CN110408612B

CN110408612B - 一种低浓度dna标准物质的保护剂、保存方法及应用

Info

Publication number: CN110408612B
Application number: CN201910615232.0A
Authority: CN
Inventors: 闻艳丽; 刘刚; 梁文; 杨雪; 杨镇州; 李兰英; 王乐乐; 许丽; 李妍; 罗超
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2039-07-09
Also published as: CN110408612A

Abstract

本发明提供了一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用，所述保护剂包括鲑鱼精DNA。本发明选取TP53基因的一段长度为300bp的序列作为目标片段，研制低浓度水平的DNA标准物质，采用浓度为20μg/mL～100μg/mL的鲑鱼精DNA作为保护剂进行保护，贮藏在低吸附离心管中放置在‑15℃～‑20℃的冷冻条件下，维持了DNA标准物质在6个月内的浓度稳定性；所述标准物质均匀性、稳定性良好，保证了生物前沿检测技术的准确可靠性，提升了临床检测和癌症早期诊断的检测能力，为精准医疗计划提供可靠的计量支撑。

Description

一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用。

背景技术

基因的异常表达是引起疾病的重要因素，在疾病的诊断和治疗过程中只有准确靶向异常基因并进行精准定量，才能进行疾病的精准治疗。由于人体内环境的复杂性以及异常基因表达量通常较低，准确可靠地检测低浓度的目标基因，是精准医疗成果临床应用的一个重要挑战。循环肿瘤DNA(ctDNA)是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可以无创的用于肿瘤早期诊断、发展过程检测、预后判断、以及个性化用药指导，然而ctDNA的含量非常低，约占整个循环DNA的1％，甚至0.1％，准确进行ctDNA的精准定量，对基因检测方法提出了巨大挑战。目前，基因检测方法的检出限越来越低，但是准确性和可靠性并未得到显著提高，低浓度核酸样品在稀释、扩增定量或传感的过程中，可能产生的偏差为最终结果的准确性带来了很大的不确定度。研究发现，对于浓度为10¹⁰copies/μL的质粒DNA样品，采用紫外(UV)进行定量，不确定度低于1％，将样品进行2000倍稀释后采用高分辨电感耦合等离子体质谱法(HR-ICP-MS)进行定量，不确定度上升近3倍，而将样品进行10⁹倍稀释并采用PCR检测时，不确定度上升至约20％。

为了促进基因检测方法的进一步发展，需要开展方法标准化研究，通过研制低浓度水平的核酸标准物质，为检测方法提供可靠的计量依据。目前，具有可靠准确度和清晰溯源链的检测方法较少。UV是基于核酸在260nm处的紫外吸收值进行绝对定量的方法，但该方法对纯度要求高且灵敏度低。HR-ICP-MS通过检测DNA分子中的P元素含量可以直接溯源至国际单位制，该方法稳定性好，检测灵敏度达10⁶copies/μL，但需要复杂的样品处理步骤。

数字PCR(dPCR)是一种新兴的核酸定量检测方法，该方法不依赖标准曲线和标准样品，不受稀释过程的影响，利用高通量芯片和单分子水平扩增，实现了基因样品的绝对定量，检测灵敏度高，理论上是低浓度水平基因标准物质研制的最佳方案。国际物质的量委员会下设的生物分析工作小组对dPCR高度重视，提出将dPCR作为DNA检测的量值溯源的主要方法。国际上其他计量组织，已经利用dPCR作为定值方法开展了DNA标准物质的研制，该项工作为DNA相关标准物质的研究起到重要的指导作用。

CN106011133A公开了一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法，利用重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切和DNA连接等方法将100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp等长度的小的DNA序列构建到一个质粒上，这种质粒经单一的限制性酶完全酶切后，可以酶切出七条亮度均一的条带，本发明用于制备DNA标准参照物，用于在琼脂糖电泳中指示DNA分子量的相对大小，但是上述DNA标准参照物不存在浓度低的特性，不能作为目标序列用于研究ctDNA。

因此，构建一种低浓度水平短链DNA标准物质，模拟ctDNA，研究其保存条件、均匀性和稳定性，在精准医疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用，所述保护剂包括鲑鱼精DNA，有利于保持DNA标准物质的稳定性、均匀性和浓度一致性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种低浓度DNA标准物质的保护剂，所述保护剂包括鲑鱼精DNA。

鲑鱼精DNA是原位杂交技术中一种常用的封闭DNA，用于避免探针的非特异性杂交。本发明中，向DNA标准物质中加入鲑鱼精DNA，显著提高了DNA标准物质的浓度稳定性。

优选地，所述鲑鱼精DNA的浓度为20μg/mL～100μg/mL，例如可以是20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL，优选为20μg/mL～50μg/mL。

优选地，所述DNA标准物质的浓度不超过1000copies/μL，例如可以是100copies/μL、200copies/μL、300copies/μL、400copies/μL、500copies/μL、600copies/μL、700copies/μL、800copies/μL、900copies/μL或1000copies/μL。

优选地，所述DNA标准物质的核酸序列如SEQ ID NO:4所示；

SEQ ID NO:4所示的核酸序列如下：

GCCACAGGTCTCCCCAAGGCGCACTGGCCTCATCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGGTCAGGAGCCACTTGCCACCCTGCACACTGGCCTGCTGTGCCCCAGCCTCTGCTTGCCTCTGACCCCTGGGCCCACCTCTTACCGATTTCTTCCATACTACTACCCATCCACCTCTCATCACATCCCCGGCGGG。

本发明中，选用长度为300bp的带有特异性突变位点的TP53基因片段作为目标序列，制备低浓度水平短链DNA标准物质，研究最佳的保存条件，保证DNA标准物质的均匀性和稳定性。

优选地，所述DNA标准物质采用数字PCR进行检测。

根据本发明，数字PCR是将实时荧光定量PCR体系等量均分到相互隔离的大于10000个反应单元中(芯片微孔或者微滴液珠)，经过PCR扩增反应，不同的反应单元表现为有荧光(阳性)或无荧光(阴性)，通过统计微反应单元的阳性率，根据泊松分布概率函数计算出核酸模板的拷贝数，数字PCR的技术特点为不需要建立工作曲线，具有较高的准确度，是一种有效的绝对定量方法。

优选地，所述数字PCR的引物的核酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1所示的核酸序列为：

5’-GTACCACCATCCACTACAACTACATGT-3’；

SEQ ID NO:2所示的核酸序列为：

5’-GGCTCCTGACCTGGAGTCTTC-3’.

优选地，所述数字PCR的探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

SEQ ID NO:3所示的核酸序列为：

5’-FAM-CATGAACCGGAGGCCCATCCTCA-BHQ1-3’.

优选地，所述保护剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供了一种DNA标准物质的保存方法，所述方法包括向DNA标准物质中加入鲑鱼精DNA，进行DNA标准物质的保存的步骤。

优选地，所述DNA标准物质的保存时间为150～180天，例如可以是150天、155天、160天、165天、170天、175天或180天。

优选地，所述DNA标准物质的保存温度为-15℃～-20℃，例如可以是-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃或-20℃。

优选地，所述DNA标准物质保存于离心管中，优选为保存于低吸附离心管中。

第三方面，本发明提供了一种DNA标准物质，所述DNA标准物质采用如第一方面所述的保护剂和/或如第二方面所述的保存方法进行保存。

第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述的DNA标准物质在体外核酸检测方法质量控制上的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明选取TP53基因的一段长度为300bp的序列作为目标片段，研制低浓度水平的DNA标准物质，采用浓度为20μg/mL～100μg/mL的鲑鱼精DNA作为保护剂进行保护，维持了低浓度DNA标准物质的浓度稳定性；

(2)本发明的DNA标准物质在鲑鱼精DNA的保护下，贮藏在低吸附离心管中放置在-15℃～-20℃的冷冻条件下，在6个月内保持稳定；

(3)本发明采用数字PCR方法进行多家单位联合定值，确定了标准物质的终浓度为(620±9.18)copies/μL(k＝2)，所述标准物质均匀性、稳定性良好；

(4)本发明制备的DNA标准物质有利于实现对低浓度核酸检测水平的量值溯源，保证生物前沿检测技术的准确可靠性，提升临床检测和癌症早期诊断的检测能力，为精准医疗计划提供可靠的计量支撑。

附图说明

图1(A)为3％琼脂糖电泳分析图，其中，泳道M1为100bp DNA Marker，泳道M2为50bp DNA Marker，泳道1为TP53基因片段标准物质，图1(B)为生物分析仪检测图；

图2为优化条件后的TP53基因片段的PCR扩增标准曲线；

图3(A)为不同类型的离心管对TP53基因片段标准物质的影响，图3(B)为不同浓度的鲑鱼精DNA对低浓度DNA的影响。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

(1)主要仪器

数字PCR仪Quant Studio 3D(Life technologies公司)；微量核酸蛋白定量仪Nanodrop 2000(Life technologies公司)；电泳仪、电泳槽(BioRad公司)；凝胶成像仪(BioRad公司)；生物分析仪2100型(Agilent公司)；天平(Mettler公司)；

(2)试剂

正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示，探针如SEQ ID NO:3所示，由上海百力格生物科技有限公司进行合成；鲑鱼精DNA(Sigma-Aldrich中国)；高灵敏度DNA分析试剂盒(Agilent公司)；转基因玉米NK603质粒分子(GBW10086)(标准值为2.40×10⁸copies/μL，扩展不确定度为0.14×10⁸copies/μL(k＝2))；其它生化试剂均为分析纯。

SEQ ID NO:1所示的核酸序列为：

5’-GTACCACCATCCACTACAACTACATGT-3’；

SEQ ID NO:2所示的核酸序列为：

5’-GGCTCCTGACCTGGAGTCTTC-3’；

SEQ ID NO:3所示的核酸序列为：

5’-FAM-CATGAACCGGAGGCCCATCCTCA-BHQ1-3’.

实施例1 TP53基因片段的制备

本实施例采用人工合成的方法制备TP53基因片段标准物质，方法如下：

(1)根据GeneBank数据库确定TP53基因序列(NCBI Gene ID：7157)，选取其中一段长度为300bp的带有特异性突变的基因序列作为目标片段，首先合成含有ctDNA序列的短链DNA，随后通过PCR将短链DNA连接起来得到如SEQ ID NO:4所示的300bp的长链DNA；

(2)将如SEQ ID NO:4所示的300bp DNA克隆到PUC57载体，构建含有目标序列的质粒DNA；

(3)以质粒DNA为模板，PCR扩增出长度300bp的双链DNA，即为TP53片段标准物质候选物。

实施例2 TP53基因片段的序列验证

本实施例采用一代测序法对构建的质粒DNA进行测序验证，鉴定TP53目的基因片段是否克隆到了质粒中。测序结果表明，插入目标序列正确性达100％，可以采用构建的质粒作为模板合成双链PCR产物。

随后对PCR扩增产物进行独立的双向测序，验证扩增片段的序列是否正确。结果证明，每次扩增的目标序列正确度100％，与设计基因序列完全相符。

实施例3 TP53基因片段的纯度验证

本实施例采用三种方法联合验证TP53基因片段的纯度：

第一种方法采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，具体为：取10μL TP53基因片段样品上样，用3％琼脂糖凝胶电泳，电压为90V，时间为30min，电泳完成后进行染色，凝胶成像仪分析DNA条带，根据图中有无杂带判断核酸纯度；

琼脂糖凝胶电泳结果如图1(A)所示，1号泳道可以清晰地看到单一的DNA条带，无RNA和蛋白质污染，证明了制备的TP53基因片段标准物质的纯度较高。

第二种方法采用紫外分光光度法进行鉴定，通过检测样品在230nm、260nm和280nm波段的紫外光吸光值，根据A260/A230和A260/A280的比值判断样品的纯度，通常纯的DNA的A260/A280为1.8～2.0，A260/A230达到2.0；

紫外分光光度计检测结果为A260/A280＝1.83，A260/A230＝2.03，满足紫外方法鉴定核酸纯度的标准。

第三种方法采用Agilent2100生物分析仪进行鉴定，依据高灵敏度DNA分析试剂盒说明书进行检测，根据图谱中有无杂峰判断核酸纯度。

检测结果如图1(B)所示，在35bp和10380bp的标志物Marker之间只有一个DNA片段，其大小约为311bp，在准确度为10％～20％的范围内符合理论长度300bp，因此，可认为该条带为TP53基因片段标准物质。

因此，三种方法同时验证了TP53基因片段的纯度符合DNA标准物质的要求。

实施例4 TP53基因片段的定值方法

参考JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》，本实施例采用数字PCR对TP53基因片段进行定值，具体步骤如下：

将4μL TP53基因片段溶液加入到20μL的PCR反应体系中(表1)，混合均匀后，进行数字PCR芯片涂片和PCR反应，反应程序为96℃酶激活10分钟，然后95℃变性30秒，60℃延伸2分钟，重复40个循环，其中，2×数字PCR预混液(3D digital PCR Master Mix)中包含TaqDNA聚合酶(Taq-DNA-Polymerase)、dUTP尿嘧啶N糖基化酶(dUTP uracil N-glycosylase)、反应缓冲液(含ROX)和dNTP混合液；

数字PCR反应结束后，芯片经荧光检测和数字PCR软件分析，得出TP53基因片段模板的浓度，根据TP53基因片段的稀释系数D，计算出DNA标准物质的拷贝数浓度。

表1数字PCR反应体系

名称	体积(μL)
		2×数字PCR预混液(3D digital PCR Master Mix)	10
正向引物SEQ ID NO:1(10μM)	0.4
		反向引物SEQ ID NO:2(10μM)	0.4
探针SEQ ID NO:3(5μM)	0.4
		DNA模板	4.0
ddH<sub>2</sub>O	4.8

(1)PCR扩增效率的考察

PCR扩增效率是指DNA聚合酶把试剂(dNTPs、模板DNA)转变为扩增子的效率，PCR扩增效率非常重要，可能影响数字PCR定量结果的准确性，并且判断是否有人为因素影响PCR扩增反应；

发明人通过优化引物、探针和反应体系，在数字PCR前采用实时荧光PCR(qPCR)制作标准曲线对PCR的扩增效率进行检验，将DNA进行10倍梯度稀释，配制成(10⁷～10²)copies/μL浓度范围的六个DNA模板梯度，每个梯度设置3个重复实验，并设置3个无模板添加的空白对照。

结果如图2所示，PCR扩增效率为98.6％，说明PCR扩增效率较高，标准曲线方程为y＝-3.355lgx+38.91，R²＝0.999，说明该体系可以用于数字PCR实验。

(2)数字PCR的重复性考察

按照优化的实验条件，将TP53基因片段加入到数字PCR反应体系中，重复检测6次。

分别独立分析检测样品的浓度，得出该方法用于检测TP53基因片段标准物质的重复性(RSD)为2.99％，满足DNA定量方法要求。

(3)数字PCR的再现性考察

分别选择不同的三天时间，由三个不同的实验者，进行dPCR实验，每个实验重复进行3次芯片式数字PCR实验。

实验结果显示，该方法检测TP53基因片段的重现性为5.23％，满足定量TP53基因标准物质的方法要求。

实施例5保存条件考察

本实施例对低浓度水平TP53基因片段的保存条件进行考察，首先对包装材料进行了考察，采用数字PCR对保存于低吸附(low adsorption tube)和普通吸附(commonly usedtube)两种离心管中的片段DNA进行定量；其次，向低浓度TP53基因片段中加入20μg/mL～100μg/mL鲑鱼精DNA，采用数字PCR测量目标DNA的浓度，选择最佳保存条件。

如图3(A)所示，保存于低吸附离心管中的DNA比保存在普通离心管中的DNA，在第0天、第3天、第5天和第7天后浓度分别提高了49.2％、42.3％、20.7％和39.3％，说明低吸附离心管能够防止DNA吸附到管壁或管盖上，减少了DNA的损失，为保存低浓度DNA标准物质提供了有力支撑。

如图3(B)所示，不同浓度的鲑鱼精DNA对TP53基因片段浓度具有影响，当不添加鲑鱼精DNA时，TP53基因的浓度明显低于添加了鲑鱼精DNA的TP53基因的浓度；从测试的不同时间点来看，添加50μg/mL和100μg/mL鲑鱼精DNA时，标准物质的浓度波动较大，因此选用20μg/mL鲑鱼精DNA作为低浓度DNA标准物质的保护剂，在后续的TP53基因片段标准物质制备中均加入20μg/mL的鲑鱼精DNA作为保护剂。

实施例6均匀性考察

本实施例对低浓度TP53基因片段的均匀性进行考察，按照《JJG1006-1994一级标准物质技术规范》要求进行抽样检查，从TP53基因片段样品中随机抽取11个样品，对每个样品取样3次，每次取样量为4μL，采用数字PCR重复测定3次，取平均值；对测定结果用方差分析法(F-检验法)进行统计，判断均匀性检验结果。

结果表明，在95％置信水平下，F值为0.61小于F0.05(10，23)，证明TP53基因片段标准物质的均匀性良好，符合JJG1006-1994《一级标准物质技术规范》均匀性检验合格要求。

实施例7稳定性考察

本实施例对低浓度TP53基因片段的稳定性采用数字PCR方法进行考察。

短期稳定性采用同步稳定性研究方法进行考察，即所有稳定性研究的测量能在重复性条件下进行，实验模拟样品在运输中可能遇到的条件，将制备的TP53基因片段标准物质放置在20℃和4℃条件下，考察短期稳定性，随机抽取3个样品，每个样品重复测定3次。

实验结果表明，TP53基因片段在20℃条件下保存7天是稳定的，在4℃条件下保存12天是稳定的。

长期稳定性采用经典稳定性研究方法进行考察，即同时制备的样品在相同条件下随着时间的推移进行测量，将样品保存在-15℃～-20℃的冷冻条件下，分别在样品制备完成后0、14、31、61、90、120、150、180天对制备的TP53基因片段标准物质随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，进行长期稳定性考察。

TP53基因片段标准物质的长期稳定性统计结果显示斜率不显著，表明TP53基因片段标准物质的浓度在规定时间内无明显的上升或下降趋势，可以判定在6个月内是稳定的。

实施例8定值和不确定度评估

本实施例按照ISO导则35《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求，对TP53基因片段标准物质采用6家实验室协同定值，参加定值的单位包括上海市产业技术研究院、中国测试技术研究院、中国农业科学院生物技术研究所等6家具有核酸检测能力的机构共同定值，每家单位分别随机抽取1个样品，平行测定8次，进行定值分析，汇总全部原始数据。

通过计算，TP53基因片段标准物质的检测平均值为124.00copies/μL，由于PCR检测过程中的稀释倍数为5倍，因此TP53基因片段标准物质的检测值为：124.00copies/μL×5＝620copies/μL。

TP53基因片段标准物质的不确定度主要来源于三个方面：标准物质的不均匀性引起的不确定度，标准物质在有效期内的变动性引起的不确定度，以及标准物质的定值过程带来的不确定度，包括数据统计引入的不确定度和对定值方法中测量影响因素进行分析评定的不确定度，TP53基因片段标准物质的不确定度统计结果见表2。

表2 TP53基因片段标准物质的不确定度

将合成标准不确定度乘以包含因子k＝2(置信区间P＝0.95)，得到扩展不确定度。TP53基因片段标准物质的定值结果及不确定度见表3。

表3 TP53基因片段标准物质定值结果

综上所述，本发明采用数字PCR方法研制了一种低浓度水平(小于1000copies/μL)的短链DNA标准物质，对标物物质的纯度、保存条件、均匀性、稳定性和定值进行了系统的研究，所述标准物质采用多家单位联合定值，定值结果准确可靠，可以有效地保障低浓度水平核酸检测结果的准确性和可靠性，提供可靠的量值溯源依据。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市计量测试技术研究院(中国上海测试中心、华东国家计量测试中心、上海市计量器具强制检定中心)

<120> 一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用

<130> 20190708

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtaccaccat ccactacaac tacatgt 27

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggctcctgac ctggagtctt c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

catgaaccgg aggcccatcc tca 23

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gccacaggtc tccccaaggc gcactggcct catcttgggc ctgtgttatc tcctaggttg 60

gctctgactg taccaccatc cactacaact acatgtgtaa cagttcctgc atgggcggca 120

tgaaccggag gcccatcctc accatcatca cactggaaga ctccaggtca ggagccactt 180

gccaccctgc acactggcct gctgtgcccc agcctctgct tgcctctgac ccctgggccc 240

acctcttacc gatttcttcc atactactac ccatccacct ctcatcacat ccccggcggg 300

Claims

1.一种低浓度DNA标准物质的保护剂，其特征在于，所述保护剂包括鲑鱼精DNA，

所述鲑鱼精DNA的浓度为20μg/mL～100μg/mL；

所述DNA标准物质的浓度不超过1000copies/μL。

2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述鲑鱼精DNA的浓度为20μg/mL～50μg/mL。

3.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述DNA标准物质的核酸序列如SEQ IDNO:4所示。

4.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述DNA标准物质采用数字PCR进行检测；

所述数字PCR的引物的核酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；

所述数字PCR的探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

6.一种DNA标准物质的保存方法，其特征在于，所述方法包括向DNA标准物质中加入鲑鱼精DNA，进行DNA标准物质的保存的步骤；

所述鲑鱼精DNA的浓度为20μg/mL～100μg/mL。

7.根据权利要求6所述的DNA标准物质的保存方法，其特征在于，所述鲑鱼精DNA的浓度为20μg/mL～50μg/mL。

8.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于，所述DNA标准物质的保存时间为150～180天；

所述DNA标准物质的保存温度为-15℃～-20℃。

9.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于，所述DNA标准物质保存于离心管中。

10.根据权利要求9所述的保存方法，其特征在于，所述DNA标准物质保存于低吸附离心管中。

11.一种DNA标准物质，其特征在于，所述DNA标准物质采用如权利要求1-5任一项所述的保护剂和/或如权利要求6-10任一项所述的保存方法进行保存。

12.一种如权利要求11所述的DNA标准物质在体外核酸检测方法质量控制上的应用。