CN103114138A - Pcr-ssp法定性检测hla-b*1502基因的方法及临床试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种PCR-SSP法定性检测HLA-B*1502基因的方法及临床检测试剂盒。本发明方法包括：找出6个能够有效识别HLA-B*1502等位基因型的特异区域；设计覆盖6个特异区域的6个特异引物，从中筛选高特异性的适用于PCR-SSP的引物对；反应体系中加入dUTP和UDG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶），解决PCR交叉污染的问题，从而进一步提高了检测的可靠性。据此研发HLA-B*1502快速简便定性检测试剂盒。本发明具有操作简便、花费时间短、特异性强、准确性高及成本低等优点。适用于中国或亚洲人种中癫痫患者在服用卡马西平和苯妥英钠之前，通过HLA-B*1502基因型检测，实现个体化安全合理用药。

Description

PCR-SSP法定性检测HLA-B*1502基因的方法及临床试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种定性检测HLA-B*1502基因的方法及相应的临床检测试剂盒。 

背景技术

癫痫病是一种高发性神经性疾病，发病人数在国外每年为40～70/10万人口，国内为30/10万左右^[1]，治疗癫痫的主要药物有苯妥英钠、卡马西平、乙琥胺、丙戊酸钠等常规药物及拉莫三嗪、奥卡西平、托吡酯等新型药物。卡马西平和苯妥英钠是目前常用的一线抗癫痫药，对复杂部分性发作的癫痫具有显著的疗效。抗癫痫药物的副反应有头痛头晕、行走不稳、厌食、恶心、呕吐，长期服用对人体的记忆、运动速度、神经系统有很大危害，会导致精神失常、人体各器官机能损伤，儿童智力发育受影响及可能威胁生命的皮肤不良反应，皮肤不良反应包括轻度的斑丘包疹及重度的重型药疹Stevens-Johnson综合征（SJS）和中毒性表皮坏死松解症（TEN）。SJS和TEN是罕见的皮肤疾病，其发病率分别为每年每百万人1.2～6和0．4～1.2人次^[2]，SJS的死亡率是5%，TEN的死亡率达25-35%。多种抗癫痫药物都会诱导SJS-TEN，包括芳香环药物卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥及非芳香环的拉莫三嗪，发病率为1-10/10000左右。对亚洲人群（中国东南部^[3]，马来西亚^[4]，泰国^[5 ]）研究证实卡马西平、苯妥英钠诱导的SJS-TEN与患者是否携带HLA-B*1502基因有很大关联。美国食品药物管理局（FDA）给出了相关警告且将HLA-B*1502列为卡马西平和苯妥英钠诱导SJS-TEN的基因关联生物标记物。美国食品药物管理局（FDA）的资料显示，中国、泰国、马来西亚和台湾等亚洲地区带有HLA-B*1502的人群高达10%以上，而日本、韩国带有HLA-B*1502的人群的比率低于1%，欧洲人群的HLA-B*1502则很罕见^[6]。因此对癫痫病人首先进行HLA-B*1502分型再决定是否给病人服用卡马西平、苯妥英钠还是其他替代药物是很有意义的。 

人的主要组织相容性复合体（MHC）称为HLA（human leukocyte antigen）。HLA复合体位于第6号染色体短臂上6p21.3（6号染色体短臂2区1带3亚带），全长约4000kb。HLA-B*1502是其中的一个等位基因，代表一种单体型。HLA-B基因序列比较复杂，每个基因型与其他相比有数个不同且不相连的位点差异，因此一般的PCR难以进行分型。目前检测HLA-B*1502的主要方法为PCR-SBT（Polymerase chain reaction sequence-based typing，基于测序分型的聚合酶链反应）^[7]、PCR-SSP（Polymerase chain reaction sequence specific primer，序列特异引物引导的聚合酶链反应）^[8]和PCR –SSO（PCR using sequence-specific oligonucleotides，序列特异性寡核苷酸探针杂交聚合酶链反应）^[9]三种方法检测。PCR-SBT方法是对HLA基因的B位点进行测序，进而确定HLA-B*1502的高分辨率方法，但是其需要很高的人力及物力花费，需要精密的高端仪器在专门的研究中心实验，并且周转时间较长（大于1天）；PCR-SSP方法是利用与HLA等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异特异性PCR扩增，具有人力、物力花费低，时间短的特性；PCR-SSO 方法是PCR扩增产物用一组与HLA等位基因序列互补探针进行杂交，然后确定HLA-B基因型的方法，其缺点是设备要求高、操作过程复杂，难以在短时间内完成全部HLA等位基因的分型。总的来说PCR-SSP相对是比较简单方便、特异性高的方法。传统的PCR-SSP方法需要四对特异引物和两对内参引物进行6次PCR反应，这不仅造成检测繁琐，分析困难，而且无论是灵敏度还是特异度均不够理想。如果想把PCR-SSP方法推广到临床应用当中，其价格、反应时间还可以再进行优化。目前市场已有的基于PCR-SSP方法单特异引物检测HLA-B*1502试剂盒是台湾的Pharmigene公司的PG1502试剂盒^[10]，其特异度为98.35%（616个样本），由于价格较高，不便在内地市场推广。另外，其检测引物不能区别 HLA-B*15:13， 15:31， 15:55， 15:88， 15:89， 18:20， 95:12， 95:21， 95:44， 95:70等HLA-B等位基因，会产生假阳性。且该试剂盒没有采取防PCR污染的措施，在临床检测中也容易导致假阳性。假阳性结果使得病人无法选择合适的药物，其后果对于儿童癫痫患者特别严重。相比其他药物卡马西平对儿童的副作用较小，丙戊酸钠会对肝脏产生重大损伤，而苯巴比妥会造成儿童智力下降。若检测有假阳性存在会导致儿童无法正确选用卡马西平而服用其他药物，造成可能的损害。 

本发明提供了一种快速，简便地定性检测HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法， 具有快速、简便、高特异度，抗污染的的优点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简便，特异度高的定性检测HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法。 

本发明提供的定性检测HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法，首先进行HLA-B*1502特异位点的解析和PCR-SSP引物设计区域的确定：通过对超过200个HLA-B等位基因的序列比对，得到HLA-B*1502的6个特异区域，它们位于HLA-B等位基因的第2和第3外显子，见附图1所示；然后根据这6个特异区域，设计PCR-SSP检测的特异引物，这些特异引物见表2所示。具体操作步骤为：  

（1）收集IMGT/HLA数据库（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）的HLA-B，特别是HLA-B*15单体型的基因组、转录组的序列，找出HLA-B*1502的特异区域。

（2）通过序列比对，得到HLA-B*1502基因第2和第3外显子的6个特异区域（附图1），HLA-B*1502单体型的基因序列中第126 至第140个碱基为第一特异区域，其序列为CCGAGGATGGCGCCC（SEQ NO.1），其中核心位点为G₁₃₁，A₁₃₂，T₁₃₃，C₁₃₆，C₁₄₀；第182至第199个碱基为第二特异区域，其序列为CCGGAACACACAGATCTC（SEQ NO.2），其中核心位点为A₁₈₆，C₁₈₈，C₁₉₉；第229至第246个碱基为第三特异区域，其序列为GCCTGCGGAACCTGCGCG（SEQ NO.3），其中核心位点为G₂₂₉，A₂₃₈，C₂₄₀，T₂₄₁，G₂₄₄，G₂₄₆；第274至第296个碱基为第四特异区域，其序列为CTCACATCATCCAGAGGATGTAT（SEQ NO.4），其核心位点为T₂₈₀，C₂₈₁，A₂₈₂，T₂₈₃，C₂₈₄，G₂₈₉，G₂₉₀，A₂₉₅，T₂₉₆；第331至第347个碱基为第五特异区域，其序列为GCGGGTATGACCAGTCC（SEQ NO.5），其核心位点为T₃₃₆，G₃₃₉，C₃₄₆；第460至第487个碱基为第六特异区域，其序列为AGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCCT（SEQ NO.6），其核心位点为C₄₆₅，T₄₆₆，C₄₆₇，C₄₈₆，T₄₈₇。 

（3）依据上述特异区域设计引物，共6个，这些引物见表 2所示；从这6个引物中，随机组合出15对引物，见表3。其中p2，p3，p4，p5为双向引物。通过序列比对，分别找出其可能造成假阳性的HLA-B基因型，选用其中可能假阳性数目较少即特异度较高的引物组进行特异性、灵敏度的比较实验，筛选得一对高特异性、高灵敏度特异引物 （参见如表4 B1502-SSP-F2 和B1502-SSP-R5）。 

（4）选择一对内参引物用于检测DNA模板的质量（参见如表4 B1502-iCTRL-F和B1502-iCTRL-R）。 

 本发明提供的定性检测HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法，具体步骤为： 

（1）提取受试者血液或组织的基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的受试者的基因组DNA为模板，在含检测HLA-B*1502单特异引物及dUTP和UDG酶的PCR反应体系中进行PCR扩增；B1502-SSP-F2 和B1502-SSP-R5；内参引物为B1502-iCTRL-F和B1502-iCTRL-R；

（3）扩增结束后，将扩增后的样品在2%琼脂糖凝胶孔中进行电泳分离。若有一条特异条带和一条内参对照条带则说明样品为HLA-B*1502阳性，若只含有内参对照条带那么所测样品为HLA-B*1502阴性。若无条带则说明DNA质量不合格，需要重新提取DNA进行检测；

最后（可使用ABI3730测序仪）测序，验证结果。

上述检测方法步骤（2）中的12μl反应体系为：11 μl试剂盒试剂，1μl受试者样品DNA 1-10ng）。 

上述检测方法步骤的PCR反应条件为：先37°C 恒温孵育3min，再热启动95°C 10min，1个循环；然后变性95°C 20sec，延伸68°C 50sec，共40个循环；最后72°C 5min。 

上述检测方法步骤（3）电泳条件为：电泳时间为20-30min，电泳电场强度不高于5V/cm。 

本发明还提供用于HLA-B*1502基因快速检测的试剂盒。 

本试剂盒具体包含4管试剂，第一管为PCR Mix，包括2×PCR Mix，特异引物B1502-SSP-F2和B1502-SSP-R5，B1502-iCTRL-F和B1502-iCTRL-R，dUTP和UDG酶，共120μl；第二管为双蒸水100μl；第三管为HLA-B*1502阳性对照样品12μl；第四管为HLA-B*1502阴性对照样品12μl。 

本发明具有如下优点： 

1.本法可以快速地在3小时内完成对待测样本基因型的检测，单特异引物和内参引物降低了成本，方便操作，适用性广，对仪器要求低，适于广泛的临床检测应用。

2.本检测方法针对HLA-B*1502第2和第3外显子区域设计引物，特异性强，可以区分除了在亚洲地区频率极低的HLA-B*15:13，15:139，15:112和15:144外的其他HLA-B基因型，灵敏度和特异度高达100% 和99.46%，相比pharmigene公司的PG1502 试剂盒有所提高。同时有效地减少假阳性使病人得到安全合理的治疗。 

3.本检测方法灵敏度高，仅需1至10纳克DNA即可达到100%的检测灵敏度。 

4.本检测方法对部分降解的DNA也能进行有效的扩增。 

5.本检测方法增加了UDG酶防PCR污染体系，可以有效控制污染造成的假阳性问题。 

附图说明

图1为HLA-B*1502第2、第3外显子及中间内含子区段（虚线标出），其中框出的1、2、3、4、5、6区域标识出了序列比对得到的HLA-B*1502六个特异区段，其中核心特异碱基位点是：特异区1：G₁₃₁，A₁₃₂，T₁₃₃，C₁₃₆，C₁₄₀；特异区2：A₁₈₆，C₁₈₈，C₁₉₉；特异区3：G₂₂₉，A₂₃₈，C₂₄₀，T₂₄₁，G₂₄₄，G₂₄₆；特异区4：T₂₈₀，C₂₈₁，A₂₈₂，T₂₈₃，C₂₈₄，G₂₈₉，G₂₉₀，A₂₉₅，T₂₉₆；特异区5：T₃₃₆，G₃₃₉，C₃₄₆；特异区6：C₄₆₅，T₄₆₆，C₄₆₇，C₄₈₆，T₄₈₇。其中本方法引物覆盖第2号和第5号特异区段的核心区域，能够扩增第2号和第5号特异区段之间的序列。 

图2为用特异引物扩增HLA-B基因的电泳凝胶成像图。其中三条分别为1.空白对照；2.HLA-B*1502阴性样本；3为HLA-B*1502阳性样本。第二个样本（条带3）中有两条带，一条HLA-B*1502特异条带（430bp），一条内参对照条带（219bp），而在第一个样本（条带2）中没有特异条带。 

图3用特异引物扩增HLA-B基因的电泳凝胶成像图部分样本实验结果示意图，更清楚地展示实验结果。 

表1为部分代表性HLA-B基因型与HLA-B*1502序列比对结果。 

表2为针对HLA-B*1502第2、3外显子的6个特异区域设计的6个引物。 

表3为6个引物任取2个得到15组引物对，与HLA-B基因型进行序列比对得到的可能假阳性基因型。 

表4为本法引物名称和序列。 

表5为199个样本实验结果，分别是本法检测和测序方法检测。 

具体实施方式

实施例

1.参照生产厂家的说明书提取受试者的全血、唾液或其他组织的基因组DNA。 

2.主要试剂：HLA-B*1502临床试剂盒试剂。主要成分包括2×PCR Mix（Roche），dUTP，UDG酶（Thermo Scientific）。 

3.反应体系及PCR程序。 

配置12μlPCR反应体系：包括11 μl试剂盒试剂，受试者样品DNA 1μl（1-10ng）。PCR反应程序：先37°C 恒温孵育3min，再热启动95°C 10min，1个循环；然后变性95°C 20sec，延伸68°C 50sec，共40个循环；最后72°C 5min。 

4.PCR片段分离：2%琼脂糖凝胶电泳检测，电场强度不高于5V/cm，时间20-30min，凝胶成像系统成像。若有长度为430bp碱基的HLA-B*1502特异条带和长度为219bp碱基的内参对照条带，所测样品为HLA-B*1502阳性，若只含有内参对照条带，所测样品则为HLA-B*1502阴性，见图2。 

5.用ABI3730测序仪进行测序检测。 

6.结果。 

通过对199个中国未知HLA-B*1502样本进行单特异引物PCR-SSP分型，同时用ABI3730测序，得到的结果见表5。灵敏度为100%，特异度为99.46%，其中一个假阳性为HLA-B*15:13，在中国人群中频率极低。这一结果证实了本检测方法的准确性及可行性。 

参考文献：

[1]中国癫痫诊疗指南(最终稿)

[2]曹志豪,骆肖群.卡马西平诱发药疹与HLA-B在汉族人群中的关系[J].医学综述, 2011, 17(6):923-924.

[3]Pei Chen,Ph.D.,Juei-Jueng Lin,M.D.. Carbamazepine-Induced Toxic Effects and HLA-B*1502 Screening in Taiwan[J], The New England Journal of Medicine, 2011, 364:1126-1133.

[4]Choong-Chor Chang,MRCP.Association of HLA-B*1502 allele with carbamazepine-induced toxic epidermal necrolysis and Stevens–Johnson syndrome in the multi-ethnic Malaysian population[J],International Journal of Dermatology, 2011,50:221–224.

[5]Wichittra Tassaneeyakul,Somsak Tiamkao. Association between HLA-B*1502 and carbamazepine-induced severe cutaneous adverse drug reactions in a Thai population[J], Epilepsia,2010,51(5):926–930.

[6]P Brent Ferrell Jr,Howard L McLeod. Carbamazepine,HLA-B*1502 and risk of Stevens–Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: US FDA recommendations[R], Pharmacogenomics,2008,9(10):1543-1546.

 [7] S. Pozzi, A. Longo, G.B. Ferrara. HLA-B locus sequence-based typing [J], Tissue Antigens, 1999, 53(3):275-281.

[8]M.Bunce,G.C.Fanning.Comprehensive,serologically equivalent DNA typing for HLA-B by PCR using sequence specfic primers(PCR-SSP)[J],Tissue Antigens, 1995,45:81-90.

[9] L.Lin,K.Tokunaga,H.Tanaka. Further molecular diversity in the HLA-B15 group [J] , Tissue Antigens,1996,47:265-274.

[10] http://www.pharmigene.com/genetic_tests/genetic_tests_1502.htm。

  

表1-1.不同HLA-B序列主要差异区域示意表（部分）

HLA-B

131

132

133

136

186

188

199

229

238

240

241

244

246

280

B*15:02

G

A

T

C

A

C

C

G

A

C

T

G

G

T

B*15:01

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G

G

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C

B*15:03

A

G

A

A

G

G

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*

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C

B*15:07

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G

G

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C

B*15:112

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B*15:13

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A

T

G

C

T

C

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B15:139

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B*15:144

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B*15:178

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G

G

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*

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C

B*15:18

A

G

A

A

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G

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*

C

B*15:194

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B*15:223

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B*15:25

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G

G

*

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B*18:01

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*

C

A

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*

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C

B*18:02

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C

A

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C

B*35:01

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C

A

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T

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B*35:03

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C

A

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T

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B*46:01

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G

G

A

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C

B*51:104

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T

A

T

G

C

T

C

C

B*58:01

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*

C

A

G

G

T

A

T

G

C

T

C

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表1-2.不同HLA-B序列主要差异区域示意表（部分）

HLA-B

281

282

283

284

289

290

296

336

339

346

465

466

486

487

B*15:02

C

A

T

C

G

G

T

T

G

C

C

T

C

T

B*15:01

*

C

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C

C

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T

G

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B*15:03

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C

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C

C

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B*15:07

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C

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C

C

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T

G

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B*15:112

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C

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B*15:13

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B15:139

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B*15:144

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T

G

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B*15:178

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C

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*

C

C

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T

G

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B*15:18

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C

*

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C

C

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B*15:194

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*

C

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*

*

*

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B*15:223

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*

C

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*

*

*

B*15:25

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*

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B*18:01

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C

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*

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*

C

C

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*

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A

C

B*18:02

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C

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A

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C

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A

C

B*35:01

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C

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*

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*

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B*35:03

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C

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T

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*

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B*46:01

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C

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C

C

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*

T

G

*

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B*51:104

T

T

G

G

*

C

*

C

A

A

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*

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*

B*58:01

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*

*

*

C

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表2.针对HLA-B*1502特异区域设计引物

编号	覆盖特异区域	序列
			p1	1	GCCGCGAGTCCGAGGATGGC          （SEQ NO.7）
p2	2	TATTGGGACCGGAACACACAGATCTC  （SEQ NO.8）
			p3	3	GAGCCTGCGGAACCTGCGCG          （SEQ NO.9）
p4	4	TCATCCAGAGGATGTATGGCTGCG     （SEQ NO.10）
			p5	5	TATGACCAGTCCGCCTACGACGGC     （SEQ NO.11）
p6	6	CTGAGAGCCTACCTGGAGGGCCTGT    （SEQ NO.12）

表3.不同引物组特异性（可能产生假阳性的HLA-B基因型）

编号	引物  组合	可能假阳性基因型数	可能产生假阳性的HLA-B基因型
				1	p1&p2	6	B*15:112;B*15:13;B*15:139;B*15:144;B*15:194;B*15:223
2	p1&p3	59	B*15:01:01:01;B*15:01:17;B*15:01:20;B*15:01:23;B*15:07:01;B*15:07:02;B*15:11:01;B*15:11:03;B*15:11:05;B*15:112;B*15:117;B*15:118;B*15:126;B*15:129;B*15:136;B*15:137;B*15:138;B*15:139;B*15:144;B*15:149N;B*15:178;B*15:19;B*15:192;B*15:193;B*15:194;B*15:195;B*15:199;B*15:201;B*15:209N;B*15:223;B*15:227;B*15:25:01;B*15:25:03;B*15:27:01;B*15:27:03;B*15:32;B*15:58;B*15:66;B*15:86;B*46:01:01;B*46:01:05;B*46:01:07;B*46:06;B*46:08;B*46:09;B*46:12;B*46:13;B*46:14;B*46:18;B*46:19;B*46:21:01;B*46:23;B*46:24;B*46:25;B*46:26;B*46:28;B*46:29;B*46:30;B*55:35
				3	p1&p4	7	B*15:13;B*15:139;B*15:144;B*15:194;B*15:223;B*15:25:01;B*15:25:03
4	p1&p5	6	B*15:112;B*15:13;B*15:139;B*15:144;B*15:25:01;B*15:25:03
				5	p1&p6	14	B*15:112;B*15:13;B*15:139;B*15:194;B*15:195;B*15:196;B*15:223;B*15:25:01;B*15:25:03;B*46:08;B*46:13;B*46:26;B*51:104;B*57:29
6	p2&p3	9	B*15:112;B*15:139;B*15:144;B*15:194;B*15:223;B*18:01:14;B*18:02;B*18:22;B*55:47
				7	p2&p4	6	B*15:13;B*15:139;B*15:144;B*15:194;B*15:223;B*53:09
8	p2&p5	4	B*15:112;B*15:13;B*15:139;B*15:144
				9	p2&p6	7	B*15:112;B*15:13;B*15:139;B*15:194;B*15:223;B*51:07:01;B*53:09
10	p3&p4	25	B*15:139;B*15:144;B*15:194;B*15:223;B*15:25:01;B*15:25:03;B*35:01:01:02;B*35:01:20;B*35:01:21;B*35:01:22;B*35:01:23;B*35:02:01;B*35:03:01;B*35:03:07;B*35:08:01;B*35:11:02;B*35:137;B*35:145N;B*35:147;B*35:155;B*35:161;B*35:168;B*35:186;B*35:42:02;B*40:59
				11	p3&p5	6	B*15:112;B*15:139;B*15:144;B*15:25:01;B*15:25:03;B*40:60
12	p3&p6	43	B*15:03:01;B*15:112;B*15:133;B*15:134;B*15:139;B*15:18:01;B*15:194;B*15:195;B*15:197;B*15:198;B*15:200;B*15:220;B*15:223;B*15:226N;B*15:25:01;B*15:25:03;B*35:01:01:02;B*35:01:20;B*35:01:21;B*35:01:22;B*35:01:23;B*35:02:01;B*35:03:01;B*35:03:07;B*35:05:01;B*35:11:02;B*35:137;B*35:145N;B*35:147;B*35:155;B*35:161;B*35:168;B*35:186;B*35:42:02;B*40:174;B*44:46;B*46:08;B*46:13;B*46:26;B*54:03;B*56:01:01;B*56:04;B*56:14
				13	p4&p5	5	B*15:13;B*15:139;B*15:144;B*15:25:01;B*15:25:03
14	p4&p6	34	B*15:13;B*15:139;B*15:194;B*15:223;B*15:25:01;B*15:25:03;B*35:01:01:02;B*35:01:20;B*35:01:21;B*35:01:22;B*35:01:23;B*35:02:01;B*35:03:01;B*35:03:07;B*35:11:02;B*35:137;B*35:145N;B*35:147;B*35:155;B*35:161;B*35:168;B*35:186;B*35:42:02;B*44:03:02;B*53:09;B*58:01:01;B*58:01:02;B*58:01:04;B*58:01:05;B*58:01:07;B*58:12;B*58:30;B*58:31N;B*58:32
				15	p5&p6	5	B*15:112;B*15:13;B*15:139;B*15:25:01;B*15:25:03

表4.引物名称和序列  

表5.实验结果

。

<110>  复旦大学

<120>  PCR-SSP法定性检测HLA-B*1502基因的方法及临床试剂盒

<130>  001

<160>  16   

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  15

<212>  DNA

<213>  

<400>  1

ccgaggatgg cgccc                                                      15

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  

<400>  2

ccggaacaca cagatctc                                                   18

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  

<400>  3

gcctgcggaa cctgcgcg                                                   18

 

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>   

<400>  4

ctcacatcat ccagaggatg tat                                             23

 

 

<210>  5

<211>  17

<212>  DNA

<213>  

<400>  5

gcgggtatga ccagtcc                                                    17

 

 

<210>  6

<211>  28

<212>  DNA

<213>  

<400>  6

agcagctgag agcctacctg gagggcct                                        28

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  

<400>  7

gccgcgagtc cgaggatggc                                                 20

 

 

<210>  8

<211>  26

<212>  DNA

<213>  

<400>  8

tattgggacc ggaacacaca gatctc                                          26

 

 

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213>  

<400>  9

gagcctgcgg aacctgcgcg                                                 20

 

 

<210>  10

<211>  24

<212>  DNA

<213>  

<400>  10

tcatccagag gatgtatggc tgcg                                            24

 

 

<210>  11

<211>  24

<212>  DNA

<213>  

<400>  11

tatgaccagt ccgcctacga cggc                                            24

 

 

<210>  12

<211>  25

<212>  DNA

<213>  

<400>  12

ctgagagcct acctggaggg cctgt                                           25

 

 

<210>  13

<211>  26

<212>  DNA

<213>  

<400>  13

tattgggacc ggaacacaca gatctc                                          26

 

 

<210>  14

<211>  24

<212>  DNA

<213>  

<400>  14

gccgtcgtag gcggactggt cata                                            24

 

 

<210>  15

<211>  35

<212>  DNA

<213>  

<400>  15

agactgctgt gctagcagtg aacaaggctc catgg                                35

 

 

<210>  16

<211>  34

<212>  DNA

<213>  

<400>  16

ggcactgcct cacccaggaa gtgcaaggtg ttaa                                 34

Claims (7)

1.一种HLA-B*1502特异位点的解析和PCR-SSP特异引物设计方法，其特征在于：通过对超过200个HLA-B等位基因的序列比对，得到HLA-B*1502的6个特异区域，它们位于HLA-B等位基因的第2和第3外显子；然后根据这6个特异区域，设计PCR-SSP检测的特异引物，具体操作步骤为： 

(1)收集IMGT/HLA数据库的HLA-B，特别是HLA-B*15单体型的基因组、转录组的序列，找出HLA-B*1502的特异区域； 

(2)通过序列比对，得到HLA-B*1502基因第2和第3外显子的6个特异区域：HLA-B*1502单体型的基因序列中第126至第140个碱基为第一特异区域，其序列为：CCGAGGATGGCGCCC，其中核心位点为G₁₃₁，A₁₃₂，T₁₃₃，C₁₃₆，C₁₄₀；第182至第199个碱基为第二特异区域，其序列为：CCGGAACACACAGATCTC，其中核心位点为A₁₈₆，C₁₈₈，C₁₉₉；第229至第246个碱基为第三特异区域，其序列为： GCCTGCGGAACCTGCGCG，其中核心位点为G₂₂₉，A₂₃₈，C₂₄₀，T₂₄₁，G₂₄₄，G₂₄₆；第274至第296个碱基为第四特异区域，其序列为：CTCACATCATCCAGAGGATGTAT，其核心位点为T₂₈₀，C₂₈₁，A₂₈₂，T₂₈₃，C₂₈₄，G₂₈₉，G₂₉₀，A₂₉₅，T₂₉₆；第331至第347个碱基为第五特异区域，其序列为：GCGGGTATGACCAGTCC，其核心位点为T₃₃₆，G₃₃₉，C₃₄₆；第460至第487个碱基为第六特异区域，其序列为：AGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCCT，其核心位点为C₄₆₅，T₄₆₆，C₄₆₇，C₄₈₆，T₄₈₇； 

(3)依据上述特异区域设计引物，共6个，这些引物见表2所示；从这6个引物中，随机组合出15对引物，通过序列比对，分别找出其可能造成假阳性的HLA-B基因型，选用其中可能假阳性数目较少即特异度较高的引物组进行特异性、灵敏度的比较实验，筛选得一对高特异性、高灵敏度特异引物：B1502-SSP-F2和B1502-SSP-R5； 

表2 针对HLA-B＊1502特异区域设计引物 

(4)选择一对内参引物：B1502-iCTRL-F和B1502-iCTRL-R，用于检测DNA模板的质量。 

2.一种PCR-SSP法定性检测HLA-B*1502基因的方法，其特征在于具体步骤如下： 

(1)提取受试者血液或组织的基因组DNA； 

(2)以步骤(1)提取的受试者的基因组DNA为模板，在含检测HLA-B*1502单特异引物及dUTP和UDG酶的PCR反应体系中进行PCR扩增；特异引物为B1502-SSP-F2和B1502-SSP-R5；内参引物为B1502-iCTRL-F和B1502-iCTRL-R； 

(3)扩增结束后，将扩增后的样品在2％琼脂糖凝胶孔中进行电泳分离，并进行判别：若有一条特异条带和一条内参对照条带，则表明所测样品为HLA-B*1502阳性；若只含有内参对照条带，则表明所测样品为HLA-B*1502阴性；若无条带，则表明DNA质量不合格，需要重新提取DNA进行检测。 

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，PCR反应体系为：11μl试剂盒试剂，1μl受试者样品DNA：1-10ng。 

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，PCR反应条件为：先37℃恒温孵育3min，再热启动95℃10min，1个循环；然后变性95℃20sec，延伸68℃50sec，共40个循环；最后72℃5min。 

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，电泳时间为20-30min，电场强度不高于5V/cm。 

6.一种用于PCR-SSP法定性检测HLA-B*1502基因的试剂盒，其特征在于：包含2×PCRMix、内参引物B1502-iCTRL-F和B1502-iCTRL-R、特异引物B1502-SSP-F2和B1502-SSP-R5、dUTP、UDG酶、双蒸水及HLA-B*1502基因的阳性和阴性对照样品。 

7.根据权利要求6所述的可供10人次检测的试剂盒，其特征在于，包含4管试剂，第一管为PCR Mix，包括2×PCR Mix，特异引物B1502-SSP-F2和B1502-SSP-R5，内参引物B1502-iCTRL-F和B1502-iCTRL-R，dUTP和UDG酶，共120μl；第二管为双蒸水100μl；第三管为HLA-B*1502阳性对照样品12μl；第四管为HLA-B*1502阴性对照样品12μl。 

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