CN111518887A - 用于检测hla-b*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测hla-b*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测HLA‑B*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法，该引物组包括3个序列特异性扩增引物对和至少一个内参基因引物对，这3个序列特异性扩增引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1‑6所示。利用该引物组，可对HLA‑B*1502等位基因的基因型进行检测。

Description

用于检测HLA-B*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及用于检测HLA-B*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
抗癫痫药物，如卡马西平、奥卡西平及苯妥英钠等，可引起皮肤不良反应，如轻度斑丘疹(MPE)、Stevens-Johnson综合征(SJS)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermalnecrolysis，TEN)及药物超敏综合征(Drug hypersensitivity syndrome，DHS)等。其中SJS和TEN是严重的皮肤和黏膜反应，可导致永久性残疾甚至致命，TEN致死率高达40％。
HLA(human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)是编码人类主要组织相容性复合体(MHC)的基因簇，定位于人类6号染色体短臂上，分为HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA-Ⅰ类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三类，其中，HLA-B是人类基因组中最具多态性的区域，包含超过1600个等位基因。美国食品药品监督管理局(FDA)于2007年12月12日发布通知，告诫HLA-B*1502等位基因阳性者服用卡马西平可能发生严重和潜在致命的皮肤反应，并推荐亚裔血统患者开始使用卡马西平前进行血液基因筛查。
目前，卡马西平、苯妥英等抗癫痫药物的药品说明书建议，携带HLA-B*1502等位基因的患者在接受卡马西平、苯妥英等抗癫痫治疗之前，应进行HLA-B*1502等位基因筛查，筛查结果阳性的患者不宜使用卡马西平、苯妥英等抗癫痫药物，除非药品的预期收益明显大于严重皮肤反应风险。
目前，可用全基因组测序的方法对人白细胞抗原HLA-B进行基因分型，对HLA-B*1502等位基因进行鉴定。但该方法检测周期长，成本高。
发明内容
本发明提供了用于检测HLA-B*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法，能够检测HLA-B*1502基因型。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了用于检测HLA-B*1502等位基因的引物组，包括：第一序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示；第二序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示；第三序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.6所示；用于扩增内参基因的至少一个内参基因引物对。
详细地，不同序列特异性扩增引物对所对应的关键位点不同。
详细地，上述内参基因为保守基因，以对PCR体系扩增过程进行质控。上述内参基因既可以为除HLA外的其他基因，也可以为HLA上不同于HLA-B*1502等位基因的其他基因。即内参基因不包括HLA-B*1502等位基因。
详细地，可以根据不同类型核心序列关键几处碱基的差异，来设计序列特异性引物。如此，基于该序列特异性引物，可通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)结合电泳的方法，来判断HLA-B*1502等位基因的基因型。
具体地，可以利用上述引物组来扩增待测样本，并对PCR扩增产物作电泳检测。电泳检测结果显示引物组中每一个引物对均有相应的扩增条带时，待测样本为HLA-B*1502基因型阳性。电泳检测结果显示引物组中每一个内参基因引物对均有相应的扩增条带，且引物组中至少一个序列特异性扩增引物对没有相应的扩增条带时，待测样本为HLA-B*1502基因型阴性。
详细地，所述第一序列特异性扩增引物对扩增HLA-B*1502等位基因的扩增片段的长度为677bp；所述第二序列特异性扩增引物对扩增HLA-B*1502等位基因的扩增片段的长度为124bp；所述第三序列特异性扩增引物对扩增HLA-B*1502等位基因的扩增片段的长度为374bp。
进一步地，所述至少一个内参基因引物对包括：第一内参基因引物对，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.8所示；第二内参基因引物对，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ IDNO.10所示。
详细地，所述第一内参基因引物对扩增内参基因的扩增片段的长度为785bp；所述第二内参基因引物对扩增内参基因的扩增片段的长度为250bp。
基于上述内容，利用上述引物组进行PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，以便于后续可电泳分辨不同长度的片段。进而可根据电泳检测结果确定HLA-B*1502基因型。
结合上述内容，对上述5个引物对分别作以下说明：
第一序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因的上下游引物，相应扩增片段长度为677bp，其序列分别为：
上游引物序列：CCGGAACACACAGATCTCCAAGACCAACA
下游引物序列：TTTCCTCCTCTTCTCGTGGGAGGCCAT。
第二序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因的上下游引物，相应扩增片段长度为124bp，其序列分别为：
上游引物序列：ATTACTCGCGAGTCCGAGGATGGC
下游引物序列：CTATACTGCAGGTTCCGCAGGCTCT。
第三序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因的上下游引物，相应扩增片段长度为374bp，其序列分别为：
上游引物序列：TTGCCGGAGTATTGGGACCGGAAC
下游引物序列：GTCGCAGCCATACATCCTCTGGATGA。
第一内参基因引物对，用于扩增内参基因的上下游引物，相应扩增片段长度为785bp，其序列分别为：
上游引物序列：AGACTTGCCAAGTGGAGCACCCAA
下游引物序列：GGAGACGCATCTTGCTCTGTGCAGAT。
第二内参基因引物对，用于扩增内参基因的上下游引物，相应扩增片段长度为250bp，其序列分别为：
上游引物序列：GCGTACATGATGTTGACCTTTCCAGGG
下游引物序列：CGCGTCGTTCTGTAACTTTTCATCAGTTGC。
第二方面，本发明提供了上述第一方面中任一所述的引物组在制备用于检测HLA-B*1502等位基因的试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供了用于检测HLA-B*1502等位基因的试剂盒，包括PCR反应试剂和上述第一方面中任一所述的引物组。
进一步地，所述引物组中每种引物的终浓度均在20-300nM范围中；
所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和超纯水；
其中，DNA聚合酶的用量在0.5-5U范围中，dNTPs(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)中每种dNTP的终浓度均在50-500μM范围中。
举例来说，每种引物的终浓度可以为20nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM或300nM；DNA聚合酶的用量可以为0.5U、1U、2U、3U、4U或5U；每种dNTP的终浓度均可以为50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、450μM或500μM。
详细地，所述DNA聚合酶可以为Taq酶、KOD FX酶、KOD Plus酶、LA Taq酶等。详细地，PCR缓冲液可以为与所选用DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液，具体浓缩程度可选用2×、5×或10×。反应体系可以等比例的放大或缩小。此外，更换其他DNA聚合酶系时，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
举例来说，选用KOD FX这一DNA聚合酶，且选用2×的浓缩缓冲液时，为配置上述PCR反应体系，体系中各个组分的用量可以为：DNA聚合酶0.2-1μl、PCR缓冲液7-15μl、各种dNTP的混合物1-10μl、上下游引物各0.3-2μl、DNA 5-500ng，以及适量超纯水以补水至20μl。当然，还可以为按照相同比例配置的其他体积大小。
进一步地，所述试剂盒所适用的PCR扩增反应条件包括：92-96℃1-10min；92-98℃5-60s，56-68℃10-60s，68-72℃30s-5min，共25-40个循环；68-72℃0-30min。
举例来说，对于92-96℃，可以为92℃、93℃、94℃、95℃或96℃；对于1-10min，可以为1min、2min、3min、6min、9min或10min；对于5-60s，可以为5s、10s、20s、30s、40s、50s或60s；对于56-68℃，可以为56℃、58℃、60℃、62℃、66℃或68℃；对于10-60s，可以为10s、20s、30s、40s、50s或60s；对于68-72℃，可以为68℃、70℃或72℃；对于30s-5min，可以为30s、1min、2min、3min、4min或5min；对于25-40个，可以为25个、30个、35个或40个；对于0-30min，可以为0min、5min、10min、20min或30min。
第四方面，本发明提供了HLA-B*1502等位基因扩增方法，包括利用上述第一方面中任一所述的引物组，或，利用上述第三方面中任一所述的试剂盒，扩增HLA-B*1502等位基因。
进一步地，所述引物组中每种引物的终浓度均在20-300nM范围中；
所述HLA-B*1502等位基因扩增的PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和超纯水；
其中，DNA聚合酶的用量在0.5-5U范围中，dNTPs中每种dNTP的终浓度均在50-500μM范围中。
进一步地，所述HLA-B*1502等位基因扩增的PCR扩增反应条件包括：92-96℃1-10min；92-98℃5-60s，56-68℃10-60s，68-72℃30s-5min，共25-40个循环；68-72℃0-30min。
第五方面，本发明提供了用于检测HLA-B*1502基因型的方法，包括：
步骤1：从待测样本中提取模板DNA，作为扩增模板；
步骤2：利用权利要求7至9中任一所述的HLA-B*1502等位基因扩增方法，对包含所述扩增模板的PCR反应体系进行PCR扩增反应，得到PCR产物；
步骤3：电泳检测所述PCR产物；
步骤4：根据电泳检测结果，确定所述待测样本的HLA-B*1502基因型；
其中，电泳检测结果显示所述引物组中每一个引物对均有相应的扩增条带时，所述待测样本为HLA-B*1502基因型阳性，电泳检测结果显示所述引物组中每一个内参基因引物对均有相应的扩增条带，且所述引物组中至少一个序列特异性扩增引物对没有相应的扩增条带时，所述待测样本为HLA-B*1502基因型阴性。
详细地，步骤1中，模板DNA为人类基因组DNA，可以选用手工提取或商品化试剂盒提取方法，对待测样本进行提取处理得到人类基因组DNA；所述待测样本为含有人类基因组DNA的人类的血液、细胞、组织或口腔拭子样本等生物学样本。
详细地，步骤3中，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分辨不同长度的片段。
详细地，PCR-SSP(sequence specific primer)即序列特异引物引导的PCR反应。本发明提供了序列特异性引物，该引物根据不同类型核心序列关键几处碱基的差异而设计，从而可通过PCR-电泳的方法判断HLA-B*1502等位基因的基因型。
本发明提供了用于检测HLA-B*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法，该引物组可对HLA-B*1502等位基因进行扩增，从而可根据扩增产物的电泳检测结果来判定HLA-B*1502等位基因的基因型。至少可以具有以下特点：
(1)检测成本低，易于普及。可以采用PCR-SSP来检测HLA-B*1502等位基因的基因型，使用普通的非标记引物和普通的PCR仪，并结合电泳即可实现检测，成本较低。而无需使用成本较高的荧光探针，以及无需使用成本较高的荧光PCR仪。可见，由于引物无需标记荧光，加上无需昂贵、复杂的设备，大大节约了检测成本，任何检测机构均可开展。
(2)检测时间短，检测效率高，方便快捷。通过PCR-电泳即可直接判读HLA-B*1502等位基因的基因型，而不用测序，简单高效。
(3)扩增结果判读直观准确。基于特定的引物设计、扩增体系、扩增程序，可以将各对引物的扩增产物大小充分区分，各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，确保了结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
设计并合成引物组，包括以下步骤：
步骤1.1：基于HLA-B*1502基因型所特有的基因序列，设计序列特异性扩增的3对上下游引物，另外设计2对内参引物，以对PCR体系过程进行质控。
对于设计引物，采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析。
本实施例所提供的序列特异性扩增引物，对HLA-B*1502基因型所特有的序列可具有特异性，本实施例所提供的内参基因，可覆盖基因的保守区域。
由于小的序列变化会导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，故分别设计PCR引物对，并在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和特异性位点/序列包含情况，选取了如下述表1所示的扩增效果最佳的引物对。
表1
Figure BDA0002477176790000081
表1中的SEQ ID NO.1-6这三个引物对，分别用于扩增HLA-B*1502等位基因的不同位点，表1中的SEQ ID NO.7-10这两个引物对，用于扩增内参基因。
步骤1.2：合成步骤1.1中设计好的引物组。
实施例2
从待测样本中提取基因组DNA，包括如下步骤：
步骤2.1：用口腔拭子收集口腔脱落细胞或新鲜外周血样本。
步骤2.2：采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)，或，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，从样本中提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，保存基因组DNA。
实施例3
HLA-B*1502等位基因扩增方法，包括以下步骤：
步骤3.1：以步骤2.2中所得的基因组DNA为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的引物组，来配制PCR反应体系。
本实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101)中DNA聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量，来分别配制3个序列特异性PCR扩增体系和1个内参基因扩增反应体系。
本实施例通过多个扩增反应体系来分别扩增HLA-B*1502等位基因的各个特异性位点，可以避免通过同一扩增反应体系来扩增各个特异性位点时，因各个特异性位点之间距离较为临近，而容易出现扩增干扰，进而影响电泳结果判定的情况。
各个序列特异性PCR扩增反应体系的具体组成如下述表2所示，内参基因扩增反应体系的具体组成如下述表3所示。当然，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
表2
试剂成分 体积
2×PCR buffer for FX 9μl
2mM dNTP 4μl
F(10μM) 0.5μl
R(10μM) 0.5μl
KOD FX(1U/μl) 0.5μl
基因组DNA 1μl
超纯水 4.5μl
表2中，F用于表征引物对中的上游引物，R用于表征引物对中的下游引物。如此，可以配置得到3个序列特异性PCR扩增体系，不同体系中的引物对不同。本实施例中，基因组DNA采用20ng。当然，DNA模板量可按需调整。
表3
试剂成分 体积
2×PCR buffer for FX 10μl
2mM dNTP 5μl
F1(10μM) 0.6μl
R1(10μM) 0.6μl
F2(10μM) 0.6μl
R2(10μM) 0.6μl
KOD FX(1U/μl) 0.5μl
基因组DNA 1μl
超纯水 1.1μl
表3中，F用于表征引物对中的上游引物，R用于表征引物对中的下游引物。本实施例中，基因组DNA采用20ng。当然，DNA模板量可按需调整。
步骤3.2：按照下述表4所示的PCR反应条件，设置PCR仪器的程序。其中，PCR反应结束后，在4℃下保存。
表4
Figure BDA0002477176790000101
步骤3.3：利用程序设好的PCR仪器，对步骤3.1中配置的各个PCR反应体系，同时进行PCR扩增反应，得到相应PCR产物。
实施例4
电泳检测，包括以下步骤：
步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.3中得到的各个PCR产物，以验证有无PCR扩增产物及产物片段的大小。
预先配制3％的琼脂糖凝胶，取步骤3.3中得到的PCR扩增产物5μl点样于凝胶上，电压120V，电泳40min后，于凝胶成像仪上观察PCR产物片段的大小，并拍摄清晰照片保存。
图1示出了琼脂糖凝胶电泳检测结果，图1中所示出的19E04、19E05、1502-阳、DJL等主要用于区分不同的待测样本。图1的最左侧列展示了标尺条，除标尺条外从左至右每4个泳道为一组，依次为19E04、19E05、1502-阳、DJL这4个待测样本的PCR产物的电泳结果，最右侧一组为空白对照组的PCR产物的电泳结果。
其中，对于任意一组中的4个泳道，从左至右依次对应于：包含第一序列特异性扩增引物对(如表1中的SEQ ID NO.1-2所示)的扩增反应体系、包含第二序列特异性扩增引物对(如表1中的SEQ ID NO.3-4所示)的扩增反应体系、包含第三序列特异性扩增引物对(如表1中的SEQ ID NO.5-6所示)的扩增反应体系、包含2个内参基因引物对(如表1中的SEQ IDNO.7-10所示)的扩增反应体系。基于此，图1中示出的F1、F2、F3均为序列特异性引物扩增结果，图1中示出的C12为内参基因引物的两重PCR扩增结果。
请参考图1，根据各个PCR产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，以及结合各个PCR产物亮带所在的泳道，可以直观、快速、准确地识别出各个产物亮带所对应的是哪一引物对的扩增产物。
具体地，根据内参基因的条带和标尺条对比，可以识别出PCR扩增是否正常；根据3个序列特异性扩增条带和标尺条对比，可以识别出是否有各个序列特异性扩增引物对的相应扩增条带。
请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，所扩增出的目标条带清晰无拖影等，亮带效果良好。
请参考图1，利用步骤1.1中设计的PCR扩增引物对HLA-B*1502阳性样本进行PCR扩增时，能够生成预期的目标产物，而未生成预期外的其他无关产物，引物对设计合理。利用步骤1.1中设计的PCR扩增引物对HLA-B*1502阴性样本进行PCR扩增时，能够得到预期的扩增效果，而未生成预期外的其他无关产物，引物对设计合理。
步骤4.2：电泳验证PCR产物片段的大小正确后，针对待测样本的PCR产物进行HLA-B*1502基因型的判读。
如果内参基因扩增正常，且3个特异性扩增均能产生大小正确的目标条带，则所检测的样本为HLA-B*1502基因型阳性。
如果内参基因扩增正常，而3个特异性扩增未能同时产生大小正确的目标条带，则所检测的样本为HLA-B*1502基因型阴性。
请参考图1，各个待测样本的C12泳道均产生了大小正确的目标条带，内参基因扩增正常，说明PCR扩增正常。
请参考图1，19E04这一待测样本的F1泳道和F2泳道均产生了大小正确的目标条带，但F3泳道未产生条带，则该待测样本为HLA-B*1502基因型阴性。
请参考图1，19E05这一待测样本的F1-F3泳道均产生了大小正确的目标条带，则该待测样本为HLA-B*1502基因型阳性。
请参考图1，1502-阳这一待测样本的F1-F3泳道均产生了大小正确的目标条带，则该待测样本为HLA-B*1502基因型阳性。
请参考图1，DJL这一待测样本的F1泳道和F3泳道均产生了大小正确的目标条带，但F2泳道未产生条带，则该待测样本为HLA-B*1502基因型阴性。
实施例5
分两个批次，共自检并送检了10个待测样本，送检机构为卫生部临床检验中心，科室为中心实验室，送检测定日期分别为2019.3.7和2019.10.15，送检的样本编号分别为19E01-19E05和19E06-19E10。
卫生部临床检验中心发布的全国人类白细胞抗原(LHA)B*1502基因检测室间质量评价统计结果显示，各个样本的自检结果与该中心提供的正确结果均相一致，评价结果为通过，成绩为100％。
实施例6
表1中示出的引物组在制备用于检测HLA-B*1502等位基因的试剂盒中的应用。制备得到的试剂盒包括表1中示出的各个引物对，其中，SEQ ID NO.1-6这6种引物用于扩增HLA-B*1502等位基因，SEQ ID NO.7-10这4种引物用于对PCR体系过程进行质控。
该试剂盒可用于对HLA-B*1502等位基因的基因型的检测应用中。
实施例7
实施例6制备得到的一种试剂盒，该试剂盒包括PCR反应试剂和引物组。该PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和超纯水。
该试剂盒包括3种序列特异性PCR扩增反应体系，各种序列特异性PCR扩增反应体系的具体成分如上述表3所示。这3种反应体系中，分别包括有如表1中SEQ ID NO.1-2所示的引物对、SEQ ID NO.3-4所示的引物对、SEQ ID NO.5-6所示的引物对。
该试剂盒包括1种内参基因扩增反应体系，其具体成分如上述表4所示，该反应体系中包括有表1中SEQ ID NO.7-10所示的2个引物对。
各个反应体系在试剂盒中均单管存放。
综上所述，本发明实施例中，基于特定设计的引物组合，并结合PCR-SSP，可以检测HLA-B*1502等位基因的基因型，具有结果准确、操作简便、成本低廉、扩增无干扰等优点。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司
<120> 用于检测HLA-B*1502等位基因的引物组、试剂盒及方法
<130> 2020.01.15
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增HLA-B*1502等位基因的上游引物
<400> 1
ccggaacaca cagatctcca agaccaaca 29
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增HLA-B*1502等位基因的下游引物
<400> 2
tttcctcctc ttctcgtggg aggccat 27
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增HLA-B*1502等位基因的上游引物
<400> 3
attactcgcg agtccgagga tggc 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增HLA-B*1502等位基因的下游引物
<400> 4
ctatactgca ggttccgcag gctct 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增HLA-B*1502等位基因的上游引物
<400> 5
ttgccggagt attgggaccg gaac 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增HLA-B*1502等位基因的下游引物
<400> 6
gtcgcagcca tacatcctct ggatga 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增内参基因的上游引物
<400> 7
agacttgcca agtggagcac ccaa 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增内参基因的下游引物
<400> 8
ggagacgcat cttgctctgt gcagat 26
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增内参基因的上游引物
<400> 9
gcgtacatga tgttgacctt tccaggg 27
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于扩增内参基因的下游引物
<400> 10
cgcgtcgttc tgtaactttt catcagttgc 30

Claims (10)

1.用于检测HLA-B*1502等位基因的引物组，其特征在于，包括：
第一序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示；
第二序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示；
第三序列特异性扩增引物对，用于扩增HLA-B*1502等位基因，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.6所示；
用于扩增内参基因的至少一个内参基因引物对。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述至少一个内参基因引物对包括：
第一内参基因引物对，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.8所示；
第二内参基因引物对，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.10所示。
3.如权利要求1或2所述的引物组在制备用于检测HLA-B*1502等位基因的试剂盒中的应用。
4.用于检测HLA-B*1502等位基因的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应试剂和如权利要求1或2所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，
所述引物组中每种引物的终浓度均在20-300nM范围中；
所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和超纯水；
其中，DNA聚合酶的用量在0.5-5U范围中，dNTPs中每种dNTP的终浓度均在50-500μM范围中。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒所适用的PCR扩增反应条件包括：92-96℃1-10min；92-98℃5-60s，56-68℃10-60s，68-72℃30s-5min，共25-40个循环；68-72℃0-30min。
7.HLA-B*1502等位基因扩增方法，其特征在于，利用如权利要求1或2所述的引物组，或，利用如权利要求4至6中任一所述的试剂盒，扩增HLA-B*1502等位基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述引物组中每种引物的终浓度均在20-300nM范围中；
所述HLA-B*1502等位基因扩增的PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和超纯水；
其中，DNA聚合酶的用量在0.5-5U范围中，dNTPs中每种dNTP的终浓度均在50-500μM范围中。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，
所述HLA-B*1502等位基因扩增的PCR扩增反应条件包括：92-96℃1-10min；92-98℃5-60s，56-68℃10-60s，68-72℃30s-5min，共25-40个循环；68-72℃0-30min。
10.用于检测HLA-B*1502基因型的方法，其特征在于，包括：
步骤1：从待测样本中提取模板DNA，作为扩增模板；
步骤2：利用权利要求7至9中任一所述的HLA-B*1502等位基因扩增方法，对包含所述扩增模板的PCR反应体系进行PCR扩增反应，得到PCR产物；
步骤3：电泳检测所述PCR产物；
步骤4：根据电泳检测结果，确定所述待测样本的HLA-B*1502基因型；
其中，电泳检测结果显示所述引物组中每一个引物对均有相应的扩增条带时，所述待测样本为HLA-B*1502基因型阳性，电泳检测结果显示所述引物组中每一个内参基因引物对均有相应的扩增条带，且所述引物组中至少一个序列特异性扩增引物对没有相应的扩增条带时，所述待测样本为HLA-B*1502基因型阴性。
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