CN106755530A - 一种检测hla‑a*31:01等位基因的mgb探针实时荧光pcr方法及其引物探针组合 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种检测HLA‑A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合,在使用高特异性MGB探针检测法的基础上,同时结合ARMS(扩增阻滞突变系统)的方法,使检测HLA‑A*31:01等位基因的方法更具特异性。本发明设计的高特异性扩增HLA‑A*31:01等位基因的引物探针组合如下:上游引物Fp:5’‑GAGCCAGAGGATGGAGCC‑3’下游引物Rp:5’‑CCAGGTCCACTCGGTCtA‑3’探针probe1:5’‑FAM‑aGGCCtGAGTATTGGGAC‑MGB‑3’探针probe2:5’‑VIC‑CCTTCACaTTCCGTGTCTC‑MGB‑3’FAM为6‑carboxyfluorescein;VIC为4,7,2‑trichloro‑7‑phenyl‑6‑carboxyfluorescein;MGB为Minor Groove Binder;此外,使用内参基因ACTB的引物及探针,将目的基因的特异性引物、探针和内参基因的引物、探针加入同一管中进行多重荧光PCR反应,通过荧光扩增曲线分析结果。本发明具有简便、灵活快速、特异性高、高通量、无污染、灵敏度高、可实时监测反应等特点,可适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA‑A*31:01等位基因的检测。
Description
技术领域
本发明属于药物基因组学和基因诊断领域,具体涉及一种检测HLA-A*31:01等位基因的方法。
背景技术
卡马西平(CBZ)是临床上治疗癫痫和外周神经痛的常用药物。然而,作为临床上最常见的容易诱发药疹反应的药物之一,卡马西平的使用也使患者面临一定的风险。这种药疹反应分为重度的药物不良反应如史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)、中毒性皮肤坏死松解(TEN)以及药物反应伴随的嗜伊红血球过多和系统综合征(DRESS)和轻度的药物不良反应如轻微斑丘疹(MPE)。卡马西平所导致的药疹反应发生率在10%左右,其中重度药疹反应如SJS/TEN的发生率尽管比较低(1-35/万),但致死率可高达30-50%。有研究表明,人类白细胞抗原(HLA)家族的等位基因HLA-A*31:01与卡马西平所导致的药疹反应密切相关。对欧洲人群的研究表明,HLA-A*31:01等位基因的存在会使患者发生药疹反应的风险增加5%~26%。而在日本人群中,发生药疹反应的患者携带HLA-A*31:01等位基因的频率远远高于正常人(60.7%vs 12.5%,P=3.64×10-15)[1]。此外,有研究表明在中国汉族人群中HLA-A*31:01虽然与卡马西平导致的SJS/TEN没有相关性,但其与卡马西平用药导致的MPE/DRESS有密切的相关性(25.8vs 2.8%,P=0.0021)[2,3]。在中国汉族人群中,HLA-A*31:01等位基因的携带率高至7.1%。因此,在卡马西平用药之前,进行HLA-A*31:01等位基因的检测非常必要,对于HLA-A*31:01阳性患者应尽量避免使用卡马西平进行治疗。
HLA是指人类白细胞抗原,由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因编码,现已发现9000多个等位基因,是当前已知的人类染色体中基因密度最高,也是多态性最为丰富的区域。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到5000多个;鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性,决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。
目前,HLA等位基因分型检测的常用方法主要是基于核酸序列识别的方法,主要包括PCR-SBT(PCR Sequence-based Typing,基于测序分型的聚合酶链式反应PCR-SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes,序列特异性寡核苷酸探针分型)和PCR-SSP(Sequence-specific primers,序列特异性引导的聚合酶链式反应)。其中,PCR-SBT直接测序法更是国际上公认的HLA基因分型方法的“金标准”。此类方法具有灵敏度高,特异性强,样本需求量少等优点。但是,拥有众多优点的同时,此类方法也存在着操作繁琐,耗时长,成本高昂,而且测序结果会出现套峰,不利于结果的判读,使得PCR-SBT法存在着模棱两可的结果等缺点。尤其,操作繁琐、耗时长等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测需要,不适应现代医学检验所要求的“快速、简便”的理念。此外,PCR-SSOP即序列特异性寡核苷酸探针,首先是对HLA的多态区域进行扩增,在扩增过程中对产物进行标记,然后针对扩增产物设计系列寡核苷酸探针固定在膜上,最后将产物与膜上的探针杂交、放射自显影,根据信号判断实验结果。该技术为传统的分型技术,灵敏度高、特异型较强,且需要样本量少;但是由于其所用的载体大多为膜或微滴定板,对于复杂的HLA等位基因来说,它不具有集成化的优点,而且洗脱条件比较繁琐,耗时较长,难以标准化和自动化。PCR-SSP即序列特异性引物PCR技术,适用于广泛临床监测。其原理是根据已知HLA基因序列设计特异性引物,直接PCR扩增基因组DNA后通过凝胶电泳检测产物,根据产物有无和片段大小来判断HLA基因型。该技术简便、技术条件容易掌握,需要样本量少、对血液条件要求不高,适用于临床对于已知HLA序列的快速检测应用等优势;然而由于PCR-SSP技术需要进行凝胶电泳实验,因此该技术在操作过程中易造成二次污染、时间长,同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物,从而易造成假阳性结果。这些传统的HLA等位基因检测方法远远不能满足日益增长的检测需求及灵活性。因此,需要建立一种简单、可靠、灵敏、高特异性的检测HLA-A*31:01等位基因的方法。
[1]Ozeki T,Mushiroda T,Yowang A,et al.Genome-wide association studyidentifies HLA-A*3101allele as a genetic risk factor for carbamazepine-induced cutaneous adverse drug reactions in Japanese population[J].Humanmolecular genetics,2011,20(5):1034-41.
[2]Hung S I,Chung W H,Jee S H,et al.Genetic susceptibility tocarbamazepine-induced cutaneous adverse drug reactions[J].Pharmacogenetics&Genomics,2006,16(4):297-306.
[3]Genin E,Chen D P,Hung S I,et al.HLA-A*31:01and different types ofcarbamazepine-induced severe cutaneous adverse reactions:an internationalstudy and meta-analysis[J].Pharmacogenomics Journal,2014,14(3):281-8.
发明内容
本发明研发出一套适宜于实时荧光PCR反应高特异性扩增HLA-A*31:01等位基因的引物探针组合,并且在现已有的实时定量PCR检测HLA分型的基础上,提供一种更加简便、快速、高通量、特异性高的可以定性检测HLA-A*31:01等位基因分型的方法,以克服现有检测技术所存在的缺陷。此检测方法更易于在临床的推广和应用,从而更加有利于HLA-A*31:01等位基因分型指导下的卡马西平和奥卡西平安全用药。
在研究本发明时,申请人通过与HLA-A中3000个其它等位基因序列的对比,进行HLA-A*31:01等位基因特异性位点和引物设计区域的确定,它们主要位于HLA-A等位基因第2外显子,然后根据特异性位点附近的区域,结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法,设计特异性引物以及MGB探针,值得注意的是探针和引物设计的位置能够排除其它HLA-A等位基因的结合、识别,尤其是HLA-A*30:01和HLA-A*32:01等位基因。采用MGB探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段,通过扩增曲线分析结果,来判断未知样本是否携带HLA-A*31:01等位基因。
本发明的技术方案具体如下:
用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA-A*31:01等位基因的引物探针组合,包括以下目的基因的特异性引物和探针,其序列如下:
上游引物Fp:5’-GAGCCAGAGGATGGAGCC-3’;
下游引物Rp:5’-CCAGGTCCACTCGGTCtA-3’;该下游引物Rp序列的倒数第二位小写字母t表示的碱基为人为引入的错配,以增强检测的特异性,并且倒数第一位碱基A为HLA-A*31系列等位基因所含有的特异性碱基;
探针probe1:5’-FAM-aGGCCtGAGTATTGGGAC-MGB-3’;小写字母a、t表示的碱基为具有特异性的碱基;
探针probe2:5’-VIC-CCTTCACaTTCCGTGTCTC-MGB-3’;小写字母a表示的碱基为能够区分HLA-A*31:01等位基因和其它HLA-A*31等位基因的特异性碱基;
其中FAM为6-carboxyfluorescein;VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein;MGB为Minor Groove Binder;
另外,该引物探针组合还包括针对内参基因设计的特异性引物和探针。
优选的,所述内参基因为ACTB,相应设计的特异性引物和探针,作为内质控体系,其序列如下:
上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’;
下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’;
探针Actin-probe:5’-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’;
其中,CY5为Cyanine dyes 5;BHQ2为Black Hole Quencher-2。
除了ACTB外,还可选择β-globin、GAPDH、ALB等常见的内参基因,并设计相应的内质控体系。
上述引物探针组合可用于制备针对HLA-A*31:01等位基因的检测试剂盒。
本发明还提出一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法,用于非疾病诊断目的,利用了上述引物探针组合,具体包括以下环节:
(1)获得抽提的待测样本基因组DNA;
(2)在同一个反应体系中,将待测样本基因组DNA与上述引物探针组合按照确定比例混合;
(3)通过Applied Biosystem 7500或者ViiATM7Real-Time PCR System进行实时荧光PCR检测,其中分别利用FAM、VIC和CY5通道进行多通道荧光信号采集;
(4)分析判断待测样本是否携带HLA-A*31:01等位基因。
反应体系及PCR扩展程序的较佳配置为:
使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增,所述反应体系以20μL计,则包括:10μLPremix Ex Taq(2×),HLA-A*31:01特异性上游引物Fp:125nM~250nM,下游引物Rp:125nM~250nM,HLA-A*31:01特异性探针probe1:10nM~20nM,probe2:20nM~40nM,以及ACTB基因特异性上游引物Actin-F:125nM~250nM,下游引物Actin-R:125nM~250nM,探针Actin-probe:50nM~100nM;然后加入待测样本基因组DNA约10ng~50ng,补充PCR等级的水至终体积20μL;扩增程序为:95℃预变性30s;95℃5~10sec,60℃34~40sec,共计40个循环。
目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光PCR仪96或者384孔板上加入同一孔中进行扩增,但用三个荧光通道进行荧光的采集;内参基因作为质控,必须出现荧光扩增曲线;在内参基因观察到扩增曲线的前提下,两条特异性探针必须同时扩增出具有设定荧光值的荧光曲线,则判定待测样本携带有HLA-A*31:01等位基因。
本发明的优点主要有:
1、节省耗材和时间、操作简单、通量高
基于本发明设计及PCR反应特点,使得该发明可以很大程度上节省实验时间和耗材,检测过程只需要50min-1h,操作也简单易行,整个实验可以在2小时内全部完成。采用本发明方法与HLA等位基因分型“金标准”PCR-SBT测序进行方法学对比,100例样本结果完全吻合;同时,使用本发明方法,可一次同时高通量进行96例或者384例样本的检测。
2、结果可靠、灵敏度高
本发明中,只需10ng-20ng基因组DNA便可进行准确的HLA-A*31:01等位基因分型检测,其中,最低检测样本量为1ng,相比于传统的技术,大大提高了检测的灵敏度。
3、检测方法灵活、无污染,避免假阳性结果产生
本发明方法较传统的HLA等位基因分型方法,未涉及多重扩增、重复开盖等二次交叉污染的可能;同时,在本发明中,针对HLA-A*31:01等位基因设计的特异性引物和探针具有很高的序列特异性,可以消除其它HLA-A系列等位基因的同源性对PCR反应的干扰。二者共同保证了检测的准确性,避免了假阳性结果的产生。此外,本发明可直接根据探针的荧光曲线判断扩增产物,不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂,操作简便、耗时短、安全、无污染。
4、成本低、经济适用
由于本发明具有高通量的特点,因此使得本发明中每个反应管的成本低;同时,此技术适用于检测人类全血、唾液、组织等全基因组DNA样本,较经济适用。
附图说明
图1为利用FAM通道,VIC通道和CY5通道对1例携带HLA-A*31:01等位基因的杂合样本和1例阴性样本进行实时荧光扩增的结果。
图2为将20ng/μL的HLA-A*31:01阳性样本通过系列稀释后在FAM荧光通道中的实时荧光扩增曲线,样本系列稀释倍数为1:1,1:4,1:8,1:10,1:20,其中,HLA-A*31:01阴性样本和NTC在检测灵敏度实验中作为对照。
图3为20ng/μL的HLA-A*31:01阳性样本通过系列稀释后在VIC荧光通道中的实时荧光扩增曲线,样本系列稀释倍数为1:1,1:4,1:8,1:10,1:20,其中,HLA-A*31:01阴性样本和NTC在检测灵敏度实验中作为对照。
图4为PCR-SBT测序结果示意图。
具体实施方式
实施例1 MGB探针法检测HLA-A*31:01等位基因
1、DNA样本的提取及稀释
按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后,使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA;将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A260/280=1.95~2.15)。用上述方法,提取100例蓝田汉族DNA样本并测得相对的浓度,然后使用PCR等级的H2O将样本稀释至10ng/μL。
2、设计引物和探针
在多态性位点集中的区域,利用ARMS方法设计HLA-A*31:01的特异性引物,上游引物Fp:5’-GAGCCAGAGGATGGAGCC-3’,下游引物Rp:5’-CCAGGTCCACTCGGTCtA-3’,以及配套的荧光探针probe1:5’-FAM-aGGCCtGAGTATTGGGAC–MGB-3’,probe2:5’-VIC-CCTTCACaTTCCGTGTCTC–MGB-3’;另外在ACTB基因上设计内参引物和探针,上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’,下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’,以及配套的荧光探针Actin-probe:5’-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’。
其中,FAM为6-carboxyfluorescein;CY5为Cyanine dyes5;VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein;BHQ2为Black Hole Quencher-2;MGB为Minor Groove Binder;
委托武汉某公司合成。
3、样本检测
在荧光定量PCR仪上,将目的基因和内参基因(ACTB)的引物、探针同时加入一个管中,分别利用FAM通道,VIC通道与CY5通道进行三通道荧光采集;使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增,反应体系(10μL)包括:5μLPremix Ex Taq(2×),HLA-A*31:01特异性上游引物Fp:125nM~250nM,下游引物Rp:125nM~250nM,HLA-A*31:01特异性探针probe1:10nM~20nM,probe2:20~40nM以及ACTB基因特异性上游引物Actin-F:125nM~250nM,下游引物Actin-R:125nM~250nM,探针Actin-probe:50nM~100nM,然后加入被测样本基因组DNA约10ng~50ng,补充PCR等级的水至终体积10μL;用于检测HLA-A*31:01等位基因分型的扩增程序:95℃预变性30s;95℃5~10sec,60℃34~40sec,共计40个循环。
4、结果分析
内参基因作为质控,必须出现荧光扩增曲线;在内参基因观察到扩增曲线的前提下,HLA-A*31:01等位基因特异性探针必须在一定的荧光阈值范围内同时出现扩增曲线,则可判断该样本携带HLA-A*31:01等位基因。本发明中,有荧光扩增曲线达到阈值以上,则代表该特异性引物及探针与DNA模板结合,并且引物能够顺利延伸,引物覆盖区域碱基序列与模板序列一致,且探针覆盖范围内碱基也与模板序列一致。
实施例2 HLA-A*31:01等位基因分型灵敏度检测
1、DNA样本的稀释
取HLA-A*31:01标准品DNA作为试验样品,其浓度为2ng/μL;用PCR等级的H2O连续稀释样品,即1:2,1:4,1:20,1:40,1:80;其DNA浓度分别为:10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL。
2、设计引物和探针
利用ARMS方法设计HLA-A*31:01的特异性引物,上游引物Fp:5’-GAGCCAGAGGATGGAGCC-3’,下游引物Rp:5’-CCAGGTCCACTCGGTCtA-3’,以及配套的荧光探针probe1:5’-FAM-aGGCCtGAGTATTGGGAC-MGB-3’,probe2:5’-VIC-CCTTCACaTTCCGTGTCTC-MGB-3’;另外在ACTB基因上设计内参引物,上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’,下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’,以及配套的荧光探针Actin-probe:5’-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’。
其中,FAM为6-carboxyfluorescein;VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein;CY5为Cyanine dyes 5;BHQ2为Black Hole Quencher-2;MGB为MinorGroove Binder;
委托武汉某公司合成。
3、样本检测
在荧光定量PCR仪上,将目的基因和内参基因(ACTB)的引物、探针同时加入一个管中,分别利用FAM通道,VIC通道与CY5通道进行三通道荧光采集;使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增,反应体系(10μL)包括:5μLPremix Ex Taq(2×),HLA-A*31:01特异性上游引物Fp:125nM~250nM,下游引物Rp:125nM~250nM,HLA-A*31:01特异性探针probe1:10nM~20nM,probe2:20~40nM以及ACTB基因特异性上游引物Actin-F:125nM~250nM,下游引物Actin-R:125nM~250nM,探针Actin-probe:50nM~100nM,然后加入被测样本基因组DNA约10ng~50ng,补充PCR等级的水至终体积10μL;用于检测HLA-A*31:01基因型的扩增程序:95℃预变性30s;95℃5~10sec,60℃34~40sec,共计40个循环。
4、实验结果
HLA-A*31:01标准样品DNA系列稀释后实时扩增结果见图2和图3。由图2可见,标准样品系列稀释倍数1:2,1:4,1:20,1:40,1:80;其DNA浓度分别为:10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL。probe1的Ct值分别为31.35,31.92,32.81,34.80,38.12,38.48。probe2的Ct值分别为30.95,31.56,32.40,34.79,37.81,38.19。由此可知本发明可检测低至1ng DNA左右的样本。
验证实验:50例样本进行SBT测序与HLA-A*31:01等位基因检测方法比较
从100例蓝田汉族样本中随机选取50例样本,将其送至GenDx公司进行SBT金标准测序,测序结果用峰图和Excel表格进行展示,以便对本发明实验结果进行复核。将PCR-SBT测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1),发现两者之间的阴、阳性符合率均为100%。
表1
本发明在前期还准备了已知为HLA-A*31:01等位基因杂合型的血样标准品,作为检测体系的阳性对照。此外,标准品的存在,使完成HLA-A*31:01等位基因检测方法建立的同时,进一步提高了待检测样本判断的准确度。
<110>陕西佰美基因股份有限公司
<120>一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合
<160> 7
<210> 1
<211>18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
GAGCCAGAGGATGGAGCC 18
<210> 2
<211>18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
AGGCCTGAGTATTGGGAC 18
<210> 3
<211>19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
CCTTCACATTCCGTGTCTC 19
<210> 4
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
CCAGGTCCACTCGGTCTA 18
<210> 5
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
CAGCAGATGTGGATCAGCAAG 21
<210> 6
<211>23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC 23
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
GCATTTGCGGTGGACGAT 18
Claims (6)
1.用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA-A*31:01等位基因的引物探针组合,其特征在于,包括以下目的基因的特异性引物和探针,其序列如下:
上游引物Fp:5’-GAGCCAGAGGATGGAGCC-3’;
下游引物Rp:5’-CCAGGTCCACTCGGTCtA-3’;该下游引物Rp序列的倒数第二位小写字母t表示的碱基为人为引入的错配,以增强检测的特异性,并且倒数第一位碱基A为HLA-A*31系列等位基因所含有的特异性碱基;
探针probe1:5’-FAM-aGGCCtGAGTATTGGGAC-MGB-3’;小写字母a、t表示的碱基为具有特异性的碱基;
探针probe2:5’-VIC-CCTTCACaTTCCGTGTCTC-MGB-3’;小写字母a表示的碱基为能够区分HLA-A*31:01等位基因和其它HLA-A*31等位基因的特异性碱基;
其中FAM为6-carboxyfluorescein;VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein;MGB为Minor Groove Binder;
还包括针对内参基因设计的特异性引物和探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合,其特征在于,所述内参基因为ACTB,相应设计的特异性引物和探针,作为内质控体系,其序列如下:
上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’;
下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’;
探针Actin-probe:5’-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’;
其中,CY5为Cyanine dyes 5;BHQ2为Black Hole Quencher-2。
3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备针对HLA-A*31:01等位基因的检测试剂盒方面的用途。
4.一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法,用于非疾病诊断目的,其特征在于:包括以下环节:
(1)获得抽提的待测样本基因组DNA;
(2)在同一个反应体系中,将待测样本基因组DNA与权利要求1或2所述引物探针组合按照确定比例混合;
(3)通过Applied Biosystem 7500或者ViiATM7Real-Time PCR System进行实时荧光PCR检测,其中分别利用FAM、VIC和CY5通道进行多通道荧光信号采集;
(4)分析判断待测样本是否携带HLA-A*31:01等位基因。
5.根据权利要求4所述的检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法,其特征在于:使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增,所述反应体系以20μL计,则包括:10μL Premix Ex Taq(2×),HLA-A*31:01特异性上游引物Fp:125nM~250nM,下游引物Rp:125nM~250nM,HLA-A*31:01特异性探针probe1:10nM~20nM,probe2:20nM~40nM,以及ACTB基因特异性上游引物Actin-F:125nM~250nM,下游引物Actin-R:125nM~250nM,探针Actin-probe:50nM~100nM;然后加入待测样本基因组DNA约10ng~50ng,补充PCR等级的水至终体积20μL;扩增程序为:95℃预变性30s;95℃5~10sec,60℃34~40sec,共计40个循环。
6.根据权利要求5所述的检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法,其特征在于:目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光PCR仪96或者384孔板上加入同一孔中进行扩增,但用三个荧光通道进行荧光的采集;内参基因作为质控,必须出现荧光扩增曲线;在内参基因观察到扩增曲线的前提下,两条特异性探针必须同时扩增出具有设定荧光值的荧光曲线,则判定待测样本携带有HLA-A*31:01等位基因。
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