CN104561313B - 一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因及其构建方法与应用 - Google Patents

一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因及其构建方法与应用，所述内标基因为γ‑生育酚甲基转移酶基因Se γ‑tmt，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示或如SEQ ID No：2所示。本发明还包括所述内标基因的构建方法以及所述利用内标基因，采用荧光实时定量PCR技术检测转基因植株DNA中的外源基因数量，从而确定外源基因在转基因芝麻植株中的拷贝数中的应用。本发明之适于芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因可以应用于芝麻转基因技术体系评价、大规模转基因芝麻的外源基因拷贝数分析、芝麻未知基因拷贝数评价与遗传特征分析等研究，为今后芝麻功能基因组学研究和优异芝麻新材料评价奠定了技术基础。同时本发明对芝麻外源基因拷贝数检测操作步骤简单，结果可靠，为获得高效稳定的转基因芝麻植株提供重要依据。

Description

一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种适合转基因植株外源基因拷贝数检测的内标基因及其构建方法与应用，具体涉及一种适合芝麻栽培种(Sesamumindicum L.，2n＝26)及野生种(Sesamum radiatum，2n＝64)外源基因拷贝数检测的内标基因及其构建方法与应用。
背景技术
内标基因是指具有植物物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA。物种专一性包括种间特异性和种内非特异性，种间特异性指的是在不同物种中具有很低的同源性，通过PCR扩增仅能在目标物种中扩增出预期产物；种内非特异性指的是在同一物种的不同栽培种中具有很高的同源性和很少的等位变异，通过PCR扩增在所有的栽培种中均能扩增出预期产物。而拷贝数恒定的基因在定量PCR的过程中可以用来计算基因组DNA的质量或拷贝数。一个好的内标基因主要从物种特异性、拷贝数稳定性等方面衡量。
转基因植物中外源基因拷贝数常常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性，因此，转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数，以筛选出拷贝数少或单拷贝的转基因植株供进一步研究或育种利用。目前，检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法有：实时荧光定量PCR技术，该技术是一种较新的DNA定量方法，其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料(如：SYBRGREEN I)或特异性的荧光探针(如：Taqman探针)，实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号(阈值)时所需的循环次数：CT值(Cycle Threshold)；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。荧光定量PCR技术具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段DNA，对每克样品中20pg-10ng的转基因成分进行有效检测。同时，与Southern法相比，荧光定量PCR技术可对T-DNA的不同序列进行扩增，因此能实现对转基因品系中的基因重组的检测(Giovanna 2002)。采用的荧光定量PCR技术较Southern Blot等分子杂交方法简单快捷，所需样品少，不进行放射性检测，成本低，通量高等优点。但是，这一方法最理想的是要获得一套好的标准品，该标准品应该是已插入外源基因的植物或动物基因组DNA，并且用Southern Blot准确测得插入外源基因拷贝数。但在实践中，由于插入宿主细胞的不同，如物种、来源、生长特性等原因，很难得到这样一套标准品。因此，替代方案是选择一种合适的阳性标准品来绘制标准曲线，是应用实时荧光定量PCR技术准确定量模板初始浓度的基础。
芝麻(Sesamum indicun L.)属胡麻科胡麻属，是我国重要的特色油料作物，现有栽培用的芝麻品种均来自于芝麻属中唯一的一个栽培种S.indicun L.。芝麻栽培种为二倍体(2n＝2X＝26)，基因组大小为2871Mb，是世界上最古老的栽培作物之一，分布较广。研究表明，芝麻种质资源遗传基础相对狭窄，不利于高产优质高抗病抗逆育种研究。为拓宽育种渠道、创制优异新种质，自上世纪90年代，国内外学者先后开展了芝麻转基因技术研究。但是，由于芝麻是较难建立再生体系和转基因技术体系的作物，加之基础研究实力相对薄弱，直至2012年，我国才成功获得第一株转基因芝麻植株，芝麻转基因技术体系基本建成。但是目前，有关外源基因导入芝麻中的遗传特征等分析技术尚未建立，转基因技术在芝麻遗传基础与材料创制研究中的应用仍受到很大程度的限制。为了完善芝麻转基因育种技术，加快芝麻基因功能研究步伐，进一步推动我国芝麻功能基因组学的快速发展，当前迫切需要探索、筛选出一种适合外源基因导入转基因芝麻拷贝数评价的内标基因，并形成一套高效的检测与评价方法，为今后外源DNA插入检测及重要基因功能验证提供技术支撑。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因及其构建方法与应用，所构建的带内标基因片段的重组质粒标准品应用荧光实时定量PCR技术建立的标准曲线线性范围宽，线性关系好，灵敏性和特异性高，准确可靠，可重复性好，便捷，为转基因芝麻的检测提供科学、准确、可靠的检测手段。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
本发明之一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因，为γ-生育酚甲基转移酶基因Seγ-tmt，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示或如SEQ ID No：2所示。
进一步，所述内标基因Seγ-tmt在芝麻栽培种中的拷贝数为单拷贝，在野生种的拷贝数为2拷贝。
本发明之一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因的构建方法，包括以下步骤：
(1)内标基因的克隆：从栽培种芝麻基因组数据库中挑选低拷贝的γ-生育酚甲基转移酶基因Seγ-tmt，同时从已构建的芝麻转录组数据库中挑选Seγ-tmt基因的mRNA序列(EST sequence，GenBankaccession no.JP645320)；根据已知两端非同源区序列设计引物，Southern blot探针用引物序列均为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4，分别在栽培种芝麻和野生种芝麻中进行基因序列PCR扩增，对PCR条带回收并进行测序；其序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示，序列比对确定，该部分序列分别在栽培种芝麻和野生种芝麻中的同段序列相似度为97.8％；
(2)内标基因γ-tmt拷贝数鉴定：分别提取栽培种芝麻(S.indicumL.，2n＝26)和野生种芝麻(S.radiatum，2n＝64)的基因组DNA，采用Southern Blot杂交方法对γ-tmt基因在不同种芝麻中的拷贝数进行鉴定，确定所述内标基因γ-tmt在栽培种中的拷贝数为单拷贝，在野生种的拷贝数为2拷贝；
(3)内标基因γ-tmt种间特异性和种内非特异性鉴定：分别设计内标基因和外源基因的荧光实时定量PCR引物，接着构建带有内标基因PCR扩增片段的重组质粒标准品和外源基因PCR扩增片段的重组质粒标准品，然后分别将重组质粒标准品做10倍梯度稀释，梯度浓度在1×107～1×103copy/μL，然后以稀释后的重组质粒标准品分别作为模板，建立以SYBR混合液为荧光指示剂的荧光实时定量PCR技术检测的双标准曲线，用来检测外源基因，表明所述内标基因γ-tmt具有种间特异性和种内非特异性的特点。
进一步，步骤(3)中，所述内标基因γ-tmt荧光实时定量PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；外源基因荧光实时定量PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8。
进一步，步骤(3)中，所述内标基因PCR扩增片段长度为长度为155bp；所述外源基因PCR扩增片段长度范围为150～200bp。
进一步，步骤(3)中，所述重组质粒的连接载体为pUCm-T中间载体。
进一步，步骤(3)中所述SYBR混合液为Maxima SYBR Green/ROXqPCR Master Mix。
本发明之一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因在定量检测转基因芝麻转基因成分中的应用。
进一步，分析外源基因在转基因芝麻中的拷贝数。
本发明利用已确定起始拷贝数的标准品重组质粒可分别绘制外源基因的标准曲线和内标基因的标准曲线，因此只要获得未知样品外源基因和内标基因扩增的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。本发明通过10倍系列稀释重组标准品质粒浓度所得到的CT值绘制标准曲线的相关系数R2可达0.998～0.999，斜率为3.389～3.553，可保证数据的精确度，可在五个数量级上的准确定量，而且不必涉及复杂探针，使用方便，价格也便宜。
本发明利用内标基因Seγ-tmt，对芝麻外源基因拷贝数进行SYBR Green荧光实时定量检测操作步骤简单，结果可靠，为获得高效稳定的转基因芝麻植株提供重要依据。本发明之适于芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因扩增特异性好、遗传稳定可以应用于芝麻转基因技术体系评价、大规模转基因芝麻的外源基因拷贝数分析、芝麻未知基因拷贝数评价与遗传特征分析等研究，为今后芝麻功能基因组学研究和优异芝麻新材料评价奠定了技术基础，同时也进一步完善了芝麻转基因检测技术和外源基因遗传转化特征分析技术，填补了我国芝麻转基因植株外源基因遗传特征分析技术的空白。
附图说明
图1为Southern Blot杂交方法检测内标基因Seγ-tmt在栽培种(S. indicum L.，2n＝26)和野生种芝麻(S.radiatum，2n＝64)中的拷贝数。
图2为内标基因Seγ-tmt与pUCm-T中间载体重组群体克隆PCR鉴定。
图3为外源基因GUS与pUCm-T中间载体重组群体克隆PCR鉴定。
图4为内标基因Seγ-tmt实时荧光定量标准曲线。
图5为GUS基因实时荧光定量标准曲线。
图6为内标基因Seγ-tmt溶解曲线。
图7为外源基因GUS溶解曲线。
图8为GUS外源基因Southern Blot杂交方法检测野生种芝麻转基因株系中的GUS拷贝数。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1：野生种芝麻转GUS基因株系T1代中GUS基因的拷贝数分析
选用研发的内标基因Seγ-tm和荧光实时定量PCR方法进行野生种芝麻转GUS基因株系中GUS基因的拷贝数分析。
(1)内标基因的克隆：从研究室构建的豫芝11基因组数据库
(www.sesamum.org)中挑选低拷贝的γ-生育酚甲基转移酶基因(Seγ-tmt，γ-tocopherol methyltransferase gene，2128bp)，同时从已构建的芝麻转录组数据库中挑选Seγ-tmt基因的mRNA序列(ESTsequence，GenBank accession no.JP645320)；根据已知两端非同源区序列设计引物，Southern blot探针用引物序列均为：
Forward primer：5’-CCTTTCAAGTTGCCGATGC-3’，即SEQ ID No：3；Reverse primer：5’-CGCTCCCCTTATTGTTTTCC-3’，即SEQID No：4，分别在栽培种芝麻(Sesamum indicum L.)和野生种芝麻Sesamumradiatum中进行基因序列扩增，PCR反应体系及反应条件参照TaKaRa高保真TAQ酶使用标准体系；采用TaKaRa PCR产物回收试剂盒对PCR条带回收并进行测序；其序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示，经序列比对确定，该部分序列分别在栽培种芝麻(Sesamum indicum L.)和野生种芝麻Sesamum radiatum中的同段序列相似度为97.8％，可知内标基因Seγ-tm克隆片段具有特异性。进一步通过荧光实时定量PCR检测和Southern blot检测来确认该内标基因的可用性。
(2)内标基因γ-tmt拷贝数鉴定：分别提取栽培种芝麻(S.indicumL.，2n＝26)和野生种芝麻(S.radiatum，2n＝64)的基因组DNA，采用Southern Blot杂交方法(参照Southern Blot杂交标准步骤进行)，对γ-tmt基因在不同种芝麻中的拷贝数进行鉴定，确定该内标基因γ-tmt在栽培种(S.indicum L.)中的拷贝数为单拷贝，在S.radiatum野生种的拷贝数为2拷贝，如图1所示。其中，M：DNAmolecular weight marker II(125-23，130bp)；泳道1：γ-tmt基因PCR片段杂交结果(阳性对照)；泳道2：选用EcoR V内切酶对S.radiatum野生种芝麻DNA酶切后，进行γ-tmt杂交；杂交带出现在23130～9416bp之间，条带模糊，数量较难辨别，表明该内切酶不适用于野生种芝麻基因组DNA的Southern Blot检测；泳道3-4：分别选用Nde I和Xsp I限制性内切酶对S.radiatum野生种芝麻DNA酶切后，进γ-tmt杂交，均出现2个杂交带；泳道5-7：分别选用EcoR V、Nde I和Xsp I限制性内切酶对豫芝11基因组酶切后，进行γ-tmt杂交，其中泳道5中杂交带位于23130～9416bp之间，条带模糊，数量较难辨别，再次表明EcoRV内切酶不适用于芝麻基因组DNA的Southern Blot检测。Nde I和Xsp I内切酶对栽培种芝麻酶切后进行γ-tmt杂交，仅有一个条带。Nde I和Xsp I两种酶切结果可以确定内标基因γ-tmt在栽培种(S.indicum L.)中的拷贝数为单拷贝，在S.radiatum野生种的拷贝数为2拷贝。
(3)内标基因及GUS外源基因荧光实时定量PCR引物：
Seγ-tm内标基因引物：Primer F：5’-TCCACCGTTCTGATCGCA-3’，即SEQ ID No：5；Primer R：5’-GAAGGAGAGAGATCCCTATGACAC-3’，即SEQ ID No：6；进行PCR扩增，实时荧光定量PCR反应体系为：300～500ng模板DNA，12.5μl Maxima SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix(2×)，0.3μM引物F，0.3μM引物R，加无菌超纯水至终体积25μl；实时荧光定量荧光实时定量PCR反应条件：95℃变性，2min；95℃变性，15s，58℃退火，20s，72℃延伸，30s；40个循环，72℃延伸30s，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR产物回收试剂盒(TaKaRa)回收目的片段，PCR产物长度为155bp；
GUS外源基因荧光实时定量PCR引物：
Primer F：5’-GCAGTGAAGGGCGAACAGT-3’，即SEQ ID No：7；
Primer R：5’-GCGTAAGGGTAATGCGAGGT-3’，即SEQ ID No：8；
进行PCR扩增，荧光实时定量PCR反应体系为：300～500ng模板DNA，12.5μl Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)，0.3μM引物F，0.3μM引物R，加无菌超纯水至终体积25μl；荧光实时定量PCR反应条件：95℃变性，2min；95℃变性，15s，58℃退火，20s，72℃延伸，30s；40个循环；72℃延伸30s；1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR产物回收试剂盒(TaKaRa)回收目的片段，PCR产物长度为179bp。
(4)标准品重组质粒的构建：分别将内标基因Seγ-tmt荧光实时定量PCR扩增片段和GUS外源基因荧光实时定量PCR扩增片段通过TaKaRa连接酶与pUCm-T中间载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，如图2，图3。图2表明，所挑取的4个单克隆分别用T载体上的M13引物和Seγ-tmt特异性引物进行PCR鉴定，其中第一个单克隆为阴性(泳道1和2)，后面3个单克隆(泳道3-8)为阳性，第9个泳道为Marker(DL2000)；图3表明，所挑取的4个单克隆分别用T载体上的M13引物和GUS基因特异性引物进行PCR鉴定，4个单克隆均为阳性(泳道1-8)，第9个泳道为Marker(DL2000)。取鉴定为阳性的菌液进行测序，结果表明，所得内标基因Seγ-tmt和外源基因GUS序列与预期一致。
(5)双标准曲线的建立：取带有内标基因Seγ-tmt和GUS外源基因的重组质粒DNA，分别作10倍梯度稀释；其中，GUS基因标准曲线所用标准品模板浓度梯度9.18×107、9.18×106、9.18×105、9.18×104、9.18×103copies/μL；Seγ-tmt标准曲线所用标准品模板浓度梯度：4.98×107、4.98×106、4.98×105、4.98×104、4.98×103copies/μL；以这些稀释的标准品重组质粒DNA为模板分别进行SYBR Green实时定量PCR反应，其中，荧光实时定量PCR反应体系：SYBR混合液12.5μL，Primer F 1μL，Primer R 1μL，模板重组质粒DNA 2μL，加无菌超纯水至25μL；荧光实时定量PCR反应条件：95℃变性2min；95℃变性15s，58℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸30s，可得荧光强度-循环数曲线，见图4、图5所示，获得双标准曲线：Srγ-tmt内标基因标准曲线y＝-3.389x+42.35，R2＝0.998；GUS外源基因标准曲线y＝-3.508x+41.79，R2＝0.999。从标准曲线看这四个野生种芝麻转基因株系基因在模板拷贝数和Ct值之间具有良好的线性关系，表明其定量PCR体系适合用于样品的定量检测；并且本实施例建立的γ-tmt内标基因定量方法具有很好的的重复性和再现性，对野生种芝麻转GUS基因株系T1代中GUS基因的拷贝数的检测有很好的稳定性和可靠性。在95℃15s，60℃15s，95℃15s(60℃至95℃设置为20min)制备溶解曲线，获得的溶解曲线为单峰，如图6为内标基因Seγ-tmt溶解曲线，图7为外源基因GUS溶解曲线，表明扩增产物条带单一，没有非特异扩增。
(6)外源基因拷贝数检测：随机挑选待测转基因野生种芝麻No.Sr267、No.Sr001、No.Sr038和No.Sr11-1No.Sr13010等4个株系T1代和2个非转基因植株，分别选取各植株幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA(参照CTAB法标准步骤进行)，稀释至300～500ng/μL待用；取1μLDNA，分别对各样品的Seγ-tmt内标基因和GUS外源基因进行荧光实时定量PCR。荧光实时定量PCR反应体系：模板DNA 300～500ng，SYBR混合液12.5μL，Primer F 1μL，Primer R 1μL，加无菌超纯水至25μL；荧光实时定量PCR反应条件：95℃变性2min，95℃变性15s，58℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸30s。根据上述标准曲线，确定6份样品中的外源基因拷贝数分别为3、1、4、1、0和0，检测结果见表2。
表2 野生种芝麻转基因株系外源基因拷贝数检测
-：PCR检测不出。
由表2可知，野生种芝麻转基因株系内标基因野生种芝麻内标基因具有种间的特异性和种内非特异性。
(7)Southern blot试验验证荧光实时定量PCR检测结果：取上述各样品待测DNA 10～20μg，选用限制性内切酶BamHI对DNA进行酶切打断，然后分别对Seγ-tmt内标基因和外源基因进行Southernblot试验，见图4所示，其中，M：DNA molecular weight marker II(125-23，130bp)；泳道1：GUS plasmid pBI121质粒的GUS杂交结果，以GUS基因PCR片段作为探针(阳性对照)；泳道2-5：No.Sr267、No.Sr 001、No.Sr038和No.Sr 11-1等4个转基因株系的GUS基因杂交结果；泳道6-7：非转基因植株的GUS基因杂交结果(阴性对照)。根据条带印迹确定内标基因和外源基因在待测植株中的拷贝数。
对比荧光实时定量PCR和Southern blot检测结果，确定结果一致，No.Sr 267、No.Sr 001、No.Sr038和No.Sr 11-1No.Sr13010等4个株系T1代中GUS拷贝数分别为3、1、4和1，由此可知该方法结果是可靠的。
实施例2：利用内标基因Seγ-tmt开展转基因芝麻株系中GUS基因导入后拷贝数分布研究
选用内标基因Seγ-tm和荧光实时定量PCR方法进行转基因芝麻株系中GUS基因导入后拷贝数分析。
(1)内标基因及GUS外源基因实时荧光定量PCR用引物：
Seγ-tm内标基因引物：Primer F：5’一TCCACCGTTCTGATCGCA一3’，即SEQ ID No：5；Primer R：5’一GAAGGAGAGAGATCCCTATGACAC一3’，即SEQ ID No：6；进行PCR扩增，实时荧光定量PCR反应体系为：300～500ng模板DNA，12.5μl Maxima SYBR Green/R0X qPCRMaster Mix(2×)，0.3μM引物F，0.3μM引物R，加无菌超纯水至终体积25μl；实时荧光定量荧光实时定量PCR反应条件：95℃变性，2min；95℃变性，15s，58℃退火，20s，72℃延伸，30s；40个循环，72℃延伸30s，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR产物回收试剂盒(TaKaRa)回收目的片段，PCR产物长度为155bp；
GUS外源基因荧光实时定量PCR引物：
Primer F：5’一GCAGTGAAGGGCGAACAGT一3’，即SEQ ID No：7；
Primer R：5’一GCGTAAGGGTAATGCGAGGT一3’，即SEQ ID No：8；进行PCR扩增，实时荧光定量PCR反应体系为：300～500ng模板DNA，12.5μl Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)，0.3μM引物F，0.3μM引物R，加无菌超纯水至终体积25μl；荧光实时定量PCR反应条件：95℃变性，2min；95℃变性，15s，58℃退火，20s，72℃延伸，30s；40个循环，72℃延伸30s，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR产物回收试剂盒(TaKaRa)回收目的片段，PCR产物长度为179bp。
(2)标准品重组质粒的构建：分别将内标基因Seγ-tmt实时荧光定量PCR扩增片段和GUS外源基因实时荧光定量PCR扩增片段通过TaKaRa连接酶与pUCm-T中间载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，取鉴定为阳性的菌液进行测序，结果表明，所得内标基因Seγ-tmt和外源基因GUS序列与预期一致。(3)双标准曲线的建立：取1μL带有内标基因Seγ-tmt和GUS外源基因的重组质粒DNA分别作10倍梯度稀释；其中，GUS基因标准曲线所用标准品模板浓度梯度9.76×107、9.76×106、9.76×105、9.76×104、9.76×103copies/μL；Seγ-tmt标准曲线所用标准品模板浓度梯度：4.74×107、4.74×106、4.74×105、4.74×104、4.74×103copies/μL；以这些稀释的标准品重组质粒DNA为模板分别进行荧光实时定量PCR反应，其中，荧光实时定量PCR反应体系：SYBR混合液12.5μL，Primer F 1μL，Primer R 1μL，模板DNA 2μL，加无菌超纯水至25μL；荧光实时定量PCR反应条件：95℃变性2min；95℃变性15s，58℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸30s，根据荧光实时定量PCR扩增过程中的荧光信号强弱，获得双标准曲线；其中，Srγ-tmt内标基因标准曲线是y＝-3.389x+42.35，R2＝0.997；GUS外源基因标准曲线是y＝-3.553x+41.74，R2＝0.998。95℃15s，在60℃15s，95℃15s(60℃至95℃设置为20min)制备溶解曲线，获得的溶解曲线为单峰，表明扩增产物条带单一，没有非特异扩增。
(5)外源基因拷贝数检测：随机挑选8个转基因野生种芝麻株系T1代，分别选取各植株幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA(参照CTAB法标准步骤进行)，稀释至300～500ng/μL待用；取1μLDNA，分别对各样品的Seγ-tmt内标基因和GUS外源基因进行荧光实时定量PCR：PCR反应体系：模板DNA300～500ng，SYBR混合液12.5μL，Primer F 1μL，Primer R 1μL，加无菌超纯水至25μL；PCR反应条件：95℃变性2min，95℃变性15s，58℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸30s。每个样品定量PCR进行2个生物学重复，每个生物学重复设置3个物理重复；检测结果见表3。
表3 转基因芝麻植株中GUS基因拷贝数分布
由表3可知，转基因芝麻的内标基因特异性的引物在8个转基因野生种芝麻株系T1代中均能分别检测到相似的荧光信号，由此可知内标基因在转基因野生种芝麻中均有种内的非特异性；并计算确定在8个转基因芝麻株系中，GUS基因拷贝数数量范围为1～12，其中低拷贝株系(GUS拷贝数≤2)比例为62.5％。

Claims (9)

1.一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因，其特征在于，所述内标基因为γ-生育酚甲基转移酶基因Seγ-tmt，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示或如SEQ ID No：2所示。
2.根据权利要求1所述的适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因，其特征在于，所述内标基因Seγ-tmt在芝麻栽培种中的拷贝数为单拷贝，在野生种的拷贝数为2拷贝。
3.一种如权利要求1或2所述的适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)内标基因的克隆：从栽培种芝麻基因组数据库中挑选低拷贝的γ-生育酚甲基转移酶基因Seγ-tmt，同时从已构建的芝麻转录组数据库中挑选Seγ-tmt基因的mRNA序列，GenBank登录号为JP645320；根据已知两端非同源区序列设计引物，Southern blot探针用引物序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4，分别在栽培种芝麻和野生种芝麻中进行基因序列PCR扩增，对PCR条带回收并进行测序；其序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示，序列比对确定，该部分序列分别在栽培种芝麻和野生种芝麻中的同段序列相似度为97.8％；
(2)内标基因γ-tmt拷贝数鉴定：分别提取栽培种芝麻和野生种芝麻的基因组DNA，采用Southern Blot杂交方法对γ-tmt基因在不同种芝麻中的拷贝数进行鉴定，确定所述内标基因γ-tmt在栽培种中的拷贝数为单拷贝，在野生种的拷贝数为2拷贝；
(3)内标基因γ-tmt种间特异性和种内非特异性鉴定：分别设计内标基因和外源基因的荧光实时定量PCR引物，接着构建带有内标基因PCR扩增片段的重组质粒标准品和外源基因PCR扩增片段的重组质粒标准品，然后分别将重组质粒标准品做10倍梯度稀释，梯度浓度在1×107～1×103copy/μL，然后以稀释后的重组质粒标准品分别作为模板，建立以SYBR混合液为荧光指示剂的荧光实时定量PCR技术检测的双标准曲线，用来检测外源基因，表明所述内标基因γ-tmt具有种间特异性和种内非特异性的特点。
4.根据权利要求3所述的适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述内标基因γ-tmt荧光实时定量PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；外源基因荧光实时定量PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8。
5.根据权利要求3所述的适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述内标基因PCR扩增片段长度为155bp；所述外源基因PCR扩增片段长度范围为150～200bp。
6.根据权利要求3所述的适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述重组质粒的连接载体为pUCm-T中间载体。
7.根据权利要求3所述的适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述SYBR混合液为Maxima SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix。
8.根据权利要求1或2所述的适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因在定量检测转基因芝麻转基因成分中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，分析外源基因在转基因芝麻中的拷贝数。
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