CN110408716A

CN110408716A - 含有多种内标准基因特异片段的dna标准样品及其应用

Info

Publication number: CN110408716A
Application number: CN201910506920.3A
Authority: CN
Inventors: 付伟; 朱鹏宇; 王晨光; 朱水芳
Original assignee: China inspection and Quarantine Research Institute
Current assignee: China inspection and Quarantine Research Institute; Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2019-11-05

Abstract

本申请公开了一种含有多种内标准基因特异片段的DNA标准样品及其应用。所述DNA标准样品中含有11种内标准基因(元件)玉米zSSIIb、玉米Adh1、大豆Lectin、油菜CruA、油菜PEP、水稻SPS、水稻PLD、通用18sRNA、苜蓿ACC、甜菜GluA3、马铃薯UGPase的特异片段，分别如SEQ ID No.1—11所示，覆盖了七大作物玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿、和水稻。本申请减少了检测中阳性标准样品的使用数量，降低了漏检的可能性。经检测，所述标准样品的均匀性、稳定性及定值等均符合要求，可用于相应内标准基因的日常检测中的质量控制、检测试剂的验证和评价，实验室能力验证活动等，可商业化推广应用。

Description

含有多种内标准基因特异片段的DNA标准样品及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体说是一种含有多种内标准基因特异片段的DNA标准样品。

背景技术

内标准基因是指具有物种特异性、拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA序列。特定物种的内标准基因是区别其他物种的遗传标志，可用于物种及其产品鉴别、转基因成分检测等诸多领域。

内标准基因是转基因检测标识制度中所必需的检测参照基因，在检测系统中，通过PCR技术对待测样品的基因组DNA进行扩增，将被转入基因作为检测的对象，利用内标准基因作为对照，检测结果能够有效鉴定待测样品物种来源以及PCR检测系统工作正常与否，通过和转入基因的相对定量结果比较，可进一步实现样品中转入基因的基因组水平定量分析。

目前，质粒标准品含有的内标准基因种类单一，对同时检测多种作物的情况时，需要使用多种质粒，使用不便，且检测成本高。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种含有多种内标准基因特异片段的DNA标准样品及其应用，本发明通过前期的信息检索和生物信息学分离，确定了11种内标准基因，通过检测这11个靶标可以覆盖玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿、和水稻七大作物。本发明将这11个靶标的特异片段聚合构建到一个质粒分子上，获得了稳定可靠的阳性质粒标准样品。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

本发明首先提供一种检测转基因成分的的DNA标准样品，DNA标准样品包括多种内标准基因特异片段，分别为SEQ ID No.1—11所示DNA片段；分别为玉米zSSIIb(编码玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2的基因)、玉米Adh1(乙醇脱氢酶基因)、大豆Lectin(植物凝集素基因)、油菜CruA(种子储藏蛋白基因)、油菜PEP(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)、水稻SPS(蔗糖合成酶基因)、水稻PLD(磷脂酶D家族基因)、通用18sRNA(真核生物18s核糖体RNA基因)、苜蓿ACC(苜蓿乙酰辅酶a羧化酶)、甜菜GluA3(谷蛋白基因)、马铃薯UGPase(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)上的特异片段。

在一种优选的实施方式中，所述SEQ ID No.1—11所示DNA片段按照SEQ IDNo.1—11的顺序依次连接。

在一种优选的实施方式中，所述DNA标准样品中的所述SEQ ID No.1—11所示DNA片段连接后的序列如SEQ ID No.12所示。

本发明还提供了包含以上任一所述DNA标准样品的重组载体。

在一种优选的实施方式中，所述重组载体的骨架载体选自pUC18、pUC19、pUC57中的一种或多种，更优选，pUC57，更优选，将所述DNA标准样品连接于pUC57平端酶EcoRV的酶切位点处。

本发明还提供了一种检测转基因成分的PCR试剂盒，所述试剂盒包括以上任一所述DNA标准样品或所述重组载体。

在一种优选的实施方式中，所述试剂盒还包括分别检测SEQ ID No.1—11所示DNA片段的引物组合；

所述检测SEQ ID No.1所示DNA片段的引物组合为引物组合1，所述引物组合1包括引物对1，所述引物对1的上游引物如SEQ ID No.13所示，下游引物如SEQ ID No.14所示；

所述检测SEQ ID No.2所示DNA片段的引物组合为引物组合2，所述引物组合2包括引物对2，所述引物对2的上游引物如SEQ ID No.16所示，下游引物如SEQ ID No.17所示；

所述检测SEQ ID No.3所示DNA片段的引物组合为引物组合3，所述引物组合3包括引物对3，所述引物对3的上游引物如SEQ ID No.19所示，下游引物如SEQ ID No.20所示；

所述检测SEQ ID No.4所示DNA片段的引物组合为引物组合4，所述引物组合4包括引物对4，所述引物对4的上游引物如SEQ ID No.22所示，下游引物如SEQ ID No.23所示；

所述检测SEQ ID No.5所示DNA片段的引物组合为引物组合5，所述引物组合5包括引物对5，所述引物对5的上游引物如SEQ ID No.25所示，下游引物如SEQ ID No.26所示；

所述检测SEQ ID No.6所示DNA片段的引物组合为引物组合6，所述引物组合6包括引物对6，所述引物对6的上游引物如SEQ ID No.28所示，下游引物如SEQ ID No.29所示；

所述检测SEQ ID No.7所示DNA片段的引物组合为引物组合7，所述引物组合7包括引物对7，所述引物对7的上游引物如SEQ ID No.31所示，下游引物如SEQ ID No.32所示；

所述检测SEQ ID No.8所示DNA片段的引物组合为引物组合8，所述引物组合8包括引物对8，所述引物对8的上游引物如SEQ ID No.34所示，下游引物如SEQ ID No.35所示；

所述检测SEQ ID No.9所示DNA片段的引物组合为引物组合9，所述引物组合9包括引物对9，所述引物对9的上游引物如SEQ ID No.37所示，下游引物如SEQ ID No.38所示；

所述检测SEQ ID No.10所示DNA片段的引物组合为引物组合10，所述引物组合10包括引物对10，所述引物对10的上游引物如SEQ ID No.40所示，下游引物如SEQ ID No.41所示；

所述检测SEQ ID No.11所示DNA片段的引物组合为引物组合11，所述引物组合11包括引物对11，所述引物对11的上游引物如SEQ ID No.43所示，下游引物如SEQ ID No.44所示。

在一种优选的实施方式中，所述引物组合1还包括检测所述引物对1扩增产物的探针1，所述探针1如SEQ ID No.15或其互补序列所示；

所述引物组合2还包括检测所述引物对2扩增产物的探针2，所述探针2如SEQ IDNo.18或其互补序列所示；

所述引物组合3还包括检测所述引物对3扩增产物的探针3，所述探针3如SEQ IDNo.21或其互补序列所示；

所述引物组合4还包括检测所述引物对4扩增产物的探针4，所述探针4如SEQ IDNo.24或其互补序列所示；

所述引物组合5还包括检测所述引物对5扩增产物的探针5，所述探针3如SEQ IDNo.27或其互补序列所示；

所述引物组合6还包括检测所述引物对6扩增产物的探针6，所述探针6如SEQ IDNo.30或其互补序列所示；

所述引物组合7还包括检测所述引物对7扩增产物的探针7，所述探针7如SEQ IDNo.33或其互补序列所示；

所述引物组合8还包括检测所述引物对8扩增产物的探针8，所述探针8如SEQ IDNo.36或其互补序列所示；

所述引物组合9还包括检测所述引物对9扩增产物的探针9，所述探针9如SEQ IDNo.39或其互补序列所示；

所述引物组合10还包括检测所述引物对10扩增产物的探针10，所述探针10如SEQID No.42或其互补序列所示；

所述引物组合11还包括检测所述引物对11扩增产物的探针11，所述探针11如SEQID No.45或其互补序列所示。

本发明还提供以上任一所述DNA标准样品、所述重组载体或所述试剂盒在检测转基因成分和/或物种鉴别中的应用；其中的所述DNA标准样品为内标准基因阳性对照；

优选的，所述转基因成分来源于转基因植物和/或其加工品；

所述转基因植物包括玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿、和/或水稻；

所述物种包括真核生物，所述真核生物包括玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿、和/或水稻。

本发明还提供了一种检测转基因成分的PCR方法，所述方法包括利用以上任一所述DNA标准样品或所述重组载体为内标准基因阳性对照进行PCR的步骤；

优选的，所述PCR使用以上任一所述试剂盒进行；

优选的，所述转基因成分来源于转基因植物和/或其加工品；

所述转基因植物包括但不限于如下植物：玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿、和/或水稻。

在上述应用和方法中，所述内标准基因包括：玉米zSSIIb、玉米Adh1、大豆Lectin、油菜CruA、油菜PEP、水稻SPS、水稻PLD、通用18sRNA、苜蓿ACC、甜菜GluA3、和/或马铃薯UGPase。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的质粒标准样品覆盖全面，含有11种内标准基因(元件)玉米zSSIIb、玉米Adh1、大豆Lectin、油菜CruA、油菜PEP、水稻SPS、水稻PLD、通用18sRNA、苜蓿ACC、甜菜GluA3、马铃薯UGPase的特异片段，覆盖了七大作物玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿、和/或水稻，且由于各特异片段构建于同一个质粒上，减少了检测中阳性标准样品的使用数量，降低了漏检的可能性。

(2)本发明的质粒标准样品经实际检测，均匀性、稳定性及定值等检测均符合要求，可用于11种内标准基因日常检测中的质量控制、检测试剂的验证和评价，实验室能力验证活动等，可商业化推广应用。

(3)本发明还提供了检测(1)中所述特异片段的引物对及探针和PCR检测方法，可同时对上述11中内标准基因进行定性和定量检测，且重复性好、高通量、灵敏、准确和快速的优点，在转基因成分检测方面具有很好的应用前景。

本发明对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国转基因产品检测标准样品的研制，填补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

附图说明

图1为聚合11种内标准基因的标准质粒分子结构示意图，其中，bla代表质粒上bla基因片段，MSC Feature 1代表质粒上的MSC特征序列1，Rep orgigin 1代表报告基因片段1，Protein Bind 1代表蛋白结合区域1，Protein Bind 2代表蛋白结合区域2，箭头方向代表质粒序列方向。

图2为pUC57-Ref质粒DNA电泳图谱，其中，左起第一泳道为DNA marker，从上到下片段大小依次为10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp、250bp，左起第二泳道为pUC57-Ref质粒DNA。

图3为酶切线性化pUC57-Ref质粒DNA电泳图谱。

图4为pUC57-Ref质粒混合24小时后荧光定量PCR扩增图，其中，图A和图B分别为以zSSIIb和UGPase基因(元件)为测试靶标。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pUC57质粒载体由上海生工生物技术科技有限公司公司提供，产品目录号为B522201。

实施例1、质粒标准样品的构建

1、11种内标准基因及其特异片段的确定

根据大量的市场调研数据，先确定商业化种植的转基因作物种类，再确定如下11种内标准基因(元件)：玉米zSSIIb、玉米Adh1、大豆Lectin、油菜CruA、油菜PEP、水稻SPS、水稻PLD、通用18sRNA、苜蓿ACC、甜菜GluA3、马铃薯UGPase；

通过大量的基因信息检索、序列比对、序列拼接和序列稳定性分析预测，我们发现不同扩增子序列的组合会导致插入片段之间的扩增干扰。因此，本专利运用实时荧光PCR验证了大量的标准检测扩增子，通过实时荧光PCR所得到的Ct值对不同扩增子的重组兼容情况进行评估，最终确定了上述11种内标准基因中可以用于构建质粒标准样品的DNA片段，具体如下：

玉米zSSIIb上的特异片段如SEQ ID No.1所示；

玉米Adh1上的特异片段如SEQ ID No.2所示；

大豆Lectin上的特异片段如SEQ ID No.3所示；

油菜CruA上的特异片段如SEQ ID No.4所示；

油菜PEP上的特异片段如SEQ ID No.5所示；

水稻SPS上的特异片段如SEQ ID No.6所示；

水稻PLD上的特异片段如SEQ ID No.7所示；

通用18sRNA上的特异片段如SEQ ID No.8所示；

苜蓿ACC上的特异片段如SEQ ID No.9所示；

甜菜GluA3上的特异片段如SEQ ID No.10所示；

马铃薯UGPase上的特异片段如SEQ ID No.11所示。

2、序列合成及质粒标准样品制备

将SEQ ID No.1—11所示DNA片段按顺序依次拼接到一起，长1168bp(SEQ IDNo.12)，委托上海生工生物工程有限公司采用基因合成技术，人工合成长1168bp的外源特异性序列并克隆到pUC57质粒上(pUC57质粒用平端酶EcoRV酶切，通过平端连接克隆)，将构建的标准质粒分子命名为pUC57-Ref(图1)。

将构建的标准质粒分子pUC57-Ref转化到大肠杆菌中，筛选阳性克隆。提取质粒，将质粒送给三家不同的测序公司分别进行测序。三家测序公司分别为上海生工生物工程有限公司、武汉擎科创新生物科技有限公司、北京华大基因科技股份有限公司。三家测序公司的测序结果完全一致，并与预期序列吻合，证明构建的标准质粒分子中含有预期的外源特异性序列。

实施例2、标准质粒分子pUC57-Ref的标准样品的制备

1、质粒DNA的提取

将pUC57-Ref质粒的阳性菌种划平板挑取单克隆菌落，在1ml含有抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养16-18h。吸取100μL培养液到100mL含有抗生素的LB培养液中扩大培养，37℃振荡培养16-18h(OD值在0.8以上)，共收集100mL菌液。4℃6000g离心15min以收集菌体。采用QIAfilter Plasmid Midi Kits试剂盒进行质粒分子的大量提取和纯化。

2、质粒DNA质量评价和浓度测定

取1μL提取的质粒DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带清晰明亮，说明提取的质粒DNA质量很好。电泳图见图2，条带大小与预期相符，质量符合要求。

采用紫外分光光度法测定所提DNA的浓度与纯度(A260/A280值应在1.8到2.0之内，A260/A230值应该大于2.0)。通过紫外分光光度法利用Nanodrop2000(ThermoScientific,Wilmington,USA)测定的pUC57-Ref质粒DNA的A260/A280值为1.85±0.01，介于1.8至2.0之间，表明其纯度符合要求，其浓度为67.0±0.4ng/μL。

3、质粒DNA的酶切线性化与纯化

根据质粒的核苷酸序列，选取单酶切位点BamHI(NEB BamHI-HF，货号R3136V)对环状质粒DNA进行酶切线性化。酶切体系如下：

采用QIAquick Gel Extraction Kit对酶切后的产物进行切胶回收。

4、线性质粒分子质量评价和浓度测定

取1μL酶切纯化后的质粒DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带清晰明亮，条带单一，无杂带和RNA条带，说明提取的质粒DNA质量很好。电泳图见图3，质量符合要求。

采用紫外分光光度法测定所提DNA的浓度与纯度。(A260/A280值应在1.8到2.0之间，A260/A230值应该大于2.0)。同时使用Picogreen荧光法测定DNA浓度。

通过紫外分光光度法利用Nanodrop2000(Thermo Scientific,Wilmington,USA)测定的pUC57-Ref质粒标准物质的A260/A280值为1.86±0.01，介于1.8至2.0之间(表1)，表明其纯度符合要求，其浓度为54.2±0.3。两种方法所测的质粒浓度相近，表明利用QIAfilter Plasmid Midi Kits试剂盒提取的质粒DNA浓度和纯度高，能够满足大批量制备质粒标准物质。

表1、pUC57-Ref质粒分子的浓度和纯度测定结果

pUC57-Ref	1	2	3	4	5	6	平均值	SD
									OD260/OD230	2.14	2.12	2.16	2.16	2.12	2.11	2.13	0.02
OD260/OD280	1.86	1.85	1.85	1.86	1.88	1.87	1.86	0.01
									紫外法浓度	54.1	54.3	54.0	54.8	54.4	53.8	54.2	0.3
Picogreen荧光法浓度	55.4	55.4	55.4	55.7	55.7	55.3	55.5	0.2

5、质粒DNA的稀释与混匀

(1)质粒DNA的稀释

以紫外分光光度法测定的质粒分子浓度为依据，按下面公式对质粒质量浓度和拷贝数浓度进行换算:

Cc＝(Cm×NA×10^-9)/(M×2×S)

式中：

Cc——质粒拷贝数浓度，copies/μL；

Cm——质粒质量浓度，mg/L；

NA——阿伏伽德罗常数,6.02×10²³copies/mol；

M——核苷酸的平均分子量，g/mol；

S——质粒分子的大小，bp。

用T₁E_0.01(1.0mmol/L Tris-Hcl，0.01mM EDTA，pH8.0)将粉末状大肠杆菌tRNA(Sigma，货号R1753-500UN)稀释至50ng/μL，以50ng/μL大肠杆菌tRNA为稀释剂将质粒分子稀释至约1×10⁶copies/μL。

(2)质粒DNA的均匀性初检

将稀释后的质粒利用摇床以150rpm的转速进行混匀。混匀过程中每隔8小时取样一次，共取样4次。每次选不同的部位进行取样，取样9份，每份取样10μL。先用实时荧光PCR以zSSIIb和UGPase基因(元件)为测试靶标检测抽取样品的Ct值(方法与实施例3中的步骤2相同)，结果显示当混匀24小时后，抽取样品的扩增曲线基本重合(图4)，Ct值大小也非常接近，zSSIIb的Ct值平均值22.87，SD值0.05，UGPase的Ct值平均值22.27，SD值0.06，(表2)。推测混合24小时后，质粒DNA已充分混匀。

表2、均匀性初检pUC57-Ref质粒分子的荧光定量PCR测定Ct值

然后用微滴数字PCR检测不同时间点抽取样品的拷贝数浓度。选取18sRNA和CruA作为微滴数字PCR的检测靶标(扩增体系与扩增程序与实施例6中的相同)，取其平均值作为质粒的拷贝数浓度值。检测结果如表3所示，对测试结果进行F检验。均匀性初检结果表明，在样品混匀24小时后，不同部位抽取的DNA样品拷贝数浓度无显著差异，均匀性良好，可进行分装。

根据数字PCR对质粒拷贝数浓度测量结果，取24h和32h混匀的平均值作为质粒DNA的浓度值。质粒DNA的浓度为4.145E+06，SD值为4.463E+04(表3)。

表3、均匀性初检pUC57-Ref质粒分子浓度的数字PCR测定结果

6、质粒DNA的分装

将经过质量评估及浓度测定，以及均匀性初检的质粒DNA在生物安全柜中进行人工分装。分装的质粒DNA每管100μL，共分装250管。将分装的质粒DNA置于100格冷冻盒中，保存于-70℃超低温冰箱中，即标准样品。

实施例3、标准样品的均匀性检测

1、抽样数量

从实施例2步骤6中分装成最小包装单元的候选标准样品中随机抽取15管进行均匀性检测。

2、采用荧光定量PCR方法进行均匀性检测

对11个内标准基因特异片段分别进行荧光定量PCR检测，所用引物和探针如表4所示，荧光定量PCR的工作原理是：PCR反应中的Taq DNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活性，能够水解荧光色素标记的杂交探针，从而将报告基团释放出来并产生荧光，而报告基团发射出来的荧光信号强弱与指数增加的靶标DNA片段成一定比例。通过检测荧光信号便可以对每个反应阶段的PCR产物进行实时监测。在CFX96荧光PCR仪(Bio-rad,HercμLes,CA,USA)上进行11个内标准基因特异片段的PCR扩增，25μL PCR反应体系主要包括：2×TaqManUniversal Master Mix 12.5μL，上下游引物各1.0μL(10μmol/L)，荧光标记探针溶液0.5μL(10μmol/L)，DNA模板2.0μL。PCR反应程序如下：50℃预消化2min；95℃变性、UNG酶失活10min；50个循环(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)。

表4、11种内标准基因的引物/探针及检测靶标信息

注：表4中上游引物、下游引物和探针后的编号相同，表示为一组引物组合，即该探针用于检测该上游引物和该下游引物的扩增产物；所述探针均为TaqMan探针，5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMRA。

3、均匀性检验

本批质粒标准样品共抽取15管样品，每管样品设置3个子样，共45个子样。采用荧光定量PCR技术以质粒标准样品为模板，检测11个内标准基因特异片段的有无。经荧光定量PCR分析测定，45个子样中的11个内标准基因特异片段均产生典型扩增曲线，Ct值在20左右(18—21)，结果为阳性。

为了考察特性量值的均匀性性，将标准样品进行梯度稀释，绘制11个内标准基因特异片段的标准曲线，定量标准样品的拷贝数浓度。绘制标准曲线的各项技术参数都在可接受的范围内，标准曲线的斜率在-3.4～-3.6之间，截距在38～40之间，决定系数在0.995～1.000之间，扩增效率在90％到110％之间，结果表明采用实施例2制备得到的标准样品绘制标准曲线，可用于转基因产品成分的定性以及定量检测。依据绘制的标准曲线，定量质粒标准样品中各个元件的拷贝数浓度，取11个内标准基因特异片段拷贝数浓度的平均值作为质粒标准样品的拷贝数浓度。采用方差分析法(F检验法)进行均匀性检验(表5)，统计分析结果均表明F<F0.05(14,30)，实施例2制备得到的标准样品的拷贝数浓度量值在管间具有良好的均匀性。

表5、瓶间均匀性检验结果

4、均匀性不确定度评估

均匀性检验结果表明，质粒DNA标准物质在瓶间具有良好的均匀性。由于(表5)，转化体特异性序列与内标准基因拷贝数比值这一特性量值的均匀性引入的不确定度采用下面公式进行计算：

相对不确定度为：

5、最小取样量

使用该标准样品制作标准曲线时需要进行梯度稀释，本项目在进行管间均匀性实验时，取2μL溶液进行梯度稀释，绘制的标准曲线具有良好的线性。在进行管间均匀性检验时，每个反应管的加样量为2μL。因此确定了进行样品稀释时最小取样量为2μL，进行PCR反应时最小取样量为2μL。

实施例4、标准样品稳定性检测

1、长期稳定性试验

长期稳定性检验是将样品分别存储在4℃和-20℃，分别在第0月、第1月、第2月、第4月、第6月、第12月后取样并储存于-70℃，每次每个贮存温度随机选取3管，每管重复取样3次(N＝3，n＝3)。采用实时荧光PCR方法(同实施例3步骤2的方法)，对不同时间点/不同温度抽取的实施例2制备得到的标准样品进行定性测试，测试结果显示，在4℃和-20℃条件下，所有子样的11个内标准基因特异片段都有典型扩增曲线，Ct值在20左右(18～21)，检测结果为阳性。实施例2制备得到的样品可以稳定的用作11个内标准基因检测的阳性对照。

为了考察标准样品拷贝数浓度的长期稳定性，采用荧光定量PCR方法分别定量11个内标准基因特异片段的拷贝数浓度，考察其平均值的长期稳定性。以梯度稀释的质粒DNA作为标准品，进行实时荧光定量PCR(同实施例3步骤2的方法)扩增，绘制11个内标准基因特异片段的标准曲线。根据绘制的标准曲线，定量不同时间点(0月、1月、2月、4月、6月)/不同温度(4℃、-20℃)抽取的标准样品的拷贝数浓度。对各靶标的平均值数据进行T检验，通过检测标准样品拷贝数浓度随时间变化情况，考察其长期稳定性，结果如表6所示。

表6、长期稳定性检验结果

目前长期稳定性考察时间为12个月，稳定性评估基本模型为Y＝β₀+β₁X。通过数据分析显示在4℃和-20℃下，|β₁|＜t_0.95，n-2s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。因此可判定基因组DNA标准物质在12个月内均处于稳定状态。

2、短期稳定性检验

短期稳定性检验旨在考察标准样品的运输稳定性。本批质粒标准样品是质粒DNA溶液，在运输过程中通常采用冷链运输。经长期稳定性检验，标准样品在4℃条件下具有良好的稳定性，因此在冷链运输条件下，可以保证标准样品的量值稳定性。

3、稳定性不确定度评估

拷贝数比值稳定性的不确定度贡献采用公式：u_s＝s(β₁)·X。-20℃条件下，有效期t＝6个月的长期稳定性不确定度＝13309*6＝79854，为4.317E+06，u_rel(S)为0.019。

实施例5、标准样品定值及不确定度评定

1、定值方法及结果

实施例2制备得到的标准样品由一家实验室采用数字PCR方法进行定值。在质粒标准样品混匀过程中，每隔一段时间从上中下3个不同部位取样，每个部位取3个子样，共取9个子样，用微滴数字PCR进行拷贝数浓度测定。根据数字PCR对质粒拷贝数浓度测量结果，当混匀时间超过24小时后，质粒DNA完全混匀。取24h和32h测量结果的平均值作为质粒DNA的浓度值。质粒DNA的浓度为4.145E+06，SD值为4.463E+04，RSD值为0.011。

2、不确定度评价

标准样品定值的不确定度由三个部分组成，第一部分是标准物质定值过程带来的不确定度u_c；第二部分是物质不均匀性所引起的标准不确定度u_bb；第三部分是物质在有效期内的不稳定性所引起的标准不确定度u_s。

合成相对标准不确定度为：

质粒DNA标准物质拷贝数浓度值的相对扩展不确定度为：U_rel＝2×0.025＝0.05(k＝2，置信概率95％)，扩展不确定度U＝0.05×4.145E+06＝2.1×10⁵。

3、定值结果表示

根据步骤1和2，实施例2制备得到的标准样品的量值及不确定度为(3.15±0.21)×10⁶copies/μL。

实施例6、标准样品的协同定值

实施例2制备得到的标准样品经8家具备检测条件的不同实验室进行协同定值验证，验证方法采用数字PCR的方法(具体使用表4所示元件PLD的引物组合进行)，11个内标准基因特异片段组合质粒标准样品相关基因扩增均为阳性，质粒拷贝数浓度均在3×10⁶copies/μL以上，与实施例5的检测结果相一致，表明实施例2制备得到的标准样品可用于11个内标准基因日常检测中的质量控制、检测试剂的验证和评价，实验室能力验证活动。

上述数字PCR的方法的扩增体系如表7和扩增程序如表8所示。

表7、11个内标准基因特异片段组合质粒标准样品协同定值数字PCR扩增体系

体系组分	上样量/μL	终浓度
			2×数字PCR扩增预混液	11	1×
上游引物(10μmol/L)	1.1	0.5μmol/L
			下游引物(10μmol/L)	1.1	0.5μmol/L
探针(10μmol/L)	0.55	0.25μmol/L
			模板(质粒标准样品)	2.2
ddH<sub>2</sub>O	6.05
			总体积	22

表8、11个内标准基因特异片段组合质粒标准样品协同定值数字PCR扩增程序

对比例1、不同质粒分子的实时荧光PCR检测

按照实施例1的方法，构建不同对照质粒分子，其与实施例1中构建的标准质粒分子pUC57-Ref的不同之处在于：

对照质粒分子CK1为在pUC57-Ref中的zSSIIb位置前连接玉米HMGa基因的特异片段，如SEQ ID No.46所示；

对照质粒分子CK2为在pUC57-Ref中的Lectin位置前连接大豆Lectin基因和KVM基因(Lectin-KVM)上的融合特异片段，如SEQ ID No.47所示；

对照质粒分子CK3为在pUC57-Ref中的CruA位置连接油菜HMGI/Y基因上的特异片段，如SEQ ID No.48所示；

对照质粒分子CK4为在pUC57-Ref中的SPS位置前连接水稻GOS基因上的特异片段，如SEQ ID No.49所示。

分别以质粒分子pUC57-Ref、CK1、CK2、CK3、CK4为模板，按照实施例3步骤2的荧光定量PCR方法分别对各质粒分子上的各特异片段进行检测，其中，玉米HMGa基因的特异片段的上下游引物和探针序列分别如下：

HMGa-79-F：TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA；

HMGa-79-R：GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT；

HMGa-79-P：FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-BHQ1；

大豆Lectin基因和KVM基因(Lectin-KVM)上的融合特异片段的上下游引物和探针序列分别如下：

KVM-F：CACCTTTCTCGCACCAATTGACA；

KVM-R：TCAAACTCAACAGCGACGAC；

KVM-P：FAM-CCACAAACACATGCAGGTTATCTTGG-BHQ1；

油菜HMGI/Y基因上的特异片段的上下游引物和探针序列分别如下：

HMGI/Y-F：GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG；

HMGI/Y-R：CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC；

HMGI/Y-P：FAM-CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT-BHQ1；

水稻GOS基因上的特异片段的上下游引物和探针序列分别如下：

GOS-F：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT；

GOS-R：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC；

GOS-P：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1。

每个质粒(共四种)分子每个扩增反应(每个靶标元件的特异片段单独进行扩增反应)设3个重复，结果用平均值表示，如表9所示。

表9、不同质粒分子的实时荧光PCR检测Ct值

靶标元件	pUC57-Ref	CK1	CK2	CK3	CK4
						玉米zSSIIb	21.02	34.89	37.02	38.56	33.23
玉米Adh1	20.58	35.32	36.56	38.42	32.65
						大豆Lectin	22.56	34.96	35.99	37.69	32.89
油菜CruA	23.43	34.64	36.88	37.35	33.13
						油菜PEP	22.65	35.25	36.02	38.01	33.25
水稻SPS	24.13	35.65	37.13	39.13	33.48
						水稻PLD	24.35	34.99	37.02	38.66	32.89
18sRNA	21.47	34.76	36.56	38.73	32.02
						苜蓿ACC	22.38	35.03	36.69	37.38	33.59
甜菜GluA3	23.01	35.66	35.89	38.32	33.46
						马铃薯UGPase	23.32	34.89	36.45	39.12	32.55
玉米HMGa	——	34.76	37.26	39.02	33.62
						大豆Lectin-KVM	——	35.02	37.56	38.65	33.08
油菜HMGI/Y	——	35.05	37.23	39.53	33.34
						水稻GOS	——	35.22	36.34	38.46	32.36

表9的结果表明，质粒pUC57-Ref的Ct值均在20-25之间；质粒CK1扩增Ct值在35左右，不符合要求；质粒CK2的Ct值在37左右，不符合要求；质粒CK3的Ct值在39左右，不符合要求；质粒CK4的Ct值在33左右，信号值较弱，不符合要求。

以上结果表明，质粒pUC57-Ref作为阳性标准样品的效果最好，其它质粒用作阳性样品不准确或不能使用。

实施例7、标准样品在检测转基因成分中的应用

待测样品：取转基因品种如表10所示，提取待测样品的基因组DNA；

检测方法：

模板为待测样品的基因组DNA，以非转基因的相应植物的基因组DNA为阴性对照，以实施例2制备得到的质粒标准样品为内标准基因的阳性对照；

同一模板分别使用表4所示引11种引物组合以及相应的外源基因引物和探针分别进行实时荧光PCR检测(按照实施例3步骤2的方法进行)。

结果：如表10所示，检测结果与实际结果完全相符，说明实施例2制备得到的质粒标准样品和实施例3步骤2的方法可以用于各类作物的转基因成分检测。

表10、待测样品的检测结果

待测样品	检测结果
		转基因玉米MON810	外源基因P-CAMV35S呈阳性。元件玉米zSSIIb和玉米Adh1呈阳性。
非转基因玉米	外源基因P-CAMV35S呈阴性。元件玉米zSSIIb和玉米Adh1呈阳性。
		转基因大豆MON89788	外源基因T-E9呈阳性。元件大豆Lectin呈阳性。
非转基因大豆	外源基因T-E9呈阴性。元件大豆Lectin呈阳性。
		转基因马铃薯AM04-1020	外源基因T-PINII呈阳性。元件马铃薯UGPase呈阳性。
非转基因马铃薯	外源基因T-PINII呈阴性。元件马铃薯UGPase呈阳性。
		转基因油菜MON88302	外源基因T-E9呈阳性。元件油菜CruA和油菜PEP呈阳性。
非转基因油菜	外源基因T-E9呈阴性。元件油菜CruA和油菜PEP呈阳性。
		转基因甜菜H7-1	外源基因T-E9呈阳性。元件甜菜GluA3呈阳性。
非转基因甜菜	外源基因T-E9呈阴性。元件甜菜GluA3呈阳性。
		转基因苜蓿J101	外源基因T-E9呈阳性。元件苜蓿ACC呈阳性。
非转基因苜蓿	外源基因T-E9呈阴性。元件苜蓿ACC呈阳性。
		转基因水稻BT63	外源基因T-NOS呈阳性。元件水稻SPS和水稻PLD呈阳性。
非转基因水稻	外源基因T-NOS呈阴性。元件水稻SPS和水稻PLD呈阳性。
		阳性标准样品	表4所示11种元件均呈阳性。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 含有多种内标准基因特异片段的DNA标准样品及其应用

<130> JH-CNP190133

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctcccaatcc tttgacatct gctccgaagc aaagtcagag cgctgcaatg caaaacggaa 60

cgagtggggg cagcagcgcg agcaccgccg cgccggtgtc cggacccaaa gctgatcatc 120

catcagctcc tgtcaccaag agagaaatcg a 151

<210> 2

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtcgtttcc catctcttcc tcctttagag ctaccactat ataaatcagg gctcattttc 60

tcgctcctca caggctcatc tcgctttgga tcgattggtt tcgtaactgg tgagggactg 120

agggtctcgg agtgg 135

<210> 3

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctcctcggg aaagttacaa ctcaataagg ttgacgaaaa cggcacccca aaaccctcgt 60

ctcttggtcg cgccctctac tccaccccca tccacatttg ggacaaagaa accggtagcg 120

ttgccagctt cgccgcttcc ttcaacttca ccttctatgc cc 162

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggccagggtt tccgtgatat gcaccagaaa gtggagcaca taaggactgg ggacaccatc 60

gctacacatc ccggtgtagc ccaatggttc tacaacgacg g 101

<210> 5

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccttgtgaa gctcgacatc cgtcaagaat ccgaccgtca caccgatgtt ttagacgcga 60

tcacgcagca cctaggcata ggttcttaca aagaatggtc agaggacaag 110

<210> 6

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgcgcctga acggatatct ttcagtttgt aaccaccgga tgacgcacgg acggctcgga 60

tcatcccgaa aagatcaacc g 81

<210> 7

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tggtgagcgt tttgcagtct atgttgtgct gccaatgtgg cctgaaggac ctcctgctag 60

tggatcag 68

<210> 8

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcctga 60

cacg 64

<210> 9

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatcagtgaa cttcgcaaag tactcggtta gtagacagtg aatgctcctg tgatctgccc 60

atgcactcat gttgtagtgt tcacgtcgtt g 91

<210> 10

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacctccata ttactgaaag gaagccaaaa gggatcaatt aagtgctcta cgaagtttaa 60

agtatgtgcc gctctcaaga ctgaacatgg cactgtgaac aggatggagc aattactc 118

<210> 11

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggacatgtga agagacggag cgcagacgcc gcagtgagga ggtgcgaggt aatggtggta 60

gagggtacgc ggaggggtag aggtagg 87

<210> 12

<211> 1168

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcccaatcc tttgacatct gctccgaagc aaagtcagag cgctgcaatg caaaacggaa 60

cgagtggggg cagcagcgcg agcaccgccg cgccggtgtc cggacccaaa gctgatcatc 120

catcagctcc tgtcaccaag agagaaatcg acgtcgtttc ccatctcttc ctcctttaga 180

gctaccacta tataaatcag ggctcatttt ctcgctcctc acaggctcat ctcgctttgg 240

atcgattggt ttcgtaactg gtgagggact gagggtctcg gagtggcctc ctcgggaaag 300

ttacaactca ataaggttga cgaaaacggc accccaaaac cctcgtctct tggtcgcgcc 360

ctctactcca cccccatcca catttgggac aaagaaaccg gtagcgttgc cagcttcgcc 420

gcttccttca acttcacctt ctatgcccgg ccagggtttc cgtgatatgc accagaaagt 480

ggagcacata aggactgggg acaccatcgc tacacatccc ggtgtagccc aatggttcta 540

caacgacggc ccttgtgaag ctcgacatcc gtcaagaatc cgaccgtcac accgatgttt 600

tagacgcgat cacgcagcac ctaggcatag gttcttacaa agaatggtca gaggacaagt 660

tgcgcctgaa cggatatctt tcagtttgta accaccggat gacgcacgga cggctcggat 720

catcccgaaa agatcaaccg tggtgagcgt tttgcagtct atgttgtgct gccaatgtgg 780

cctgaaggac ctcctgctag tggatcagcc tgagaaacgg ctaccacatc caaggaaggc 840

agcaggcgcg caaattaccc aatcctgaca cggatcagtg aacttcgcaa agtactcggt 900

tagtagacag tgaatgctcc tgtgatctgc ccatgcactc atgttgtagt gttcacgtcg 960

ttggacctcc atattactga aaggaagcca aaagggatca attaagtgct ctacgaagtt 1020

taaagtatgt gccgctctca agactgaaca tggcactgtg aacaggatgg agcaattact 1080

cggacatgtg aagagacgga gcgcagacgc cgcagtgagg aggtgcgagg taatggtggt 1140

agagggtacg cggaggggta gaggtagg 1168

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctcccaatcc tttgacatct gc 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcgatttctc tcttggtgac agg 23

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agcaaagtca gagcgctgca atgca 25

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgtcgtttcc catctcttcc tcc 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccactccgag accctcagtc 20

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aatcagggct cattttctcg ctcctca 27

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cctcctcggg aaagttacaa 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gggcatagaa ggtgaagtt 19

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccctcgtctc ttggtcgcgc cctct 25

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggccagggtt tccgtgat 18

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccgtcgttgt agaaccattg g 21

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agtccttatg tgctccactt tctggtgca 29

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cccttgtgaa gctcgacatc 20

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cttgtcctct gaccattctt tgt 23

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ccgaccgtca caccgatgtt ttaga 25

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ttgcgcctga acggatat 18

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cggttgatct tttcgggatg 20

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tccgagccgt ccgtgcgtc 19

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tggtgagcgt tttgcagtct 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ctgatccact agcaggaggt cc 22

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgttgtgctg ccaatgtggc ctg 23

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cctgagaaac ggctacca 18

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cgtgtcagga ttgggtaat 19

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tgcgcgcctg ctgccttcct 20

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gatcagtgaa cttcgcaaag tac 23

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

caacgacgtg aacactacaa c 21

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tgaatgctcc tgtgatctgc ccatgc 26

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gacctccata ttactgaaag gaag 24

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gagtaattgc tccatcctgt tca 23

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ctacgaagtt taaagtatgt gccgctc 27

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

ggacatgtga agagacggag c 21

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cctacctcta cccctccgc 19

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ctaccaccat tacctcgcac ctcctca 27

<210> 46

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ttggactaga aatctcgtgc tgattaattg ttttacgcgt gcgtttgtgt ggattgtagg 60

acaaggctcc ctatgtagc 79

<210> 47

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cttctttctc gcaccaattg acactaagcc acaaacacat gcaggttatc ttggtctttt 60

caacgaaaac gagtctggtg atcaagtcgt cgctgttgag tttga 105

<210> 48

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ggtcgtcctc ctaaggcgaa aggaccttcc tcggaggtgg agacgaaagt tgcggcaccg 60

agtggctccg ggaggccacg tggacgaccg ccgaagaag 99

<210> 49

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tggtgagcgt tttgcagtct atgttgtgct gccaatgtgg cctgaaggac ctcctgctag 60

tggatcag 68

Claims

1.一种检测转基因成分的DNA标准样品，其特征在于：所述DNA标准样品包括SEQ IDNo.1—11所示DNA片段。

2.如权利要求1所述的DNA标准样品，其特征在于：所述SEQ ID No.1—11所示DNA片段按照SEQ ID No.1—11的顺序依次连接。

3.如权利要求2所述的DNA标准样品，其特征在于：所述DNA标准样品中的所述SEQ IDNo.1—11所示DNA片段连接后的序列如SEQ ID No.12所示。

4.包含权利要求1—3中任一所述的DNA标准样品的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的骨架载体选自pUC18、pUC19、pUC57中的一种或多种，更优选，pUC57，更优选，将所述DNA标准样品连接于pUC57平端酶EcoRV的酶切位点处。

6.一种检测转基因成分的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1—3中任一所述DNA标准样品或权利要求4或5所述重组载体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括分别检测SEQ IDNo.1—11所示DNA片段的引物组合；

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述引物组合1还包括检测所述引物对1扩增产物的探针1，所述探针1如SEQ ID No.15或其互补序列所示；

所述引物组合2还包括检测所述引物对2扩增产物的探针2，所述探针2如SEQ ID No.18或其互补序列所示；

所述引物组合3还包括检测所述引物对3扩增产物的探针3，所述探针3如SEQ ID No.21或其互补序列所示；

所述引物组合4还包括检测所述引物对4扩增产物的探针4，所述探针4如SEQ ID No.24或其互补序列所示；

所述引物组合5还包括检测所述引物对5扩增产物的探针5，所述探针3如SEQ ID No.27或其互补序列所示；

所述引物组合6还包括检测所述引物对6扩增产物的探针6，所述探针6如SEQ ID No.30或其互补序列所示；

所述引物组合7还包括检测所述引物对7扩增产物的探针7，所述探针7如SEQ ID No.33或其互补序列所示；

所述引物组合8还包括检测所述引物对8扩增产物的探针8，所述探针8如SEQ ID No.36或其互补序列所示；

所述引物组合9还包括检测所述引物对9扩增产物的探针9，所述探针9如SEQ ID No.39或其互补序列所示；

所述引物组合10还包括检测所述引物对10扩增产物的探针10，所述探针10如SEQ IDNo.42或其互补序列所示；

所述引物组合11还包括检测所述引物对11扩增产物的探针11，所述探针11如SEQ IDNo.45或其互补序列所示。

9.权利要求1—3中任一所述DNA标准样品、权利要求4或5所述重组载体或权利要求6—8中任一所述试剂盒在检测转基因成分和/或物种鉴别中的应用；其中的所述DNA标准样品为内标准基因阳性对照；

优选的，所述转基因成分来源于转基因植物和/或其加工品；

10.一种检测转基因成分的PCR方法，其特征在于：所述方法包括利用权利要求1—3中任一所述DNA标准样品或权利要求4或5所述的重组载体为内标准基因阳性对照进行PCR的步骤；

优选的，所述PCR使用权利要求6—8中任一所述试剂盒进行；

优选的，所述转基因成分来源于转基因植物和/或其加工品；