CN103205498A - 一种用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子及其制备和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子及其制备和应用方法，质粒分子以pMD19-T为载体，通过连接酶连接PCR扩增产物，PCR扩增产物包括含转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特异性序列和玉米内标基因zSSIIb特异性序列；其构建需先设计引物，然后进行PCR扩增获得含转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特异性序列和玉米内标基因zSSIIb特异性序列的DNA片段，将得到的PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α培养后提取质粒得到质粒分子pVZ。本发明构建的质粒分子pVZ可用于检测玉米及其相关产品中转基因玉米MIR162含量，其适用性强，稳定性好，具有极高的应用价值与市场前景。

Description

一种用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子及其制备和应用方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因质粒分子pVZ的构建及其在转基因玉米定量检测中的应用。

背景技术

截至2011年，全球转基因种植面积已达到1.6亿公顷，其中转基因玉米种植面积居第一位。作为我国最重要的粮食作物之一，国内转基因玉米研发工作进展也较为迅速，目前有多个转基因玉米优良品系进入环境释放阶段，申请商业化种植，其中转植酸酶玉米已经获得安全评价证书。转基因作物迅猛发展的同时，也伴随着人们对其环境安全和食用安全的关注和质疑。研究、制定转基因作物及其产品成分检测标准，对于加强转基因作物安全管理，防止转基因作物未经安全批准进入生产流通环节；保障转基因生物安全和人类健康，保护消费者利益；消除公众对于转基因作物安全性的疑虑，营造良好的转基因作物产业化氛围具有重要意义。

质粒分子（Plasmid Molecule）作为一种新的DNA标准物质具有容易获得、使用方便、纯度易控制和均匀性好等优点，被越来越多的应用在转基因产品定量检测中。研究、构建转植酸酶基因玉米阳性质粒分子，对于加强该品种的安全管理，保护消费者利益，消除公众对于转基因作物安全性的疑虑，营造良好的转基因作物产业化氛围具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子及其制备和应用方法。

本发明的技术方案如下：

一种用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子，以pMD19-T为载体，通过连接酶连接PCR扩增产物，PCR扩增产物包括含转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特异性序列和玉米内标基因zSSIIb特异性序列。该质粒分子的特异性序列如下：

GCGAAGAGCGTGACCAAGAACGACGTGGACGGCTTCGAGTTCTACCTGAACACCTTCCACGACGTGATGGTGGGCAACAACCTGTTCGGCCGCAGCGCCCTGAAGACCGCCAGCGAGCTGATCACCAAGGAGAACGTGAAGACCAGCGGCAGCGAGGTGGGCAACGTGTACAACTTCCTGATCGTGCTGACCGCCCTGCAGGCCCAGGCCTTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT，如SEQ ID NO.1所示。

所述的用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子的制备方法，包括步骤如下：

（1）根据转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因序列和玉米内标基因序列设计引物，引物序列如下：

C-Vip3Aa20-1F:5'-GCGAAGAGCGTGACCAAGA-3'，SEQ ID NO.2所示，

C-Vip3Aa20-2R:5'-GCGGGCTCTGGCTTCACAGGTGGTCAGGGTCAGGAA-3'，如SEQID NO.3所示，

C-zSSIIb-1F:5'-TTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGC-3'，SEQ IDNO.4所示，

C-zSSIIb-2R:5'-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3'，SEQ ID NO.5所示；

（2）用引物C-Vip3Aa20-1F/C-Vip3Aa20-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R分别进行PCR扩增获得含转基因玉米MIR162Vip3Aa20转化体特异性基因序列和玉米内标基因zSSIIb特异性序列的DNA片段；回收这两个目的片段，以此为模板采用引物C-Vip3Aa20-1F/C-zSSIIb-2R进行重叠PCR扩增；

（3）将得到的PCR产物回收后通过连接酶连接到pMD19-T载体上，连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α，将得到的克隆产物大量培养后提取质粒得到质粒分子pVZ。

上述步骤（2）所述的PCR扩增具体步骤为：以C-Vip3Aa20-1F/C-Vip3Aa20-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R为上、下游引物，在Premix Ex Taq(Takara)扩增体系中，加入转基因玉米MIR162模板DNA，先95℃扩增5min，再95℃扩增30s，再58℃扩增30s，然后72℃扩增30s，这样进行35个循环，最后在72℃扩增7min。重叠PCR扩增的扩增体系和反应程序如下：扩增体系为Premix rTaq(Takara)15μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.5μL，回收的目的片段2μL，加水补足至30μL；反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃7min。

所述的质粒分子pVZ作为转基因玉米MIR162标准品的替代品在SYBR Green I实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转基因玉米MIR162成分中的应用，具体应用方法为：

（1）建立MIR162基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线：

先将质粒分子pVZ进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162基因特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；

扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBRGreen I实时荧光定量PCR标准曲线；

（2）提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的SYBRGreen I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

上述步骤（1）、（2）中所述的MIR162基因特异性引物序列（见专利号201210052534的中国专利）如下：

Vip3Aa20-F:5'-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3'，如SEQ ID NO.7，

Vip3Aa20-R:5'-CACGATCAGGAAGTTGTA-3'，如SEQ ID NO.8。

步骤（1）、（2）中所述的zSSIIb引物序列（国家标准）如下：

zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'，如SEQ ID NO.9，

zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'，如SEQ ID NO.10。

步骤（1）、（2）中所述的扩增条件均为：扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(Rox)10μL，浓度为10μmol/L的Forward primer0.4μL，浓度为10μmol/L的Reverse primer0.4μL，ddH2O8.2μL，DNA模板1μL，扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。

所述的质粒分子作为转基因玉米MIR162标准品的替代品在TaqMan探针实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转基因玉米MIR162成分中的应用，应用方法如下：

（1）建立转基因玉米MIR162的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线：

①对质粒分子pVZ进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制转基因玉米MIR162的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线；

（2）提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入转基因玉米MIR162基因特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的转基因玉米MIR162定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

上述步骤（1）和（2）中，zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针如下：

zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'，SEQ ID NO.9所示，

zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'，SEQ ID NO.10所示，

zSSIIb-P:FAM-5'-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3'-TAMRA，SEQ ID NO.6所示；

转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针序列（专利号：201210052534的中国专利）如下：

Vip3Aa20-F:5'-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3'，如SEQ ID NO.7，

Vip3Aa20-R:5'-CACGATCAGGAAGTTGTA-3'，如SEQ ID NO.8，

Vip3Aa20-P:FAM-5'-CGCTGGTCTTCACGTTCTCCT-3'-Eclipse，如SEQ ID NO.11。

步骤（1）和（2）中，所述的扩增均为扩增的参数如下：扩增反应体积为20μL,2×PremixEx Taq(Rox)12.5μL，浓度为10μmol/L的Forward primer1μL，浓度为10μmol/L的Reverseprimer1μL，浓度为10μmol/L的TaqMan probe0.5μL，ddH2O4μL，DNA模板1μL.扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。

本发明具有的优点和效果如下：

本发明构建的质粒分子pVZ可作为转基因玉米MIR162标准品的替代品用于SYBR GreenI实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量检测玉米及其相关产品中转基因玉米MIR162含量，其适用性强，稳定性好，具有极高的应用价值与市场前景。

附图说明

图1为实施例1中内标准基因zSSIIb的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。

图2为实施例1中转基因玉米MIR162SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。

图3为实施例2中内标准基因zSSIIb的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。

图4为实施例2中转基因玉米MIR162TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子的制备方法，包括步骤如下：

（1）根据转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因序列和玉米内标基因序列设计引物与探针，引物与探针序列如下：

C-Vip3Aa20-1F:5'-GCGAAGAGCGTGACCAAGA-3'，SEQ ID NO.2所示，

C-Vip3Aa20-2R:5'-GCGGGCTCTGGCTTCACAGGTGGTCAGGGTCAGGAA-3'，SEQ IDNO.3所示，

C-zSSIIb-1F:5'-TTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGC-3'，SEQ IDNO.4所示，

C-zSSIIb-2R:5'-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3'，SEQ ID NO.5所示；

（2）用引物为C-Vip3Aa20-1F/C-Vip3Aa20-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R进行PCR扩增，扩增体系为Premix Ex Taq(Takara)20μL，上、下游引物(10μmol/L)各2.5μL，转基因玉米MIR162模板DNA(50ng/μL)2μL，加水补足至50μL。反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。重叠PCR扩增的扩增体系和反应程序如下：扩增体系为Premix rTaq(Takara)15μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.5μL，回收的目的片段2μL，加水补足至30μL；反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃7min。

（3）将两个目的片段产物回收，以此为模板采用引物C-Vip3Aa20-1F/C-zSSIIb-2R进行重叠PCR扩增，得到的PCR产物回收后通过连接酶连接到pMD19-T载体（2692bp）上。连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α。将得到的克隆产物大量培养后提取质粒，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证。

实施例1质粒分子pVZ在转基因玉米MIR162SYBR Green I实时荧光定量PCR检测中的应用

将质粒分子pVZ按5倍倍比分别稀释至25000、5000、1000、200和40copies/μL.每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。

引物和探针由大连Takara公司合成，稀释成10μmol/L备用。

合成的转基因玉米MIR162转化体特异性引物序列如下：

Vip3Aa20-F:5'-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3'，如SEQ ID NO.7，

Vip3Aa20-R:5'-CACGATCAGGAAGTTGTA-3'，如SEQ ID NO.8；

玉米内标引物与探针（zSSIIb）采用国家标准引物，其序列如下：

zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'，如SEQ ID NO.9，

zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'，如SEQ ID NO.10；

扩增反应体积为20μL，扩增反应体积为20μL,2×Premix Ex Taq(Rox)10μL,浓度为10μmol/L的Forward primer0.4μL,浓度为10μmol/L的Reverse primer0.4μL,ddH2O8.2μL,DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s,50℃30s,72℃30s，在72℃收集荧光信号,共计40循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水（ddH₂O，空白）和非转基因样品（郑单958，阴性）对照。

结果：通过对不同质粒分子pVZ拷贝数为25000、5000、1000、200和40的DNA进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct,横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MIR162标准品（3%,1%,0.5%,0.1%）、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。

对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162的特异性引物对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图1所示，该曲线的斜率为-3.314系数R²为0.998，转基因玉米MIR162基因特异性引物的标准曲线如图2所示，该曲线的斜率为-3.417,相关系数R²为0.999，两条标准曲线的标准偏差(SD)均小于0.17，相对标准偏差(RSD)均小于0.33%，因此根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式：

样品中转基因玉米MIR162含量=(Vip3Aa20基因拷贝数/内标基因zSSIIb拷贝数)×100％

可以计算出待测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。对转基因玉米MIR162含量为3%、1%、0.5%的混合样品的定量结果为3.09%、0.87%和0.58%，百分偏差分别为3%、13%和16%，三次重复的标准偏差(SD)均小于0.101，相对标准偏差(RSD)均小于11.6%；上述定量结果准确度和精确度较高，均符合欧盟的定量检测标准。

实施例2质粒分子pVZ2在转基因玉米MIR162TaqMan探针实时荧光定量PCR检测中的应用

将质粒分子pVZ按5倍倍比分别稀释至25000、5000、1000、200和40copies/μL.每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。

引物和探针由大连Takara公司合成，稀释成10μmol/L备用。

合成的转基因玉米MIR162转化体特异性引物与探针序列如下：

Vip3Aa20-F:5'-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3'，如SEQ ID NO.7，

Vip3Aa20-R:5'-CACGATCAGGAAGTTGTA-3'，如SEQ ID NO.8，

Vip3Aa20-P:FAM-5'-CGCTGGTCTTCACGTTCTCCT-3'-Eclipse，如SEQ ID NO.11；

玉米内标引物与探针（zSSIIb）采用国家标准引物与探针，其序列如下：

zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'，SEQ ID NO.9所示，

zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'，SEQ ID NO.10所示，

zSSIIb-P:FAM-5'-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3'-TAMRA，SEQ ID NO.6所示；

扩增反应体积为20μL，扩增反应体积为20μL,2×Premix Ex Taq(Rox)12.5μL,浓度为10μmol/L的Forward primer1μL,浓度为10μmol/L的Reverse primer1μL，浓度为10μmol/L的TaqMan probe0.5μL,ddH2O4μL,DNA模板1μL.扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s,60℃30s，在60℃收集荧光信号,共计40个循环.每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水（ddH₂O，空白）和非转基因样品对照。

结果：通过对不同质粒分子pVZ拷贝数为25000、5000、1000、200和40的DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct,横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MIR162标准品（3%,1%,0.5%,0.1%）、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。

对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162的基因特异性引物对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图3所示，该曲线的斜率为-3.384系数R²为0.997，转基因玉米MIR162基因特异性引物的标准曲线如图4所示，该曲线的斜率为-3.522,相关系数R²为0.999；两条标准曲线的标准偏差(SD)均小于0.11，相对标准偏差(RSD)均小于0.31%，因此根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式：

样品中转基因玉米MIR162含量=(Vip3Aa20基因拷贝数/内标基因zSSIIb拷贝数)×100％

可以计算出待测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。对转基因玉米MIR162含量为3%、1%、0.5%的混合样品的定量结果为3.20%、1.13%和0.47%，百分偏差分别为6.7%、13%和6%，三次重复的标准偏差(SD)均小于0.178，相对标准偏差(RSD)均小于12.6%；上述定量结果准确度和精确度较高，均符合欧盟的定量检测标准。

以上结果可以证明，本发明为转基因玉米MIR162标准品提供了适用性强、稳定性好的阳性质粒分子替代品。为转基因标识提供了一种强有力的技术支撑，为转基因产品的控制提供了必要的手段。

Claims (10)

1.一种用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子，其特征是，以pMD19-T为载体，通过连接酶连接PCR扩增产物，PCR扩增产物包括含转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特异性序列和玉米内标基因zSSIIb特异性序列。

2.根据权利要求1所述的一种用于转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子，其特征是，所述的含转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特异性序列和玉米内标基因zSSIIb特异性序列为：

GCGAAGAGCGTGACCAAGAACGACGTGGACGGCTTCGAGTTCTACCTGAACACCTTCCACGACGTGATGGTGGGCAACAACCTGTTCGGCCGCAGCGCCCTGAAGACCGCCAGCGAGCTGATCACCAAGGAGAACGTGAAGACCAGCGGCAGCGAGGTGGGCAACGTGTACAACTTCCTGATCGTGCTGACCGCCCTGCAGGCCCAGGCCTTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT。

3.权利要求1所述的转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子的制备方法，其特征是，包括步骤如下：

（1）根据转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因序列和玉米内标基因序列设计引物与探针，引物与探针序列如下：

C-Vip3Aa20-1F:5'-GCGAAGAGCGTGACCAAGA-3'

C-Vip3Aa20-2R:5'-GCGGGCTCTGGCTTCACAGGTGGTCAGGGTCAGGAA-3'

C-zSSIIb-1F:5'-TTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGC-3'

C-zSSIIb-2R:5'-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3'；

（2）用引物C-Vip3Aa20-1F/C-Vip3Aa20-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R分别进行PCR扩增获得含转基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特异性序列和玉米内标基因zSSIIb特异性序列的DNA片段；回收这两个目的片段，以此为模板采用引物C-Vip3Aa20-1F/C-zSSIIb-2R进行重叠PCR扩增；

（3）将得到的PCR产物回收后通过连接酶连接到pMD19-T载体上，连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α，将得到的克隆产物大量培养后提取质粒得到质粒分子pVZ。

4.根据权利要求1所述的所述的转基因抗虫玉米基因特异性检测的质粒分子的制备方法，其特征是，步骤（2）所述的PCR扩增具体步骤为：以C-Vip3Aa20-1F/C-Vip3Aa20-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R为上、下游引物，在Premix Ex Taq(Takara)扩增体系中，加入转基因玉米MIR162模板DNA，先95℃扩增5min，再95℃扩增30s，再58℃扩增30s，然后72℃扩增30s，这样进行35个循环，最后在72℃扩增7min。

5.权利要求1所述的质粒分子作为转基因玉米MIR162标准品的替代品在SYBR Green I实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转基因玉米MIR162成分中的应用。

6.权利要求5所述的应用方法，其特征是，步骤为：

（1）建立MIR162基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线：

先将质粒分子pVZ进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162基因特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；

扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBRGreen I实时荧光定量PCR标准曲线；

（2）提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的SYBRGreen I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征是，步骤（1）、（2）中所述的MIR162基因特异性引物序列如下：

Vip3Aa20-F:5'-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3'

Vip3Aa20-R:5'-CACGATCAGGAAGTTGTA-3'；

步骤（1）、（2）中所述的zSSIIb引物序列如下：

zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'

zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'。

8.根据权利要求6所述的应用方法，其特征是，步骤（1）、（2）中所述的扩增条件均为：扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(Rox)10μL，浓度为10μmol/L的Forward primer0.4μL，浓度为10μmol/L的Reverse primer0.4μL，ddH2O8.2μL，DNA模板1μL，扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。

9.权利要求1所述的质粒分子作为转基因玉米MIR162标准品的替代品在TaqMan探针实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转基因玉米MIR162成分中的应用。

10.权利要求9所述的应用方法，其特征是，步骤为：

（1）建立转基因玉米MIR162的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线：

①对质粒分子pVZ进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制转基因玉米MIR162的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线；

（2）提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入转基因玉米MIR162基因特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的转基因玉米MIR162定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

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