基因株系。将不同的阳性转基因株系单株收种，通过Basta筛选出纯合的T3代(图8D)。

6、35S::ZmWRKY44拟南芥植株的耐盐性分析

（1）ZmWRKY44高效表达转基因植株的筛选

以qW44F/R为引物进行半定量PCR，qW44F：GATCTGTGCAGTTCACCGCC；qW44R：CCAACTCCCAGTCCAAGCAC检测ZmWRKY44基因在纯合转基因株系中的表达量。如图9所示在11个株系（Line）中，株系6（L6）和8（L8）中ZmWRKY44基因的表达量最高。

（2）盐胁迫对35S::ZmWRKY44种子发芽率的影响

将表达量最高的两个纯系株系L6和L8的T₃代种子以及野生型种子消毒后播种于NaCl浓度分别为0mM、50mM、100mM、150mM的1/2MS培养基，4-5d后观察NaCl对植株发芽率的影响。如图10所示：L6和L8种子的发芽率和野生型植株（WT）种子的发芽率随着NaCl浓度的增加而降低。并且L6和L8的种子的发芽率与WT种子的发芽率相比，对NaCl的胁迫更加敏感（图10A，B，C，D）。0mM NaCl时，L6和L8以及WT的种子正常能够发芽生长；50mM NaCl条件下，L6和L8以及WT的种子的发芽受到抑制，并且幼苗子叶泛黄，L6和L8比WT表现的更明显；当100mMNaCl时，OE和WT种子的发芽率明显下降，L6和L8比WT种子的发芽率降低幅度更大；在150mM NaCl时，L6和L8以及WT的种子发芽、都受到严重抑制，L6和L8种子的发芽率几乎为0，WT则有少数几颗能发芽。

（3）盐胁迫对35S::ZmWRKY44植株生长的影响

将在1/2MS培养基上发芽5d的纯合T₃代35S::ZmWRKY44（L6和L8）以及野生型植株（WT）转到含有100mM NaCl的1/2MS培养基上培养3d后，如图11所示，WT植株正常生长，但是L6和L8植株的叶片开始变黄，生长受到抑制。

7、35S::ZmWRKY44拟南芥植株中的耐逆基因表达特性分析

35S::ZmWRKY44拟南芥植株中的耐逆基因在盐胁迫条件下的表达情况

35S::ZmWRKY44植株对盐胁迫表现出了一定的敏感性，为了进一步探究ZmWRKY44基因的盐敏感性，本实验用100mM的NaCl处理35S::ZmWRKY44植株，检测ZmWRKY44基因在0h、1h、6h、12h的表达情况。由于ZmWRKY44基因作为一种转录调控因子，可能调控多种与耐逆相关的基因如STZ、DREB2A、RD29B、COR、CBF等基因的表达。另外，植物的非生物胁迫应答通常与ABA信号途径相关，一些参与ABA信号途径的基因如ABF2、ABI3等也是研究植物耐逆机制的关键基因。因此，本实验通过RT-qPCR检测AtSTZ、AtDREB2A、AtRD29B、AtABF2四个基因在转基因植株L6和野生型植株（WT）中的表达变化，为进一步探究ZmWRKY44基因的其它非生物相关功能以及可能调控的靶基因做准备。ZmWRKY44、AtSTZ、AtDREB2A、AtRD29B不同NaCl处理时段的表达情况如图12（A,B,C,D,E,F）。ZmWRKY44的表达在12h内受到NaCl的诱导，但其增量随时间的增加而降低（图12-A）。NaCl未处理前，STZ和DREB2A在OE中的表达量高于WT中的，但RD29、ABF2则相反（图12-E）。当NaCl胁迫时，OE和WT中的STZ、DREB2A以及RD29的表达量都增加，并且STZ和DREB2A在OE中的表达量高于WT中的，而RD29在OE中的表达量低于WT的，如同未处理前的表达模式（图12-B,C,D）。ABF2基因的表达则受到盐胁迫的抑制，表达量下降（图12-F）。

Claims (4)

1.玉米转录因子ZmWRKY44，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述玉米转录因子ZmWRKY44对盐敏感性的应用。

3.权利要求1所述玉米转录因子ZmWRKY44提高植物耐盐性的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米或拟南芥。

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