ES2635188T3 - Evento de maíz 5307 - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de enlace del evento de maíz 5307 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID No: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, en donde dicha secuencia de enlace es diagnóstica para el evento de maíz 5307, y en donde la molécula de ácido nucleico está comprendida en una semilla de maíz depositada con el número de acceso ATCC: PTA-9561.

Description

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DESCRIPCIÓN DETALLADA
Esta invención se refiere a una línea de maíz genéticamente mejorada que produce la proteína de control de insectos, FR8a, y una enzima fosfomanosa isomerasa (PMI) que permite que la planta utilice manosa como fuente de carbono. La invención particularmente se refiere a un evento de maíz transgénico denominado 5307 que comprende un genotipo novedoso, así como también composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos de este evento en una muestra biológica. La invención se refiere además a plantas de maíz que comprenden el genotipo del evento 5307, a semillas transgénicas de las plantas de maíz. Las plantas de maíz que comprenden el genotipo del evento 5307 de la invención son útiles para controlar las plagas de insectos coleópteros incluidos Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de la raíz de maíz del oeste, D. virgifera zeae, el gusano de la raíz del maíz de México y D. longicornis barberi, el gusano de la raíz del maíz del norte. Las plantas de maíz que comprenden el genotipo del evento 5307 de la invención también son capaces de utilizar manosa como fuente de carbono.
En una realización, la invención abarca una semilla de maíz transgénica de una planta de evento de maíz 5307. Un ejemplo de dicha semilla se deposita con el número de acceso de ATCC: PTA-9561. La semilla transgénica del evento 5307 comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 y complementos de estas. Estas secuencias definen un punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada en el genoma de la planta de maíz del evento de maíz 5307. En otra realización, la invención abarca una molécula de ácido nucleico preferiblemente aislada que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En otra realización, la invención abarca una molécula de ácido nucleico preferiblemente aislada, en donde la molécula de ácido nucleico está comprendida en una semilla de maíz depositada con el número de acceso en ATCC PTA-9561.
En una realización, la invención abarca una molécula de ácido nucleico, preferiblemente aislada, que comprende al menos 10 o más (por ejemplo 15, 20, 25 ó 50) nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN heteróloga insertada en el genoma de una planta de maíz del evento de maíz 5307 y al menos 10 o más (por ejemplo 15, 20, 25 ó 50) nucleótidos contiguos de un ADN genómico de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada en el genoma de la planta de maíz del evento de maíz 5307. También se incluyen secuencias de nucleótidos que comprenden 10 o más nucleótidos de secuencia inserto contiguas del evento 5307 y al menos un nucleótido de ADN flanqueador del evento 5307 adyacente a la secuencia inserto. Tales secuencias de nucleótidos son diagnósticas para el evento 5307. La amplificación de ácido nucleico del ADN genómico del evento 5307 produce un amplicón que comprende tales secuencias de nucleótidos diagnósticas.
En otra realización, la invención abarca una molécula de ácido nucleico, preferiblemente aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia de enlace del evento 5307 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y complementos de estas, en donde la secuencia de enlace abarca el enlace entre un casete de expresión heterólogo insertado en el genoma de maíz y ADN del genoma de maíz que flanquea el sitio de inserción y es diagnóstica para el evento.
En otra realización, la invención abarca un ácido nucleico preferiblemente aislado que liga una molécula de ADN heteróloga con el genoma de la planta de maíz en el evento de maíz 5307 que comprende una secuencia de aproximadamente 11 a aproximadamente 20 nucleótidos contiguos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y complementos de estas.
En otra realización, la invención abarca una molécula de ácido nucleico, preferiblemente aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y complementos de estas.
En una realización de la invención, se proporciona un amplicón que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y complementos de estas.
En otra realización, la invención abarca cebadores de secuencia flanqueadora para detectar el evento 5307. Tales cebadores de secuencia flanqueadora comprenden una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1-1348 de la SEQ ID NO: 5 (denominada arbitrariamente en la presente la secuencia flanqueadora 5'), o los complementos de esta, también divulgada como SEQ ID NO: 111. En un aspecto de esta realización, los cebadores de secuencia flanqueadora se seleccionan del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8 a la SEQ ID NO: 14 y complementos de estas. Las secuencias flanqueadoras pueden extenderse para incluir las secuencias del cromosoma 5, con énfasis específico en el nucleótido comprendido en la SEQ ID NO: 103, útil para detectar secuencias asociadas con el evento de maíz 5307. En el contexto de la SEQ ID NO: 103, un “N” se define como cualquier base “A”, “T”, “G” o “C”. SEQ ID NO: 110 es el complemento inverso de esta secuencia. En el contexto de la SEQ ID NO: 110, un “N” se define como cualquier base “A”, “T”, “G” o “C”.
En otra realización, la invención abarca cebadores de secuencia flanqueadora que comprenden al menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1-1093 de la SEQ ID NO: 6 (denominada arbitrariamente en la presente la secuencia flanqueadora 3') o los complementos de esta. En un aspecto de esta realización, los cebadores de
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Las plantas de maíz de la invención puede caracterizarse adicionalmente por que al digerir el ADN genómico de la planta con las endonucleasas de restricción SmaI y PmeI se obtiene una banda de hibridación simple usando una sonda de longitud completa en condiciones de alta rigurosidad. En la presente se ejemplifica una sonda de longitud completa que comprende una secuencia de nucleótidos especificada en la SEQ ID NO: 7.
En una realización, la invención proporciona una planta de maíz, en donde el genotipo del evento 5307 confiere a la planta de maíz resistencia a insectos o la capacidad de utilizar manosa. En una aspecto de esta realización, el genotipo que confiere resistencia a insectos a las plantas de maíz comprende un gen FR8a. En otro aspecto de esta realización, el genotipo que confiere a las plantas de maíz la capacidad de utilizar manosa comprende un gen PMI.
En una realización, la invención proporciona una muestra biológica de una planta, tejido o semilla de evento de maíz 5307, en donde la muestra comprende una secuencia de nucleótidos que es, o es complementaria a, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, y en donde la secuencia es detectable en la muestra usando un método de amplificación de ácido nucleico o hibridación de ácido nucleico. Por consiguiente, la secuencia genética funciona como un medio de detección. En un aspecto de esta realización, la muestra se selecciona de harina de maíz, harina de maíz amarilla, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados en su totalidad o en parte de forma que contengan subproductos de maíz.
En otro aspecto, la especificación divulga un extracto derivado de una planta, tejido o semilla del evento de maíz 5307 que comprende una secuencia de nucleótidos que es, o es complementaria a, una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Un ejemplo de tal semilla está depositado en ATCC con el número de acceso PTA-9561. En un aspecto, la secuencia se detecta en el extracto usando un método de amplificación de ácido nucleico o hibridación de ácido nucleico. En otro aspecto, la muestra se selecciona de harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados en su totalidad o en parte de forma que contengan productos de maíz.
En otro aspecto más, la especificación divulga un método para producir una planta de maíz resistente a al menos la infestación del gusano de la raíz del maíz que comprende: (a) cruzar sexualmente una primera planta de maíz genitora con una segunda planta de maíz genitora, en donde dicha primera o segunda planta de maíz genitora comprende ADN del evento de maíz 5307, produciendo de este modo una pluralidad de plantas de progenie de primera generación; (b) seleccionar una primera planta de progenie de primera generación que es resistente a al menos la infestación del gusano de la raíz del maíz; (c) autofecundar la primera planta de progenie de primera generación, produciendo de este modo una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación; (d) y seleccionar de las plantas de progenie de segunda generación una planta que es al menos resistente a la infestación del gusano de la raíz del maíz; en donde las plantas de progenie de segunda generación comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
En otro aspecto, la especificación divulga un método para producir semillas de maíz híbridas que comprende: (a) plantar semillas de una primer línea de maíz endogámica que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, y semillas de una segunda línea de maíz endogámica que tiene un genotipo diferente; (b) cultivar las plantas de maíz resultantes de dicha plantación hasta el momento de floración; (c) emascular dichas flores de las plantas de maíz de una de las líneas de maíz endogámicas; (d) cruzar sexualmente las dos líneas endogámicas diferentes entre sí, y (e) cosechar las semillas híbridas producidas de este modo. En un aspecto, la primera línea de maíz endogámica proporciona los genitores femeninos. En otro aspecto, la primera línea de maíz endogámica proporciona los genitores masculinos. La especificación divulga además la semilla híbrida producida por el método incorporado y las plantas híbridas que crezcan a partir de la semilla.
En otro aspecto, la especificación divulga un método para seleccionar marcadores asociados con el evento de maíz 5307 que comprende: (a) someter a detección las secuencias del cromosoma 5 del evento de maíz 5307, (b) comparar estas secuencias con secuencias NP2222 no transgénicas, (c) comparar las secuencias a efectos de detectar variaciones secuenciales, (d) usar estas variaciones secuenciales como medio para desarrollar marcadores asociados con el evento de maíz 5307, (e) usar los marcadores para someter a detección líneas, y (f) detectar el marcador que confirma la presencia de secuencias del evento de maíz 5307 en el cromosoma 5.
Un experto en la técnica reconocerá que el genotipo transgénico de la invención puede introgresarse mediante reproducción en otras líneas de maíz que comprenden genotipos transgénicos diferentes. Por ejemplo, una línea de maíz endogámica que comprende el genotipo transgénico de la invención puede cruzarse con una línea de maíz endogámica que comprende el genotipo transgénico del evento Bt11 resistente a lepidópteros, que se conoce en la técnica, produciendo de esta forma semillas de maíz que comprenden el genotipo transgénico de la invención y el genotipo transgénico de Bt11. Algunos ejemplos de otros eventos transgénicos que pueden cruzarse con una línea endogámica de la invención incluyen los eventos GA21 y NK603 tolerantes al herbicida glifosato, el evento MON802 tolerante a glifosato/resistente a insectos lepidópteros, el evento DBT418 resistente a insectos lepidópteros, el evento DAS-06275-8 resistente a insectos lepidópteros, el evento MIR162 resistente a insectos lepidópteros, el evento MS3 de esterilidad masculina, el evento B16 tolerante a la fosfinotricina, el evento MON 80100 resistente a
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insectos lepidópteros, los eventos T14 y T25 tolerantes al herbicida fosfinotricina, el evento 176 resistente a insectos lepidópteros, el evento MIR604 resistente a insectos coleópteros y el evento MON863 resistente a insectos coleópteros, todos conocidos en la técnica. Se reconocerá adicionalmente que pueden hacerse otras combinaciones con el genotipo transgénico de la invención y por consiguiente estos ejemplos no deben tomarse como limitantes.
Un experto en la técnica también reconocerá que las semillas de maíz transgénicas que comprenden el genotipo transgénico de la invención pueden tratarse con varios compuestos químicos para el tratamiento de semillas, incluidos insecticidas, para aumentar o sinergizar la actividad insecticida de la proteína FR8a. Por ejemplo, la semilla de maíz transgénica de la invención puede tratarse con el insecticida comercial Cruiser®. Tal combinación puede usarse para aumentar el espectro de actividad y la eficacia de la proteína y el compuesto químico mencionados.
Reproducción
El genotipo transgénico de la invención puede introgresarse en cualquier línea de maíz endogámica o híbrida usando técnicas de reproducción reconocidas en la técnica. El objetivo de la reproducción vegetal es combinar en una única variedad o híbrido varios rasgos deseables. Para cultivos extensivos, estos rasgos pueden incluir resistencia a insectos y enfermedades, tolerancia a herbicidas, tolerancia al calor y la sequía, reducción del tiempo de maduración del cultivo, mayor rendimiento y mejor calidad agronómica. Con la cosecha mecánica de muchos cultivos es importante la uniformidad de las características vegetales tales como germinación y establecimiento de rodales, tasa de crecimiento, maduración y altura de planta y mazorca.
Los cultivos extensivos se reproducen a través de técnicas que aprovechan el método de polinización de la planta. Una planta se autopoliniza si el polen de una flor se transfiere a la misma o a otra flor de la misma planta. Una planta experimenta una polinización cruzada cuano el polen viene de una flor de una planta diferente.
Las plantas que se han autopolinizado y seleccionado por su tipo durante muchas generaciones se convierten en homocigotas en casi todos los loci genéticos y producen una población uniforme de progenie de reproducción verdadera. Un cruzamiento entre dos líneas homocigotas diferentes produce una población uniforme de plantas híbridas que pueden ser heterocigotas para muchos loci genéticos. Un cruzamiento de dos plantas, siendo cada una heterocigota en una cantidad de loci genéticos, producirá una población de plantas híbridas que difieren genéticamente y no será uniforme.
El maíz puede reproducirse mediante técnicas de autopolinización y polinización cruzada. El maíz tiene flores masculinas y femeninas separadas en la misma planta, ubicadas en la espiga y en la mazorca, respectivamente. La polinización natural ocurre en el maíz cuando el viento lleva el polen desde las espigas hasta los filamentos que sobresalen por la parte superior de las mazorcas.
Un método confiable para controlar la fertilidad masculina de las plantas ofrece la oportunidad de mejorar la reproducción vegetal. Esto es especialmente aplicable al desarrollo de híbridos de maíz, que depende de alguna clase de sistema de esterilidad masculina. Hay diversas opciones para controlar la fertilidad masculina disponibles para los criadores, tales como: emasculación manual o mecánica (o despenachado), esterilidad masculina citoplasmática, esterilidad masculina genética, gametocidas y similares.
La semilla de maíz híbrida se produce típicamente mediante un sistema de esterilidad masculina que incorpora el despenachado manual o mecánico. Se plantan franjas alternas de dos líneas de maíz endogámicas en un campo, y se retiran las espigas que contienen polen de una de las líneas endogámicas (femenina). Siempre que haya suficiente aislamiento de fuentes de polen de maíz externas, las mazorcas de la línea endogámica despenachada serán fertilizadas solamente por la otra línea endogámica (masculina), y la semilla resultante es por lo tanto híbrida y formará plantas híbridas.
El proceso de despenachado trabajoso y en ocasiones poco fiable puede evitarse usando uno de los muchos métodos para conferir esterilidad masculina genética en la técnica, cada uno con sus beneficios y desventajas. Estos métodos usan distintos enfoques tales como proporcionar a la planta un gen que codifica una sustancia citotóxica asociada con un promotor específico de tejido masculino o un sistema antisentido en el que se identifica un gen fundamental para la fertilidad y se inserta un antisentido para ese gen en la planta (ver: Fabinjanski, et al. EPO 89/3010153.8 publicación no. 329.308 y solicitud de PCT PCT/CA90/00037 publicada como WO 90/08828).
Desarrollo de líneas endogámicas de maíz
El uso de líneas endogámicas con esterilidad masculina es un factor en la producción de híbridos de maíz. Las técnicas de reproducción vegetal conocidas en la técnica y usadas en un programa de reproducción de plantas de maíz incluyen, a modo no taxativo, selección recurrente, retrocruzamiento, reproducción genealógica, selección mejorada por polimorfismo de longitud de restricción, selección y transformación asistida por marcador. El desarrollo de híbridos de maíz en un programa de reproducción de plantas de maíz requiere, en general, el desarrollo de líneas endogámicas homocigotas, el cruzamiento de estas líneas y la evaluación de los cruzamientos. Los métodos de reproducción genealógica y reproducción de selección recurrente se usan para desarrollar líneas endogámicas a partir de poblaciones reproductoras. Los programas de reproducción de plantas de maíz combinan los contextos genéticos de dos o más líneas endogámicas u otras varias fuentes de germoplasma en bancos de reproducción en
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los que se desarrollan nuevas líneas endogámicas mediante autofecundación y selección de fenotipos deseados. Las nuevas líneas endogámicas se cruzan con otras líneas endogámicas y los híbridos de estos cruzamientos se evalúan para determinar cuáles tienen potencial comercial. La reproducción vegetal y el desarrollo de híbridos, tal como se practican en un programa de reproducción de plantas, son procesos costosos y que requieren mucho tiempo.
La reproducción genealógica se inicia con el cruzamiento de dos genotipos, cada uno puede tener una o más características deseables que no tiene el otro o que complementan al otro. Si los dos genitores originales no proporcionan todas las características deseadas pueden incluirse otras fuentes en la población reproductora. En el método de genealogía las plantas superiores se autofecundan y se seleccionan en generaciones consecutivas. En las generaciones consecutivas la condición heterocigota da paso a líneas homogéneas como resultado de la autopolinización y la selección. Típicamente en el método de genealogía de reproducción de cinco o más generaciones se practica la autofecundación y selección: F1 • F2; F2 • F3; F3 F4; F4 F.5; etc.
La reproducción de selección recurrente, por ejemplo el retrocruzamiento, puede usarse para mejorar una línea endogámica y un híbrido que se crea usando dichas líneas endogámicas. El retrocruzamiento puede usarse para transferir un rasgo deseable específico de una línea endogámica o fuente a una línea endogámica que no tiene ese rasgo. Esto puede lograrse, por ejemplo, cruzando en primer lugar una línea endogámica superior (genitor recurrente) con una línea endogámica donante (genitor no recurrente), que porta el gen(es) apropiado para el rasgo en cuestión. La progenie de este cruzamiento luego se aparea con el genitor recurrente superior seguido de la selección en la progenie resultante para que el rasgo deseado se transfiera desde el genitor no recurrente. Después de cinco o más generaciones de retrocruzamiento con selección para el rasgo deseado, la progenie será homocigota para controlar en loci la característica que se transfiere, pero será similar al genitor superior esencialmente para todos los otros genes. A continuación, la última generación de retrocruzamiento se autofecunda para proporcionar una progenie de reproducción pura para el gen(es) que se transfirió. Un híbrido desarrollado a partir de líneas endogámicas que contienen el gen(es) transferido es esencialmente igual a un híbrido desarrollado a partir de las mismas líneas endogámicas sin el gen(es) transferido.
Las líneas endogámicas selectas, es decir, líneas endogámicas homocigotas de reproducción pura, también pueden usarse como materiales de partida para la reproducción o como poblaciones fuente para desarrollar otras líneas endogámicas. Estas líneas endogámicas derivadas de líneas endogámicas selectas pueden desarrollarse usando los métodos de reproducción de selección recurrente y reproducción genealógica descritos anteriormente. Por ejemplo, cuando se usa la reproducción por retrocruzamiento para crear estas líneas derivadas en un programa de reproducción de plantas de maíz, las líneas endogámicas selectas pueden usarse como una línea genitora o material de partida o población fuente y pueden servir como genitor donante o recurrente.
Desarrollo de híbridos de maíz
Un híbrido de maíz de cruzamiento simple resulta del cruzamiento de dos líneas endogámicas, cada una con un genotipo que complementa el genotipo de la otra. La progenie híbrida de la primera generación se denomina F1. En el desarrollo de híbridos comerciales en una programa de reproducción de plantas, solo se buscan las plantas híbridas F1. Los híbridos F1 preferidos son más vigorosos que sus genitores endogámicos. Este vigor híbrido, o heterosis, puede manifestarse en muchos rasgos poligénicos, incluidos el crecimiento vegetativo aumentado y el rendimiento aumentado.
El desarrollo de una híbrido de maíz en un programa de reproducción de plantas de maíz implica tres pasos: (1) la selección de plantas a partir de varios bancos de germoplasma para cruzamientos de reproducción iniciales; (2) la autofecundación de las plantas seleccionadas a partir de los cruzamientos de reproducción para que diversas generaciones produzcan una serie de líneas endogámicas, que, aunque diferentes entre sí, se reproducen de forma idéntica y son altamente uniformes; y (3) el cruzamiento de las líneas endogámicas seleccionadas con diferentes líneas endogámicas para producir la progenie híbrida (F1). Durante el proceso endogámico en el maíz, el vigor de las líneas disminuye. El vigor se restablece cuando dos líneas endogámicas diferentes se cruzan para producir la progenie híbrida (F1). Una consecuencia importante del carácter homocigótico y homogéneo de las líneas endogámicas es que el híbrido entre un par de líneas endogámicas definidas será siempre igual. Una vez que se han identificado las líneas endogámicas que proporcionan un híbrido superior, la semilla híbrida puede reproducirse indefinidamente siempre que la homogeneidad de las líneas endogámicas genitoras se mantenga. Gran parte del vigor híbrido exhibido por los híbridos F1 se pierde en la siguiente generación (F2). Por lo tanto, las semillas de los híbridos no se usan como material de plantación.
La producción de semillas híbridas requiere la eliminación o desactivación del polen producido por el genitor femenino. La eliminación o desactivación incompleta del polen proporciona el potencial para la autopolinización. Esta semilla autopolinizada involuntariamente puede cosecharse accidentalmente y envasarse con las semillas híbridas.
Una vez que se planta la semilla, es posible identificar y seleccionar estas plantas autopolinizadas. Estas plantas autopolinizadas serán genéticamente equivalentes a la línea endogámica femenina usada para producir el híbrido.
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2x TAQMAN Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) complementada con cebadores hasta una concentración final de 900 nM cada uno, sondas hasta una concentración final de 100 nM cada una y agua hasta un volumen final de 70 µL. Esta mezcla se distribuyó en tres repeticiones de 20 µL cada una en placas de amplificación de 96 pocillos y se selló con película de sellado térmico transparente ópticamente (Marsh Bio Products). Se ejecutó 5 PCR en el instrumento ABI Prism 7700 usando los siguientes parámetros de amplificación: 2 min a 50 °C y 10 min a 95 °C, seguido por 35 ciclos de 15 s a 95°C y 1 min a 60 °C.
Los resultados del análisis TAQMAN ostraron que el evento 5307 tenía una copia del gen FR8a y una copia del gen PMI.
Los siguientes son ejemplos de combinaciones adecuadas de secuencias cebador/sonda que se usaron:
10 Nombre de cebador Secuencia de cebador SEQ ID NO: FR8a-directo 5’-TACGAGAGCTGGGTGAACTTCA-3’ SEQ ID NO: 73 FR8a-inverso 5’-CGATCAGGTCCAGCACGG -3’ SEQ ID NO: 74 FR8a-sonda 5’-CCGCTACCGCCGCGAGATGA-3’ SEQ ID NO: 75
15 (etiqueta 5’ = FAM, etiqueta 3’ = TAMRA)
PMI-directo 5’-CCGGGTGAATCAGCGTTT-3’ SEQ ID NO: 76 PMI-inverso 5’-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3’ SEQ ID NO: 77 PMI-sonda 5’-TGCCGCCAACGAATCACCGG-3’ SEQ ID NO: 78
20 (etiqueta 5’ = FAM, etiqueta 3’ = TAMRA)
ZmADH-267 directo 5’-GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT-3’ SEQ ID NO: 79 ZmADH-337 inverso 5’-TCCAGCAATCCTTGCACCTT-3’ SEQ ID NO: 80 ZmADH-316 sonda 5’-TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA-3’ SEQ ID NO: 81
25 (etiqueta 5’ = TET, etiqueta 3’ = TAMRA) Los ensayos PM1271, MIC5307a y MIC5307b TAQMAN se diseñan como un ensayo específico de evento que cubre la secuencia de enlace 3’.
Los siguientes son ejemplos de combinaciones adecuadas de secuencias cebador/sonda que se usaron:
Nombre de cebador Secuencia de cebador SEQ ID NO: 30 PM1277-directo 5’-GCCGTATCCGCAATGTGTTA-3’ SEQ ID NO: 82 PM1277-inverso 5’-GGCCCAGGGAAGAGGGTATAT-3’ SEQ ID NO: 83 PM1277-sonda 5’-AAGTTGTCTAAGCGTCAAT-3’ SEQ ID NO: 84 (etiqueta 5’ = TET, etiqueta 3’ = TAMRA)
35 MIC5307a-directo 5’-TGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACC-3’SEQ ID NO: 82 MIC5307a-inverso 5’-TTTGCCAGTGGGCCCA-3’ SEQ ID NO: 83 MIC5307a-sonda 5’-ACAATATACCCTCTTCCCTGGGCCAGG-3’ SEQ ID NO: 84 (etiqueta 5’ = TET, etiqueta 3’ = TAMRA)
40 MIC5307b-directo 5’-GCCGTATCCGCAATGTGTTA-3’ SEQ ID NO: 82 MIC5307b-inverso 5’-AAGTTGTCTAAGCGTCAAT-3’ SEQ ID NO: 83 MIC5307b-sonda 5’-GGCCCAGGGAAGAGGGTATAT-3’ SEQ ID NO: 84 (etiqueta 5’ = TET, etiqueta 3’ = TAMRA)
45 Ejemplo 3. Detección del evento 5307 mediante transferencia Southern
El ADN genómico usado para el análisis Southern se aisló a partir de tejido de hojas combinado de diez plantas que representaban la sexta generación de retrocruzamiento (BC6) del evento 5307 usando esencialmente el método de Thomas et al. (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993). Todas las plantas usadas para aislamiento de ADN se analizaron individualmente usando PCR TAQMAN (tal como se describió en el Ejemplo 2) para confirmar la
50 presencia de una única copia del gen FR8a y del gen PMI. Para los testigos segregantes negativos, el ADN se aisló a partir de tejido de hojas combinado de cinco plantas que representaban la generación BC4 del evento 5307. Estas plantas segregantes negativas se analizaron individualmente usando PCR TAQMAN y los ensayos fueron negativos para la presencia del gen FR8a y del gen PMI, pero, como se esperaba, fueron positivos para el testigo interno de ensayo, el gen Adh endógeno de maíz.
55 El análisis Southern se llevó a cabo usando técnicas de biología molecular convencionales. El ADN genómico (7,5 μg) se digirió doblemente con las enzimas de restricción SmaI y PmeI, que tienen sitios de reconocimiento únicos dentro del inserto de ADN-T del evento 5307 del plásmido pSYN12274 (Figura 1). Este enfoque permite la determinación de la cantidad de copias de los elementos, correspondientes a la sonda específica usada para cada Southern, que se ha incorporado al evento 5307. Esto resultó en una banda de hibridación por copia del elemento
60 presente en el evento 5307. Esto resultó en una banda de hibridación por copia del elemento presente en el evento
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5307. Después de una electroforesis en gel de agarosa y transferencia alcalina a una membrana Nytran®, las hibridaciones se llevaron a cabo usando sondas generadas por PCR de longitud completa específicas para un elemento. La sonda de longitud completa usada en las transferencias Southern comprende las secuencias de nucleótidos especificadas en la SEQ ID NO: 7. La sonda se etiquetó con 32P a través de cebado aleatorio usando el sistema Rediprime™ II (Amersham Biosciences, Cat. No. RPN1633).
Se usaron las siguientes condiciones de hibridación de alta rigurosidad: se agregaron 1-2 millones cpm/ml a PerfectHyb (Sigma) complementado con 100 µg/ml de ADN Calf Thymus (Invitrogen) previamente entibiado hasta alcanzar 65 °C. La prehibridación se lleva a cabo en la misma solución indicada anteriormente, a la misma temperatura durante toda la noche o durante una hora al menos. La hibridación se llevó a cabo a 65 °C durante 3 horas seguida de lavado 2X en 2X SSC, 0,1% de SDS durante 20 minutos a 65 °C y 2X en 0,1X SSC, 0,1% de SDS durante 20 minutos a 65 oC.
En cada Southern se incluyeron tres muestras testigo: (1) ADN de un segregante negativo (no transformado) usado para identificar todas las secuencias endógenas de Zea mays que puedan sufrir hibridación cruzada con la sonda específica de elemento; (2) ADN de un segregante negativo en el que se introduce una cantidad de pSYN12274 digerido por SmaI-PmeI que es igual a una cantidad de una copia basada en la longitud de la sonda, para demostrar la sensibilidad del experimento para detectar una única copia de gen dentro del genoma de Zea mays; y (3) el plásmido pSYN12274 digerido por SmaI-PmeI que es igual a una cantidad de una copia basada en la longitud de la sonda, como un testigo positivo para la hibridación así como también para demostrar la sensibilidad del experimento.
Los datos de la hibridación proporcionan pruebas confirmatorias que respaldan el análisis PCR TAQMAN donde el evento 5307 contiene una única copia de los genes FR8a y PMI, y que el evento 5307 no contiene ninguna de las secuencias principales del vector presentes en pSYN12274. Tal como se esperaba para las sondas FR8a y PMI, la digestión con SmaI-PmeI resultó en una única banda de hibridación del tamaño correcto, lo que demostró que una única copia de cada gen está presente en el evento 5307. Adicionalmente, la falta de hibridación en la sonda principal demuestra la ausencia de cualquier secuencia principal de vector pSYN12274 incorporada al evento 5307 durante el proceso de transformación.
Ejemplo 4. Secuenciación de inserto de ADN-T
Se determinó la secuencia de nucleótidos de la totalidad del inserto de ADN transgén presente en el evento 5307 para demostrar la integridad general del inserto y la contigüidad de los elementos funcionales, y para detectar cualquier cambio individual en el par de bases. El inserto de evento 5307 se amplificó con PCR a partir de ADN derivado de la generación BC5 como dos fragmentos individuales superpuestos. Cada fragmento se amplificó usando un cebador de polinucleótidos homólogo a secuencias genómicas vegetales que flanquean el inserto de evento 5307 y un cebador de polinucleótidos homólogo al gen FR8a. Para generar un fragmento 5’, un primer cebador de polinucleótidos homólogo a la secuencia flanqueadora 5’, SEQ ID NO: 8 a la SEQ ID NO: 15, se combinó con un segundo cebador de polinucleótidos homólogo al ADN insertado dentro del gen FR8a, SEQ ID NO: 33 a la SEQ ID NO: 41, el promotor de ubiquitina, SEQ ID NO: 42 a la SEQ ID NO: 53 o el gen PMI, SEQ ID NO: 54 a la SEQ ID NO: 60. Para generar el fragmento 3’, un primer cebador de polinucleótidos homólogo a la secuencia flanqueadora 3’, SEQ ID NO: 69 a la SEQ ID NO: 72, se combinó con un segundo cebador de polinucleótidos homólogo al ADN insertado dentro del gen FR8a, SEQ ID NO: 9 a la SEQ ID NO: 17, el promotor de ubiquitina, SEQ ID NO: 18a la SEQ ID NO: 26 o el gen PMI, SEQ ID NO: 27 a la SEQ ID NO: 32.
La amplificación de PCR se llevó a cabo usando el sistema Expand High Fidelity PCR (Roche, Cat. No. 1732650) y los siguientes parámetros de amplificación: 2 min a 94 °C durante 1 ciclo, seguido por 10 ciclos de 15s a 94 °C, 30s a 55-65 °C y 5 min a 68 °C, seguidos por 20 ciclos de 15s a 94 °C, 30s a 55-65 °C y 5 min+5s/cic de 72 °C, seguidos por 1 ciclo de 7 min a 72 °C.
El amplicón resultante de la amplificación con PCR usando la SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 41 comprendía la secuencia de enlace 5’ (SEQ ID NO: 1). El amplicón resultante de la amplificación con PCR usando la SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 72 comprendía la secuencia de enlace 3’ (SEQ ID NO: 2). Cada fragmento de secuenciación se clonó individualmente en el vector pCR® -XL-TOPO (Invitrogen, Cat. No. K4700-20) y se identificaron y secuenciaron tres clones distintos para cada fragmento. La secuenciación se llevó a cabo usando el analizador ABI3730XL usando química ABI BigDye® 1.1 o Big Dye 3.1 dGTP (para plantillas ricas en GC). El análisis de secuencias se realizó usando el paquete Phred, Phrap y Consed de la Universidad de Washington y se llevó a cabo con una tasa de error menor a 1 en 10.000 bases (Ewing and Green, 1998). La secuencia consenso final se determinó al combinar los datos de secuencia de los seis clones individuales (tres para cada fragmento de secuenciación) para generar una secuencia consenso del inserto de evento 5307. Para validar adicionalmente cualquier discrepancia individual de par de bases entre el inserto de evento 5307 y el plásmido pSYN12274, se amplificaron pequeños (aproximadamente 300-500 bp) productos de PCR específicos para cualquier región donde se observó una discrepancia de par de bases en la secuencia consenso inicial usando la misma metodología mencionada anteriormente. Para todas las discrepancias de par de bases posibles en el inserto del evento 5307, la secuenciación del producto de PCR directa resultó en picos únicos claros en todos los pares de bases en cuestión, lo que indica que estas discrepancias probablemente están presentes en el inserto de evento 5307. El alineamiento se llevó a cabo usando el programa ClustalW con los siguientes parámetros: matriz de puntuación blosum55,
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Los extractos preparados tal como se describió anteriormente se analizaron cuantitativamente para FR8a mediante ELISA (Tijssen, 1985) usando anticuerpo anti-mCry3A monoclonal purificado por inmunoafinidad y anticuerpo anti-Cry1Ab policlonal purificado por inmunoafinidad. El límite inferior de cuantificación de ELISA de doble sándwich se estimó en función de la concentración más baja de proteína de referencia pura que se encuentra sobre la porción lineal de la curva estándar, el volumen máximo de un extracto testigo que podría analizarse sin interferencias de fondo y el peso correspondiente de la muestra que representaba la alícuota.
Los niveles cuantificables de la proteína FR8a se detectaron en todos los tejidos vegetales derivados del evento 5307. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como promedios de las cinco muestras de tejido repetidas. Los niveles de la muestra testigo estuvieron por debajo del límite de cuantificación para todos los tejidos.
En todas las fases de crecimiento, los niveles medios de FR8a medidos en hojas, raíces y polen variaron de aprox. 18 -29 µg/g p. fresco (77 -113 µg/g p. seco), aprox. 1,8 – 4,1 µg/g p. fresco (22 -41 µg/g p. seco) y aprox. <LOD – 0,15 µg/g p. fresco (<LOD – 0,15 µg/g p. seco) respectivamente. [límite de detección (LOD) = 0,08 µg/g p. fresco, 0,08 µg/g p. seco].
Los niveles de FR8a fueron generalmente similares entre los genotipos endogámico e híbrido para cada tipo de tejido en cada punto de evaluación.
Cuantificación de PMI
Los extractos preparados tal como se describió anteriormente se analizaron cuantitativamente para PMI mediante ELISA (Tjissen, 1985) usando anticuerpos de conejo policlonales purificados con proteína A y de cabra policlonales purificados por inmunoafinidad específicos para PMI. El límite inferior de cuantificación de ELISA de doble sándwich se estimó en función a la concentración más baja de proteína de referencia pura que se encuentra sobre la porción lineal de la curva estándar, el volumen máximo de un extracto testigo que podría analizarse sin interferencias de fondo y el peso correspondiente de la muestra que representaba la alícuota.
La proteína PMI se detectó en la mayoría de los tejidos vegetales derivados del evento 5307 analizados. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como promedios de las cinco muestras de tejido repetidas. Los niveles de la muestra testigo estuvieron por debajo del límite de cuantificación para todas las fases y tejidos.
En todas las fases vegetales, los niveles medios de PMI medidos en hojas, raíces y polen variaron de aprox. 0,4 a aprox. 0,6 µg/g p. fresco (1,5 -2,3 µg/g p. seco), aprox. 0,1 – 0,2 µg/g p. fresco (0,9 -1,5 µg/g p. seco) y aprox. 16,7
– 30,6 µg/g p. fresco (17,1 – 31,1 µg/g p. seco), respectivamente. [límite de detección (LOD) = 0,08 g/g p. fresco, 0,08 g/g p. seco].
Los niveles de PMI fueron generalmente similares entre los genotipos endogámico e híbrido para cada tipo de tejido en cada punto de evaluación.
Ejemplo 7. Eficacia de la aplicación del evento 5307
Gusano de la raíz del maíz del oeste y del norte
Se evaluó la eficacia de las plantas del evento 5307 contra el gusano de la raíz del maíz del oeste y del norte en 12 lugares de los Estados Unidos. El evento 5307 se evaluó con y sin la adición del tratamiento insecticida para semillas Crusier®. Los grupos testigo consistieron en semillas tratadas con dos tasas diferentes de Cruiser® y un testigo sin tratar. Los tratamientos consistieron en cuatro replicaciones de dos hileras de 17,5-20 pies separadas por 30” en el centro diseñadas en un bloque completo aleatorio. Se eligieron aleatoriamente diez plantas por tratamiento y se evaluaron según su eficacia usando una escala de 0-3 en donde 0 = sin daño por alimentación (calificación más baja que puede darse); 1 = un nudo (círculo de raíces), o el equivalente a un nudo entero, comidos hasta aproximadamente dos pulgadas del tallo (línea del suelo en el 7.º nudo); 2 = dos nudos completos comidos; 3 = tres
o más nudos comidos (calificación más alta que puede darse). El daño entre nudos completos comidos se indicó como el porcentaje del nudo faltante, es decir, 1,50 = 1 ½ nudos comidos, 0,25 = ¼ de un nudo comido.
La eficacia del evento 5307 se comparó con estándares de insecticidas granulares comerciales aplicados en surcos. El diseño experimental fue como el descrito anteriormente. Los resultados en la Tabla 2 demostraron que la eficacia del evento 5307 es comparable con los estándares comerciales en la protección de las plantas contra el daño por alimentación del gusano de la raíz del maíz.
Tabla 2. Comparación de la eficacia del evento 5307 con insecticidas comerciales aplicados en surcos. Tratamiento Calificación de daño de raíz (escala CRW 0-3) 5307 0,06 Force 3G 0,23
MIR604 0,13 Testigo sin tratar 2,05
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Gusano de la raíz del maíz de México
Las plantas del evento 5307 se evaluaron según su resistencia al gusano de la raíz del maíz de México en dos lugares de Texas. El diseño experimental fue esencialmente el mismo que se describe anteriormente.
Se evidenció una tasa de respuesta clara. Los resultados en la Tabla 3 demuestran que la eficacia del evento 5307 es comparable con los estándares comerciales en la protección de las plantas contra el daño por alimentación del gusano de la raíz del maíz de México.
Tabla 3. Eficacia del evento 5307 comparada con insecticidas comerciales aplicados en surcos contra el gusano de la raíz del maíz de México.
Tratamiento Calificación de daño de raíz (escala CRW 0-3) Evento 5307 0,025
Force 3G 0,084 MIR604 con Cruiser 0,104 Testigo sin tratar 0,710
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva indican el nivel de experiencia de los expertos en la técnica a quienes está dirigida esta invención.
Aunque la invención que antecede se ha descrito en detalle a modo de ilustración y ejemplo a efectos de claridad de comprensión, será obvio que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones.
Ejemplo 8. Uso del sitio de inserción del evento 5307 para integración dirigida en maíz.
Las secuencias que flanquean el evento 5307 divulgadas en la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 se usaron para explorar bases de datos de genomas de maíz. Se encontraron concordancias idénticas con ambas secuencias flanqueadoras en el clon BAC, ZMMBBc0077H14, del cromosoma 5 (Número de acceso de NCBI AC202955). Más específicamente, el inserto del evento 5307 se encuentra entre un marcador 5', denominado en la presente marcador molecular público umc1475 (SEQ ID No: 104), y un marcador 3', denominado en la presente marcador molecular público uaz190 (SEQ ID No: 107). Usando esta información, se determinó que el ADN heterólogo insertado en el evento 5307 desplazó 38 nucleótidos del ADN genómico del maíz, que se encuentran entre la secuencia flanqueadora 5' (corriente arriba de la secuencia eliminada) y la secuencia flanqueadora 3' (corriente abajo de la secuencia eliminada). Los cebadores útiles para identificar el marcador molecular uaz190 se especifican como SEQ ID NO: 108 y 109. Los cebadores útiles para identificar el marcador molecular umc1475 se especifican como SEQ ID NO: 105 y 106. Se desarrollaron marcadores adicionales a efectos de mapear correctamente el sitio de inserción. Estos marcadores se denominaron SM1108C, SM0584B, SM0377D y SM0501D. Los cebadores y las sondas útiles para detectar estos marcadores son los siguientes: SM1108C, SEQ ID NO: 91 a la SEQ ID NO: 93; SM0584B, SEQ ID NO: 94 a la SEQ ID: 96; SM0377D, SEQ ID NO: 97 a la SEQ ID NO: 99 y SM0501D, SEQ ID NO: 100 a la SEQ ID NO: 102.
El rendimiento agronómico consistente del transgén del evento 5307 durante varias generaciones en condiciones de campo sugiere que estas regiones identificadas alrededor del sitio de inserción del evento 5307 proporcionan buenas posiciones genómicas para la integración dirigida de otros genes transgénicos de interés. Tal integración dirigida supera los problemas con los llamados "efectos de posiciones" y el riesgo de crear una mutación en el genoma tras la integración del transgén en el huésped. Ventajas adicionales de tal integración dirigida incluyen, a modo no taxativo, reducción de una gran cantidad de eventos de transformación que deben someterse a detección y evaluarse antes de obtener una planta transgénica que exhibe el nivel deseado de expresión del transgén sin exhibir también anormalidades resultantes de la inserción involuntaria del transgén en un locus importante en el genoma huésped. Además, tal integración dirigida permite el apilamiento de transgenes que lleva a la reproducción de líneas vegetales selectas con ambos genes más eficientes.
Usando las enseñanzas descritas anteriormente, el experto es capaz de usar métodos conocidos en la técnica para dirigir transgenes al mismo sitio de inserción que en el evento 5307 o hasta un sitio próximo al sitio de inserción en 5307. Uno de estos métodos se describe en la Publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N.o 20060253918. Brevemente, se usan hasta 20 Kb de la secuencia genómica que flanquea 5' para el sitio de inserción (SEQ ID NO: 5) y hasta 20 Kb de la secuencia genómica que flanquea 3' para el sitio de inserción (SEQ ID NO: 6) para flanquear el gen o genes de interés que se pretenden insertar en una posición genómica en el cromosoma 5 a través de recombinación homóloga. Estas secuencias pueden flanquearse adicionalmente con repeticiones de borde de ADN-T tales como las secuencias repetidas de borde izquierdo (LB) y de borde derecho (RB) y otras secuencias de refuerzo para mejorar la eficiencia de administración de ADN-T. El gen o los genes de interés pueden colocarse exactamente en el sitio de inserción del evento 5307 o pueden colocarse en cualquier lugar dentro de las regiones de 20 Kb alrededor de los sitios de inserción del evento 5307 para conferir un nivel consistente de expresión del transgén sin efectos perjudiciales para la planta. Los vectores de ADN que contienen el gen o genes
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de interés y las secuencias flanqueadoras pueden administrarse en las células vegetales a través de uno de los diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, a modo no taxativo, la transformación mediada por Agrobacterium. La inserción del vector de ADN en el sitio objetivo del evento 5307 puede mejorarse adicionalmente mediante uno de los diversos métodos incluyendo, a modo no taxativo, la coexpresión o regulación hacia arriba de genes que mejoran la recombinación o la regulación hacia abajo de genes que suprimen la recombinación endógena. Adicionalmente, se conoce en la técnica que la escisión de secuencias específicas en el genoma puede usarse para aumentar la frecuencia de recombinación homóloga, por lo tanto la inserción en el sitio de inserción del evento 5307 y sus regiones flanqueadoras puede mejorarse mediante la expresión de endonucleasas específicas para secuencias naturales o diseñadas para escindir estas secuencias.
Un ejemplo de esta técnica se demuestra en Shukla et al. (Nature vol. 459, 21 de mayo de 2009). Este método usa nucleasas de dedos de zinc a efectos de dirigir secuencias heterólogas hasta un locus específico en función al uso de secuencias homólogas dentro de la planta objetivo. Un experto en la técnica podría usar el inserto del evento 5307 entre un marcador 5', denominado en la presente marcador molecular público umc1475 (SEQ ID No: 104), y un marcador 3', denominado en la presente marcador molecular público uaz190 (SEQ ID No: 107) para crear un locus para inserción dirigida.
Ejemplo 9. Uso del sitio de inserción y las secuencias flanqueadoras del evento 5307 para estabilización de la expresión génica.
Las secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción del evento 5307 también pueden usarse para estabilizar la expresión de otro(s) gen(es) de interés cuando se inserta(n) como un transgén en otras posiciones genómicas en el maíz y otros cultivos. Específicamente, se usan hasta 20 Kb de la secuencia genómica que flanquea 5' para el sitio de inserción (SEQ ID NO: 5) y hasta 20 Kb de la secuencia genómica que flanquea 3' para el sitio de inserción (SEQ ID NO: 6) para flanquear el gen o genes de interés que se pretenden insertar en el genoma de las plantas. Estas secuencias pueden flanquearse adicionalmente con repeticiones de borde de ADN-T tales como las secuencias repetidas de borde izquierdo (LB) y de borde derecho (RB) y otras secuencias de refuerzo para mejorar la eficiencia de administración de ADN-T. El gen o los genes de interés pueden colocarse exactamente como en el sitio de inserción del evento 5307 o pueden colocarse en cualquier lugar dentro de las regiones de 20 Kb alrededor de los sitios de inserción del evento 5307 para conferir un nivel consistente de expresión del transgén. Los vectores de ADN que contienen el gen o genes de interés y la secuencia flanqueadora del sitio de inserción del evento 5307 pueden administrarse en las células vegetales a través de uno de los diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, a modo no taxativo, transformación de protoplasto, bombardeo biolístico y transformación mediada por Agrobacterium. El ADN administrado puede integrarse aleatoriamente en un genoma vegetal o también puede estar presente como parte de las unidades genéticas segregantes independientemente tales como cromosoma o minicromosoma artificial. Los vectores de ADN que contienen el gen(es) de interés y las secuencias flanqueadoras de sitio de inserción del evento 5307 pueden administrarse en células vegetales. Por consiguiente, rodeando un gen o genes de interés con la secuencia genómica que flanquea el sitio de inserción del evento 5307, la expresión de dichos genes se estabiliza en una planta huésped transgénica tal como una planta dicotiledónea o una planta monocotiledónea como el maíz.
DEPÓSITO
Los solicitantes hicieron un depósito de semilla de maíz del evento 5307 descrito anteriormente el 15 de octubre de 2008 de acuerdo con el Tratado de Budapest en la American type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 con el número de acceso ATCC PTA-9561. El depósito se mantendrá en el depositario durante un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante el período de vigencia de la patente, el que sea más largo, y se reemplazará cuando sea necesario durante dicho período. Los solicitantes no impusieron restricciones sobre la disponibilidad del material depositado en la ATCC; sin embargo, los solicitantes no tienen autoridad para renunciar a ninguna restricción impuesta por la ley sobre la transferencia de material biológico o su transporte en el ámbito comercial.

Claims (1)

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ES09836807.9T 2008-12-16 2009-12-14 Evento de maíz 5307 Active ES2635188T3 (es)

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