CN103484533A - 检测hla-b*5801等位基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属药物基因组学和基因诊断领域,涉及检测HLA-B*5801等位基因的方法,包括:取待测样本DNA,用三对特异性引物和一对内参引物,用序列特异性引物法扩增DNA片段后用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,或,抽提样本DNA后,用一对特异性引物、一对内参引物和3条荧光探针,用Taqman探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段,通过扩增曲线分析结果。本方法可结合琼脂糖凝胶电泳、高分辨率熔解曲线、SYBRGreen荧光定量PCR等结果判读工具,具有快速、简便、灵活、分辨率高、无污染等特点,适用检测外周血、毛发等样本中HLA-B*5801等位基因,用以判断痛风或高尿酸血症患者服用别嘌呤醇后出现严重皮肤不良反应的概率。
Description
技术领域
本发明属于药物基因组学和基因诊断领域,具体涉及检测HLA-B*5801等位基因的方法及其用途。
背景技术
随着人们饮食中的高蛋白、高嘌呤、高热量食物的摄入量的大幅上升,以及饮酒量(尤其是啤酒类)增加,活动量减少等,导致了肥胖和代谢综合征患者增加,使得伴随的高尿酸血症和原发性痛风的发病率呈上升趋势。研究显示,痛风是一种由于嘌呤物质代谢异常,尿酸产生过多或因尿酸排泄不良而致血中尿酸升高,尿酸盐结晶沉积在关节滑膜、滑囊、软骨及其他组织中引起的反复发作性炎症性疾病,其表现为患者关节活动受限、热、痛、肿,伴有关节畸形、结节性痛风结石甚至肾脏病变,该疾患给患者带来极大痛苦。
目前,临床有关痛风的治疗原则除了严格的低嘌呤饮食、戒酒之外,消炎止痛药和控制尿酸药物的使用是必不可少的。治疗痛风的常用药物包括秋水仙碱、非甾体类消炎药、苯溴马隆和别嘌呤醇(Allopurinol)等;秋水仙碱是目前治疗痛风的一线药物,可抑制多核细胞移行至关节并抑制其吞噬功能,同时又抑制已进入关节腔的细胞释放乳酸和溶酶体酶,阻止细胞的有丝分裂,可迅速止痛。但是由于秋水仙碱对骨髓有直接抑制作用,可引起粒细胞缺乏、再生障碍性贫血等严重不良反应,所以仅限于在痛风急性发作期作为止痛药物使用。苯溴马隆和别嘌呤醇常用于痛风症状缓解期,但两者作用机理却截然不同,其中,苯溴马隆属促尿酸排泄药,对肾近曲小管尿酸盐—阴离子交换系统有强而可逆的抑制作用,从而减少尿酸的重吸收,达到降低血尿酸的作用;别嘌呤醇为抵制尿酸合成的药物,别嘌呤醇及其代谢产物氧嘌呤醇均能抑制黄嘌呤氧化酶,阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸,从而减少尿酸的生成,使血和尿中的尿酸含量减低到溶解度以下水平,防止尿酸形成结晶沉积在其他组织内。作为尿酸合成过程最后一步的抑制剂,别嘌呤醇是目前少数几种能够抑制尿酸生成的药物之一;在痛风严重的时候与排尿酸药苯溴马隆合用,可加强疗效;在对于尿酸生成过多、对排尿酸药过敏或无效,以及不宜使用排尿酸药物(如有肾功能不全)的原发性和继发性痛风病人,别嘌呤醇最为适合(Hamburger et al., 2011)。
所述的别嘌呤醇自1963年起用于临床,其疗效得到广泛肯定,但部分患者服用别嘌呤醇后会出现以皮疹为主的不良反应。事实上,所有的药物都可能引起皮肤反应,虽然大多比较轻微,一般停药或常规抗过敏药物治疗即痊愈,但近5%的别嘌呤醇服用患者会出现严重的皮肤不良反应,包括Steven-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)(Roujeau et
al., 1995)。Steven-Johnson综合征表现为严重的多形性红斑,可累及皮肤与粘膜,包括口、鼻、眼、阴道、尿道、胃肠道和下呼吸道粘膜,患者甚至有失明之虞,进一步发展则形成中毒性表皮坏死松解症,全身黏膜溃烂,在红斑上发生松弛性大泡或表皮剥离;若遇轻度触碰或牵拉可导致表皮大面积剥离,据报道,SJS/TEN的致死率可达26%(Aubock & Fritsch, 1985;
Arellano & Sacristan, 1993);因此,目前别嘌呤醇在临床上的使用受到极大限制,但由于其作用机理的独特性,对尿酸生成的抑制作用无其他药物可以替代,其适应症患者只能冒着随时会出现严重不良反应的风险服用该药。同时,作为一种迟发型过敏反应,所述SJS/TEN通常在服药后数周才会出现症状,且患者出现皮炎后一般首先到皮肤科就诊,一旦用药史叙述不清,极易造成漏诊、误诊,从而延误停药和治疗的时机。
Hung等人(Hung et al., 2005)在台湾地区服用别嘌呤醇的痛风患者中筛查了与药物代谢和免疫应答相关的823个SNP位点之后,发现与重症药疹呈强相关的SNP位点都位于MHC基因上,集中在HLA-A,B,C和DRB1基因座,尤其是HLA-B*5801等位基因,在服用别嘌呤醇后出现严重皮肤不良反应的患者中100%存在,而在未出现皮肤不良反应的患者(耐受人群)和正常对照组中,其携带率仅为15%和20%;因此,越来越多的临床医师推荐在服用别嘌呤醇之前进行HLA-B*5801等位基因检测,以判断是否属有关高危人群;致力于有效降低由别嘌呤醇引起的严重不良反应。
研究得知,人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,简称HLA)复合体是当前已知的人类染色体中基因密度最高,也是多态性最为丰富的区域;截止到2010年7月,世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1等位基因已达到4836个;鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性,决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测,主要围绕特异性位点的判断和相似等位基因的鉴别展开。
目前常用的检测方法包括:
(1) PCR-SBT法:即直接测序法;其可直接获得DNA序列,鉴定所有存在的多态性,为最直接、最直观的方法;但是,由于目的基因序列的特殊性、引物设计等多种因素,测序结果会出现套峰,不利于结果的判读,使得PCR-SBT法存在着模棱两可的结果,必要时需要人工判读碱基序列(Adams et al., 2004),且测序技术需要用到造价昂贵的测序仪,医院内通常不会配备;
(2)PCR-SSP法:即序列特异性引物法;其根据各等位基因的核苷酸序列,设计出一套针对每一等位基因特异性的或组特异性的引物,此即为序列特异性引物;所述SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合,通过PCR特异性地扩增该基因片段,从而达到分析基因多态性的目的;所述PCR-SSP法也是临床上使用最普及的方法。
目前,市面上仍缺乏仅针对HLA-B*5801等位基因的结果可靠、操作简便的试剂盒,临床需要常规开展HLA-B*5801的检测时,不得不依靠国外进口价格昂贵的商品化试剂盒,该类试剂盒的设计初衷是明确具有相同血清学分型的几十种HLA-B等位基因,因此需要使用许多引物排除相似等位基因的干扰。由于进口试剂主要针对欧美人群设计,其HLA位点分布与中国人群大相径庭,许多欧美人群中常见的等位基因在中国人群中从未发现,且过多的引物反而会出现结果难以判读的情况;以Olerup®
SSP HLA-B*58试剂盒(Olerup,Sweden)为例,作为HLA-B*58高分辨率试剂盒,1个样本中Olerup采用了24对引物分别进行扩增;由于人的染色体一条来自父方,一条来自母方,因此等位基因会出现纯合子与杂合子两种情况;当待测等位基因为纯合子时,检测结果准确性极高,但是,HLA-B是整个HLA系统中多态性最复杂的基因座,截止到2010年,已经存在3000种等位基因,即使是同一种血清型B58中,已报道的存在31种等位基因(B*5801-B*5831),所以出现杂合子的可能性远远高于纯合子;若一旦出现杂合子,就无法避免两种等位基因结果相互干扰的情况,如根据Olerup的设计,B*5801的电泳结果为1、2、13泳道出现扩增条带,B*5819的电泳结果为1、2、6、7、13泳道出现扩增条带,部分B51/B52/B56/B78等位基因的电泳结果为6、7、13;导致实验结果为1、2、6、7、13出现条带时,既可判断为B*5819、B*5801的杂合子,也可判断为一条链为B*5801,另一条链为B51/B52/B56/B78中的一种,或者一条链为B*5819,另一条链为B51/B52/B56/B78中的一种。采用24对引物,不但工作量增加了,反而还会导致结果判读的不便,这种模棱两可的情况会在高达20种杂合子等位基因组合中出现。
因此,本申请拟建立一种操作简便、干扰因素少、适合中国人群使用的HLA-B*5801检测方法。
与本发明相关的现有技术有:
1,Arellano F & Sacristan JA. Ann Pharmacother.
1993,27: 337–343.
2,Aubock J & Fritsch P. Br Med J. 1982,290: 1969–1970.
3,Hung SI, Chung WH, Liou LB, Chu CC, Lin M, Huang
HP. Proc Natl Acad Sci U S
A. 2005,102:4134-4139.
4,Adams SD, Barracchini KC, Chen D, Robbins F,
Wang L, Larsen P, et a1. J Transl Med. 2004,2(1):30.
5,Smith HS, Bracken D, Smith JM. Gout: J Pain. 2011, 12:1113-1129.
6,Roujeau JC, Kelly JP, Naldi L, Rzany B, Stern RS,
Anderson T, et al. N Engl J Med. 1995, 333(24):1600-1607.
7,Hamburger M, Baraf HS, Adamson TC, Basile J, Bass L, Cole B, et al. Phys Sportsmed. 2011, 39(4):98-123
。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足,提供检测HLA-B*5801等位基因的方法;本发明方法能为痛风或高尿酸血症患者服用别嘌呤醇后出现严重皮肤不良反应的可能性的判断提供有意义的参考。有利于别嘌呤醇的个体化用药。
本发明的检测HLA-B*5801等位基因的方法,包括:获得抽提的待测样本DNA后,使用三对特异性引物和一对内参引物,用序列特异性引物法(PCR-SSP)扩增DNA片段后用琼脂糖凝胶电泳或高分辨率熔解曲线分析扩增结果,或,抽提样本DNA后,使用一对特异性引物、一对内参引物和3条荧光探针,采用Taqman探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段;通过扩增曲线分析结果。本检测方法较现有技术明显操作简便、干扰因素少,检测结果准确且可靠。
具体而言,本发明的检测HLA-B*5801等位基因的方法,其特征在于,其包括步骤:
(1)获得抽提的待测样本DNA;
(2)设计三对特异性引物和1对内参引物,或,一对特异性引物和相应的2条荧光探针,以及1对内参引物和1条相应荧光探针;
(3)进行PCR-SSP扩增;扩增结束后,通过琼脂糖凝胶电泳判断待测样本中是否有扩增产物;或,在荧光定量PCR仪上进行Taqman聚合酶链反应,根据出现的荧光分析待测样本中是否有扩增产物;
(4)分析待测样本是否携带HLA-B*5801等位基因。
本发明方法中,使用QIAamp DNA Extract Kit试剂盒提取DNA;
本发明方法中,设计的序列特异性引物和内参引物为:
在HLA-B基因多态性位点集中区域设计HLA-B*5801的三对特异性引物,其中,
第一条上游引物F1:5’-CCGGGTCCGAGATCCGTCT-3’(序列1),
第二条上游引物F2:5’-GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列2),
第三条上游引物F3:5’-accgagagaacctgcggat-3’(序列3),
通用下游引物R:5’-gccatacatcctctggatga-3’(序列4);
另外,使用Primer 3 软件在β-globin基因上设计内参引物,其中,
上游引物Globin-F:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列5),
下游引物Globin-R:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列6);
上述的三对特异性引物和一对内参引物分别进行单独扩增后,采用琼脂糖凝胶电泳检测每根PCR管中是否扩增出目的条带;
本发明方法中,还可在多态性位点集中区域设计HLA-B*5801的特异性引物,其中,上游引物F2:5’-GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列2),
下游引物R:5’-gccatacatcctctggatga-3’(序列4),以及配套的两条荧光探针:
probe1:5’-CY5-TCCGAGATCCGCCTCCCTGAGGCC- BHQ2-3’(序列7)
和probe2:5’-JOE- ACCGAGAGAACCTGCGGATCGCGCTCC-BHQ2-3’(序列8);
另外在β-globin基因上设计内参引物,其中,
上游引物Globin-F:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列5),
下游引物Globin-R:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列6),以及配套荧光探针:5’-FAM-AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-TAMRA-3’(序列9);
上述特异性引物管和内参管在荧光定量PCR仪上分别扩增,内参管作为质控管,必须出现荧光扩增曲线;在内参管观察到扩增曲线的前提下,两条特异性探针必须同时出现扩增曲线,则判断待测样本携带HLA-B*5801等位基因。
本发明方法中,有目的片段生成则代表该目的片段内引物覆盖区域碱基序列与原设计一致;或,有荧光扩增曲线产生则代表该目的片段内引物覆盖区域碱基序列与原设计一致,且探针覆盖范围内碱基也与原设计一致;
本发明中,内参引物扩增出特异性条带表示DNA样本质量可靠,或,内参的荧光探针出现扩增曲线表示DNA样本质量可靠;
本发明中,三对特异性引物和一对内参引物同时扩增出特异性条带,则代表待测样本携带HLA-B*5801等位基因;
本发明中,当3条荧光探针同时出现扩增曲线,代表待测样本携带HLA-B*5801等位基因。
本发明中,所述PCR-SSP扩增具有快速、简便、灵活、分辨率高的特点,可自由结合各种结果判读工具,如:琼脂糖凝胶电泳、高分辨率熔解曲线、SYBR Green荧光定量PCR等;
本发明中,所述的Taqman探针法具有快速、简便、无污染等特点;
本发明方法适用于检测离体的包括全血、毛发、组织等各种样本中的HLA-B*5801等位基因。本发明方法能为痛风或高尿酸血症患者服用别嘌呤醇后出现严重皮肤不良反应的可能性的判断提供有意义的参考。进一步的,对预防服用别嘌呤醇后发生重症药疹具有重要的临床意义。
本发明的检测HLA-B*5801等位基因的方法的优点有:
1,结果可靠
采用本发明方法与SSP
HLA-B*58试剂盒(Olerup,Russia)进行方法学对比,60例样本(42例HLA-B*5801,18例非HLA-B*5801)结果完全吻合;与AllSet Gold SSP HLA-B17
High Res Kit(Invitrogen)进行方法学比对,20例样本(17例HLA-B*5801,3例非HLA-B*5801)结果完全吻合,可完全取代商品化试剂盒;
2,检测方法灵活、无污染
本发明方法中采用PCR-SSP方式扩增,由于未涉及多重扩增,可自由结合多种产物判读方法,如SYBR Green方法扩增后通过熔解曲线判断是否有特异性扩增产物;普通定性PCR后,通过琼脂糖凝胶电泳或者高分辨率熔解曲线判断是否有特异性扩增产物;
3,本发明方法中采用Taqman探针法扩增,可直接根据探针的荧光曲线判断扩增产物,不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂,操作简便、安全、无污染。
为了便于理解,以下将通过具体的附图和实施例对本发明的方法进行详细地描述。需要特别指出的是,具体实例和附图仅是为了说明,显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明,在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变,这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1为采用PCR-SSP方法扩增DNA样本后产物的电泳图,
其中,1~9:样本;10:HLA-B*5801阳性对照;M:marker;
A:第一对引物扩增后产物的电泳图;
B:第二对引物扩增后产物的电泳图;
C:第三对引物扩增后产物的电泳图;
D:内参引物扩增后产物的电泳图;
编号为5的样本和HLA-B*5801阳性对照使用三种特异性引物和内参引物均可扩增出产物,据此判断5号样本携带HLA-B*5801等位基因。
图2为采用Taqman探针法检测DNA样本获得的荧光扩增曲线图,
其中,各曲线分别为:内参的探针形成的扩增曲线,第一条HLA-B*5801特异性Taqman探针的扩增曲线,第二条HLA-B*5801特异性探针形成的扩增曲线;同时出现所述3种扩增曲线的样本为HLA-B*5801基因型。
具体实施方式
实施例
1 PCR-SSP
法检测
HLA-B*5801
等位基因
1. 提取DNA:
按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血(2ml)后,使用QIAamp DNA Extract Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA;
2. 设计序列特异性引物和内参引物:
在HLA-B基因多态性位点集中区域设计HLA-B*5801的三对特异性引物,第一条上游引物F1:5’-CCGGGTCCGAGATCCGTCT-3’(序列1),第二条上游引物F2:5’-GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列2),第三条上游引物F3:5’-accgagagaacctgcggat-3’(序列3),通用下游引物R:5’-gccatacatcctctggatga-3’(序列4);另外,使用Primer 3 软件(http://frodo.wi.mit.edu/)在β-globin基因上设计内参引物,上游引物Globin-F:5’- AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列5),下游引物Globin-R:5’- TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列6);
3. 样本检测:
三对特异性引物和一对内参引物分别进行单独扩增,使用Premix Taq Hot Start Version试剂盒(TaKaRa,Japan);反应体系包括:10μl Premix Taq Hot Start Version,上游引物0.5μl(10μM),下游引物0.5μl(10μM),然后加入25 ng样本DNA,加水至总体积20μl;PCR扩增条件:95℃预变性2 min,95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45s,45个循环后,72℃延伸5 min;采用琼脂糖凝胶电泳检测每根PCR管中是否扩增出目的条带;
4. 结果分析:
内参管作为质控管,必须出现长385 bp的目的条带,代表DNA样本质量合格;若样本的HLA-B基因座序列与第一对引物覆盖区域序列一致,则会出现长201
bp的目的条带,第二对引物的目的条带为383
bp,第三对引物为328 bp(结果如图1所示);三对特异性引物必须都扩增出目的产物,可判断该样本携带HLA-B*5801等位基因。
实施例
2 Taqman
探针法检测
HLA-B*5801
等位基因
1. 提取DNA:
按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血(2ml)后,使用QIAamp DNA Extract Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA;
2. 设计引物和探针:
在多态性位点集中区域设计HLA-B*5801的特异性引物,上游引物F2:5’-GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列2),下游引物R:5’-gccatacatcctctggatga-3’(序列4),以及配套的两条荧光探针:probe1:5’-CY5-TCCGAGATCCGCCTCCCTGAGGCC-
BHQ2-3’(序列7) 和probe2:5’-JOE- ACCGAGAGAACCTGCGGATCGCGCTCC-BHQ2-3’(序列8);另外在β-globin基因上设计内参引物,上游引物Globin-F:5’-
AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列5),下游引物Globin-R:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列6),以及配套荧光探针:5’-FAM- AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-TAMRA-3’(序列9);
3. 样本检测:
在荧光定量PCR仪上分别扩增特异性引物管和内参管;使用Premix Ex Taq 试剂盒(TaKaRa,Japan)扩增,反应体系包括:10μl Premix Ex Taq,上游引物0.5μl(10μM),下游引物0.5μl(10μM),相应探针各0.5μl(10μM),ROX
Reference Dye II 0.4μl;然后加入25 ng样本DNA,加水至总体积20μl;PCR扩增条件:95℃预变性2 min,95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45s,50个循环后,72℃延伸5 min;
4. 结果分析:
内参管作为质控管,必须出现荧光扩增曲线,代表DNA样本质量合格;若样本的HLA-B基因座序列与特异性引物覆盖区域序列一致,则会扩增出特异性产物;在此基础上,probe1和probe2覆盖范围内的碱基若与探针序列一致,则会出现相应荧光的扩增曲线;在内参管观察到扩增曲线的前提下,两条特异性探针必须同时出现扩增曲线,可判断该样本携带HLA-B*5801等位基因。
SEQUENCE
LISTING
<110> 复旦大学附属华山医院
<120> 检测HLA-B*5801等位基因的方法
<160> 9
<170> PatentIn
version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 第一条上游引物F1
<400> 1
ccgggtccga gatccgtct
19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 第二条上游引物F2
<400> 2
gggccggagt attgggatg
19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 第三条上游引物F3
<400> 3
accgagagaa cctgcggat
19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 通用下游引物R
<400> 4
gccatacatc ctctggatga
20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物Globin-F
<400> 5
agtcagggca gagccatcta
20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物Globin-R
<400> 6
ttagggttgc ccataacagc
20
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> probe1
<400> 7
cytccgagat ccgcctccct gaggcc 26
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> probe2
<400> 8
accgagagaa cctgcggatc gcgctcc 27
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 配套荧光探针
<400> 9
agtctgccgt tactgccctg tgg 23
Claims (10)
1.检测HLA-B*5801等位基因的方法,其特征在于,其包括:获得抽提的待测样本DNA后,使用三对特异性引物和一对内参引物,用序列特异性引物法扩增DNA片段后用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,或,抽提样本DNA后,使用一对特异性引物、一对内参引物和3条荧光探针,采用Taqman探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段;通过扩增曲线分析结果;包括步骤:
(1)获得抽提的待测样本DNA;
(2)设计三对特异性引物和1对内参引物,或,一对特异性引物和相应的2条荧光探针,以及1对内参引物和1条相应荧光探针;
(3)进行PCR-SSP扩增;扩增结束后,通过琼脂糖凝胶电泳分析待测样本中是否有扩增产物;或,在荧光定量PCR仪上进行PCR-SSP扩增后,根据荧光扩增曲线分析待测样本中是否有扩增产物;
(4)分析待测样本是否携带HLA-B*5801等位基因。
2.按权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的设计的序列特异性引物和内参引物为:
在HLA-B基因多态性位点集中区域设计HLA-B*5801的三对特异性引物,其中,
第一条上游引物F1:5’-CCGGGTCCGAGATCCGTCT-3’(序列1),
第二条上游引物F2:5’-GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列2),
第三条上游引物F3:5’-accgagagaacctgcggat-3’(序列3),
通用下游引物R:5’-gccatacatcctctggatga-3’(序列4);
以及,在β-globin基因上设计内参引物,其中,
上游引物Globin-F:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列5),
下游引物Globin-R:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列6)。
3.按权利要求1所述的方法,其特征在于,还在多态性位点集中区域设计HLA-B*5801的特异性引物,其中,
上游引物F2:5’-GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列2),
下游引物R:5’-gccatacatcctctggatga-3’(序列4),以及配套的两条荧光探针:
probe1:5’-CY5-TCCGAGATCCGCCTCCCTGAGGCC-
BHQ2-3’(序列7)
和probe2:5’-JOE-
ACCGAGAGAACCTGCGGATCGCGCTCC-BHQ2-3’(序列8);
以及,在β-globin基因上设计内参引物,其中,
上游引物Globin-F:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列5),
下游引物Globin-R:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列6),以及配套荧光探针:5’-FAM- AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-TAMRA-3’(序列9)。
4.按权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的三对特异性引物和一对内参引物分别进行单独扩增后,采用琼脂糖凝胶电泳检测每根PCR管中是否扩增出目的条带,有目的片段生成代表该目的片段内引物覆盖区域碱基序列与原设计一致;内参引物扩增出特异性条带表示DNA样本质量可靠;三对特异性引物和一对内参引物同时扩增出特异性条带,代表待测样本携带HLA-B*5801等位基因。
5.按权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的特异性引物管和内参管在荧光定量PCR仪上分别扩增,内参管作为质控管,必须出现荧光扩增曲线;在内参管观察到扩增曲线的前提下,两条特异性探针同时出现扩增曲线,则判断待测样本携带HLA-B*5801等位基因。
6.按权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的待测样本选自离体的全血、毛发或组织。
7.权利要求1的方法在预测痛风或高尿酸血症患者服用别嘌呤醇后出现药物不良反应概率中的用途。
8.按权利要求7所述的用途,其特征在于,所述的药物不良反应是严重皮肤不良反应。
9.按权利要求8所述的用途,其特征在于,所述的严重皮肤不良反应是重症药疹。
10.一种检测服用别嘌呤醇后的严重皮肤不良反应的探针,其特征在于,其包括:针对待测样本DNA的HLA-B*5801的三对特异性引物和1对内参引物,或,一对特异性引物和相应的2条荧光探针,以及1对内参引物和1条相应荧光探针,
所述的HLA-B*5801的三对特异性引物,其中,
第一条上游引物F1:5’-CCGGGTCCGAGATCCGTCT-3’(序列1),
第二条上游引物F2:5’-GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列2),
第三条上游引物F3:5’-accgagagaacctgcggat-3’(序列3),
通用下游引物R:5’-gccatacatcctctggatga-3’(序列4);
以及,在β-globin基因上设计的内参引物,其中,
上游引物Globin-F:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列5),
下游引物Globin-R:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列6);
或,
所述的HLA-B*5801的特异性引物,其中,
上游引物F2:5’-GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列2),
下游引物R:5’-gccatacatcctctggatga-3’(序列4),以及配套的两条荧光探针:
probe1:5’-CY5-TCCGAGATCCGCCTCCCTGAGGCC-
BHQ2-3’(序列7)
和probe2:5’-JOE-
ACCGAGAGAACCTGCGGATCGCGCTCC-BHQ2-3’(序列8);
以及,在β-globin基因上设计的内参引物,其中,
上游引物Globin-F:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列5),
下游引物Globin-R:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC--3’(序列6),以及配套荧光探针:5’-FAM-AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-TAMRA-3’(序列9)。
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