CN107722112B

CN107722112B - 水稻条纹叶枯病抗性基因Stv-bi及其应用

Info

Publication number: CN107722112B
Application number: CN201610647862.2A
Authority: CN
Inventors: 唐九友; 左示敏; 吴旭江; 殷文超; 潘学彪; 储成才
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2016-08-09
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2036-08-09
Also published as: CN107722112A; WO2018028553A1

Abstract

本发明公开了水稻条纹叶枯病抗性基因Stv‑bi及其应用。本发明提供的蛋白质为a1)或a2)或a3)或a4)或a5)：a1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a2)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列7所示的蛋白质；a4)在序列表中序列7所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a5)将a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病性相关的蛋白质。实验证明，本发明提供的蛋白质对调控条纹叶枯病的抗性具有重要作用，在培育抗条纹叶枯病的水稻品种中具有广阔前景。

Description

水稻条纹叶枯病抗性基因Stv-bi及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及水稻条纹叶枯病抗性基因Stv-bⁱ及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)作为全球近半数人口最主要的粮食作物，其产量及品质长期经受各类细菌、真菌、以及病毒等病原菌的严重威胁。多年的生产实践表明，通过利用植物自身的抗病基因(R基因)培育抗性品种是最为经济、安全而又有效的应对措施(RonaldPC. 1997.The molecular basis of disease resistance in rice.Plant Mol.Biol.35:179-186)。在过去的十几年中，多个水稻白叶枯病及稻瘟病抗病基因被成功克隆并有效的整合到水稻的抗性改良研究和应用中(Helliwell EE,Yang Y.2013.Molecularstrategies to improve rice disease resistance.Methods Mol.Biol.956:285-309.)，但有关水稻抗病毒病基因的分离和应用鲜有报道(Mandadi KK,Scholthof KB.2013.Plantimmune responses against viruses:how does a virus cause disease？Plant Cell25:1489-1505)。

条纹叶枯病(rice stripe disease)是水稻最为主要的病毒病之一。这一病害由水稻条纹病毒(rice stripe virus，RSV)引起，后者是第一个报道的具有双义编码策略的植物病毒，主要通过灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)以较为持久的方式传播(Ramirez BC, Haenni AL.1994.Molecular biology of tenuiviruses,a remarkablegroup of plant viruses.J.Gen.Virol.75:467-475)。该病毒侵染水稻后，发病较早的植株心叶沿叶脉呈现断续的黄绿色或黄白色条斑，随后这些条斑融合成片，心叶卷曲成纸捻状，弯曲下垂呈“假枯心”；发病迟的植株只在剑叶或叶鞘上有褪色斑，抽穗不良或畸形不结实。此外，发病植株一般还表现为分蘖少和矮化(Fargette D，Ghesquiere A，Albar L，Thresh JM.2006.Virus resistance in rice.G.Loebenstein and J.P.Carr(eds.).Natural Resistance Mechanisms of Plants to Virus.431-446)。不同于细菌或真菌病害的是，条纹叶枯病一旦发病，就无法通过现有的理化方法逆转，因此也是水稻种植上最难防治的病害之一。

条纹叶枯病频繁爆发于温带及亚热带地区，包括中国、朝鲜、日本以及远东。早在上世纪60年代，日本每年超过600,000公顷的水稻种植面积(Shimizu T,Nakazono-NagaokaE， Uehara-Ichiki T，Sasaya T，Omura T.2011.Targeting specific genes for RNAinterference is crucial to the development of strong resistance to Ricestripe virus.Plant Biotechnol.J.9:503-512)，韩国40％的水稻种植面积(Jonson MG，Choi HS，Kim JS，Choi IR，Kim KH.2009.Complete genome dequence of the RNAs 3 and4 segments of rice stripe virus isolates in Korea and their phylogeneticrelationshipswith Japan and China isolates.Plant Pathol.J.25:142-150)，以及中国20多个省大约2，660，000公顷的水稻种植面积受到RSV爆发的影响(Wang HD，Chen JP，Zhang HM，Sun XL，Zhu JL，Wang AG， Sheng WX，Adams MJ.2008.Recent Rice stripevirus epidemics in Zhejiang province， China，and experiments on sowing date，disease–yield loss relationships，and seedling susceptibility.Plant Dis.92:1190-1196)。此后，RSV多次爆发于上述粳稻种植区，其中从2000年开始的最近一轮大规模条纹叶枯病爆发引起了人们的严重关切。这轮RSV爆发在中国多个省份，普遍性的导致了20％～30％的产量损失，个别重病区引起了30～40％的产量损失，甚至颗粒无收(Zhang S，Li L，Wang X，Zhou G.2007.Transmission of rice stripe virus acquired fromfrozen infected leaves by the small brown planthopper(Laodelphax striatellusFallén).J.Virol.Methods 146:359-362)；而在韩国同样影响了84％的水稻种植区，造成了巨大的经济损失(Jonson MG，Choi HS，Kim JS，Choi IR，Kim KH.2009.Complete genomesequence of the RNAs 3 and 4 segments of rice stripe virus isolates in Koreaand their phylogenetic relationshipswith Japan and China isolates.PlantPathol.J.25:142-150)。

通过对大量品种的表型筛选，日本育种家们在上世纪60年代发现一些籼稻、热带粳稻以及一些粳型旱稻中存在RSV的有效抗源，而其它温带粳稻品种普遍感条纹叶枯病(Washio O， Ezuka A，Sakurai Y，Toriyama K.1967.Studies on the breeding of ricevarieties resistant to rice stripe disease.I.Varietal difference inresistance to stripe disease.Jpn.J.Breed.17:91-98)。其中，来自旱稻品种的两个抗性基因Stv-a和Stv-b虽然具有显著且稳定的RSV抗性，但是由于其与其它产量和品质副效基因紧密连锁，一直没有在 RSV抗性育种中得到推广利用。一些籼稻品种中含有Stv-b的等位基因Stv-bⁱ基因具有不完全显性的抗病性。从1960s起，来源于籼稻品种‘Modan’的Stv-bⁱ基因被导入粳稻品种，随后这些中间品种被广泛地应用到抗RSV的优质粳稻品种的选育中。在过去的近半个世纪中， Stv-bⁱ基因是唯一一个提供持续高效抗性同时不影响水稻品质和产量的RSV抗性基因，迄今还没有致病小种产生的报道(Hayano-Saito Y，Tsuji T，FujiiK，Saito K，Iwasaki M， Saito A.1998.Localization of the rice stripe diseaseresistance gene，Stv-bⁱ， by graphical genotyping and linkage analysis withmolecular markers.Theor.Appl. Genet.96，1044-1049)。由此，克隆Stv-bⁱ基因，有助于揭开水稻抗病毒分子机制；为单子叶植物的抗病毒机制研究提供参考；同时也为进一步的RSV抗性育种尤其是基因工程改良育种以及分子标记辅助育种提供依据，以更好地控制和减低RSV对水稻生产的危害。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高水稻的条纹叶枯病抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质。

本发明所提供的蛋白质，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)氨基酸序列是序列表中序列7所示的蛋白质；

a4)在序列表中序列7所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a5)将a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病性相关的蛋白质。

其中，序列表中序列4可由1710个氨基酸残基组成。序列表中序列7可由1708个氨基酸残基组成。

为了使a1)或a3)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列4或序列表中序列7所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述a5)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过 850个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a5)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a5)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2、序列表中序列5、序列表中序列2自5′末端起第128至5260位、或序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述抗病性可为抗条纹叶枯病。

所述抗病性可为抗水稻条纹病毒引起的病害。

所述植物可为c1)至c14)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)大麦；c6)小麦；c7)烟草；c8)番茄；c9)燕麦；c10)高粱；c11) 玉米；c12)棉花；c13)大豆；c14)油菜。所述水稻具体可为水稻品种武育粳3号或水稻品种武陵粳1号。

所述蛋白质的活性片段也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质的核酸分子，具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5) 或(b6)所示的DNA分子：

(b1)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)核苷酸序列是序列表中序列2自5′末端起第128至5260位所示的DNA分子；

(b3)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(b4)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

(b5)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列具有50％或50％以上同一性，且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b6)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

序列表中序列1由11390个核苷酸组成。序列表中序列2由5260个核苷酸组成，序列表中序列2的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由5127个核苷酸组成，序列表中序列5的核苷酸编码序列表中序列7所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质的核苷酸序列50％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有50％或更高，或60％或更高，或70％或更高，或80％或更高，或90％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

基于所述核酸分子开发的分子标记甲，或，与所述核酸分子紧密连锁并可用于鉴定或辅助鉴定植物抗病性的分子标记乙也属于本发明的保护范围。

含有或部分含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。

所述表达载体具体可为实施例中提及的载体pCAMBIA2300或载体pCAMBIA2300的衍生载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII等。

所述重组载体具体可为实施例中提及的480C或500ox。

所述重组微生物为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

所述重组微生物具体可为将所述重组质粒480C或500ox导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为根癌农杆菌。

所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌AGL1。

所述转基因细胞系可为将所述重组载体转化受体细胞获得的。

所述转基因细胞系具体可为将所述重组质粒480C或500ox转化受体细胞获得的。

与所述蛋白质结合的抗体也属于本发明的保护范围。

d1)或d2)或d3)或d4)的应用也属于本发明的保护范围：

d1)所述蛋白质，或，所述核酸分子，或，含有或部分含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗病性中的应用；

d2)所述蛋白质，或，所述核酸分子，或，含有或部分含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育抗病性提高或降低的转基因植物中的应用；

d3)所述蛋白质，或，所述核酸分子，或，含有或部分含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备抗病性药物中的应用；

d4)所述核酸分子产生的分子标记在选育抗病性植物中的应用。

上文中，所述抗病性可为抗条纹叶枯病。

上文中，所述抗病性可为抗水稻条纹病毒引起的病害。

上文中，所述植物可为c1)至c14)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)大麦；c6)小麦；c7)烟草；c8)番茄；c9)燕麦；c10) 高粱；c11)玉米；c12)棉花；c13)大豆；c14)油菜。所述水稻具体可为水稻品种武育粳 3号或水稻品种武陵粳1号。

为解决上述技术问题，本发明还提供了培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法一，包括使所述蛋白质在受体植物中表达或过表达、或提高受体植物中所述蛋白质的活性，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗病性增强。

上述方法一中，所述“使所述蛋白质在受体植物中表达或过表达、或提高受体植物中所述蛋白质的活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到表达或过表达所述蛋白质、或提高所述蛋白质的活性的效果。

上述方法一中，所述“使所述蛋白质在受体植物中表达或过表达、或提高受体植物中所述蛋白质的活性”具体可为向受体植物中导入编码所述蛋白质的核酸分子。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法二，包括抑制受体植物中所述蛋白质的表达量或抑制受体植物中所述蛋白质的活性，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗病性降低。

上述方法二中，所述“抑制受体植物中所述蛋白质的表达量或抑制受体植物中所述蛋白质的活性”可通过、RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制所述蛋白质的表达量或活性的目的。

上述方法二中，所述“抑制受体植物中所述蛋白质的表达量或抑制受体植物中所述蛋白质的活性”具体可为向受体植物中导入抑制编码所述蛋白质的核酸分子的表达的物质。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法三，包括将通过上述方法一或上述方法二获得的转基因植物与待改良植物杂交，得到后代转基因植物的步骤；所述后代转基因植物与所述转基因植物(即作为亲本的转基因植物)具有相同的抗病性。

上述方法中，编码所述蛋白质的核酸分子，具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4) 或(b5)或(b6)所示的DNA分子：

(b1)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

(b3)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(b4)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

上述方法中，所述“向受体植物中导入编码所述蛋白质的核酸分子”可通过向受体植物中导入重组载体甲实现；所述重组载体甲可为向表达载体或克隆载体插入编码所述蛋白质的核酸分子得到的重组质粒。

所述重组载体甲具体可为所述480C或所述500ox。

上述方法中，所述“抑制编码所述蛋白质的核酸分子的表达的物质”可通过向受体植物中导入重组载体乙实现。所述重组载体乙具体可为实施例中提及的480Ri。

上述方法中，所述抗病性可为抗条纹叶枯病。

上述方法中，所述抗病性可为抗水稻条纹病毒引起的病害。

上述方法中，所述受体植物可为c1)至c14)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)大麦；c6)小麦；c7)烟草；c8)番茄；c9)燕麦；c10)高粱；c11)玉米；c12)棉花；c13)大豆；c14)油菜。所述水稻具体可为水稻品种武育粳3号或水稻品种武陵粳1号。

上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述核酸分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述核酸分子，也可用常规育种技术将所述核酸分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明还提供了一种核酸分子甲，所述核酸分子甲可为如下(e1)或(e2)或(e3)所示的DNA分子：

(e1)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

(e2)与(e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性的DNA分子；

(e3)在严格条件下与(e1)或(e2)限定的核苷酸序列杂交的DNA分子。

实验证明，利用本发明提供的蛋白质及其编码基因能调控植物抗病性。因此，本发明提供的蛋白质对调控条纹叶枯病的抗性具有非常重要的作用，在培育抗条纹叶枯病的水稻品种中具有广阔前景。

附图说明

图1为Stv-bⁱ基因的精细定位图谱和单染色体片段代换系的基因型和表型数据。

图2为日本晴、Lemont和特青在定位区间内的基因组和转录本结构示意图。其中Nipponbare为日本晴，Teqing为特青。

图3为实施例2的实验结果。

图4为实施例3的实验结果。

图5为实施例4的实验结果。

图6为实施例6的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

载体pCAMBIA2300为Cambia公司产品。克隆载体pMD18-T为TaKaRa公司的产品。载体pUC18 为ThermoFisher公司的产品。

载体pUC-RNAi：将载体pUC18的限制性内切酶BamHI和BglII的识别序列间的片段(载体 pUC18被限制性内切酶BamHI和BglII切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为马铃薯GA20氧化酶基因的内含子的序列，得到重组质粒，命名为载体pUC-RNAi。

载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII的构建方法：将载体pCAMBIA2300的多克隆位点替换成含有限制性内切酶XmaI的识别序列和限制性内切酶AvrII的识别序列的片段。

水稻感病品种武育粳3号为武进稻麦育种场培育而成的市售品种。水稻感病品种武育粳3 号以下简称武育粳3号或WYJ3。

水稻抗病品种武陵粳1号为由扬州大学农学院、江苏省种子管理站和武进区稻麦育种场通过多代回交选育而成的市售品种。水稻抗病品种武陵粳1号以下简称武陵粳1号或WLJ1。

水稻感病品种Lemont为来源于美国的市售水稻品种。水稻感病品种Lemont以下简称 Lemont。

水稻抗病品种特青为广东省农业科学院水稻研究所培育的市售品种。水稻抗病品种特青以下简称特青或Teqing。

近等基因系NIL39由发明人以Lemont为轮回亲本，特青为供体亲本通过分子标记多代辅助选择获得。近等基因系NIL39以下简称NIL39。

水稻感病品种日本晴为来源于日本的市售水稻品种。水稻感病品种日本晴以下简称日本晴或Nipponbare。

实施例1、Stv-bⁱ基因的精细定位

研究结果表明来源于特青的抗条纹叶枯病基因qSTV11^TQ(与本申请后续发现的Stv-bⁱ基因是等位基因，故本发明中如无其他说明则统一将该基因命名为Stv-bⁱ基因)定位于水稻第11 条染色体分子标记CAPS2和CAPS3之间55.7kb的区间内(Wu XJ，Zuo SM，ZhangYF，Zhu JK， Ma N，Tang JY，Chu CC，Pan XB.2011.Fine mapping of qSTV11^TQ,a majorgene coferring resistance to rice strip disease.Theor.Appl.Genet.122:915-23)。为进一步精细定位 Stv-bⁱ基因，在上述55.7kb区间内开发多态性分子标记，并依据分子标记鉴定结果构建了以 Lemont为遗传背景、包含更小特青染色体单片段的染色体单片段代换系(Chromosome single segment substitution lines，CSSSLs)，依据CSSSLs条纹叶枯病抗病性的鉴定(Wu XJ,Zuo SM,Zhang YF,Zhu JK,Ma N,Tang JY,Chu CC,PanXB.2011.Fine mapping of qSTV11^TQ, a major gene coferring resistance to rice stripdisease.Theor.Appl.Genet.122:915-23)，最终将Stv-bⁱ基因定位于分子标记CAPS5(CAPS5F：5’-AAGTATGTCGCAAACTCGAT-3’和CAPS5R：5’-TCTAAAGCTGACTGCTCTGC-3’)和InDel11(InDel11F：5’-CAAATTTGGAAAGGTGGTAT-3’和InDel11R： 5’-ACGTTAAATAAAAAGTCAACAGC-3’)之间29.6kb的区域(见图1)。参考日本晴基因组 (http:// rice.plantbiology.msu.edu/annotation_pseudo_current.shtml)的注释结果，在该29.6kb的区域检测到5个开放读码框(见图2)，包括2个转座子编码基因、一个反转座子编码基因以及一对同源基因LOC_Os11g31480(核苷酸序列如序列表中序列1所示)和 LOC_Os11g31500，可见LOC_Os11g31480或LOC_Os11g31500中的一个或两个即是抗条纹叶枯病基因。

采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)得到如下实验结果(见图2)：日本晴中仅检测到LOC_Os11g31480的一个转录本STV11S(核苷酸序列如序列表中的序列3所示，下文简称STV11S基因)；特青和Lemont中，均在预测的第一外显子Exon1B 前面检测到另一个可变剪接第一外显子Exon1A，相应的检测到两个转录本，即转录本STV11L (核苷酸序列如序列表中序列2所示，下文简称STV11L基因)和转录本STV11S；在日本晴、特青和Lemont三个品种中，均检测到LOC_Os11g31500的一个转录本STV11-pa1(核苷酸序列如序列表中序列5所示,下文简称STV11-pa1基因)。上述结果表明，特青和日本晴在目的基因所在区域可能存在很大的序列差异。

采用基于PCR的基因组步移技术(PCR-based genome walking methods)得到如下实验结果(图2)：对特青相应基因组的序列进行了扩增和测序分析，在特青中分子标记CAPS5和 InDel11界定的区域内，仅存在LOC_Os11g31480和LOC_Os11g31500两个同源基因，而且覆盖特青LOC_Os11g31480的第一内含子、第一外显子Exon1A以及第一个启动子的片段在日本晴中完全缺失或被其他片段替代；对Lemont的相应区域进行了序列分析，发现所在区域同样仅存在 LOC_Os11g31480和LOC_Os11g31500两个同源基因。

上述结果表明：日本晴中，LOC_Os11g31480基因尽管缺失了第一外显子Exon1A和启动子，但仍然能检测到高水平的转录本STV11S，可见该转录本前面的区域即对应于特青等位基因的第一内含子同时也能行使启动子的功能，由此可见LOC_Os11g31480基因含有两个可变剪接启动子和两个可变剪接的第一外显子。

实施例2、Stv-bⁱ基因的功能验证

一、重组质粒和重组农杆菌的构建

1、重组质粒的构建

(1)将载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII的限制性内切酶XmaI和AvrII的识别序列间的片段(载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII被限制性内切酶XmaI和AvrII切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1自5′末端起第2621到11390位所示的DNA 分子，得到重组质粒，命名为T-480C。

(2)将载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII的限制性内切酶XmaI和AvrII的识别序列间的片段(载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII被限制性内切酶XmaI和AvrII切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列5所示的cDNA分子对应的包括所有调控区段在内的基因组序列，得到重组质粒，命名为500C。500C表达序列表中序列7所示的蛋白质 STV11-pa1。

(3)将载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII的限制性内切酶XmaI和AvrII的识别序列间的片段(载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII被限制性内切酶XmaI和AvrII切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为包含特青基因组的LOC_Os11g31480第一可变启动子和序列表中序列1所示的双链DNA分子，得到重组质粒，命名为480C。480C表达序列表中序列4所示的蛋白质STV11L。

2、重组农杆菌的构建

将T-480C导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/T-480C。

将500C导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/500C。

将480C导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/480C。

将载体pCAMBIA2300-XmaI/AvrII导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/pCAMBIA2300。

二、水稻转基因植株的再生

将武育粳3号种子脱壳灭菌，然后采用农杆菌侵染法将AGL1/T-480C转化武育粳3号，获得T₀代转基因水稻植株。T₀代转基因水稻植株收种后，经G418筛选后播种，得到T₁代转基因水稻。T₁代转基因水稻收种后，再次经G418筛选后播种，得到T₂代转基因纯合水稻。分别取2个T₂代转基因水稻株系(T-480C L1和T-480C L2)进行后续步骤三的实验。

按照上述方法，将AGL1/T-480C替换为AGL1/500C，其它步骤均相同，得到T₂代转基因水稻的纯合植株。分别取2个T₂代转基因水稻株系(500C L1和500C L2)进行后续步骤三的实验。

按照上述方法，将AGL1/T-480C替换为AGL1/480C，其它步骤均相同，得到T₂代转基因水稻的纯合植株。分别取2个T₂代转基因水稻株系(480C L1和480C L2)进行后续步骤三的实验。

按照上述方法，将AGL1/T-480C替换为AGL1/pCAMBIA2300，其它步骤均相同，得到T₂代转空载体水稻的纯合植株，以下简称转空载体水稻。

三、转基因水稻的鉴定

采用Trizol法提取生长至4周的T-480C L1的地上组织总RNA，得到T-480C L1的总RNA，将该总RNA用逆转录酶反转录出第一链cDNA，简称为T-480C L1的cDNA。

按照上述方法，将T-480C L1分别替换为T-480C L2、480C L1、480C L2、500C L1和500C L2，得到T-480C L2的cDNA、480C L1的cDNA、480C L2的cDNA、500C L1的cDNA和 500CL2的cDNA。

按照上述方法，将T-480C L1替换为武育粳3号，得到空白对照cDNA。

按照上述方法，将T-480C L1替换为转空载体水稻，得到空载对照cDNA。

按照上述方法，将T-480C L1替换为武陵粳1号，得到阳性对照cDNA。

以上述cDNA为模板，实时定量检测STV11L基因、STV11S基因或STV11-pa1基因的相对表达量(以Actin1基因为内参)。

鉴定STV11L基因的引物为5’-AGGCCGTCATCTACCTCA-3’和 5’-ACATTCAGCACAAGGTTTCT-3’。鉴定STV11S基因的引物为5’-GCCTCTCAGCTCGATCTAC和 5’-ACATTCAGCACAAGGTTTCT-3’。鉴定STV11-pa1基因的引物为 5’-TCTGCCACTGGATTGACTA-3’和5’-GGGTCCAATCTTGTCTATGA-3’。鉴定Actin1基因的引物为5’-CAGGCCGTCCTCTCTCTGTA-3’和5’-AAGGATAGCATGGGGGAGAG-3’。

实验结果表明(图3中C)：将武陵粳1号中STV11L基因的表达量作为1，转空载体水稻、 480C L1和480C L2中STV11L基因的表达量分别为0、1.2和2.08，武育粳3号和转空载体水稻中均没有检测到STV11L基因的表达；将转空载体水稻中STV11S基因的表达量作为1，T-480C L1和T-480C L2中STV11S基因的表达量分别为5.8和13.4，武育粳3号和转空载体水稻中STV11S基因的表达量无显著差异；将转空载体水稻中STV11-pa1基因的表达量作为1，500C L1和500C L2中STV11-pa1基因的表达量分别为4.5和2.9，武育粳3号和转空载体水稻中STV11-pa1基因的表达量无显著差异。

四、转基因水稻的条纹叶枯病抗性鉴定

以武育粳3号、武陵粳1号、转空载体水稻、T-480C L1、T-480C L2、480C L1、480CL2、 500C L1和500C L2为实验材料，测定水稻的条纹叶枯病抗性。

实验重复三次，每个株系每次种植40株于2L的玻璃烧杯中，在水稻生长至10天时，每株水稻苗接种4头2-3龄带水稻条纹病毒灰飞虱若虫(2-3龄带水稻条纹病毒灰飞虱若虫由江苏省农业科学院植物保护所提供)，每天驱赶灰飞虱4次以便于被测水稻苗均匀受毒。48小时后，用吸管将灰飞虱全部移走，并将水稻苗移栽到没有灰飞虱的水稻温室中，约一个月后调查实验材料的发病情况。

各供试材料的水稻条纹叶枯病抗病性通过两个指标进行测定：1)健康植株比率，即计算接虫后未发病植株数目占总接虫植株数目的百分比(Wu XJ,Zuo SM,Zhang YF,ZhuJK, Ma N,Tang JY,Chu CC,Pan XB.2011.Fine mapping of qSTV11^TQ,a major genecoferring resistance to rice stripdisease.Theor.Appl.Genet.122:915-23)；2)病情指数，即按病害发生严重程度，根据Washio的抗性鉴定标准，将各苗的发病情况分成A、B、Bt、Cr、 C和D六个级别，统计各家系中不同级别的株数，按公式计算病情指数＝(100×A+80×B+60 ×Bt+40×Cr+20×C+5×D)/被测总苗数(Washio O，Ezuka A，Sakurai Y，ToriyamaK.1967.Studies on the breeding of rice varieties resistant to rice stripedisease.I.Varietaldifference in resistance to stripe disease.Jpn.J.Breed.17:91-98)。

健康植株比率的实验结果见图3中A，病情指数实验结果见图3中B。结果表明，转化LOC_Os11g31480能达到与抗病对照一致的抗病性。而相对应的是即使选用LOC_Os11g31500表达量高的转基因纯合株系进行表型鉴定，转基因也没有提高条纹叶枯病的抗病性。这些结果证实条纹叶枯病抗病基因对应于LOC_Os11g31480而不是LOC_Os11g31500。LOC_Os11g31480基因含有两个可变剪接启动子和两个可变剪接的第一外显子，即含有序列表中序列2所示的转录本STV11L和序列表中序列3所示的转录本STV11S。为了进一步验证这两个转录本对条纹叶枯病抗病性的贡献，将步骤二获得的T-480C L1和T-480C L2进行条纹叶枯病表型鉴定。结果表明， T-480C L1和T-480C L2并没有出现比武育粳3号明显增强的条纹叶枯病抗病性。这一结果表明 STV11L或STV11L与STV11S的互作在条纹叶枯病抗病性中发挥了关键作用。

实施例3、Stv-bⁱ沉默株的获得和鉴定

系谱分析表明粳稻品种武陵粳1号的条纹叶枯病抗性基因来源于籼稻品种‘Modan’ (PanXB，Chen ZX，Zuo SM，Zhang YF，Wu XJ，Ma N，Jiang QX，Que JH，ZhouCH.2009.A new rice cultivar'Wulingjing 1'with resistance to rice stripe virusbred by markerassisted selection.Acta Agron.Sin.35:1851-1857；Wu XJ，Zuo SM，Zhang YF， Zhu JK，Ma N，Tang JY，Chu CC，Pan XB.2011.Fine mapping of qSTV11^TQ，amajor gene coferring resistance to rice strip disease.Theor.Appl.Genet.122:915-23)。为证实在特青中克隆的条纹叶枯病抗病基因LOC_Os11g31480与来源于籼稻品种‘Modan’的抗病基因即Stv-bⁱ是等位基因，我们选用武陵粳1号进行LOC_Os11g31480基因的RNAi敲除实验。

一、重组质粒和重组农杆菌的构建

1、重组质粒的构建

(1)480Ri的构建

a、PCR扩增特青基因组DNA获得DNA分子1。DNA分子1的核苷酸序列如序列表中序列2自5′末端起第4670到5031位所示(长度为362bp)。

b、将DNA分子1和克隆载体pMD18-T连接，得到重组质粒。测序结果表明，该重组质粒中含有DNA分子1。

c、用限制性内切酶SalI和BamHI酶切步骤b构建的重组质粒，回收约360bp的DNA片段甲。

d、用限制性内切酶SalI和BamHI酶切载体pUC-RNAi，回收载体骨架1(载体pUC-RNAi被切成一个大片段和一个小片段，载体骨架1为大片段)。

e、将载体骨架1和DNA片段甲连接，得到重组质粒。

f、用限制性内切酶BglII和XhoI酶切步骤e构建的重组质粒，回收载体骨架2(步骤e构建的重组质粒被切成一个大片段和一个小片段，载体骨架2为大片段)。

g、将载体骨架2和DNA片段甲连接，得到重组质粒。

h、用限制性内切酶PstI酶切步骤g构建的重组质粒，回收DNA片段丙(步骤g构建的重组质粒被切成一个大片段和一个小片段，DNA片段丙为小片段)。

i、用限制性内切酶PstI酶切表达载体pCAMBIA2301A(由表达载体pCAMBIA2300改造得到，具有Actin1启动子和OCS终止子)，回收载体骨架3(载体pCAMBIA2301A被切成一个大片段和一个小片段，载体骨架3为大片段)。

j、将载体骨架3和DNA片段丙连接，得到重组质粒，命名为480Ri。480Ri为以表达载体 pCAMBIA2300为出发载体，在酶切位点插入如下表达盒：自上游至下游依次由Actin1启动子、 DNA片段丙和OCS终止子组成。

(2)500Ri的构建

按照上述(1)的方法，将DNA分子1替换为DNA分子2，其它步骤均不变，得到重组质粒，命名为500Ri。DNA分子2的核苷酸序列如序列表中序列5自5′末端起第4469到4814位所示(长度为346bp)。

2、重组农杆菌的构建

将480Ri导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/480Ri。

将500Ri导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/500Ri。

将pCAMBIA2301A导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/pCAMBIA2301A，作为对照。

二、沉默株的获得

将武陵粳1号种子脱壳灭菌，然后采用农杆菌侵染法(Liu,X.Q.,Bai,X.Q.,Wang,X.J. &Chu,C.C.2007.OsWRKY71,a rice transcription factor,is involved in ricedefense response.J.Plant Physiol.164,969-79)将AGL1/480Ri转化武陵粳1号，获得T₀代沉默株。将T₀代沉默株自交产生的种子命名为T₁代沉默种子，由T₁代沉默种子长成的水稻植株命名为T₁代沉默株，T₁代转基因水稻收种后，再次经G418筛选后播种，得到T₂代转基因纯合水稻。分别取2个T₂代转基因水稻株系将其命名为480Ri L1和480Ri L2进行后续步骤三的实验。

按照上述方法，将AGL1/480Ri替换为AGL1/500Ri，其它步骤均相同，得到T₂代纯合沉默株，随机选择两个沉默株系，将其命名为500Ri L1和500Ri L2。

按照上述方法，将AGL1/480Ri替换为AGL1/pCAMBIA2301A，其它步骤均相同，得到T₂代纯合转空载体水稻的植株，以下简称转空载体水稻。

三、沉默株的鉴定

采用Trizol法分别提取生长至4周且叶片全展开的480Ri L1和480Ri L2的叶鞘组织的总RNA，得到480Ri L1和480Ri L2的总RNA，将该总RNA用逆转录酶反转录出第一链cDNA，简称为480Ri L1的cDNA和480Ri L2的cDNA。

采用Trizol法分别提取幼穗生长至5厘米的500Ri L1和500Ri L2的幼穗的总RNA，得到500Ri L1和500Ri L2的总RNA，将该总RNA用逆转录酶反转录出第一链cDNA，简称为500Ri L1的cDNA和500Ri L2的cDNA。

按照上述方法，将480Ri L1或500Ri L1替换为武陵粳1号，得到对应空白对照cDNA。

按照上述方法，将480Ri L1或500Ri L1替换为转空载体水稻，得到对应空载对照cDNA。

以上述cDNA为模板，实时定量检测STV11L基因、STV11S基因和STV11-pa1基因的相对表达量(以Actin1基因为内参)。

鉴定STV11L基因的引物为5’-AGGCCGTCATCTACCTCA-3’和 5’-ACATTCAGCACAAGGTTTCT-3’。鉴定STV11S基因的引物为 5’-GCCTCTCAGCTCGATCTAC-3’和5’-ACATTCAGCACAAGGTTTCT-3’。鉴定STV11-pa1基因的引物为5’-TCTGCCACTGGATTGACTA-3’和5’-GGGTCCAATCTTGTCTATGA-3’。鉴定Actin1基因的引物为5’-CAGGCCGTCCTCTCTCTGTA-3’和5’-AAGGATAGCATGGGGGAGAG-3’。

实验结果表明(图4中C)：将转空载体水稻中STV11L基因的表达量作为1，480RiL1、 480Ri L2、500Ri L1和500Ri L2中STV11L基因的表达量分别为0.04、0.06、0.60和0.67，武陵粳1号和转空载体水稻中STV11L基因的表达量无显著差异；将转空载体水稻中STV11S 基因的表达量作为1，480Ri L1、480Ri L2、500Ri L1和500Ri L2中STV11S基因的表达量分别为0.21、0.18、0.79和0.87，武陵粳1号和转空载体水稻中STV11S基因的表达量无显著差异；将转空载体水稻中STV11-pa1基因的表达量作为1，480Ri L1、480Ri L2、500RiL1 和500Ri L2中STV11-pa1基因的表达量分别为0.73、0.91、0.17和0.12，武陵粳1号和转空载体水稻中STV11-pa1基因的表达量无显著差异。

四、沉默株的条纹叶枯病抗性鉴定

以武陵粳1号、转空载体水稻、武育粳3号、480Ri L1、480Ri L2、500Ri L1和500RiL2 为实验材料，鉴定水稻的条纹叶枯病抗性。鉴定方法同实施例2步骤四。

结果表明(图4中A和B)，在武陵粳1号背景下特异敲除LOC_Os11g31480能完全破坏Stv-bⁱ介导的条纹叶枯病抗病性，相应地在武陵粳1号背景下特异性敲除LOC_Os11g31500，并没有影响Stv-bⁱ介导的条纹叶枯病抗病性，由此可见LOC_Os11g31480与Stv-bⁱ系等位基因。在水稻中沉默Stv-bⁱ基因可降低水稻对条纹叶枯病的抗性。

实施例4、STV11L基因的表达模式分析

实时定量检测不同组织的水稻样本中STV11L基因或STV11S基因的相对表达量

进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：

(1)获得样本

采集Lemont及Lemont背景下含有来自特青Stv-bⁱ抗病基因染色体片段的近等基因系 NIL39不同发育时期的幼苗(包括2周、3周、4周、5周大幼苗，对应标注为图5中的2w、3w、4w、5w Shoot)、叶片(包括拔节期叶片展开前1周、展开0天及展开1周后三个年龄段的叶片，对应标注为图5中的－1w、0d、1w Leaf blade)、叶鞘(包括拔节期叶片展开前1 周、展开0天及展开1周后三个年龄段的相应叶鞘，对应标注为图5中的－1w、0d、1w Leaf sheath)、穗(包括5厘米阶段的幼穗以及开花后3周大的老穗，对应标注为图5中的Y和O Panicle)、茎秆(包括拔节期倒一节幼茎和倒三节老茎，对应标注为图5中的Y和O Culm) 和根(包括2周大幼根和拔节期的老根，对应标注为图5中的Y和O Root)的样本，放入液氮保存。

(2)STV11L基因或STV11S基因的表达模式分析

采用Trizol试剂盒(Invitrogen Life Technologies公司的产品)提取步骤(1)中各样本的总RNA，采用反转录试剂盒(Toyobo公司产品)将该总RNA反转录出第一链cDNA，然后以该cDNA为模板，采用荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司产品)实时定量检测各样本中STV11L基因或STV11S基因的相对表达量(以Actin1基因作为内参基因)。鉴定STV11L基因的引物为5’-AGGCCGTCATCTACCTCA-3’和5’-ACATTCAGCACAAGGTTTCT-3’。鉴定STV11S 基因的引物为5’-GCCTCTCAGCTCGATCTAC-3’和5’-ACATTCAGCACAAGGTTTCT-3’。鉴定Actin1 基因的引物5’-CAGGCCGTCCTCTCTCTGTA-3’和5’-AAGGATAGCATGGGGGAGAG-3’。

各样本中STV11L基因的相对表达量见图5中A，各样本中STV11S基因的相对表达量见图5中B。

实验结果表明，在不同时期的组织中均能检测STV11L基因和STV11S基因表达，且这两个基因在老叶鞘中的相对表达量均较高，这一实验结果与条纹叶枯病毒因载体昆虫灰飞虱的取食习惯即首先大量侵染外层老叶鞘的表型完全一致。

实施例5、Stv-bⁱ基因同源基因的鉴定

以水稻Stv-bⁱ基因的cDNA序列为探针，在公共数据库(www.ncbi.nih.nlm.gov)上进行比对，比对结果显示在水稻的第12染色体上还有Stv-bⁱ基因的第三个同源基因 LOC_Os12g29350，其转录本STV11-pa2的核苷酸序列如序列表中序列6所示，表达序列表中序列8所示的蛋白质STV11-pa2。

通过cDNA扩增、测序及比对，得到如下结果：

核苷酸水平上，转录本STV11-pa2与转录本STV11L之间具有58.5％的序列一致性，转录本STV11-pa2与转录本STV11-pa1之间具有57.3％的序列一致性，转录本STV11L与转录本 STV11-pa1之间具有74％的序列一致性；氨基酸水平上，蛋白质STV11-pa2与蛋白质STV11L 之间具有50.2％的序列一致性，蛋白质STV11-pa2与蛋白质STV11-pa1之间具有48.5％的序列一致性，蛋白质STV11L与蛋白质STV11-pa1之间具有67.9％的序列一致性。

实施例6、组成性过表达STV11-pa1提高了水稻条纹叶枯病抗病性

实时定量PCR分析STV11-pa1基因的表达水平发现，在幼苗中STV11-pa1基因的表达处于极低的水平，近乎实时定量PCR的检测下限(图6中A)，这也解释了在实施例2中，通过转入STV11-pa1基因的全长基因组序列(即在对应转基因植株中，STV11-pa1转基因由其自身启动子驱动)并不能改变感病品种武育粳3号的条纹叶枯病抗病性。另一方面，氨基酸序列比对表明蛋白质STV11-pa1与蛋白质STV11L有较高的序列一致性，暗示蛋白质STV11-pa1与蛋白质STV11L可能存在功能上的保守性。为了进一步明确蛋白质STV11-pa1在条纹叶枯病抗病性上的功能，采用花椰菜花叶病毒的CaMV 35S启动子组成性高水平驱动STV11-pa1基因在武育粳3号中的表达以检测该蛋白的功能。

一、重组质粒和重组农杆菌的构建

1、重组质粒的构建

重组质粒500ox：以表达载体pCAMBIA2300为出发载体，在酶切位点插入如下表达盒：自上游至下游依次由CaMV 35S启动子、序列表中序列5所示的cDNA分子和polyA终止序列组成。重组质粒500ox在下文中简称500ox。

2、重组农杆菌的构建

将500ox导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/500ox。

将载体pCAMBIA2300-35S导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为 AGL1/pCAMBIA2300-35S，作为对照。

二、STV11-pa1过表达株系的获得

将武育粳3号种子脱壳灭菌，然后采用农杆菌侵染法(Liu,X.Q.,Bai,X.Q.,Wang,X.J. &Chu,C.C.2007.OsWRKY71,a rice transcription factor,is involved in ricedefense response.J.Plant Physiol.164,969-79)将AGL1/500ox转化武育粳3号，获得T₀代转基因株系。T₀代转基因水稻植株收种后，经G418筛选后播种，得到T₁代转基因水稻。T₁代转基因水稻收种后，再次经G418筛选后播种，得到T₂代转基因纯合水稻。分别取2个T₂代转基因水稻株系(500ox L1和500ox L2)行后续步骤三的实验。

按照上述方法，将AGL1/500ox替换为AGL1/pCAMBIA2300-35S，其它步骤均相同，得到T₂代转空载体水稻的纯合植株，以下简称转空载体水稻。

三、STV11-pa1过表达株系的鉴定

采用Trizol法分别提取生长至4周且叶片全展开的500ox L1和500ox L2的地上组织的总RNA，将该总RNA用逆转录酶反转录出第一链cDNA，简称为500ox L1的cDNA和500oxL2 的cDNA。

按照上述方法，将500ox L1替换为转空载体水稻，得到空载对照cDNA。

以上述cDNA为模板，实时定量检测STV11-pa1基因的相对表达量(以Actin1基因为内参)。

鉴定STV11-pa1基因的引物为5’-TCTGCCACTGGATTGACTA-3’和 5’-GGGTCCAATCTTGTCTATGA-3’。鉴定Actin1基因的引物为 5’-CAGGCCGTCCTCTCTCTGTA-3’和5’-AAGGATAGCATGGGGGAGAG-3’。

实验结果表明(图6中B)：将转空载体水稻中STV11L基因的表达量作为1，500ox L1和500ox L2中STV11L基因的表达量分别为1629和1756，武育粳3号和转空载体水稻中STV11-pa1基因的表达量无显著差异。

四、STV11-pa1过表达株系的条纹叶枯抗性鉴定

以武陵粳1号、转空载体水稻、武育粳3号、500ox L1和500ox L2为实验材料，鉴定水稻的条纹叶枯病抗性，鉴定方法同实施例2步骤四。

结果表明(图6中C和D)，在武育粳3号背景下过表达STV11-pa1基因能显著提高水稻的条纹叶枯病抗病性。由此证明蛋白质STV11-pa1同样可用于水稻条纹叶枯病的抗性改良。

Claims

1.蛋白质，为如下a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

a2）氨基酸序列是序列表中序列7所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下（b1）或（b2）或（b3）或（b4）：

（b1）核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

（b2）核苷酸序列是序列表中序列2自5′末端起第128至5260位所示的DNA分子；

（b3）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

（b4）核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为向表达载体或克隆载体插入权利要求2或3所述核酸分子得到的重组质粒。

7.含有权利要求2或3所述核酸分子重组微生物。

8.如权利要求7所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物为将权利要求5或6所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

9.d1）或d2）或d3）的应用：

d1）权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗病性中的应用；

d2）权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育抗病性提高或降低的转基因植物中的应用；

d3）权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备抗病性药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗病性为抗水稻条纹病毒引起的病害。

11.如权利要求9或10所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；所述双子叶植物为烟草、番茄、棉花、大豆和/或油菜。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为：水稻、大麦、小麦、燕麦、高粱和/或玉米。

14.一种培育转基因植物的方法，包括使权利要求1所述蛋白质在受体植物中表达或过表达、或提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗病性增强。

15.一种培育转基因植物的方法，包括抑制受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量或抑制受体植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗病性降低。

16.一种培育转基因植物的方法，包括将通过权利要求14或15所述的方法获得的转基因植物与待改良植物杂交，得到后代转基因植物的步骤；所述后代转基因植物与所述转基因植物具有相同的抗病性。

17.如权利要求14、15或16所述的方法，其特征在于：所述抗病性为抗水稻条纹病毒引起的病害。

18.如权利要求14、15或16所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；所述双子叶植物为烟草、番茄、棉花、大豆和/或油菜。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述禾本科植物为：水稻、大麦、小麦、燕麦、高粱和/或玉米。