BRPI0712392B1 - A nucleic acid moleculum of the mirror maize event, kit and methods for the detection of the same, amplicon, biological sample and extract derived from plants of the reference event, methods for production of a lepidopter pest resistant corn plant understanding the event mir162 and hybrid corn seeds, as well as insecticide protein, nucleic acid molecule, chemical gene, recombinant vector, and procasitic transgenic host cell - Google Patents
A nucleic acid moleculum of the mirror maize event, kit and methods for the detection of the same, amplicon, biological sample and extract derived from plants of the reference event, methods for production of a lepidopter pest resistant corn plant understanding the event mir162 and hybrid corn seeds, as well as insecticide protein, nucleic acid molecule, chemical gene, recombinant vector, and procasitic transgenic host cell Download PDFInfo
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Abstract
molécula de ácido nucléico isolada, amplicon, par de iniciadores de polinucleotídeos, método e kit para detecção, planta de milho transgênico, semente de milho, amostra biológica, extrato, método para produção de uma planta de milho resistente e de sementes de milho híbridas, semente híbrida, proteína inseticida isolada, vetor, célula hospedeira transgênica, sítio alvo, método para fazer uma planta transgênica de milho. um novo milho transgênico designado evento mir162 é exposto. a invenção relata os ácidos nucléicos que são únicos ao evento mir162 e os métodos para detectar a presença de evento mir162 baseados em sequências de dna dos recombinantes planejados inseridos dentro do genoma do milho que resultaram no enento mir162, e das sequências genômicas pareando o sítio de inserção. a invenção também se refere a plantas de milho abrangendo o genótipo transgênico do mir162 e aos métodos para produção de uma planta de milho pelo cruzamento com uma planta de milho contendo o genótipo mir162 com ela mesma ou com outra variedade de milho. sementes de plantas de milho contendo o genótipo mir162 também são objetos da presente invenção. a invenção também relata os métodos de controle de insetos usando as plantas de milho mir162.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO DO EVENTO DE MILHO MIR162, PAR DE INICIADORES, KIT E MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DA MESMA, AMPLICON, AMOSTRA BIOLÓGICA E EXTRATO DERIVADOS DE PLANTAS DO REFERIDO EVENTO, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO RESISTENTE A PESTES LEPIDÓPTERAS COMPREENDENDO O EVENTO MIR162 E SEMENTES DE MILHO HÍBRIDAS, BEM COMO PROTEÍNA INSETICIDA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, GENE QUIMÉRICO, VETOR RECOMBINANTE E CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA PROCARIÓTICA".
ANTECEDENTES A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, transformação de plantas, e reprodução de plantas. Mais especificamente, a invenção relaciona-se a plantas de milho transgênicas resistentes a insetos compreendendo um novo genótipo transgênico e a métodos de detecção da presença de ácidos nucléicos que são únicos às plantas de milho transgênicas em uma amostra e composições desta.
As pragas de plantas é um fator principal na perda de importantes colheitas agrícolas do mundo. Aproximadamente USD $8 bilhões são perdidos a cada ano somente nos EUA devido a infestações de pragas não-mamíferas incluindo insetos. Em adição às perdas na colheita do campo, as pragas de insetos são também um fardo para os cultivadores de frutas e vegetais, para os produtores de flores ornamentais e para os jardineiros caseiros.
Pragas de insetos são principalmente controladas pelas aplicações intensas de pesticidas químicos, que são ativos através da inibição do crescimento dos insetos, a prevenção da alimentação ou reprodução dos insetos, ou causam a morte. Desta forma um bom controle dos insetos pode ser alcançado, mas estes químicos algumas vezes podem também afetar outros insetos benéficos. Outro problema resultante do grande uso de pesticidas químicos é o aparecimento das variedades às quais resistem a insetos. Isto tem sido parcialmente suavizado pelas várias práticas de gerenciamento de resistência, mas há uma necessidade crescente por agentes alternativos de controle de pragas. Agentes de controle de pragas biológicas, tais como amostras de Bacillus thuringiensis (Bt) expressando toxinas pesticidas como δ-endotoxinas, também têm sido aplicados às culturas agrícolas de plantação com resultados satisfatórios, oferecendo uma alternativa ou complemento aos pesticidas químicos. A codificação de genes para algumas destas δ-endotoxinas foi isolada e suas expressões em hospedeiros heterólogos têm demonstrado que fornecem outra ferramenta para o controle de pragas de insetos economicamente importantes. Em particular, a expressão da Bt δ-endotoxinas tem fornecido proteção eficiente contra pragas de insetos selecionadas, e plantas transgêni-cas expressando tais toxinas têm sido comercializadas, permitindo que fazendeiros reduzam as aplicações de agentes químicos de controle de insetos.
Outra família de proteínas inseticidas produzidas por espécies de Bacillus durante o estágio vegetativo de crescimento (proteínas inseticidas vegetativas (Vip)) também foi identificada. As Patentes dos EUA - US 5,877,012, 6,107,279, e US 6,137,033, incorporadas neste pedido por referência, descrevem uma nova classe de proteínas inseticidas chamadas de Vip3. Outras descrições, incluindo o WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546, e WO 99/57282, também homólogos já identificaram a classe Vip3 de proteínas. As sequências de codificação da Vip3 codificam aproximadamente 88 proteínas kDa que possuem atividade inseticida contra um grande espectro de pragas de lepidópteros, incluindo, mas não limitado a, lagarta-rosca (BCW, Agro- tis ipsilon), lagarta-do-cartucho (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta-da-maçã-do-algodoeiro (TBW, Heliothis virescens), broca da cana-de-açúcar, (SCB, Diatraea saccharalis), lagarta elasmo (LCB, Elasmopal-pus lignosellus) e lagarta da espiga (CEW, Helicoverpa zea), e quando expressadas em plantas transgênicas, por exemplo milho (Zea mays), elas conferem proteção à planta contra os danos causados pela alimentação dos insetos.
Os atuais métodos de transformação das plantas geralmente levam à integração aleatória de transgênicos como vip3 dentro de um genoma de planta hospedeira. Esta inserção aleatória do DNA introduzido dentro do genoma da planta pode ser letal se o DNA estrangeiro for introduzido dentro de um gene nativo criticamente importante e desta forma causar a mutação do mesmo. Além disso, ainda se um evento de inserção aleatória não danificar o funcionamento de um gene da célula hospedeira, a expressão de um gene estrangeiro inserido pode ser influenciada por "efeitos de posição" causados pelo DNA ge-nômico ao redor. Em alguns casos, o gene é introduzido dentro dos sítios onde os efeitos de posição são fortes o suficiente para evitar a síntese de uma quantidade eficaz do produto do gene introduzido. Por exemplo, foi observado nas plantas que podem haver grandes variações nos níveis de expressão de um gene heterólogo introduzido dentro de um cromossomo da planta entre os eventos selecionados individualmente. Também pode haver diferenças nos padrões temporais ou espaciais da expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene nos vários tecidos das plantas, que podem não corresponder aos padrões esperados dos elementos regulatórios transcri-cionais presentes na construção do gene introduzido. Em outros exemplos, a produção exagerada do produto do gene possui efeitos danosos na célula. Devido a estes problemas potenciais, é comum a produção de centenas de eventos diferentes e fazer a filtragem daque- les eventos para um único evento que possui os padrões e níveis de expressão transgênica desejados para fins comerciais. Contudo, uma vez identificado um sítio viável comercialmente dentro do genoma da planta, seria vantajoso direcionar genes de interesse para aqueles sítios não prejudiciais.
Foram descritos diversos métodos para a inserção direcionada de uma sequência de nucleotídeos de interesse, num sítio de cromossomo específico, dentro de uma célula de planta. Sistemas de recombinação específicos do sítio foram identificados nos diversos organismos procarióticos e eucarióticos inferiores. Tais sistemas compreendem tipicamente uma ou mais proteínas que reconhecem duas cópias de uma sequência de nucleotídeos específicos, separam e ligam aquelas sequências de nucleotídeos, e desta forma fornecem uma troca de informações genéticas específicas do sítio numa forma precisa. Diversas recombinases específicas do sítio são conhecidas na técnica. Estas incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, o sistema de bacteriófagos P1 Cre/lox (Austin e outros (1981) Cell 25: 729-736), o sistema de recombinase R/RS do plasmídeo pSR1 do levedo Zygosaccharomyces rouxii (Araki e outros (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), o sistema Gin/gix do fago Mu (Maeser e Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176), o sistema de recombinase FLP/FRT do plasmídeo 2 .mu.m do levedo Saccharomyces cerevisiae (Broach e outros (1982) Cell 29: 227-234), e a recombinase Int do bacteriófago Lambda (Landy (1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 912-949; Landy (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 699-707; Lorbach e outros (2000) J. Mol. Biol. 296: 1175-1181; e WO 01/16345). Uma aproximação direcionada específica do sítio particularmente útil é revelada na publicação do pedido de Patente Norte-Americana sob número: US 2006/0130179, incorporada neste por referência, usa recombinação mediada pela integrase lambda. O método compreende a introdução, dentro de uma célula de planta de uma sequência de nucleotídeos direcionada compreendendo um primeiro sítio de reconhecimento Integra-se; introdução de dentro da célula da planta de uma sequência de nucleotídeos doadores compreendendo um segundo sítio de Reconhecimento Integrase; e a introdução dentro da célula da planta, uma Integrase ou de um complexo de Integrases. Outra aproximação direcionada específica do sítio útil está revelada na Publicação do pedido de Patente Americana sob o número sob US 2006/0253918, incorporada neste por referência, e usa recombinação homóloga para integrar um ou mais genes (piramidação de genes) em sítios específicos no genoma.
Um evento que possui níveis ou padrões desejados de expressão transgênica é útil para introduzir o transgene dentro de outros antecedentes genéticos pelo cruzamento sexual usando métodos de reprodução convencionais. A progenitura de tais cruzamentos mantém as características de expressão transgênica do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar uma expressão do gene confiável num número de variedades que são bem adaptadas para as condições de crescimento locais. Seria também uma vantagem de ser capaz de detectar a presença de um evento particular a fim de determinar se a progenitura de um cruzamento sexual contém um transgênico de interesse. Além disso, um método para detectar um evento particular seria útil para cumprir com os regulamentos que exigem a aprovação do pré-mercado e rotulação dos alimentos derivados das plantas de plantações recombinantes, por exemplo. É possível detectar a presença de um transgene por qualquer método de detecção do ácido nucléico bem conhecido incluindo, mas não limitado, a amplificação térmica (Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)) usando iniciadores de polinucleotídeos ao a hibridização do DNA usando sondas de ácido nucléico. Tipicamente, para o bem da simplicidade e uniformidade dos reagentes e metodologias para uso na detecção de uma construção de DNA específica que foi usada para transformar várias variedades de plantas, estes métodos de detecção geralmente focam nos elementos genéticos frequentemente usados, por exemplo, promotores, termina-dores, e genes marcadores, porque para muitas construções de DNA, a região da sequência de codificação é intercambiável. Como resultado, tais métodos podem não ser úteis para descriminar entre as construções que diferem somente com referência para as sequências de codificação. Além disso, tais métodos podem não ser úteis para discriminar entre diferentes eventos, particularmente aqueles produzidos usando a mesma construção de DNA a menos que a sequência cro-mossômica DNA adjacente ao DNA heterólogo inserido ("pareamento de DNA") seja conhecida.
Pelas razões mencionadas acima, há uma necessidade de eventos de milho transgênico resistente a insetos compreendendo sequências novas de ácido nucléico que são únicas ao evento de milho transgênico, úteis para identificar o evento de milho transgênico e para detectar ácidos nucléicos do evento de milho transgênico numa amostra biológica, bem como de kits compreendendo os reagentes necessários para o uso na detecção destes ácidos nucléicos numa amostra biológica. Ainda há uma outra necessidade em fornecer sítios alvos específicos dentro do genoma de milho para permitir o direcionamento e controle da inserção de sequências de nucleotídeos a serem integradas dentro do genoma do milho.
SUMÁRIO A presente invenção refere-se a um evento de milho transformado (Zea mays), designado MIR162 compreendendo um novo ge-nótipo transgênico que compreende uma sequência de codificação vip3Aa20, que é única para o evento MIR162. A sequência de codificação vip3Aa20 codifica uma proteína inseticida Vip3Aa20 que confere resistência aos insetos para as plantas de milho MIR162. O evento MIR162 também compreende uma sequência de codificação pmi codificando uma proteína PMI que confere nas células do milho a habilidade para utilizar manose como uma fonte de carbono. Em adição à sequência de codificação vip3A20, a presente invenção também fornece outros ácidos nucléicos que são únicos ao MIR162. A invenção também fornece plantas de milho transgênico compreendendo os ácidos nucléicos únicos ao MIR162, semente das plantas de milho transgênico, e métodos para produzir uma planta de milho transgênico compreendendo os ácidos nucléicos únicos da invenção pelo cruzamento de um milho reproduzido com si próprio compreendendo os ácidos nucléicos únicos para o MIR162 ou outra linhagem de milho de um genótipo diferente. Uma amostra da semente, e consequentemente plantas de milho cultivado da semente, compreendendo ácidos nucléicos únicos para o MIR162, foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) com número de acesso PTA-8166. As plantas do milho transgênico da invenção podem ter essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas correspondentes das plantas de milho não-transgênicos isogênicos em adição àquelas conferidas nas plantas de milho pelo novo genótipo da invenção. Amostras biológicas e extratos das plantas de milho MIR162, tecidos e sementes também são fornecidos pela presente invenção. A presente invenção também fornece composições e métodos para detectar a presença de ácidos nucléicos únicos para o MIR162 em amostras biológicas baseadas na sequência de DNA dos cassetes de expressão recombinante dentro do genoma do milho que resultou no evento MIR162, e das sequências genômicas pareando o sítio de inserção. A presente invenção também fornece um sítio alvo de inserção não-prejudicial num cromossomo do milho útil para introduzir genes de interesse para um local específico no cromossomo, e métodos de alterar um genoma de milho pela introdução de ácidos nucléicos heterólogos no sítio de inserção revelado ou na vizinhança do sítio de inserção revelado. O evento MIR162 pode ainda ser caracterizado pela análise dos níveis de expressão das proteínas Vip3Aa20 e PMI, bem como pelo teste do MIR162 para eficácia contra pragas de insetos lepidópteros. A presente invenção também fornece métodos de produzir plantas de milho transgênico resistentes a um espectro mais amplo de pragas de insetos pela piramidação da característica de resistência ao inseto Vip3Aa20 com características de resistência ao inseto diferente do Vip3Aa20.
Estes e outros aspectos da invenção ficarão mais aparentes a partir da descrição detalhada a seguir.
DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 é a sequência de codificação Vip3Aa20 no M1R162. SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácido Vip3Aa20. SEQ ID NO: 3 é a sequência de plasmídeo pNOV1300. SEQ ID Nos: 4-12 são iniciadores e sondas úteis num ensaio TAQMAN. SEQ ID NO: 13 é a sequência de uma sonda vip3Aa20. SEQ ID NO: 14 é a sequência de uma sonda pmi. SEQ ID Nos: 15-37 são iniciadores úteis na presente invenção. SEQ ID No: 38 é a sequência de um amplicon vip3Aa20. SEQ ID Nos: 39-40 são iniciadores úteis na presente invenção. SEQ ID No: 41 é a sequência de um amplicon CJ134/179 5'. SEQ ID Nos: 42-43 são iniciadores úteis na presente invenção. SEQ ID NO: 44 é um amplicon vip3Aa20 3'. SEQ ID NO: 45 é a junção de inserção do genoma 5'. SEQ ID NO: 46 é a sequência flanqueadora do genoma do milho 5’ para inserção. SEQ ID NO: 47 é a junção de inserção do genoma 3'. SEQ ID NO: 48 é a sequência flanqueadora do genoma do milho 3' para inserção. SEQ ID NO: 49 é a inserção do MIR162 e sequências flan- queadoras. SEQ ID Nos. 50-54 são inicíadores úteis na presente invenção. SEQ ID NO: 55 é uma amplicon 5' PCR. SEQ ID Nos. 56-58 são inicíadores úteis na presente invenção. SEQ ID NO: 59 é uma amplicon 3' PCR. SEQ ID Nos. 60-105 são inicíadores úteis na presente invenção. SEQ ID NO: 106 é a sequência da região do cromossomo do milho 5 compreendendo o local alvo do cromossomo revelado. SEQ ID NO: 107 é a sequência genômica do milho que foi deslocada pela inserção do DNA heterólogo no MIR162.
DESCRIÇÃO DETALHADA
As seguintes definições e métodos a seguir são fornecidos para definir melhor a presente Invenção e para guiar aqueles com habilidades comuns na técnica na prática da presente invenção. A menos que seja observado de outra forma, os termos usados neste documento devem ser entendidos conforme o uso convencional para aqueles com habilidades comuns na técnica em questão. As definições dos termos comuns da biologia molecular também podem ser encontradas no Rieger et aí., Glossário de Genética: Clássica e Molecular, 5a edição, Springer-Verlag: New York, 1994. A nomenclatura das bases do DNA e dos aminoácidos conforme disposto no 37 C.F.R. § 1.822 é usada neste documento.
Como usado neste documento, o termo "amplificado" significa a construção de cópias múltiplas de uma molécula de ácido nu-cléico ou cópias múltiplas complementares à molécula de ácido nucléi-co usando pelo menos uma das moléculas de ácido nucléico como um padrão. Sistemas de amplificação incluem, mas não estão limitados ao sistema de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sistema da reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação baseada em sequência de ácido nucléico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontário), sistemas de Q-Beta Replicase, sistema de amplificação baseada na transcrição (TAS), e amplificação pelo deslocamento da fita (SDA). Ver, por exem pI o:Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, D. H. Persing, e outros, Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). O produto da amplificação é descrito como um amplicon.
Uma "sequência de codificação" é uma sequência de ácido nucléico que é transcrita dentro do RNA tal como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, "sentido" RNA ou "antissentido" RNA. Preferencialmente o RNA é então traduzido num organismo para produzir uma proteína.
Conforme usado neste, o termo milho significa Zea mays ou milho e inclui todas as variedades de plantas que podem ser reproduzidas com milho, incluindo espécies selvagens de milho. "Kit de Detecção" conforme usado neste refere-se a um kit de partes úteis na detecção da presença ou ausência do DNA único para plantas MIR162 numa amostra, onde o kit compreende sondas de ácido nucléico e/ou iniciadores da presente invenção, que formam híbridos especificamente sob condições de alto rigor para uma sequência alvo de DNA, e outros materiais necessários para possibilitar métodos de amplificação ou hibridização do ácido nucléico.
Conforme usado neste o termo "evento" transgênico refere- se a uma planta recombinante produzida pela transformação e regeneração de um tecido ou célula da planta com DNA heterólogo, por exemplo, um cassete de expressão que inclui um gene de interesse. O termo "evento" refere-se ao transformante original e/ou progenitura do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também refere-se à progenitura produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra linhagem de milho. Ainda depois do retrocruza-mento repetido para um parente recorrente, o DNA introduzido e o flanqueador DNA dos parentes transformados estão presentes na progenitura do cruzamento no mesmo local do cromossomo. O termo "evento" também refere-se ao DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e a sequência genômica flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido que esperar-se-ia ser transferido para uma progenitura que recebe o DNA inserido incluindo o transge-ne de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem progenitora que inclui o DNA inserido (por exemplo: o transformante original e a progenitura resultante da autofecundação) e uma linhagem progenitora que não contém o DNA inserido. Normalmente, a transformação do tecido da planta produz múltiplos eventos, cada um representa a inserção de uma construção de DNA dentro de uma localização diferente no genoma de uma célula de planta. Baseado na expressão do transgene ou outras características desejáveis, um evento particular é selecionado. Desta forma, "evento MIR162" ou "evento MIR162" podem ser usados intercambiavelmente.
Uma planta do milho MIR162 resistente aos insetos pode ser reproduzida primeiramente pelo cruzamento sexual de uma primeira planta de milho progenitora consistindo em uma planta de milho cultivada a partir de uma planta de milho MIR162 transgênico, tal como uma planta de milho MIR162 cultivada a partir da semente depositada no ATCC sob número de acesso: PTA-6188, e progenitura desta deri- vada da transformação com o cassete de expressão dos meios de execução da presente invenção que conferem resistência aos insetos, com uma segunda planta de milho progenitora que falta resistência aos insetos, desta forma produzindo uma pluralidade de primeiras plantas da progenitura; e depois pela seleção de uma primeira planta da progenitura que é resistente aos insetos; e autofecundação da primeira planta da progenitura, desta forma produzindo uma pluralidade de segunda planta da progenitura; e finalmente pela seleção das segundas plantas da progenitura uma planta resistente a insetos. Estas etapas podem ainda incluir o retrocruzamento da primeira planta da progenitura resistente a insetos ou a segunda planta da progenitura resistente a insetos com a segunda planta de milho progenitora ou uma terceira planta de milho progenitora, desta forma produzindo uma planta de milho que seja resistente aos insetos. "Cassete de Expressão " conforme usado neste documento significa uma molécula de ácido nucléico capaz de direcionar a expressão de uma sequência de nucleotídeos específicos numa célula hospedeira apropriada, compreendendo um promotor ligado opera-velmente à sequência de nucleotídeos de interesse que é ligada ope-ravelmente aos sinais de terminação. Isto também compreende tipicamente sequências necessárias para tradução apropriada da sequência de nucleotídeos. O cassete de expressão também pode compreender sequências não necessárias na expressão direta de uma sequência de nucleotídeos de interesse, mas que estão presentes devido aos sítios de restrição convenientes para remoção do cassete de um vetor de expressão. O cassete de expressão compreendendo a sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um dos seus componentes é heterólogo com relação a pelo menos um dos seus outros componentes. O cassete de expressão também pode ser um que esteja naturalmente ocorrendo mas que foi obtido numa forma recombinante útil para a expressão heteróloga. Tipicamente, contudo, a expressão cassete é heterólogo com relação ao hospedeiro, isto é, a sequência de ácido nucléico particular do cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula do hospedeiro e deve ser introduzida dentro da célula do hospedeiro ou um antepassado da célula hospedeira por um processo de transformação conhecido na técnica. A expressão da sequência de nucleotídeo no cassete de expressão pode ser sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível que inicia a transcrição somente quando a célula hospedeira é exposta a alguns estímulos externos particulares. No caso de um organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor também pode ser específico para um tecido em particular, ou órgão, ou estágio de desenvolvimento. Um cassete de expressão, ou fragmento deste, também pode ser referido como "sequência inserida" ou "sequência de inserção" quando transformada numa planta.
Um "gene" é uma região definida que está localizada dentro de um genoma e que, apesar da sequência de codificação mencionada acima, pode compreender outras, primariamente regulatória, sequências de ácido nucléico responsáveis para o controle da expressão, que quer dizer a transcrição e tradução, da porção de codificação. Um gene também pode conter outras sequências não traduzidas 5' e 3' e sequências de terminação. Outros elementos que podem estar presentes são, por exemplo, íntrons. "Gene de interesse" refere-se a qualquer gene que, quando transferido para uma planta, confere na planta uma característica desejada como resistência a antibióticos, resistência a vírus, resistência a insetos, resistência a doenças, ou resistência a outras pragas, tolerância a herbicidas, valor nutricional melhorado, melhora do desempenho num processo industrial ou capacidade reprodutiva alterada. "Genótipo" conforme usado neste documento é o material genético herdado das plantas do milho de origem, nem todas que são necessariamente expressadas nas plantas de milho descendentes. O genótipo MIR162 refere-se ao material genético heterólogo transformado dentro do genoma de uma planta bem como o material genético flanqueando a sequência inserida.
Uma sequência de ácido nucléico "heteróloga" é uma sequência de ácido nucléico não naturalmente associada com uma célula hospedeira na qual esta é introduzida, incluindo a ocorrência não natural de cópias múltiplas de uma sequência de ácido nucléico Uma sequência de ácido nucléico "homóloga" é uma sequência de ácido nucléico naturalmente associada com uma célula hospedeira na qual esta é introduzida. "Operavelmente-ligada" refere-se à associação das sequências de ácido nucléico num fragmento de ácido nucléico único para que a função de uma afete a função da outra. Por exemplo, um promotor é operavelmente - ligado com uma sequência de codificação ou RN A funcional quando este é capaz de afetar a expressão da sequência de codificação ou RNA funcional (isto é, quando a sequência de codificação ou RNA funcional está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação em orientação de senso ou antisenso podem ser operavelmente-ligadas às sequências regulató-rias. "Iniciadores" conforme usados neste documento são ácidos nucléicos isolados que são fortalecidos para uma fita de DNA alvo complementar pela hibridização do ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, e então estendido ao longo da fita de DNA alvo por uma polimerase, tal como polimerase de DNA. Pares ou conjuntos de iniciadores podem ser usados para amplificação de uma molécula de ácido nucléico, por exemplo, pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação do ácido nucléico.
Uma "sonda" é um ácido nucléico isolado ao qual é ligado um rótulo detectável convencional ou molécula repórter, tal como um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente ou enzima. Tal sonda é complementar a uma fita de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção, para uma fita de DNA genômico do milho evento MIR162. O DNA do MIR162 pode ser de uma planta de milho ou de uma amostra que inclui DNA do MIR162. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente ácidos ribonucléicos ou deso-xirribonucléico, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se unem especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.
Iniciadores e sondas são geralmente entre 10 e 15 nucleo-tídeos ou mais em comprimento. Iniciadores e sondas também podem ser pelo menos 20 nucleotídeos ou mais em comprimento, ou pelo menos 25 nucleotídeos ou mais, ou pelo menos 30 nucleotídeos ou mais em comprimento. Tais iniciadores e sondas hibridizam especificamente para uma sequência alvo sob condições de hibridização de alto rigor. Iniciadores e sondas de acordo com a presente invenção podem ter sequência completa complementar com a sequência alvo, embora as sondas diferem da sequência alvo e que retêm a habilidade para hibridizar as sequências alvo podem ser projetadas por métodos convencionais.
Conforme usado neste documento "piramidação" (empi-Ihamento) do gene ou de característica combina características desejadas dentro de uma linhagem transgênica. Reprodutores de plantas empilham características transgênicas ao fazer cruzamentos entre parentes que cada um têm uma característica desejada e então identifica a descendência que ambas têm destas características desejadas. Outra forma de empilhar genes é pela transferência de dois ou mais ge- nes dentro do núcleo da célula de uma planta ao mesmo tempo durante a transformação. Outra forma de empilhar genes é pela retransfor-mação de uma planta transgênica com outro gene de interesse. Por exemplo, empilhamento de gene pode ser usado para combinar duas características de resistência a insetos diferentes, uma característica resiste a insetos e uma característica resiste a doenças, ou uma característica de resistência a herbicida. O uso de um marcador selecioná-vel além de um gene de interesse também seria considerado empilhamento de gene. "Condições de rigor" ou "condições de hibridização rigorosas" incluem referências a condições sob as quais uma sonda irá hi-bridizar para sua sequência alvo, para um grau maior detectável do que para outras sequências. Condições de rigor são dependentes da sequência alvo e irão diferir dependendo da estrutura do polinucleotí-deo. Pelo controle do rigor da hibridização e/ou condições de lavagem, as sequências alvo que serão 100% complementares à sonda (sonda homóloga) podem ser identificadas. Alternativamente, condições rigorosas podem ser ajustadas para permitir alguma inadequação nas sequências de forma que graus mais baixos de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extensivo para a hibridização dos ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) La-boratory Techniques ín Biochemistry and Molecular Biology-Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 OverView of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid sonda assays", Elsevier: New York; e Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel e outros, Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience: New York (1995), e também Sambrook e outros (2001) Molecular Cloning: A La-boratory Manual (5a Ed, Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Especificidade é tipicamente a função das lavagens pós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Geralmente, hibridização de alta resistência e condições de lavagem são selecionadas a estarem aproximadamente a 5°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica numa força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência alvo hibri-diza para uma sonda perfeitamente compatível. Tipicamente, sob condições de alto rigor uma sonda irá hibridizar para sua sequência alvo, mas não para outras sequências.
Um exemplo de condições de hibridização de alto rigor para a hibridização dos ácidos nucléicos complementares que possuem mais de 100 resíduos complementares num filtro em "Southern Blot" ou "Northern Blot" é 50% formamida com 1 mg de heparina a 42°C, a hibridização sendo executada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem de rigor muito alta é 0,15M NaCI a 72°C por aproximadamente 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem de rigor alto é uma lavagem 0,2x SSC a 65°C por 15 minutos (ver, Sam-brook, infra, para uma descrição do buffer SSC).
Um bom exemplo de condições de hibridização para a presente invenção incluem hibridização em 7% SDS, 0,25 M NaP04 pH 7,2 a 67°C durante a noite, seguida por duas lavagens em 5% SDS, 0,20 M NaP04 pH 7,2 a 65°C por 30 minutos em cada lavagem, e duas lavagens em 1% SDS, 0,20 M NaP04 pH 7,2 a 65°C por 30 minutos em cada lavagem. Um bom exemplo de lavagem de rigor médio para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45°C por 15 minutos. Um bom exemplo de lavagem de rigor baixo para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40°C por 15 minutos.
Para sondas de aproximadamente 10 a 50 nucleotídeos, condições de alto rigor tipicamente envolvem concentrações de sal de menos de aproximadamente 1,0 M Na íon, tipicamente concentrações de aproximadamente 0,01 a 1,0 M Na íons (ou outros sais) num pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente de pelo menos de aproximadamente 30°C. Condições de alto rigor também podem ser alcançadas com a adição de agentes destabilizantes como a formamida. Geralmente, um sinal para taxa de ruído de 2x (ou superior) do que o observado para uma sonda não relacionada no ensaio específico de hibridi-zação indica a detecção de uma hibridização específica. Ácidos nu-cléicos que não hibridizam entre si sob condições de alto rigor são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificarem forem substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando a máxima degenera-ção do códon permitida pelo código genético. A seguir alguns bons exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usadas para hibridizar as sequências de nucleotídeos que são substancialmente idênticas às sequências de nucleotídeos de referência da presente invenção: uma sequência de nucleotídeos de referência preferencial mente hibridiza para a sequência de nucleotídeos de referência em 7% de Dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50*0 com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50Ό, mais preferencial mente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50*0 com lavagem em 1X SSC, 0,1% SDS a 5013, mais preferenci almente ainda em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04,1 mM EDTA a 5013 com lavagem em 0,5X SSC, 0,1% SDS a 5013, pref erencialmen-te em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50Ό com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 50° C, mais preferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPQ4, 1 mM EDTA a 50Ό com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SD S a 65*0. As sequências da presente invenção podem ser detectadas usando todas as condições acima. Para fins de definir a invenção, são usadas as condições de alto rigor. "Transformação" é um processo para a introdução do ácido nucléico heterólogo dentro de uma célula hospedeira ou organismo. Particularmente, "transformação" significa a integração estável de uma molécula de DNA dentro do genoma de um organismo de interesse. "Transformado / transgênico / recombinante" refere-se a um organismo hospedeiro como uma bactéria ou uma planta no qual uma molécula de ácido nucléico heteróloga foi introduzida. A molécula de ácido nucléico pode ser estavelmente integrada dentro do genoma do hospedeiro ou a molécula de ácido nucléico também pode estar presente como uma molécula extracromossômica. Tal molécula extracro-mossômica pode ser auto-replicadora. Células transformadas, tecidos ou plantas são entendidas para conter não somente o produto final de um processo de transformação, mas também a progenitura transgêni-ca deste. Um hospedeiro "não-transformado", "não-transgênico", ou "não-recombinante" refere-se a um organismo do tipo selvagem, por exemplo, uma bactéria ou planta, que não contém a molécula de ácido nucléico heteróloga. Como usado neste documento, "transgênico" re-fere-se a uma planta, célula de planta, ou grande quantidade de células de planta estruturadas ou não-estruturadas tendo integrado, através de técnicas bem conhecidas de manipulação genética e inserção de genes, uma sequência de ácidos nucléicos representando um gene de interesse dentro do genoma da planta, e tipicamente dentro de um cromossomo de um núcleo da célula, mitocôndria ou outra organela contendo cromossomos, num local diferente, ou num número de cópias maior que, daquele normalmente presente na planta nativa ou célula da planta. Plantas transgênicas resultam da manipulação e inserção de tais sequências de ácido nucléico, ao contrário das mutações que ocorrem naturalmente, para produzir uma planta que ocorre de forma não natural ou uma planta com um genótipo que ocorre de forma não natural. Técnicas para a transformação das plantas e células das plantas são bem conhecidas no estado da técnica e podem compreender, por exemplo, eletroporação, microinjeção, transformação mediada por Agrobactéria, e transformação balística.
Conforme usado neste documento, o termo "único" para MIR162 significa características distintivas de MIR162. Desta forma, ácidos nucléicos únicos para o evento MIR162 não são encontrados em outras plantas de milho que não sejam MIR162. A classe "Vip3" de proteínas compreende, por exemplo, Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ac, Vip3Ad, Vip3Ae, VipAf, Vip3Ag, Vip3Ba, e Vip3Bb, e seus homólogos. "Homólogo" significa que a proteína indicada ou polipeptídeo sustentam uma relação definida para outros membros da classe Vip3 de proteínas. "Vip3Aa20" é um homólogo Vip3 único para o evento MIR162. Foi gerado por mutações espontâneas introduzidas dentro do gene vip3Aa19 otimizado para milho contido no pNOV1300 (SEQ ID NO: 3) durante o processo de transformação da planta.
Esta invenção refere-se a uma linhagem geneticamente melhorada de milho que produz uma proteína de controle de insetos, Vip3Aa20, e a uma enzima fosfomanose-isomerase (PMI) que permite que a planta utilize a manose como uma fonte de carbono. A invenção é particularmente projetada para um evento de milho transgênico designado MIR162 compreendendo um novo genótipo, bem como para composições e métodos para detectar ácidos nucléicos únicos ao MIR162 numa amostra biológica. A invenção é ainda projetada para plantas de milho compreendendo o genótipo MIR162, para sementes transgênicas das plantas de milho, e para métodos para produzir uma planta de milho compreendendo o genótipo MIR162 pelo cruzamento de um milho cruzado com si mesmo compreendendo o genótipo MIR162 ou outra linhagem de milho. Plantas de milho compreendendo o genótipo MIR162 da invenção são úteis no controle de pragas de insetos lepidópteros incluindo, mas não limitado a, lagarta-rosca (BCW, Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho (FAW, Spodoptera frugi-perda), lagarta-da-maçã-do-algodoeiro (TBW, Heliothis virescens), broca da cana-de-açúcar, (SCB, Diatraea saccharalis), lagarta elasmo (LCB, Elasmopalpus lignosellus), e lagarta da espiga (CEW, Helico-verpa zea), e larva do feijão ocidental (WBCW, Striacosta albicosta). A invenção é ainda projetada para um método de proteger o milho trans-gênico do dano causado pela alimentação dos insetos, pelo qual o empilhamento do traço de resistência do inseto do MIR162 com uma característica diferente de resistência ao inseto na mesma planta transgênica uma planta de milho que é protegida do dano causado pela alimentação dos insetos para um grau maior que as características de resistência do inseto por si só.
Numa modalidade, a presente invenção abrange uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é única ao evento MIR162.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba uma molécula de ácido nucléico isolada que liga uma molécula de DNA he-teróloga introduzida dentro do genoma do MIR162 para o genoma do DNA no MIR162 compreendendo pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, 50 ou mais) nucleotídeos contíguos da molécula do DNA heteróloga e pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, 50, ou mais) nucleotídeos contíguos do DNA do genoma flanqueando o ponto de inserção da molécula do DNA heteróloga. Estão também incluídas as sequências de nucleotídeos que compreendem 10 ou mais nucleotídeos da sequência de inserção contígua do evento MIR162 e pelo menos um nucleotídeo do DNA flanqueador do evento MIR162 adjacente à sequência de inserção. Tais sequências de nucleotídeos são únicas, e diagnosticar o evento MIR162. A hibridização ou amplificação do ácido nucléico do DNA genômico do MIR162 produz um ampli-con compreendendo tais sequências únicas permite diagnosticar para o evento MIR162. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas.
Em outra modalidade, a invenção engloba uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma sequência de junção do evento MIR162, na qual uma sequência de junção transpõe a junção entre um cassete de expressão heteróloga inserido dentro do genoma do milho e o DNA do genoma do milho pareando o local de inserção e é diagnosticado para o evento. Num aspecto desta modalidade, a sequência de junção é selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, e os complemento desta.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba uma molécula de ácido nucléico isolada unindo uma molécula de DNA heteróloga o genoma da planta do milho no evento MIR162 compreendendo uma sequência de aproximadamente 11a aproximadamente 20 nucleotídeos contíguos selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, e os complementos desta.
Em outra modalidade, a invenção engloba uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas. Num as- pecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico isolada é contida numa semente de milho depositada na "American Type Culture Collection" sob o número de acesso PTA-8166, ou em plantas cultivadas da semente.
Numa modalidade da presente invenção, um amplicon compreendendo uma sequência de nucleotídeos única para o evento MIR162 é fornecida. Num aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba os ini-ciadores da sequência flanqueadora para detectar o evento MIR162. Tais iniciadores da sequência flanqueadora compreendem uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 10-15 nucleotídeos contíguos de 5' ou a sequência flanqueadora de 3'. Num aspecto desta modalidade, os nucleotídeos contíguos são selecionados dos nucleotídeos 1-1088 (inclusive) da SEQ ID NO: 49 (arbitrariamente designado neste como a sequência flanqueadora 5'), ou os complementos desta. Em outro aspecto desta modalidade, os iniciadores da sequência flanqueadora 5' são selecionados do grupo consistindo na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NOs: 68-80, e os complementos destas. Em outro aspecto desta modalidade, os nucleotídeos contíguos são selecionados dos nucleotídeos 9391-10579 (inclusive) da SEQ ID NO: 49 (arbitrariamente designada neste como a sequência flanqueadora 3'), ou os complementos desta. Ainda num outro aspecto desta modalidade, iniciadores da sequência flanqueadora 3' são selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NOs: 97-105, e os complementos destas.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos na presença de um modelo de evento MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento MIR162. Num aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador e/ou o segundo iniciador é escolhido da SEQ ID NO: 1 ou o complemento desta. Em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador e/ou o segundo iniciador é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 15-35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 42, e os complementos destas. Ainda em outro aspecto desta modalidade, a amplicon que é produzida pelo par de iniciadores compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, ou os complementos destas.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos na presença de um modelo de evento MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento MIR162. Onde o primeiro iniciador é ou é complementar para uma sequência de genoma da planta do milho pareando o ponto de inserção de uma sequência de DNA heteróloga inserida dentro do genoma do evento MIR162, e o segunda sequência de iniciador de polinucleotídeos é ou é complementar à sequência de DNA heteróloga inserida dentro do genoma do evento MIR162.
Num aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 1-1088 de SEQ ID NO: 49, nucleotídeos 9391-10579 da SEQ ID NO: 49, e os complementos destas. Num outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NOs: 68-72, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NOs: 97-105, e os complementos destas. Em outro aspecto desta modalidade, o segundo iniciador do polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da posição 1089-9390 da SEQ ID NO: 49, ou complementos desta. Ainda num outro aspecto desta modalidade, o segundo iniciador do polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 15-35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NOs: 50-52, SEQ ID NOs: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, e os complementos destas.
Em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do polinucleotídeo, que é disposto na SEQ ID NO: 36, e o segundo iniciador do polinucleotídeo que é disposto na SEQ ID NO: 37 funcionam juntos na presença de um modelo de evento MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento MIR162 conforme descrito no Exemplo 4. Numa modalidade deste aspecto, o amplicon compreende a sequência de nucleotídeos disposta na SEQ ID NO: 38.
Ainda em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do polinucleotídeo, que é disposto na SEQ ID NO: 39, e o segundo iniciador do polinucleotídeo que é disposto na SEQ ID NO: 40 funcionam juntos na presença de um padrão de evento MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento de milho MIR162 conforme descrito no Exemplo 4. Numa modalidade deste aspecto, o amplicon compreende a sequência de nucleotídeos disposta na SEQ ID NO: 41.
Ainda em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do polinucleotídeo, que é disposto na SEQ ID NO: 53, e o segundo iniciador do polinucleotídeo que é disposto na SEQ ID NO: 54 funcionam juntos na presença de um padrão de evento de milho MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento de milho MIR162 conforme descrito no Exemplo 5. Numa modalidade, o amplicon compreende a sequência de nucleotídeos dispostas na SEQ ID NO: 55.
Ainda em outro aspecto desta modalidade, o primeiro inici-ador do polinucleotídeo, que é disposto na SEQ ID NO: 58, e o segundo iniciador do polinucleotídeo que é disposto na SEQ ID NO: 56, funcionam juntos na presença de um padrão de evento de milho MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento de milho MIR162 conforme descrito no Exemplo 5. Numa modalidade, o amplicon compreende a sequência de nucleotídeos dispostos na SEQ ID NO: 59.
Naturalmente, está bem dentro do conhecimento da técnica a obtenção da sequência adicional ainda dentro da sequência do ge-noma pareando qualquer lado das sequências de DNA heteróloga inseridas para uso como uma sequência de iniciadores que pode ser usada em tais pares de iniciadores para amplificar as sequências que são diagnosticadas para o evento MIR162. Com o propósito desta descrição, a frase "ainda dentro da sequência do genoma pareando qualquer lado das sequências de DNA heterólogas inseridas" refere-se especificamente a um movimento sequencial longe das extremidades das sequências de DNA heterólogas inseridas, os pontos pelos quais as sequências de DNA inseridas são adjacentes à sequência de DNA genômica nativa, e fora para dentro do DNA genômico do cromossomo particular dentro do qual as sequências de DNA heterólogas foram introduzidas. Preferencialmente, uma sequência de iniciadores correspondente a ou complementar a uma parte da sequência de inserção deveria fazer o prime da extensão transcricional de uma tira nascente do DNA ou RNA em direção da junção de sequência flanqueadora mais próxima. Consequentemente, uma sequência de iniciadores cor- respondendo a ou complementar a uma parte da sequência flanquea-dora genômica deveria fazer o prime da extensão transcricional de uma tira nascente de DNA ou RNA na direção da junção de sequência flanqueadora mais próxima. Uma sequência de iniciadores pode ser, ou pode ser complementar a, uma sequência de DNA heteróloga inserida dentro do cromossomo de uma planta, ou uma sequência flanqueadora genômica. Um técnico com conhecimentos na técnica reconhecería prontamente o benefício se uma sequência de iniciadores necessitaria, ou necessitaria ser complementar a, a sequência disposta dentro da sequência de DNA heteróloga inserida ou conforme disposta na SEQ ID NO: 38 dependendo da natureza do produto desejado para ser obtido através do uso do conjunto alojado de iniciadores destinados para uso na amplificação de uma sequência de pareamen-to particular contendo a junção entre a sequência de DNA genômica e a sequência de DNA heteróloga inserida.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba uma proteína inseticida isolada compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma molécula de ácido nucléico codificando a SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico é SEQ ID NO: 1. A presente invenção também engloba um gene quimérico compreendendo um promoter heterólogo operavelmente ligado à molécula de ácido nucléico, e aos vetores recombinantes e células hospedeiras compreendendo o gene quimérico.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba um método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento MIR162 em numa amostra compreendendo ácidos nucléicos de milho, onde o método compreende: (a) colocar a amostra em contato com um par de iniciadores de polinucleotí-deos que, quando usado numa reação de amplificação de ácidos nucléicos com DNA genômico do evento MIR162 produz um amplicon que é diagnosticado para o evento MIR162; (b) realização de uma reação de amplificação do ácido nucléico, por meio desta forma produzindo o amplicon; e (c) detectando o amplicon. Num aspecto desta modalidade, o amplicon compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas.
Numa outra modalidade, a presente invenção engloba um método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento MIR162 numa amostra compreendendo ácido nucléico do milho, onde o método compreende: (a) contatando a amostra com uma sonda que hibridiza sob condições de alto rigor com DNA genômico do evento MIR162 e não hibridiza sob condições de alto rigor com DNA de uma planta de milho controle; (b) sujeitando a amostra e a sonda a condições de hibridização de alto rigor; e (c) detectando a hibridização da sonda para o DNA. A detecção pode ser feita por qualquer meio bem conhecido na técnica incluindo fluorescência, quimiluminescência, radiológica, imunológica, e outros. No caso em que a hibridização destinar-se a ser usada como um meio para a amplificação de uma sequência particular para produzir um amplicon que é diagnosticada para o evento MIR162, a produção e detecção por qualquer meio bem conhecido na técnica da amplicon destinam-se a ser um indicativo da hibridização destinada à sequência alvo onde uma sonda ou iniciador é utilizado, ou sequências onde duas ou mais sondas ou iniciadores são utilizados. O termo "amostra biológica" destina-se a compreender uma amostra que contém ou é suspeita de conter um ácido nucléico compreendendo entre cinco e dez nucleotídeos em qualquer lado do ponto no qual um ou outro dos dois pontos terminais da sequência de DNA heteróloga inserida contacta a sequência de DNA genômico dentro do cromossomo no qual a sequência de DNA heteróloga foi inserida, neste documento também conhecido como sequências de junção. Além disso, a sequência de junção compreende tão pouco quanto dois nucleotídeos: aqueles sendo o primeiro nucleotídeo dentro do flanqueador DNA ou genômico adjacente ao co-valentemente unido ao primeiro nucleotídeo dentro da sequência de DNA heteróloga inserida. Em um aspecto desta modalidade, a sonda compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba um kit para a detecção dos ácidos nucléicos que são únicos ao evento MIR162 na amostra biológica. Kit inclui pelo menos uma molécula de ácido nucléico de comprimento suficiente de polinucleotídeos contíguos para funcionar como um iniciador ou sonda num método de detecção do ácido nucléico, que depois da amplificação ou hibridização para uma sequência de ácido nucléico alvo numa amostra seguida pela detecção do amplicon ou hibridização para a sequência alvo, são diagnosticados para a presença de sequências de ácido nucléico únicas ao evento MIR162 na amostra. Kit ainda inclui outros materiais necessários para permitir a hibridização do ácido nucléico ou os métodos de amplificação. Num aspecto desta modalidade, uma molécula de ácido nucléico contida no kit compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 49. Em outro aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico é um iniciador selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 15-37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NOs: 50-54, SEQ ID NOs: 56-58, SEQ ID NOs: 60-105, e os complementos destas. Ainda em outro aspecto desta modalidade, o amplicon compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, ou os complementos destas. Uma variedade de métodos de detecção podem ser usados incluindo, mas não limitados a TAQMAN (Perkin Elmer), amplificação térmica, reação em cadeia por ligase, hibridização de Southern, métodos ELISA, e métodos de detecção colorimétrica e fluorescente. Em particular a presente invenção fornece kits para detectar a presença da sequência alvo, isto é, pelo menos a sequência vip3Aa20 ou uma sequência de junção, numa amostra contendo ácido nucléico genômico do MIR162. Kit é compreendido por pelo menos um polinucleotídeo capaz de ligar ao sítio alvo ou substancialmente adjacente ao sítio alvo e pelo menos um meio para detectar a ligação do polinucleotídeo para o sítio alvo. Os meios de detecção podem ser fluorescente, quimioluminescência, colorimétrica, ou isotópico e podem ser acoplados pelo menos com métodos imunológicos para detectar a ligação. Kit também é visionado que pode detectar a presença do sítio alvo numa amostra, isto é, pelo menos a sequência vip3Aa20 ou uma sequência de junção do MIR162, levando vantagem de duas ou mais sequências de polinucleotídeos que juntas são capazes de ligar às sequências de nucleotídeo adjacentes a ou dentro de aproximadamente 100 pares de base, ou dentro de aproximadamente 200 pares de base ou dentro de aproximadamente 500 pares de base ou dentro de aproximadamente 1000 pares de base da sequência alvo e que podem ser estendidas entre si para formar um amplicon que contém pelo menos o sítio alvo.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba um método de detectar a proteína Vip3Aa20 numa amostra biológica, o método compreende: (a) extrair proteína do tecido do evento MIR162; (b) ensaiar a proteína extraída usando um método imunológico compreendendo anticorpos específicos para a proteína Vip3Aa20 produzida pelo evento MIR162; e (c) detectar a ligação do anticorpo mencionado para a proteína Vip3Aa20.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba uma amostra biológica derivada de uma planta de milho do evento MIR162, tecido, ou semente, onde a amostra compreende uma sequência de nucleotídeos que é ou é complementar para a sequência que é única ao evento MIR162, e onde a sequência é detectável na amostra usando uma amplificação de ácido nucléico ou um método de hibridização de ácido nucléico. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é ou é complementar à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59. Num outro aspecto desta modalidade, a amostra é selecionada do grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope do milho, óleo de milho, maisena e cereais fabricados no todo ou em parte que contenham produtos a base de milho.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba um extrato de uma amostra biológica derivada de uma planta de milho MIR162, tecido ou semente compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é ou é complementar a uma sequência que é única ao MIR162. Em um aspecto desta modalidade, a sequência é detectável no extrato usando uma amplificação do ácido nucléico ou método de hibridização do ácido nucléico. Em outro aspecto desta modalidade, a sequência é ou é complementar para SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59. Ainda em outro aspecto desta modalidade, a amostra é selecionada do grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope do milho, óleo de milho, maisena, e cereais fabricados no todo ou em parte que contenham produtos a base de milho.
Outra modalidade da presente invenção engloba uma plan- ta de milho, ou partes desta, e semente de uma planta de milho compreendendo o genótipo do evento transgênico MIR162, onde o genóti-po compreende uma sequência de nucleotídeos disposta nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, ou os complementos destas. Um exemplo de semente de milho compreende as moléculas de ácido nucléico da invenção que foram depositadas no dia 23 de janeiro de 2007 e atribuídas o número de acesso ATCC: PTA-8166. Em um aspecto desta modalidade, a planta de milho é das linhagens de milho reproduzidas CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP911, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, BCTT609, AF031, NPH8431, 894, BUTT201, R327H, 2044BT, e 2070BT. Contudo um técnico com conhecimentos na técnica reconhecerá que o genótipo MIR162 pode ser introduzido dentro de qualquer variedade de planta que possa ser reproduzida com milho, incluindo espécies selvagens de milho, e desta forma, a lista de linhagens reproduzidas desta modalidade não deve ser limitada.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba uma planta de milho compreendendo pelo menos uma primeira e uma segunda sequência de DNA ligadas juntas para formar uma sequência de nucleotídeos contíguos, onde a primeira sequência de DNA está dentro de uma sequência de junção e compreende pelo menos aproximadamente 11 nucleotídeos contíguos selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 1079-1098 da SEQ ID NO: 49, nucleotídeos 9381-9400, e os complementos desta, onde a segunda sequência de DNA está dentro da sequência de DNA inserida heteróloga disposta na SEQ ID NO: 49, e os complementos desta; e onde a primeira e segunda sequência de DNA forem úteis como sondas ou iniciadores do nu-cleotídeo para detectar a presença das sequências de ácido nucléico do evento de milho MIR162 numa amostra biológica. Num aspecto desta modalidade, os iniciadores do nucleotídeo são usados num método de amplificação do DNA para amplificar uma sequência de DNA alvo do DNA padrão extraído da planta de milho e a planta de milho é identificável de outras plantas de milho pela produção de uma ampli-con correspondendo a uma sequência de DNA compreendendo SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 47.
Plantas de milho da invenção podem ainda ser caracterizadas em que digerir simultaneamente o DNA genômico da planta com as endonucleases de restrição Kpnl, EcoRV ou Ncol resulta em aproximadamente uma banda de hibridização de 8 kb, de 13 kb ou 4.6 kb vip3Aa20 respectivamente, usando uma sonda vip3Aa20 sob condições de alto rigor. Exemplificada neste documento está uma sonda vip3Aa20 compreendendo a sequência de nucleotídeos disposta na SEQ ID NO: 13.
Plantas de milho da invenção podem ainda ser caracterizadas em que digerir o DNA genômico da planta com as endonucleases de restrição Acc65l ou BamHI resulta em uma única banda de hibridização pmi usando uma sonda pmi sob condições de alto rigor. Exemplificada neste documento está uma sonda pmi compreendendo a sequência de nucleotídeos disposta na SEQ ID NO: 14.
Em uma modalidade, a presente invenção engloba uma planta de milho, onde o genótipo MIR162 confere a resistência ao inseto à planta de milho ou habilidade para utilizar manose como uma fonte de carbono, ou ambos, a resistência ao inseto e a habilidade para utilizar manose como uma fonte de carbono. Em um aspecto desta modalidade, o genótipo transgênico conferindo resistência ao inseto à planta de milho da invenção compreende um gene vip3Aa20 e o genó-tipo transgênico conferindo a habilidade para utilizar manose como uma fonte de carbono à planta de milho da invenção compreende um gene pmi.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta de milho resistente às pragas dos lepidópteros compreendendo: (a) sexualmente cruzando uma primeira planta de milho parente com uma segunda planta de milho parente, onde a primeira ou segunda planta de milho parente mencionadas compreendem o evento MIR162 DNA, desta forma produzindo uma pluralidade da primeira geração de plantas de progenitura; (b) selecionando uma primeira geração de planta da progenitura que é resistente a uma ou mais pragas dos lepidópteros; (c) purificando a primeira geração de planta da progenitura, desta forma produzindo uma pluralidade de plantas da progenitura de segunda geração; e (d) selecionado da segunda geração de plantas de progenitura, uma planta que seja resistente a uma ou mais pragas dos lepidópteros; onde as plantas da progenitura de segunda geração compreendem uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, e SEQ ID NO: 59.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produção de sementes de milho híbridas compreendendo: (a) plantando sementes de uma primeira linhagem de milho reproduzida compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, e SEQ ID NO: 59, e sementes de uma segunda linhagem reproduzida tendo um genótipo diferente; (b) cultivando plantas de milho resultantes da plantação mencionada até a hora da florescência; (c) castrando tais flores das plantas de uma das linha- gens reproduzidas do milho; (d) cruzando sexualmente as duas linhagens diferentes de reprodução entre si; e (e) colhendo a semente híbrida produzida deste. Num aspecto desta modalidade, a primeira linhagem de milho reproduzida fornece os parentes femininos. Em outro aspecto desta modalidade, a primeira linhagem de milho reproduzida fornece os parentes masculinos. A presente invenção também engloba a semente híbrida produzida pelo método incorporado e as plantas híbridas cultivadas da semente.
Um técnico com conhecimentos na técnica reconhecerá que o genótipo transgênico do MIR162 pode ser introduzido pela reprodução dentro de outras linhagens do milho compreendendo diferentes genótipos transgênicos. Por exemplo, um milho MIR162 reproduzido com milho pode ser cruzado com um milho reproduzido compreendendo o genótipo transgênico do evento Bt11 resistente ao lepidóptero (Patente dos EUA N° 6.114.608 e 6.342.660, incorporada neste por referência). A semente e as plantas da progenitura resultantes possuem as características empilhadas de resistência ao inseto e o espectro combinado de atividade do CrylAb e Vip3Aa20. Outra característica de empilhamento englobada pela presente invenção inclui a combinação da característica de resistência a insetos MIR162 e a característica de resistência a insetos MIR604 (Publicação do Pedido de Patente dos EUA N° 2005/0216970, publicada em 29 de setembro de 2005, incorporadas neste por referência). As características empilhadas na semente resultante e progenitura conferem nas plantas um aumento do espectro de atividade; isto é, as plantas são ativas contra ambas as pragas de insetos lepidópteras e coleópteros.
Desta forma, a presente invenção engloba um método de proteger uma planta de milho transgênica dos danos causados pela alimentação de uma ou mais pragas de insetos onde o método compreende o empilhamento na mesma planta de milho transgênica de uma característica resistente a insetos Vip3Aa20 com outra característica resistente a insetos que é diferente do Vip3Aa20, onde as características empilhadas protegem a planta de milho contra danos causados pela alimentação de uma ou mais pragas de insetos para um grau superior do que seria esperado devido às características de resistência a insetos por si só. Em um aspecto desta modalidade, a característica resistente a insetos Vip3Aa20 compreende um evento MIR162 que é empilhado com a característica resistente a insetos Cry3A055 compreendida no evento MIR604 na mesma planta de milho transgênica pelo cruzamento sexual do evento MIR162 com o evento MIR604 ou pela transformação das características juntamente dentro da mesma planta.
Exemplos de outros eventos transgênicos que podem ser cruzados com um MIR162 reproduzido incluem o evento GA21 tolerante a glifosato, o evento MON802 resistente a insetos lepidópte-ros/tolerante a glifosato, o evento DBT418 resistente a lepidópteros, o evento MS3 de esterilidade masculina, o evento B16 tolerante a fosfi-notricina, o evento MON 80100 resistente a insetos lepidópteros, os eventos T14 e T25 tolerantes à fosfinotricina, o evento 176 resistente a insetos lepidópteros, e o evento MON863 resistente a coleópteros, todos estes são bem conhecidos na técnica. Será ainda reconhecido que outras combinações ou empilhamentos podem ser feitos com o genótipo transgênico da invenção e desta forma estes exemplos não devem ser vistos como limitadores.
Um técnico na técnica também reconhecerá que a semente do milho transgênica compreendendo o genótipo MIR162 pode ser tratada com vários tratamentos químicos da semente, incluindo inseticidas, para aumentar ou sinergizar a atividade inseticida da proteína Vip3Aa20. A invenção descrita neste documento revela um sítio espe- cífico no cromossomo 5 no genoma do milho que é excelente para a introdução dos ácidos nucléicos heterólogos. Também é revelado um marcador molecular 5' (opie2; nucleotídeos 1680-3338 da SEQ ID NO: 106) e um marcador molecular 3' (gag; nucleotídeos 43,275-45,086 da SEQ ID NO: 106) úteis na identificação da localização de um local alvo no cromossomo 5. Desta forma, a invenção descrita fornece métodos para introduzir ácidos nucléicos heterólogos de interesse dentro deste sítio alvo preestabelecido ou na vizinhança deste local alvo. A invenção descrita também engloba uma semente de milho e/ou uma planta de milho compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos heteró-loga inserida no local alvo revelado ou na vizinhança geral de tal local. Uma opção para executar tal integração alvo é substituir uma inserção diferente no lugar do cassete de expressão vip3Aa20 exemplificado neste documento. Com relação a isto, recombinação homóloga alvo, por exemplo sem limitações, pode ser usada de acordo com a invenção descrita. "Recombinação homóloga" refere-se a uma reação entre qualquer par de sequência de nucleotídeos tendo sítios correspondentes contendo uma sequência de nucleotídeos similar (isto é, sequências homólogas) através da qual as duas moléculas podem interagir (recombinar) para formar uma nova sequência de DNA recombinante. Os sítios da sequência de nucleotídeos similares são referidos neste como uma "sequência de homologia". Geralmente, a frequência da recombinação homóloga aumenta conforme o comprimento da sequência de homologia aumenta. Desta forma, enquanto a recombinação homóloga pode ocorrer entre duas sequências de nucleotídeos que são menos do que idênticas, a frequência de recombinação (ou eficiência) declina conforme a divergência entre as duas sequências aumenta. A recombinação pode ser conquistada usando uma sequência de homologia em cada uma das moléculas alvo e doadora, desta forma gerando um produto de recombinação "cruzamento único". Al- ternativamente, duas sequências de homologia podem ser posicionadas em cada uma das sequências de nucleotídeos doadores e alvo. A recombinação entre duas sequências de homologia no doador com duas sequências de homologia no alvo gera um produto de recombinação "cruzamento duplo". Se as sequências de homologia na molécula do doador parear uma sequência que deve ser manipulada (por exemplo, uma sequência de interesse), a recombinação de cruzamento duplo com a molécula alvo resultará num produto de recombinação onde a sequência de interesse substitui uma sequência de DNA que estava originalmente entre as sequências de homologia na molécula alvo. A troca da sequência de DNA entre o alvo e o doador através de um evento de recombinação com cruzamento duplo é chamada de "substituição de sequência." Este tipo de tecnologia é o assunto, por exemplo, da Publicação do Pedido de Patente dos EUA N° 2006/0253918, incorporado neste por referência. Com o sítio alvo revelado agora sendo identificado e com as sequências em volta do local alvo identificadas, o técnico com conhecimentos na técnica reconhecerá que outros métodos para a integração alvo dos ácidos nucléicos heterólogos podem ser usados. Tais métodos, por exemplo, sem limitações, são revelados na Publicação do Pedido de Patente dos EUA N° 2007/0039074 e na Publicação do Pedido de Patente dos EUA N° 2006/0130179.
Em uma modalidade, a presente invenção engloba um local alvo do cromossomo de milho localizado no cromossomo 5 entre um marcador molecular opie2 disposto como nucleotídeos 1680-3338 da SEQ ID NO: 106 e um marcador molecular gag disposto como nucleotídeos 43,275-45,086 da SEQ ID NO: 106, onde o sítio alvo compreende um ácido nucléico heterólogo. Em outra modalidade, o sítio alvo do cromossomo de milho está localizado no cromossomo 5 entre os nucleotídeos 25,454 e 25,513 da SEQ ID NO: 106. Ainda em outra modalidade, o local alvo do cromossomo está pareado 5' pelos núcleo- tídeos 5,454 to 25,454 da SEQ ID NO: 106 e pareado 3' pelos nucleo-tídeos 25,513 a 45,513 da SEQ ID NO: 106.
Em uma modalidade, a presente invenção engloba um método de fazer uma planta de milho transgênico compreendendo a inserção de um ácido nucléico heterólogo numa posição no cromossomo 5 localizado entre um marcador molecular opie2 disposto como nu-cleotídeos 1680-3338 da SEQ ID NO: 106 e um marcador molecular gag disposto como nucleotídeos 43,275-45,086 da SEQ ID NO: 106. Em outra modalidade, o ácido nucléico heterólogo é inserido no cromossomo 5 entre os nucleotídeos 25,454 e 25,513 da SEQ ID NO: 106. Ainda em outra modalidade, o ácido nucléico heterólogo é pareado 5' pelos nucleotídeos 5,454 a 25,454 da SEQ ID NO: 106 e parea-dos 3' pelos nucleotídeos 25,513 a 45,513 da SEQ ID NO: 106. O genótipo transgênico da presente invenção pode ser introduzido em qualquer milho reproduzido ou híbrido usando técnicas de reprodução reconhecidas na técnica. O objetivo da reprodução da planta é combinar numa variedade única ou híbrida várias características desejáveis. Para colheitas do campo, estas características podem incluir resistência a insetos e doenças, tolerância a herbicidas, tolerâncias a aquecimento e seca, reduzindo o tempo para maturidade da colheita, maior produção, e melhor qualidade agronômica. Com a colheita mecânica de muitas culturas, a uniformidade das características da planta tal como germinação, o estabelecimento das culturas, taxa de crescimento, maturidade, e altura da planta e da parte superior, é importante.
Colheitas do campo são reproduzidas através de técnicas que levam vantagem do método de polinização da planta. Planta é au-to-polinizada se o pólen de uma flor for transferido para a mesma ou outra flor da mesma planta. Planta tem polinização cruzada se o pólen vier de uma flor de planta diferente.
Plantas que foram autopolinizadas e selecionadas por tipo por muitas gerações tornam-se homozigotas em quase todos genes de loci e produzem uma população uniforme de progenitura de cruzamento verdadeira. Um cruzamento entre duas linhagens homozigotas diferentes produz uma população uniforme de plantas híbridas que podem ser heterozigotas para muitos genes de loci. Um cruzamento de duas plantas cada uma heterozigota num número de gene de loci produzirá uma população de plantas híbridas que diferem geneticamente e não serão uniformes.
Milho (Zea mays L.), pode ser reproduzido por ambas as técnicas de autopolinização e polinização cruzada. Milho possui flores femininas e masculinas separadas na mesma planta, localizadas no pendão e na espiga, respectivamente. A polinização natural ocorre no milho quando o vento sopra o pólen da franja para o cabelo do milho que sai do topo das espigas.
Um método confiável de controle da fertilidade masculina nas plantas oferece a oportunidade para a reprodução melhorada da planta. Isto é especialmente verdadeiro para o desenvolvimento dos híbridos do milho, que dependem de algum tipo de sistema de esterilidade masculina. Existem diversas opções para o controle da fertilidade masculina disponíveis para os reprodutores, tais como: castração manual ou mecânica (ou despendoamento), esterilidade masculina cito-plasmática, esterilidade masculina genética, gametócitos e similares. A semente do milho híbrido é produzida tipicamente por um sistema de esterilidade masculina incorporando o despendoamento manual ou mecânico. Tiras alternadas de duas linhagens de milho são plantadas no campo, e as franjas produzindo pólen são removidas de uma das linhagens (feminina). Contanto que haja isolação suficiente das fontes do pólen de milho estrangeiras, as espigas das linhagens despendoadas serão fertilizadas somente da outra linhagem (masculi- no), e a semente resultante é desta forma híbrida e formará plantas híbridas. O processo de despendoamento geralmente laboroso, e ocasionalmente não confiável, pode ser evitado pelo uso de um dos muitos métodos de conferir esterilidade masculina genética conhecido na técnica, cada um com seus próprios benefícios e desvantagens. Estes métodos usam uma variedade de aproximações tais como depositar dentro da planta um gene codificando uma substância citotóxi-ca associada com um promotor específico de tecido masculino ou um sistema antissentido no qual um gene crítico para fertilidade é identificado e um antissentido para aquele gene é inserido na planta (ver: Fabinjanski, e outros EPO 89/3010153.8, publicação número 329,308 e pedido PCT PCT/CA90/00037 publicado como WO 90/08828). O uso das linhagens estéreis masculinas é assim um fator na produção dos híbridos de milho. Técnicas de reprodução de plantas conhecidas na técnica e usadas num programa de reprodução de planta de milho incluem, mas não estão limitadas a, seleção recorrente, retrocruzamento, reprodução pedigree, seleção melhorada do poli-morfismo do comprimento de restrição, transformação e seleção melhorada do marcador genético. O desenvolvimento dos híbridos de milho num programa de reprodução de planta de milho exige, geralmente, o desenvolvimento das linhagens de reprodução homozigotas, o cruzamento destas linhagens, e a avaliação dos cruzamentos. Métodos de reprodução por seleção recorrente e reprodução pedigree são usados para desenvolver linhagens de reprodução das populações para reprodução. Programas de reprodução de planta de milho combinam os antecedentes genéticos de duas ou mais linhagens de reprodução ou várias outras fontes de germoplasma dentro de pools de reprodução a partir dos quais novas linhagens de reprodução são desenvolvidas e é feita a seleção dos fenótipos desejados. As novas li- nhagens são cruzadas com outras linhagens reproduzidas e os híbridos destes cruzamentos são avaliados para determinar quais destes têm potencial comercial. Reprodução de plantas e o desenvolvimento de híbridos, conforme praticado num programa de reprodução de planta de milho, são processos caros e consomem tempo.
Reprodução pedigree inicia com o cruzamento de dois ge-nótipos, cada qual pode ter uma ou mais características desejáveis que está faltando no outro ou que complementa o outro. Se os dois parentes originais não proverem todas as características desejáveis, outras fontes podem ser incluídas na população de reprodução. No método pedigree, plantas superiores são autofecundadas e selecionadas nas gerações sucessivas. Nas gerações sucessivas a condição heterozigótica dá lugar às linhagens homogêneas como um resultado da autopolinização e seleção. Tipicamente no método pedigree de reprodução de cinco ou mais gerações de autofecundação e seleção é praticada: Fi -> F2; F2-> F3; F3 ->F4; F4 ->F.5; etc.
Reprodução de seleção recorrente, retrocruzamento, por exemplo, pode ser usado para melhorar uma linhagem de reprodução e um híbrido que é feito usando aquelas linhagens. Retrocruzamento pode ser usado para transferir uma característica específica desejável de uma linhagem ou fonte para uma linhagem em que falta aquela característica. Isto pode ser conquistado, por exemplo, pelo primeiro cruzamento de uma linhagem superior (parente recorrente) com uma linhagem doadora (parente não-recorrente), que carrega o(s) gene(s) apropriado(s) em questão. A progenitura deste cruzamento é então acasalada novamente ao parente recorrente superior seguido pela seleção na progenitura resultante para a característica desejada para ser transferida do parente não- recorrente. Depois de cinco ou mais gerações de retrocruzamento com seleção para a característica desejada, a progenitura será homozigota para loci controlando a característica sendo transferida, mas será como o parente superior para essencialmente todos os outros genes. A última geração retrocruzada é então autofecundada para dar reprodução de progenitura pura para o(s) ge-ne(s) sendo transferida. Um híbrido desenvolvido das linhagens contendo o(s) gene(s) transferido(s) é essencialmente o mesmo como um híbrido desenvolvido das mesmas linhagens sem o(s) gene(s) transferidos.
Linhagens de reprodução de elite, que é, puras, linhagens de reprodução homozigota, também podem ser usadas como materiais de início para reprodução ou populações fonte a partir das quais podem desenvolver outras linhagens de reprodução. Estas linhagens de reprodução derivadas das linhagens de reprodução da elite podem ser desenvolvidas usando os métodos de reprodução de seleção recorrente e reprodução pedigree mencionados anteriormente. Como um exemplo, quando a reprodução de retrocruzamento é usada para criar estas linhagens derivadas num programa de reprodução de planta de milho, a reprodução de elite pode ser usada como uma linhagem pro-genitora ou material de início ou população fonte e pode servir como parente recorrente ou doador.
Um híbrido do milho simples resulta do cruzamento de duas linhagens de reprodução, cada uma das quais possui um genótipo que complementa o genótipo da outra. A progenitura híbrida da primeira geração é designada Fi. No desenvolvimento dos híbridos comerciais num programa de reprodução de planta de milho, somente as plantas do híbrido F-ι são procuradas. Híbridos F^ preferidos são mais vigorosos que seus parentes reproduzidos. Este vigor híbrido, ou heterose, pode ser manifestado em muitas características poligênicas, incluindo aumento do crescimento vegetativo e da produção. O desenvolvimento de um híbrido de milho num programa de reprodução de planta de milho envolve três etapas: (1) a seleção das plantas dos vários pools de germoplasma para cruzamentos para reprodução inicial; (2) a autofecundação das plantas selecionadas dos cruzamentos para reprodução para diversas gerações para produzir uma série de linhagens de reprodução, que embora diferentes uma da outra, reproduzem verdadeiramente e são altamente uniformes; e (3) cruzamento das linhagens de reprodução selecionadas com linhagens reproduzidas diferentes para produzir a progenitura híbrida (F^. Durante o processo de reprodução no milho, o vigor das linhagens diminui. O vigor é restaurado quando duas linhagens diferentes de reprodução são cruzadas para produzir a progenitura híbrida (F^. Uma importante consequência da homozigosidade e homogeneidade das linhagens de reprodução é que o híbrido entre um par definido de reproduções sempre será o mesmo. Uma vez que as reproduções que dão um híbrido superior tenham sido identificadas, a semente do híbrido pode ser reproduzida indefinitamente enquanto a homogeneidade dos parentes reproduzidos seja mantida.
Um híbrido simples é produzido quando duas linhagens de reprodução são cruzadas para produzir a progenitura Um híbrido duplo é produzido de quatro linhagens reproduzidas cruzadas em pa-res (A X B e C X D) e então os dois híbridos F-ι são cruzados novamente (A X B) X (C X D). Um híbrido triplo é produzido de três linhagens reproduzidas onde duas linhagens reproduzidas são cruzadas (A X B) e então o híbrido F^ resultante é cruzado com o terceiro reproduzido (A X B) X C. Muito do vigor híbrido exibido pelos híbridos F1 é perdido na próxima geração (F2). Consequentemente, a semente dos híbridos não é usada para estoque de plantas. A produção de semente híbrida requer a eliminação ou ina-tivação do pólen produzido pelo parente feminino. A remoção incompleta ou inativação do pólen fornece o potencial para autopolinização. Esta semente autopolinizada inadvertidamente pode ser colhida aci- dentalmente e embalada com a semente híbrida.
Uma vez que as sementes são plantadas, é possível identificar e selecionar aquelas "autopolinizadas". Essas plantas "autopolini-zadas" serão geneticamente equivalentes à linhagem de fêmeas congênitas utilizadas para produzir o híbrido.
Tipicamente essas plantas "autopolinizadas" podem ser identificadas e selecionadas de acordo com seu declínio no vigor. Fêmeas puras são identificadas pela sua aparência menos vigorosa para características vegetativas e/ou reprodutivas, incluindo plantas de baixa estatura, pequeno tamanho de espiga, formatos da espiga e do grão, cor do sabugo ou outras características. A identificação dessas linhagens "autopolinizadas" também pode ser efetuada através de análises com marcadores moleculares. Ver, "The Identification of Female Selfs in Hybrid Maize: A Comparison Using Electrophoresis and Morphology", Smith, J. S. C. and Wych, R. D., Seed Science and Technology 14, pp. 1-8 (1995), cujas divulgações estão expressamente incorporadas neste por referência. Através dessas tecnologias, a homozigosidade da linhagem de "autopolinizadas" pode ser verificada analisando a composição alélica em vários loci ao longo do genoma. Estes métodos permitem a rápida identificação da invenção descrita por referência. Ver também, "Identification of Atypical Plants in Hybrid Maize Seed by Postcontrol and Electrophoresis" Sarca, V. et al., Probleme de Genetica Teoritica si Aplicata Vol. 20 (1) pp. 29-42.
Como é prontamente aparente para alguém conhecedor da ciência, os antecedentes são apenas alguma das várias maneiras inerentes pelas quais a presente invenção pode ser concebida por aqueles interessados no desenvolvimento de genótipos transgênicos da invenção dentro de outras linhagens de milho. Outras maneiras estão disponíveis, e os exemplos acima são meramente ilustrativos.
Os exemplos subsequentes têm unicamente o propósito de ilustrar uma ou mais incorporações preferenciais da invenção e não são para serem construídos como limitador do escopo da invenção. EXEMPLOS
Exemplo 1. Transformação e Seleção do Evento MIR162 O evento MIR6Q4 foi produzido por uma transformação mediada pelo Agrobacterium de uma linhagem de milho (Zea mays) patenteada. Embriões imaturos foram transformados essencialmente como descrito por Negrotto et aí. (Plant Cell Reports 19: 798-803, 2000), referência incorporada por referência, usando um fragmento de DNA do plasmídeo pNOV13O0 (SEQ ID NO: 3). pNOV1300 contém uma sequência de nucleotídeos incluindo cassetes de expressão arranjados. O primeiro cassete de expressão inclui uma região promotora ZmUbilnt de um gene poliumbiquitina de Zea mays o qual contém o primeiro íntron (GenBank® Número de Acesso S94464) Έ operavel-mente ligado a uma sequência codificadora posterior vip3Aa19 E opera vel mente ligada ao íntron PEPC #9 do gene fosfoenolpiruvato carbo-xilase (GenBank® Número de acesso X15239) de Zea mays (Matsuoka and Minami, 1989. European J. Of Biochem. 181:593-598) e um finaliza dor de sequência 35S do RNA 35S do mosaico de vírus genoma da couve-flor (Similar ao GenBank® Número de Acesso AF140604). Sua função é promover a sequência de poliadenilaçâo (Franck et a/., 1980. Cell 21:285-294). O gene vip3Aa19 em pNOV1300 inclui uma sequência codificadora sintética/otimizada para milho, vip3Aa (Estruch, et aí., 1999.) a qual foi sintetizada para acomodar o códon preferencial, habitual para o milho (Murray et a/., 1989). A sequência codificadora sintética vip3Aa19 usada em transformações de plantas, codifica uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência codificadora de vip3Aa1 nativa, encontrado nas bactérias do solo Bacillus thuringiensis cepa AB88 (patente US 5,877,012), com exceção de um único aminoácido diferente na posição 284; a sequência codificadora do vip3Aa1 nativa codifica a lisina, enquanto que a sequência codificadora do vip3Aa19 sintéticq codifica a glutamina nesta posição. A sequência codificadora vip3Aa19 codifica uma proteína de controle de insetos, a Vip3Aa19 que promove resistência aos insetos lepidópteros. O segundo cassete de expressão é compreendido pelo promotor ZmUbilnt operavelmente ligado a uma sequência codificadora pmi (também conhecido como E.coli manA), codificando a fosfomanose isomerase (GenBank® Número de Acesso M15380), a qual catalisa a isomerização da manose-6-fosfato para frutose-6-fosfato (Negrotto et ai, 2000). A sequência codificadora pmi é posteriormente ligada a uma terminação da transcrição final da nopalina sintase 3’ e à sequência de poliadenilação.
Embriões imaturos foram extirpados entre 8-12 dias de idade e enxaguados em meio de cultura recém preparado para a transformação. Os embriões foram agitados com a suspensão de células de Agrobacterium abrigando o vetor de transformação pNOV1300, agitando em vortex durante 30 segundos, seguido por mais 5 minutos de incubação. A solução em excesso contendo Agrobacterium foi aspirada e os embriões foram movidos para placas contendo um meio de cultura não seletivo. Embriões foram co-cultivados com o Agrobacterium remanescente a 22 °C por 2-3 dias ao abrigo da luz. Embriões foram transferidos para um meio de cultura suplementado com ticarcilina (100 mg/ml) e nitrato de prata (1,6 mg/l) sendo incubados ao abrigo da luz por 10 dias. Embriões produzindo o calo embriogênico foram transferidos para o meio de cultura celular contendo manose.
As plântulas regeneradas foram testadas pela análise TAQMAN® PCR (ver Exemplo 2) para a presença de ambos os genes pmi e vip3Aa19, tão bem como pela ausência do gene de resistência ao antibiótico espectinomicina (spec). Foi descoberto posteriormente (ver abaixo Exemplo 4) que durante o processo de transformação duas mutações foram introduzidas dentro da sequência codificadora vip3Aa19, uma das quais resultou em uma mudança no aminoácido da proteína Vip3Aa19. Consequentemente essa nova sequência codificadora vip3Aa o qual é única para o evento MIR162, foi designada vip3Aa20. A sequência codificadora vip3Aa20 codifica a isoleucina na posição 129 no local de um resíduo de metionina codificado pelo gene vip3Aa19.
Plantas positivas para ambos transgenes, e negativas para o gene spec, foram transferidas para uma estufa para propagação posterior. Os eventos positivos foram identificados e triados usando bioensaíos com insetos contra a lagarta de cereais. Os eventos inseticidas foram caracterizados como número de transcrição pela análise TAQMAN. MIR162 foi escolhido para análise posterior por ter uma sequência única de transcrição dos transgenes, boa expressão da proteína identificada por ELISA, e boa atividade inseticida contra a lagarta de cereais. O pedigree da produção do evento MIR162 foi como segue: T0 MIR162 planta (x NPH8431)-* -+ NPH8431 (MIR162) F-, (x NP2161) NP2161 (MIR162) F-, (x NP2161) NP2161 (MIR162) BC1F-, (x B9620) Fi (x B9620) -> BCIFí (x B9620) -> BC2F1 (x B9620) BC3Fi (x B9620) -> BC4Fi (x B9620), O material vegetal da geração BC4 foi usado para a análise Southern, determinação da transcrição e sequência do DNA inserido. Controles negativos para os experimentos consistem de 10 plantas segregadas da geração BC4.
Exemplo 2. Detecção de MIR162 por TAQMAN PCR A análise TAQMAN foi essencialmente conduzida como descrita em Ingham et ai (Biotechniques, 31:132-140, 2001), referência incorporada por referência. DNA genômico foi isolado de folhas de plantas de milho transgênicas e não-transgênicas, usando o kit de extração de DNA genômico Puregene® (Gentra Systems, Minneapolis, MN) essencialmente de acordo com as instruções do fabricante, exceto que todos os passos foram conduzidos em placas de 96-poços de 1,2 ml. O grânulo do DNA seco foi submetido à re-suspensão em tampão TE (10 Mm Tris-HCI, pH 8.0, 1mM EDTA).
Reações TAQMAN PCR foram conduzidas em placas de 96-poços. Para o controle do gene endógeno do milho, "iniciadores" e as sondas foram projetados especificamente para a sequência codifi-cadora de álcool/desidrogenase (adhl) de Zea mays (Genbank N° de Acesso AF044295). Será reconhecido por uma pessoa habilidosa que outros genes do milho podem ser usados como controles endógenos. Reações foram multiplicadas para amplificação simultânea de vip3Aa e adhl ou pmi e adhl. Para cada amostra, uma mistura principal foi gerada pela combinação de 20 μΙ_ do extrato de DNA genômico com 35 μΙ_ 2x TAQMAN Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) suplementado com "iniciadores" para uma concentração final de 900 nM cada, sondas para uma concentração final de 100 nM cada, e água para completar um volume final de 70μΙ_. Esta mistura foi distribuída dentro de três replicatas de 20 μι. cada uma em placas de amplificação de 96-poços seladas com filme termosselante e transparente (Marsh Bio Products). PCR foi executado em um instrumento ABI Prism 7700 usando os seguintes parâmetros de amplificação: 2 min a 50“C e 10 min a 95*0, seguidos de 35 ciclos de 15 s a 95Ό e 1 min a 600.
Resultados da análise TAQMAN demonstraram que o evento MIR162 possuía uma cópia do gene vip3Aa20 e uma cópia do gene pmi.
Os iniciadores e as sondas que foram utilizados nas reações TAQMAN PCR, são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. "Iniciadores" usados no ensaio TAQMAN.
Exemplo 3. Detecção de M1R182 por blot Southern O DNA genômico utilizado para a análise Southern foi separado do tecido de folha empoçado de 10 plantas representando a geração BC4 de MIR162 usando essencialmente o método de Thomas et a/. (Theor. Appl, Genet. 86:173-180, 1993), referência incorporada por referência. Todas as plantas usadas para isolamento do DNA foram individualmente analisadas usando TAQMAN PCR (como descrito no Exemplo 2) para confirmar a presença de uma única cópia do gene vip3Aa20 e do gene pmi. Para os controles negativos segregados, o DNA foi separado do tecido de folha empoçado dos segregados nega- tivos da geração BC4. Essas plantas negativas segregadas foram individualmente analisadas usando TAQMAN PCR para confirmar a ausência dos genes vip3Aa20 e pmi, mas foram, como esperado, positivas para o gene de milho endógeno adhl. A análise Southern foi conduzida usando técnicas convencionais de biologia molecular (Ver Chomczynski, P. 1992. Analytical Biochemistry 201:34-139). O DNA genômico (7.5 pg) foi digerido com enzimas de restrição que digerem dentro do suplemento do evento MIR162, mas não dentro da sequência codificadora que corresponde a uma sonda específica usada no experimento. Esse avanço permitiu a determinação de um número de cópias de cada gene, correspondendo a uma sonda específica usada para cada análise Southern, o qual foi incorporado dentro do evento MIR162.
Outras séries de digestões de restrição foram conduzidas nas quais o suplemento foi digerido com enzimas de restrição que poderíam liberar um fragmento de um tamanho conhecido do suplemento. Esse avanço fornece evidência adicional para a presença de uma única cópia de cada sequência codificadora presente no MIR162 e permitiu uma detecção de cópias parciais do suplemento, que podem estar intimamente ligadas ao suplemento MIR162. Dando sequência a uma eletroforese em gel de agarose e uma transferência alcalina para uma Zeta-Sonda® de membrana GT (Bio-Rad, Cat. N2 162-0195), as hibridizações foram conduzidas usando as sondas PCR de elementos geradas em comprimento total. As sondas foram marcadas com 32P via impregnação aleatória usando o sistema MegaPrime® (Amersham Biosciences, Cat. N2 RPN1607). A hibridização foi conduzida a 65Ό, seguida de enxágues múltiplos em 2X SSC, 0,1% SDS e depois 0,1X SSC e 0.1% SDS. As membranas foram submetidas à auto-radiografia.
Inclusas em cada análise Southern estão três amostras controle: (1) DNA de um segregado negativo (não-transformado) usado para identificar quaisquer sequências endógenas Zea mays que possam hibridizar-cruzado com a sonda específica-elemento; (2) DNA de um segregado negativo interno o qual é introduzido em uma quantidade de pNOV1300 digerido que é equivalente a um número de cópias no tamanho do plasmídeo introduzido, para demonstrar a sensibilidade do experimento em detectar uma única cópia contendo o geno-ma de Zea mays e (3) Plasmídeo pNOV1300 digerido análogo a um número de cópia baseado no tamanho do plasmídeo, para agir como controle positivo para hibridização tão bem como para demonstrar a sensibilidade do experimento.
Os resultados da análise Southern demonstraram que o suplemento MIR162 contém uma única cópia dos genes vip3Aa20 e pmi e não contém as sequências determinadoras de pNOV1300. Uma sonda vip3Aa19 (SEQ ID NO: 13) foi utilizada para a análise Southern de vip3Aa20. As sequências dos nucleotídeos vip3Aa19 e vip3Aa20 diferem por dois nucleotídeos e são 99,9 % idênticas. Por esta razão a sonda vip3Aa19 hibridizada para a sequência presente em MIR162 sob condições precisas. Usando a sonda vip3Aa19, uma digestão de Kpn\ e EcoRV resultou em bandas simples de hibridização com aproximadamente 8 kb e 13 kb de tamanho, respectivamente. Além do mais, uma dupla digestão Λ/col resultou em uma única banda de hibridização coerente com o tamanho esperado de 4.6 kb. Usando uma sonda pmi (SEQ ID NO: 14), uma digestão Acc65l e uma fíamHI resultaram em únicas bandas de hibridizações com tamanho aproximado de 4 kb e 6 kb, respectivamente. Além disso, uma dupla digestão Xma\ + H/ndlll resultou em uma única banda de hibridização coerente com o tamanho esperado de 8.1 kb. A banda 8.1 kb Xma\ + Hinó\\\ pNOV1300 (controle positivo) também hibridizou com as sondas vip3Aa19 e pmi conforme o esperado. Alguma hibridização cruzada no caminho do "plasmídeo-único" com a escada de sonda do DNA foi detectada. Tipicamente escadas de DNA disponíveis comercialmente, podem conter algumas sequências de vetor que podem cruzar hibridi-zadamente com as sequências do plasmídeo controle conforme observado nesses experimentos, porém não impactam as descobertas deste estudo. Finalmente, a sonda determinante não hibridizou demonstrando a ausência de qualquer incorporação de sequências do vetor pNOV1300 dentro do MIR162 durante os processos de transformação.
Exemplo 4. Seguenciamento do suplemento do DNA Heteróloqo A sequência de nucleotídeos do vip3Aa e pmi das sequências codifiçadoras na molécula de DNA heteróloga inserida em MIR162 foi determinada por demonstrar integridade total do suplemento, contiguidade dos elementos funcionais e por detectar quaisquer mudanças individuais no par de bases. As sequências codificadoras foram amplificadas do DNA derivado da geração BC4. A amplificação PCR foi conduzida usando um dos sistemas Expand High Fidelity PCR (Roche, Cat. N- 1732650) ou PfüUltra5 Hotstart High-Fidelity DNA po-limerase (Stratagene, Cat. N- 600390). Cada um dos produtos da PCR foi clonado individualmente dentro seja pelo vetor pCR^-XL-TOPO (In-vitrogen, Cat. N- K4700-20), ou pelo vetor pCR®-Bluntll-TOPO (Invitro-gen, Cat. Ns K2800-20) e, três clones separados para cada produto da PCR foram identificados e sequenciados. Sequenciamento foi conduzido usando um analisador ABI3730XL baseado em ABI BigDye® 1.1 ou química Big Dye 3.1 dGTP (para padrões enriquecidos para CG), A análise sequencial foi feita usando o Phred, Phrap, e pacote Consed da Universidade de Washington e conduzida em uma taxa de erro inferior a 1 em 10.000 bases (Ewing & Green, 1998. Genome Research 8:186-194). O consenso final da sequência de cada gene foi determinado pela combinação dos dados sequenciais de cada um dos três clones individuais para gerar um consenso para sequência de cada gene. O alinhamento sequencial foi conduzido usando o programa ClustalW utilizando os seguintes parâmetros: scoring matrix blosum55, gap opening penalty 15, gap extension penalty 6.66 (Thompson et al, 1994. Nucleic Acids Research 22:4673-4680). A sequência codificadora completa do vip3Aa20 foi amplificada por PCR usando os "iniciadores" MOV3Aa-01-5': 5ATGAACAAGAACAACACCAA3' (SEQ ID NO: 15) e MOV3Aa-01-3': 5'CTACTTGATGCTCACGTCGTAG3' (SEQ ID NO: 16) e enzima PfuUltra Hotstart gerando um produto 2370bp. O "amplicon" PCR foi sequenciado usando os "iniciadores" mostrados na Tabela 2.
Tabela 2.
Duas outras reações PCR se sobrepuseram à sequência codi- ficadora oompleta do vip3Aa20. O final 5’ de vip3Aa20 foi coberto com uma amplificação PCR usando os "inicia dores" 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEQ ID NO: 36) e VIP_R4 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (SEQ ID NO: 37) e enzima "Expansora de Alta Fidelidade". A segunda reação cobriu o final 3’ de vip3Aa20\ o produto foi amplificado com os "inicíadores" VIP-F3: 5‘GGTGCTGTTCGAGAAGAGGT3· {SEQ ID NO: 42) e PMI_REV1: 5'CGATTTATCACTCTCAATCACAT3' (SEQ ID NO: 43) e enzima Έχ-pansora de Alta Fidelidade". Os "amplicons" gerados por estas reações compreendem uma sequência de nucleotídeos 2946 bp (SEQ ID NO: 38) e uma sequência de nucleotídeos 2577 bp (SEQ ID NO: 44), respectivamente. O consenso dos dados sequenciais revelaram duas mudanças nos nucleotídeos na sequência codifiçadora de vip3Aa em MIR162 (designada vip3Aa20) comparada à sequência codificadora do vip3Aa em pNOV130Q (designada vip3Aa19), a qual foi usada para transformar MIR162. A primeira mudança de nucleotídeos, uma mutação de G para T, ocorreu na posição 387 da sequência codificadora do vip3Aa19 (SEQ ID NO: 3). Essa mutação resultou na metionina na posição 129 de Vip3Aa19 sendo trocada por uma isoleucina em Vip3Aa20 (M129I). A segunda mudança de nucleotídeos ocorreu na posição 1683 da sequência codificadora ocasionando uma mutação de G para C, porém não resultou em uma mudança de aminoácidos. Consequentemente, a sequência codificadora de vip3Aa20 e da proteína Vip3Aa20 são únicas para o evento MIR162 e podem ser usadas para identificar qualquer planta compreendendo o genótipo transgêní-co MlR162. A sequência codificadora pmi, MIR162 foi idêntica àquela na transformação do plasmídeo pNOV1300. Um alinhamento das proteínas inseticidas Vip3Aa20 e Vip3Aa19 é mostrado na Tabela 3. Tabela 3. Comparação das sequências de aminoácidos de Vip3Aa20 e Vip3Aa19.
A caixa sombreada indica a mudança no aminoácido. Exemplo 5. Análise da Sequência de Pareamento do DNA
Um número de métodos é conhecido por aqueles com habilidade na técnica de amplificar sequências de DNA desconhecido adjacentes a uma região nuclear de sequência conhecida. Esses métodos incluem, mas não são limitados por PCR inverso (iPCR) [Ochman et. al., Genetics 120:621-623 (1988); Triglia et. al., Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)], PCR "cabo de caçarola" [Jones e Winistorfer, Nucleic Acids Res. 20:595-600 (1992); Jones e Winistorfer, Biotechniques 23:132-138 (1997)], PCR ligação-ancorada cassete [Mueller e Wold, Science 246:780-786 (1989)], PCR-vetorette [Riley et. al., Nucleic Acids Res. 18:2887-2890 (1990)], novo-Alu-PCR [Puskas et. al., Nucleic Acids Res. 22:3251-3252 (1994)] e PCR Interlaceamento Termo-Assimétrico (TAIL-PCR) [Liu e Whittier, Genomics 25:673-681 (1995)].
Um método utilizado pra amplificar o genoma do DNA do milho, sequência de pareamento do DNA heterólogo dentro do evento MIR162, foi PCR vetorette essencialmente como descrito por Riley et al., Nucleic Acids Res. 18:2887-2890 (1990), referência incorporada por referência. A sequência de pareamento 5' e a sequência de junção foram confirmadas usando procedimentos PCR padrão. Os pares do "iniciador" sequentes, ou complementos dele, foram usados para confirmar a sequência: 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEQ ID NO: 36)/ VIP_R4: 5'G AAGGT GTT CAGGT AG AACT CGAAG3' (SEQ ID NO: 37) e CJB179: 5ΆΤGCAAATAGGCTGGGAATAGTC3' (SEQ ID NO: 39)/ CJB134 5'GTACCAGCTTGCTGAGTGGCT3' (SEQ ID NO: 40). O "amplicon" resultante teve a sequência mostrada em SEQ ID NO: 41 e compreende a sequência de junção 5' do SEQ ID NO: 45. Será reconhecido que outras sequências de "iniciador" podem seu utilizadas para confirmar as sequências de pareamento e de junção. Usando este método, o suplemento MIR162 foi encontrado como sendo pareado a 5' pelos nucleotídeos 1040-1088 da sequência genômica do milho mostrada em SEQ ID NO: 46.
Uma região mais ampla da sequência de pareamento 5' do evento MIR162 foi gerada usando o kit Seegene DNA Walking Spee- dUp® Premix seguindo as instruções do fabricante.
Uma primeira reação PCR foi conduzida independentemente em quarto tubos individuais usando "iniciador" FE1002: 5'CGTGACTCCCTTAATTCTCCGCT3' (SEQ ID NO: 50) com uma dos "iniciadores" DW-ACP 1, 2, 3, ou 4 fornecidos pelo fabricante. Os seguintes reagentes foram misturados em um tubo PCR em gelo: 100 pg DNA genômico MIR162, 4 μΙ 2,5 μΜ DW-ACP (um de cada com o DW-ACP 1, 2, 3, ou 4), 4 μΙ 2,5 μΜ FE1002, 19 μΙ água destilada, e 25 μΙ 2X SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Os tubos foram submetidos à preaquecimento num ciclador térmico (9413). PCR foi completado usando o seguinte protocolo: um ciclo a 94*C por ci nco minutos, 420 por um minuto e, 72*0 por dois minutos, 30 ciclos d e 940 por 40 segundos, 550 por 40 segundos, e 720 por 90 segundo s, e um ciclo a 720 por sete minutos. Os produtos do PCR foram pur ificados usando exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão.
Uma segunda reação PCR foi conduzida em quatro tubos individuais usando "iniciador" FE1003: 5'GATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTT3' (SEQ ID NO: 51) com o "ini-ciador" DW-ACPN fornecido pelo fabricante do kit. Os seguintes reagentes foram misturados em um tubo PCR em gelo: 3 μΙ do produto PCR purificado, 1 μΙ 10 μΜ DW-ACPN, 1 μΙ 10 μΜ FE1003, 5 μΙ água destilada, e 10 μΙ 2X SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Os tubos foram submetidos à pré-aquecimento (940) em ciclador térmico. PCR foi completado adotando o seguinte protocolo: um ciclo a 940 por cinco minutos, 35 ciclos a 94*0 por 40 segundos, 6013 por 40 segundos, e 7213 por 90 segundos, e um ciclo a 720 por sete minutos.
Uma terceira reação PCR foi conduzida independentemente em quatro tubos individuais usando o "iniciador" FE1004: 5'GATT GT CGTTT CCCGCCTT CAGTT3' (SEQ ID NO: 52) com o "iniciador Universal" fornecido pelo fabricante. Os seguintes reagentes fo- ram misturados em tubo PCR em gelo: 2 μΙ de produto PCR purificado, 1 μΙ 10 μΜ "iniciador Universal", 1 μΙ 10 μΜ FE1004, 6 μΙ água destilada, e 10 μΙ 2X SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Os tubos foram submetidos à pré-aquecimento (940) em ciclador térmico. PCR foi completado adotando o seguinte protocolo: um ciclo a 940 por cinco minutos, 35 ciclos a 940 por 40 segundos, 600 por 40 segundos, e 720 por 90 segundos, e um ciclo a 720 por sete mi nutos.
Dez μΙ dos produtos do PCR foram corridos em gel de aga-rose contendo 1% brometo de etídio. A banda apropriada foi extraída do gel de agarose e purificada usando um kit de extração Qiagen Qia-quick Gel de acordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído foi clonado em um vetor de clonagem Invitrogen TOPO-XL de acordo com as instruções do fabricante. Este clone foi transformado dentro de E. coli, e o DNA do plasmídeo foi extraído das células após uma noite crescendo com um kit Qiagen Miniprep de acordo com as instruções do fabricante. Este plasmídeo foi utilizado para eluir o sequenciamen-to.
Um novo "iniciador" foi projetado contendo uma nova sequência previamente conhecida, para ser usada com um "iniciador" no suplemento do DNA heterólogo para amplificar a completa sequência de pareamento 1 kb fora da sequência de pareamento do "iniciador" do DNA genômico. A sequência de pareamento do "iniciador" 162DWConf3: 5'CCTGTGTTGTTGGAACAGACTTCTGTC3' (SEQ ID NO: 53) e suplemento do DNA "iniciador" FE0900: 5'GGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC3' (SEQ ID NO: 54) foram usados para amplificar a molécula de ácido nucléico contendo a sequência de pareamento 5' para confirmação. A sequência do "ampli-con" resultante é publicada em SEQ ID NO: 55. Este "amplicon" 5' compreende a sequência de junção 5' publicada em SEQ ID NO: 45.
Dez μΙ do produto PCR ("amplicon") foram corridos em gel de agarose contendo 1% de brometo de etídio. A banda apropriada foi extraída do gel de agarose e purificada usando um kit de extração Qiagen Qia-quick Gel de acordo com as informações do fabricante. O DNA extraído foi clonado dentro de um vetor de clonagem Invitrogen TOPO-XL de acordo com as instruções do fabricante. Este clone foi transformado dentro de uma E. coii. O DNA do plasmídeo foi extraído das células após crescimento noturno em meio de cultura com um kit Qiagen Miniprep seguindo as instruções do fabricante. Três plasmideos foram completamente se-quenciados usando os "iniciadores" mostrados na Tabela 4. As sequências dos plasmideos foram alinhadas para gerar a confirmação completa da sequência de pareamento 5'. Usando este método aproximadamente, 1 kb da sequência de pareamento 5' (SEQ ID NO: 46) foi determinada.
Tabela 4. Sequências do iniciador". A sequência de pareamento 3' do evento MIR162 foi gerada usando um "kit Universal" Clonetech GenomeWalker™ {Clonetech Laboratories, Inc.) seguindo as instruções do fabricante.
Primeiro, poços de adaptador-ligado aos fragmentos de DNA genômico não clonado, conhecidos como "bibliotecas" GenomeWalker foram construídas. Cada biblioteca foi construída pela digestão do DNA genômico MIR162 com uma enzima de restrição(Dral, EcoRV, Pvull, SM, and Xmn\) como se segue: por exemplo, 25 μ! de DNA genômico MIR162 (0.1 pg/μΙ), 8 μΙ da enzima de restrição (10 unids/μΙ), 10 μΙ do tampão para enzima de restrição (10X), e 57 μΙ H20 destilada foram misturados em um tubo e incubados a 37Ό por uma noite. DNA foi então purificado realizando várias series de extração de fenol/ clorofórmio. Finaimente, o DNA foi precipitado e lavado com etanol, seco e dissolvido em 20 μΙ de tampão TE.
Para ligar o adaptador GenomeWalker no final do DNA genômico do MIR162, 4μΙ do DNA genômico purificado e digerido, foi misturado com 1,9 μΙ do adaptador GenomeWalker (25 μΜ), 1,6 μΙ 10X Tampão de Ligação, e 0,5 μΙ T4 DNA Ligase (6 unids/μΙ). Essas reações foram incubadas por uma noite a 160. As reações foram paralisadas com incubação a 700 por cinco minutos. Após a parada da reação, 72 μΙ de TE foram adicionados em cada tubo, e os conteúdos foramagitadoscompletamente, Uma primeira reação PCR foi conduzida usando "iniciador" AP1, fornecido pelo fabricante, com "iniciadores" diferentes projetados contendo sequência conhecida do suplemento de DNA heterólogo (Ciclo 1 "iniciadores específicos do gene" ou "GSP1"). Os seguintes rea- gentes foram misturados em um tubo PCR em gelo: 1 μΙ do DNA MIR162 apropriado da biblioteca, 1 μ110 μΜ AP1, 1 μ110 μΜ GSP1, 1 μΙ 10 mM dNTPs, 5 μΙ 10Χ Tampão Advantage 2 PCR, 1 μΙ of BD Advanta-ge 2 polimerase, e 40 μΙ água destilada. PCR foi completado adotando o seguinte protocolo: sete ciclos a 9413 por 25 segun dos e 72*0 por quatro minutos, 32 ciclos a 94G por 25 segundos e 67° C por quatro minutos e, um ciclo a 67*0 por quatro minutos. Cada rea ção PCR primária foi diluída 50 vezes pela adição de 1 μΙ do produto PCR primário, com 49 μΙ de água destilada. As reações que funcionaram foram (1) as bibliotecas Dral e Xmnl com o iniciador GSP1 162GW3F1: 5ΤCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEQ ID NO: 56) e "iniciador" AP1.
Uma segunda reação PCR foi conduzida independentemente usando "iniciador" AP2, fornecido pelo fabricante, com diferentes "iniciadores" projetados contendo a sequência conhecida do suplemento DNA heterólogo (Ciclo 2 "iniciadores específicos do gene" ou "GSP2"). Os seguintes reagentes foram misturados em um tubo PCR em gelo: 1 μΙ do produto PCR primário apropriado, 1 μΙ 10 μΜ AP2, 1 μΙ 10 μΜ GSP2, 1 μΙ 10 mM dNTPs, 5 μΙ 10Χ Tampão Advantage 2 PCR, 1 μΙ of BD Advantage 2 polimerase, e 40 μΙ água destilada. PCR foi completado adotando o seguinte protocolo: cinco ciclos a 940 por 25 segundos e 7213 por quatro minutos, 20 ciclos a 9413 por 25 segundos e 670 por quatro minutos, e um ciclo a 6713 por quatro minutos. As reações que funcionaram foram (1) as bibliotecas Dral e Xmnl com o "iniciador" GSP2, 162GW3F2: 5'AAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG3' (SEQ ID NO: 57) e "iniciador" AP2.
Dez μΙ dos produtos do PCR foram corridos em um gel de agarose contendo 1% de brometo de etídio. A banda apropriada foi extraída do gel de agarose e purificada usando um kit de extração Qi- agen Qiaquick Gel de acordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído foi clonado dentro de um vetor de clonagem Invitrogen TOPO-XL de acordo com as instruções do fabricante. Esse clone foi transformado dentro de uma E. coli, e o DNA do plasmídeo foi extraído das células após uma noite de crescimento, usando um kit Qiagen Mini-prep seguindo as instruções do fabricante. Esse plasmídeo foi se-quenciado usando sequenciamento final de eluição.
Um novo "iniciador" foi projetado contendo uma nova sequência previamente conhecida, para ser usada com um iniciador no DNA suplementar para amplificar aproximadamente 1 kb da sequência de pareamento de 3' fora do DNA genômico. O "iniciador" de DNA suplementar 162GW3F1: 5ΤCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEQ ID NO: 56) e um "iniciador" de sequência de pareamento 3' 1623'GWR1: 5CTGGTGAACCGATTTTTACGGAGG3' (SEQ ID NO: 58) foram usados para amplificar uma molécula de ácido nucléico compreendendo a sequência de pareamento 3' para confirmação. A sequência do "ampli-con" resultante é publicada em SEQ ID NO: 59. Esse "amplicon" 3' compreende a sequência de junção 3' publicado em SEQ ID NO: 47. Dez μΙ do "amplicon" PCR foi eluído em gel de agarose contendo 1% de brometo de etídio. A banda apropriada foi extraída do gel de agarose e purificada, usando um kit de extração Qiagen Qiaquick Gel de acordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído foi clonado dentro de um vetor de clonagem Invitrogen TOPO-XL de acordo com as instruções do fabricante. Esse clone foi transformado dentro de E. coli. DNA do plasmídeo foi extraído das células após crescimento em meio de cultura durante a noite, com um kit Qiagen Miniprep, de acordo com as instruções do fabricante. Três plasmídeos foram completamente sequenciados usando os "iniciadores" mostrados na Tabela 5. As sequências dos plasmídeos foram alinhadas para gerar a confirma- ção completa da sequência de pareamento 3' (SEQ ID NO: 48).
Tabela 5. Sequência do "iniciador11.
Exemplo 6. Detecção da proteína Vip3Aa20 em MIR162 por ELISA
Os extratos foram preparados das folhas» raízes, cerne, ca- roço, seda, pólen e das plantas completas MIR162. Elas foram quantitativamente analisadas para Vip3Aa20 por ELISA usando imunoafini-dade, anti-Vip3A purificada de cabra, proteína A-purificada de coelho e anticorpos policlonais anti-Vip3A usando método conhecido como procedimento ELISA. Vip3Aa20 foi detectado em todos os tecidos analisados para todos os estágios de crescimento. O significado do nível de proteína Vip3Aa20 detectado em planta inteira durante a florescência e maturidade da semente foi 10 pg/g peso fresco e 16 pg/g peso fresco, respectivamente. O significado dos níveis de proteína Vip3Aa20 nas folhas durante a florescência foi 22 pg/g peso fresco.
Exemplo 7. Eficácia do MIR162 em campo. O evento MIR162 foi testado em campo para a eficácia contra lagarta de cereais (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta do milho (CEW, Helicoverpa zea), lagarta rosca (BCW, Agrotis ipsilon), e broca do milho Europeu (ECB, Ostrinia nubilalis). Performance do evento MIR162 foi comparada àquela do Warrior® (Syngenta, Inc.), um inseticida convencional padrão aplicado em uma taxa de 11,2 g a.i./acre, evento milho transgênico Bt11, compreendendo um gene crylAb, e um híbrido Bt11 X MIR162, produzido pelo cruzamento de uma linhagem inata Bt11 com uma linhagem inata MIR162.
Vinte e oito provas foram plantadas em 13 estados que representam as maiores regiões de cultivo de milho dos Estados Unidos continental. Provas foram plantadas randomicamente em blocos completos projetados com quatro canteiros replicados em cada bloco. Os canteiros possuíam 5,334 metros (17,5 pés) por fileira por tratamento por replicação. A densidade de plantio objetivada era de aproximadamente 30.000 plantas/acre. Faixas do Immunodiagnóstico foram utilizadas para confirmar a presença ou a ausência das proteínas Vip3Aa20 e CrylAb em diferentes grupos de tratamento.
Pestes de infestações naturais que foram utilizadas nas provas onde as populações eram suficientemente altas; onde não o eram, infestações artificiais foram induzidas. Infestação artificial com dois, 2°- ao 3o "instar" larval a V1-V2, foi utili zado nas provas BCW. Os canteiros foram avaliados a 3, 7, e 14 dias pós-infestação. Os danos em BCW foram relatados como plantas parcialmente danificadas e plantas completamente cortadas. Os canteiros FAW foram avaliados 7 e 14 dias pós-infestação ou após o 3o estágio larva I foram observados nas plantas controle. A seguinte escala foi usada para avaliar os danos nas folhas em FAW e CEW: - Nenhum dano visível à folha - Dano buraco-de-alfinete em poucas folhas - Pequena quantidade de buraco-de-tiro em poucas folhas - Dano buraco-de-tiro em várias folhas - Dano buraco-de-tiro e lesões em poucas folhas - Lesões em várias folhas - Lesões amplas em várias folhas - Lesões amplas e porções devoradas em poucas folhas - Lesões amplas e porções devoradas em várias folhas - Lesões amplas e porções devoradas na maioria das folhas Danos nas plantas foram estimados para ambos, primeira e segunda geração ECB. A seguinte escala foi usada para classificar danos da primeira geração, tipicamente quando as larvas do 3o ao 4o "instar": 1 - Nenhum dano visível às folhas 2 - Pequena quantidade de feridas buraco-de-tiro em poucas folhas 3 - Feridas buraco-de-bala comuns em várias folhas 4 - Várias folhas com buracos-de-tiro e lesões alongadas 5 - Várias folhas com lesões alongadas 6 - Várias folhas com lesões alongadas cerca de 2,5 cm 7 - Lesões longas comuns em cerca de metade das folhas 8 - Lesões longas comuns em cerca de dois terços das folhas - Maioria das folhas com lesões longas Danos à segunda geração ECB foram estimados de três a quatro semanas após infestação artificial ou ao final do período de postura de ovos. As seguintes medições foram tomadas: número de larvas vivas/talo, número de larvas vivas/pé, Número de larvas vi-vas/espiga, Número de túneis/talo, comprimento cumulativo do túnel (cm}/talo, comprimento cumulativo do túnel (cm )/pé, Número de tú-neis/espiga, comprimento cumulativo túnel dano no caroço (cm}/espiga, e % de plantas infestadas.
As provas CEW foram geral mente plantadas tardiamente para aumentar os níveis de infestação natural. O dano por alimentação das espigas foi avaliado quando larvas CEW nas plantas controle estavam em estágio de crescimento L5-L6. Espigas avaliadas incluíram o registro do número de larvas observado por espiga e o comprimento visível do túnel por alimentação do caroço, medindo da ponta da espiga até a média do caroço mais baixo destruído.
Os resultados do teste de BCW em campo são mostrados na Tabela 6. Menos que 3% das plantas MIR162 e plantas Bt11 X MIR162 foram cortadas pelas larvas BCW. Números signíficantes de Bt11 e das plantas controle foram cortadas. Plantas contendo o genó-tipo MIR162 tiveram menos danos de alimentação por BCW que as plantas tratadas com inseticidas convencionais.
Tabela 6. Danos aos talos das cinco provas com BCW 21 dias após infestação. Os danos foram avaliados com o percentual total de plan- tas cortadas.
Os resultados da prova FAW em campo são mostrados na Tabela 7. Dano por alimentação de FAW foi avaliado em uma escala de 0,01 a 9. O significado do dano por alimentação nos híbridos de M1R162 foi muito baixo (< 1} e significantemente mais baixo que os danos médios observados em Bt11 e com tratamentos por inseticidas convencionais. A opressão de insetos nessas provas foi muito forte com aproximadamente 50 a 100 larvas recém-nascidas/planta. Bt11 promoveu alguma proteção contra danos, considerando que o tratamento convencional com inseticida não promoveu proteção, apresentando a mesma quantidade de danos que o controle.
Tabela 7. Taxa de danos oor alimentação das folhas de cinco provas para FAW. O significado da taxa de danos 14 dias aoós a infestação é apresentado para cada tratamento.
Os resultados das provas estimados para a primeira geração ECB são apresentados na Tabela 8. Dano por alimentação por ECB foi classificado em uma escala de 1-9. Nessas provas, MIR162 conferiu mínima proteção contra danos for alimentação contra ECB. Bt11 protegeu completa mente as plantas dos danos contra alimenta- ção de ECB. As plantas Bt11 X MIR162 possuíram o mesmo nível de proteção que as plantas Bt11. O tratamento com inseticida convencional promoveu melhor proteção que o traço de MIR162, porém signifi-cantemente menos proteção que àquela promovida por Bt11.
Tabela 8. Danos por alimentação das folhas teste em campo. O significado das taxas de danos 14 dias após a infestação.
Os resultados dos danos provocados por ECB à segunda geração são apresentados na Tabela 9. Os danos por alimentação foram medidos como comprimento cumulativo do túnel em cada talo de milho (se mais de um túnel fossem encontrados, os comprimentos seriam somados). Os tratamentos Bt11 e Bt11 x MIR162 promoveram forte proteção contra a perfuração dos talos, considerando não existir proteção contra o tunelamento que foi promovido somente pelo MIR162 ou com o tratamento pelo inseticida.
Tabela 9. Taxas de danos de sete provas da segunda geração larvas ECB medidos em comprimento de túnel fcm) por talo. As medidas foram tomadas de três a quatro dias após a infestação artificial.
Resultados das provas para os danos estimados CEW são apresentados na Tabela 10. Danos por alimentação foram classifica- dos pelo comprimento do túnel por espiga, medidos da ponta da espiga até a média do caroço mais baixo destruído. Danos significantes das espigas foram observados em Bt11, inseticida, e canteiros de controle. Bt11 promoveu algum nível de proteção comparado ao controle não tratado e foi comparado à proteção promovida pelo tratamento convencional com inseticida. MIR162 e Bt11 X MIR162 promoveram proteção quase completa para as espigas do dano por alimentação das larvas CEW.
Tabela 10. Taxas de danos às espigas de seis provas para CEW medidos como médias do comprimento dos danos de alimentação. As medidas foram tomadas guando larvas CEW estavam L5-L6 em plantas controle.
Exemplo 8. Eficácia de MIR162 contra a laaarta do feiião ocidental fWBCWt.
Os eventos transgênicos comerciais produtores da proteína CrylAb não promoveram níveis aceitáveis de proteção contra a lagarta do feijão ocidental (WBCW, Stríacosta albicosta). Por esta razão, o MIR162 sozinho e combinado com outros genótipos transgênicos foi testado para eficácia contra WBCW.
Os ovos de WBCW foram coletados de uma mariposa fêmea selvagem, capturada. As larvas foram alimentadas com uma dieta "meridic" para larvas cortadoras até serem utilizadas nos experimentos. Plantas de milho foram desenvolvidas em campo. Os seguintes tratamentos foram testados: MIR162, Bt11, MIR604, MIR162 X Bt11, MIR162 X MIR604, MIR604 X Bt11, Force® (Syngenta, Inc.), um inseti- cida convencional aplicado ao plantio para uma isolinhagem negativa, e dois controles isolinhagens negativos. MIR604 é um novo evento milho transgênico que compreende um gene cry3A055 codificador da proteína que é ativa contra a larva da praga do milho (Diabrotica spp.) e é revelado em um pedido de patente nos EUA número de publicação N°. 2005/0216970, publicada em 29 de Setembro de 20 05, referência incorporada por referência.
Para os experimentos, um pedaço de duas polegadas das sedas verdes e da casca foi cortado das espigas de um campo de crescimento de plantas de milho em cada tratamento e réplica. As terminações finais marrons das sedas foram removidas e as cascas, descartadas. Aproximadamente 3,81 cm (1,5 polegadas) das sedas foram colocadas em copos plásticos individuais de 14 ml. Uma larva foi colocada em cada copo e os copos foram selados. Vários estágios diferentes de larvas foram testados variando do 3o ao 6o "instar". Copos contendo sedas e as larvas foram mantidos a um período de dia natural a temperatura ambiente durante a permanência dos experimentos. A sobrevivência das larvas foi registrada após oito dias. Os tratamentos foram realizados em quatro replicatas por experimento.
Os resultados dos experimentos com WBCW são apresentados na Tabela 11. Sobrevivência de WBCW nas sedas das isolinhagens negativas e do tratamento convencional com inseticida foi próximo de 100%. Sobrevivência das larvas WBCW nas sedas Btll e MIR604, testadas quer sejam sozinhas, ou em combinação na mesma planta, não foi diferente dos sobreviventes das isolinhagens negativas. Sobrevivência das larvas WBCW foi reduzida quando as larvas foram alimentadas com as sedas de MIR162. A combinação de MIR162 X Bt11 na mesma planta não promoveu a redução da sobrevivência que o MIR162 sozinho. Entretanto, surpreendentemente, quando o genóti-po transgênico de MIR162 foi combinado com o genótipo transgênico de MIR604 na mesma planta, a mortalidade larval aumentou significa-tivamente quando comparado ao MIR162 ou ao MIR604 sozinhos. Tabela 11. Percentual (±SE) sobrevivência de larvas WBCW nas sedas de milho.
Exemplo 9. Uso do sítio de inserção do evento MIR162 para integração objetivada no milho.
As sequências de pareamento do MIR162 reveladas em SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48 Foram usadas para busca de "milhos” em bases de dados genômicos. Pares idênticos para ambas as sequências de pareamento foram encontradas em um clone BAC, CH201-307P5, do cromossomo (NCBI Ne acesso. AC18531 3) em Con-tig 13 {SEQ ID NO: 106). Mais especificamente, o suplemento MIR162 está no cromossomo 5 entre um marcador molecular 5\ designado por referência como marcador Opie2 {nucleotídeos 1680-3338 do SEQ ID NO: 106), e um marcador molecular 3’, designado por referência como marcador gag (nucleotídeos 43.275-45.086 do SEQ ID NO: 106). Usando esta informação, foi determinado que o DNA heterólogo inserido dentro de MIR162 desordenou 58 nucleotídeos do milho DNA ge-nômico, nucleotídeos 25.455 para 25.512 do SEQ ID NO: 106 (também mostrado como SEQ ID NO: 107), o qual está entre a sequência de pareamento 5' (nucleotídeos 1-25.454 do SEQ ID NO: 106) e a sequência de pareamento 3' (nucleotídeos 25.513-51.328 do SEQ ID NO: 106). A performance agronômica consistente do transgene do evento MIR162 sobre várias gerações sob condições de campo, sugere que essas regiões identificadas ao redor do sítio de inserção em MIR162 forneceram boas posições genômicas para a integração desejada dos outros genes transgênicos de interesse. Tal integração desejada supera os problemas com o que chamamos de "efeitos de posição", e o risco de criar uma mutação no genoma sobre integração do transgene dentro do hospedeiro. Outras vantagens de tal integração desejada incluem, mas não se limitam a, redução do amplo número de eventos de transformação que precisam ser rastreados e testados antes da obtenção de uma planta transgênica que exiba o nível desejado da expressão do transgene sem que também exiba anormalidades resultantes da inserção indevida do transgene dentro de um lócus importante no genoma do hospedeiro. Além disso, tal integração desejada permite abundância da execução e criação de transgenes de linhagens de plantas de elite com ambos os genes mais eficientes.
Usando o preceito acima descrito, a pessoa habilidosa é apta a usar métodos conhecidos na ciência para atingir ácidos nucléi-cos heterólogos de interesse para o mesmo sítio de inserção no cromossomo 5 como aquele no MIR162 ou para um sítio em justa proximidade ao sítio de inserção em MIR162. Um desses métodos é descrito em Publicação de Pedido Patente Aplicação EUA N°. 20060253918, incorporada na íntegra por referência para referência. Brevemente, acima de 20 Kb de sequência genômica de pareamento 5' para o sítio de inserção (nucleotídeos 5.454 a 25.454 de SEQ ID NO: 106) e acima de 20 Kb de sequência genômica de pareamento 3' para o sítio de inserção (nucleotídeos 25.513 a 45.513 de SEQ ID NO: 106) são usados para parear o gene ou os genes de interesse que são pretendidos a serem inseridos dentro de uma locação gênica no Cromossomo 5 via recombinação homóloga. Essas sequências podem ser promovidas pareando a margem do T-DNA repetidamente tal como a borda esquerda {LB) e a borda direita (RB) sequências repetidas e outras sequência íncentivadoras para aumentara eficiência de livramento de T-DNA. O gene ou os genes de interesse podem ser colocados exatamente como no sítio de inserção do MIR162 ou podem ser colocadas em qualquer lugar contendo as regiões 20 Kb ao redor dos sítios de inserção MIR162 para conferir níveis consistentes de expressão do transgene sem efeitos prejudiciais à planta. Os vetores de DNA contendo o gene ou os genes de interesse e as sequências de parea-mento podem ser liberados dentro das células das plantas via um dos vários métodos conhecidos por aqueles especialistas na área, incluindo, porém não limitando a transformação mediada pelo Agrobacterium, A inserção do vetor DNA dentro do sítio alvo do MIR162 pode ser acentuada por um dos vários métodos, incluindo, mas não limitando à co-expressão ou a super-regulação da recombinação dos genes intensificados ou a sub-regulação da recombinação endógena dos genes de supressão. Além disso, é conhecida na ciência que a divagem de sequências específicas do genoma, pode ser usada para aumentar a frequência de recombinação homóloga, por esta razão a inserção dentro do sítio de inserção em MIR162 e suas regiões de pareamento podem ser acrescidas pela expressão da sequência-específica de endo-nucleases natural ou projetada para clivar essas sequências. Contudo usando o preceito fornecido por referência, qualquer ácido nucléico heterólogo pode ser inserido no cromossomo milho 5 em um sitio alvo localizado entre os nucleotídeos 25.454 e 45.513 de SEQ ID NO: 106 ou em um sítio alvo na vizinhança deste sítio.
Exemplo 10. Uso do sítio de inserção do evento MIR182 e sequências de pareamento para estabilização da expressão do gene.
As sequências genômicas de pareamento do sítio de inserção do MIR162 também podem ser usadas para estabilizar a expressão de outro(s) gene(s) de interesse quando inseridos como um trans-gene em outras posições genômicas no milho e em outros cultivos. Especificamente, acima de 20 Kb da sequência genõmíca de pareamento 5' para o sítio de inserção (nucleotídeos 5.454 a 25.454 de SEQ ID NO: 106) e acima de 20 Kb da sequência genômica de pareamento 3’ para o sitio de inserção (nucleotídeos 25.513 a 45.513 de SEQ ID NO: 106) são usados para parear o gene ou os genes de interesse que são pretendidos a serem inseridos dentro do genoma das plantas. Essas sequências podem ser promovidas pareando a margem do ΤΟΝ A repetidamente tal como a borda esquerda (LB) e a borda direita (RB) sequências repetidas e outras sequência incentivadoras para aumentar a eficiência de livramento de T-DNA. O gene ou os genes de interesse podem ser colocados exata mente como no sítio de inserção em MIR162 ou podem ser colocadas em qualquer lugar interiormente as regiões 20 Kb ao redor dos sítios de inserção em MIR162 para conferir níveis consistentes de expressão do transgene. Os vetores de DNA contendo o gene ou os genes de interesse e a sequência de pareamento do sítio de inserção de MIR162 podem ser liberados dentro das células da planta via um dos vários métodos conhecidos àqueles habilidosos na ciência, incluindo, mas não limitando a transformação "protoplaf, bombardeamento biolítico e a transformação mediada via Agrobacteríum. O DNA liberado pode se integrar randomicamente dentro de um genoma da planta ou também se fazer presente como parte das unidades genéticas independentemente segregadas tais como um cromossomo ou um minicromossomo. Os vetores de DNA contendo o(s) gene(s) de interesse e as sequências de pareamento do sítio de inserção de MIR162 podem ser liberados dentro das células da planta.
Deste modo, circundando um gene ou genes de interesse com a sequência genômica de pareamento o sítio de inserção de MIR162, a expressão de tais genes é estabilizada em plantas transgênicas hospedeiras tais como planta dicotiledônea ou uma planta monocotiledô-nea como a planta de milho.
DEPÓSITO
Peticionários fizeram um depósito das sementes de milho do evento MIR162 revelado acima anteriormente a 23 de Janeiro de 2007 de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Cultu-re Colection (ATCC), 1801 Universidade de Boulevard, Manassas, VA 20110 sob N°de acesso ATCC N°. PTA-8166. O depósit o será mantido no depositário por um período de 30 anos, ou 5 anos após o ultimo pedido, ou o tempo de vida efetivo da patente, o qual for mais tardio, e será substituído se necessário durante aquele período. Peticionários não impõem restrições sobre a disponibilidade do material depositado do ATCC; contudo, peticionários não têm autoridade para protelar qualquer uma das restrições impostas pela lei posto à transferência de material biológico ou sua transportação em comércio. Peticionários não protelam qualquer violação de seus direitos garantidos sob esta patente ou sob a Proteção de Variedade de Plantas (Plant Variety Pro-tection) decreto 7 USC 2321 et seq.
Todas as publicações e documentos da patente publicados, citados neste relatório são incorporados para referência na mesma extensão que cada publicação individual ou documento de patente foi especificamente e individualmente indicado a serem incorporados segundo referência.
REIVINDICAÇÕES
Claims (22)
1. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que é única ao evento MIR162, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e complementos das mesmas.
2. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, e de seus complementos.
3. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
4. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico é compreendida numa semente de milho depositada na American Type Culture Collection sob número de acesso N°. PTA-8166.
5. Amplicon, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1.
6. Par de iniciadores de polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo os quais funcionam juntos na presença de um DNA modelo do evento MIR162 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico do evento MIR162, em que o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos seleciona- da a partir do grupo consistindo nos nucleotídeos 1-1088 de SEQ ID NO: 49, nucleotídeos 9391-10579 de SEQ ID NO: 49, e seus complementos, e em que o segundo iniciador de polinucleotídeos compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 1089-9390 de SEQ ID NO: 49, ou seus complementos, e em que o referido evento de milho MIR162 apresenta a sequência de SEQ ID NO: 49 no geno-ma do milho.
7. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de iniciador é selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NOs: 68-72, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NOs: 97-105, e seus complementos, e em que o segundo iniciador de polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15-35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NOs: 50-52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, e seus complementos.
8. Método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única para o evento MIR162 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos de milho, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar a amostra em contato com um par de iniciadores como definidos na reivindicação 6; (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, de forma a produzir um amplicon; e (c) detectar o amplicon, em que o amplicon compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, ou seus complementos, em que o referido evento de milho MIR162 apresenta a sequência de SEQ ID NO: 49 no genoma do milho.
9. Método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única para o evento MIR162 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos do milho, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar a amostra em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de alto rigor com DNA genômico do evento MIR162 e não hibridiza sob condições de alto rigor com DNA de uma planta de milho controle, em que a sonda compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e de seus complementos; (b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização de alto rigor; e (c) detectar hibridização da sonda para a molécula de ácido nucléico em que o referido evento de milho MIR162 apresenta a sequência de SEQ ID NO: 49 no genoma do milho.
10. Kit para detecção de ácidos nucléicos que são únicos para o evento MIR162, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico que é um iniciador ou sonda compreendendo uma sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 15-37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NOs: 50-54, SEQ ID NOS: 56-58, SEQ ID NOs: 60-105, e os complementos das mesmas, e os quais, ao amplificar ou hibridizar uma sequência de ácidos nucléicos alvo numa amostra seguida pela detecção do amplicon ou hibridização com a sequência alvo, são diagnósticos para a presença das sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento MIR162 na amostra.
11. Amostra biológica, caracterizada pelo fato de que é derivada de uma planta de milho, tecido, ou semente do evento MIR162, em que a amostra é selecionada a partir do grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais fabricados no todo ou em parte contendo produtos derivados de milho, em que a amostra compreende uma sequência de nucleotídeos a qual é ou é complementar à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59 e em que a sequência é detectável na amostra usando uma amplificação de ácido nucléico ou método de hibridização de ácido nucléico.
12. Extrato, caracterizado pelo fato de que é derivado de uma amostra biológica de uma planta de milho, tecido, ou semente do evento MIR162, em que a amostra é selecionada a partir do grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais fabricados no todo ou em parte contendo produtos derivados de milho, em que o extrato compreende uma sequência de nucleotídeos a qual é ou é complementar à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59.
13. Extrato de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sequência é detectável no extrato usando um método de amplificação de ácido nucléico ou de hibridização de ácidos nucléicos.
14. Método para produção de uma planta de milho resistente a pestes lepidópteras compreendendo o evento MIR162, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cruzar sexualmente uma primeira planta de milho progenitora com uma segunda planta de milho progenitora, em que a referida primeira ou segunda planta de milho progenitora compreende o DNA evento MIR162, de forma a produzir uma pluralidade de plantas descendentes de primeira geração; (b) selecionar uma planta descendente de primeira geração que seja resistente a infestação por insetos lepidópteros; (c) autopolinizar a planta descendente de primeira geração , de forma a produzir uma pluralidade de plantas descendentes de segunda geração; (d) selecionar a partir das plantas descendentes de segunda geração, uma planta que seja resistente a pestes lepidópteras; em que a planta descendente de segunda geração compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59.
15. Método de produção de sementes de milho híbridas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) plantar sementes de uma primeira linhagem de milho congênita compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59 e sementes de uma segunda linhagem congênita tendo um genótipo diferente; (b) cultivar plantas de milho resultantes das ditas plantadas até a época de floração; (c) emascular as flores mencionadas das plantas de uma das linhagens congênitas de milho; (d) cruzar sexualmente as duas diferentes linhagens congênitas uma com a outra; e (e) colher a semente híbrida produzida desta maneira.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a plantas da primeira linhagem de milho congênita são os progenitores femininos.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a plantas da primeira linhagem de milho congênita são os progenitores masculinos.
18. Proteína inseticida isolada, caracterizada pelo fato de que compreende SEQ ID NO: 2.
19. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que é codificadora da proteína como definida na reivindicação 18.
20. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora heteróloga operativamente ligada à molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 19.
21. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o gene quimérico como definido na reivindicação 20.
22. Célula hospedeira transgênica procariótica, caracterizada pelo fato de que compreende um gene quimérico como definido na reivindicação 20.
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