CN114480614A

CN114480614A - 一种用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN114480614A
Application number: CN202111588701.8A
Authority: CN
Inventors: 陈炤源; 王浩; 章婷婷; 顾逸飞
Original assignee: Jiangsu Weihe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Weihe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114480614B

Abstract

本发明提供了一种用于检测HLA‑DQα1:160D编码基因的PCR扩增引物组和Taqman探针,包含一对根据HLA‑DQα1:160D编码基因特异性序列设计的引物及相应一条探针，还包含一对内对照引物及相应一条探针。本发明具有如下技术效果：本试剂盒采用改良的ARMS分析法结合Taqman多重荧光PCR技术设计引物和探针，通过一个反应管即可确定实验样本HLA‑DQα1:160D编码基因阳性与否，通过内对照引物及探针排除样本HLA‑DQα1:160D编码基因的假阴性结果。操作快速简便，具有广泛的应用前景与临床参考价值。

Description

一种用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的方法和试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。

背景技术

HLA位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA-Ⅰ类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三类，经典的Ⅱ类基因一般指DR、DP和DQ，HLA-Ⅲ类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。其中，HLA-B是人类基因组中最具多态性的区域，包含超过1600个等位基因。研究报道，HLA与多种疾病密切相关，如强直性脊柱炎、类风湿关节炎、贝赛特氏症、乳糜泻等。

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。是最常见的主要累及关节的炎症性疾病，同时也是最常见的自身免疫性疾病，全球的发病率为1％，中国的发病率大约为0.3％。其发病机制尚未完全阐明。普遍认为RA是由环境与基因相互作用以及多基因之间相互作用而导致的一种复杂性疾病。研究表明，RA的遗传度约为60％，提示遗传因素在RA发病中发挥重要作用。在遗传因素中，HLA-DRB1是最为大家所熟知的因素。早期遗传关联研究集中于HLA基因，发现HLA-DRB1与RA的发病显著关联，且各民族之间呈现异质性。HLA-DRB1*04:01是高加索人中主要的RA风险等位基因，而DRB1*04:05是东方人中最常见的RA风险等位基因。除HLA-DRB1外，其他HLA基因，如HLA-B和HLA-DPB1，也被认为与RA的易感性有关。在最新研究中，通过对类风湿关节炎患者MHC区域全覆盖深度测序，发现并首次报道了一个新基因位点(HLA-DQα1:160D)，是我国汉族类风湿关节炎的另一个强相关遗传因素，其易感风险高于已知的HLA-DRB1。

由此可见，快速而准确地检测HLA-DQα1:160D编码基因对临床疾病辅助诊断、医学研究及疾病病因学研究等具有重要意义。目前常用的上述基因检测方法主要有PCR-SSP法、SYBR Green I、Taqman荧光定量PCR法、测序法等。PCR-SSP(sequence specific primer)即序列特异引物引导的PCR反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，通过特定PCR反应体系扩增各等位基因型特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，此方法成本低，但操作复杂，无法自动获取结果，准确度也有待提高。SYBR GreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。Taqman荧光定量PCR法克服了以上不足，操作简便、快速，特异性高，并可实现高通量检测。测序法可以获得高分辨结果，但临床应用价值不高，价格昂贵、操作复杂、费时。一般来讲，Taqman荧光定量PCR法通过设计一对或多对HLA-DQα1:160D编码基因特异性引物及相应探针，进行PCR扩增，考虑到HLA多态性非常高，结果易出现假阳性，从而影响其准确性。因此，本领域急需一种操作简便、快速，且准确度高的检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的方法和试剂盒。

本发明的原理是：本发明采用实时荧光PCR结合Taqman探针技术对HLA-DQα1:160D编码基因进行定性检测。根据GENBANK数据库中公布的HLA基因序列，设计了1组HLA-DQα1:160D编码基因特异性引物和探针，以FAM标记，每一次检测进行1管反应，即可检测出HLA-DQα1:160D编码基因。同时管内添加一对内标引物和探针，以HEX标记，可监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果。探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，从而实现对HLA-DQα1:160D编码基因的定性检测。

HLA约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域。普通的引物设计方法对于区分HLA基因亚型存在一定局限性，准确性不高，或者需要设计特异性探针，成本较高。我们使用了ARMS引物设计方法，并在传统ARMS基础上进行了改良。我们将引物划为三个区域，5’端三分之一区域——弱错配、3’端三分之一区域——强错配、中间三分之一区域——中错配。无错配引物检测存在假阳性的情况下，首先设计弱错配引物，如扩增结果准确，则引物可以使用；如扩增结果仍存在假阳性，则设计中错配引物，如扩增结果准确，则引物可以使用；如扩增结果仍存在假阳性，则设计强错配引物，使得3‘末端存在突变的基因型无法延伸，准备判断扩增结果。该方法准确性高，操作简便，具有广阔的应用前景。

本发明使用多重Taqman荧光PCR方法，是在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的靶片段存在与否。运用多重Taqman荧光定量PCR检测，一管多检，准确、高效满足检测需求。

本发明的用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，包含一对根据HLA-DQα1:160D编码基因特异性序列设计的引物及相应一条探针，序列如下：

名称	序列
		引物1	5’-TCCAAGTCTACCGTGACA-3’
引物2	5’-CTTGCAGTCATAAATCTAATCAT-3’
		探针1	5’-TGGGTCAGCCCAACACCCT-3’

所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对内对照引物及相应一条探针，用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果，序列如下：

名称	序列
		引物3	5’-CATCTGGACATGCTTGCT-3’
引物4	5’-ACACATGGAAGACCACA-3’
		探针2	5'-TGTTAAAGCTCTGAATAA-3'

所述的PCR扩增引物组，是根据改良的扩增阻碍突变系统ARMS分析法设计特异性引物，其特征在于，所述的扩增引物是在引物不同位置引入错配碱基。

所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX或VIC，3’端的淬灭基团为BHQ-1。

本发明提供了上述PCR扩增引物组和Taqman探针在制备检测HLA-DQα1:160D编码基因等位基因的试剂盒中的应用。

本发明提供了含有上述PCR扩增引物组和Taqman探针的试剂盒，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。

所述的PCR反应试剂包括PCR反应混合液和Taq酶。

所述的PCR反应混合液包括：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)、二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。

本发明的技术效果如下：本发明采用改良的ARMS分析法结合Taqman多重荧光PCR技术设计引物和探针，通过一个反应管即可确定实验样本HLA-DQα1:160D编码基因阳性与否，通过内对照引物及探针排除样本HLA-DQα1:160D编码基因的假阴性结果。操作快速简便，具有广泛的应用前景与临床参考价值。

附图说明

图1为样本检测示意图。

图2-1为HLA-DQα1:160D阳性样本——Sample 1荧光PCR扩增曲线。

图2-2为HLA-DQα1:160D阳性样本——Sample 2荧光PCR扩增曲线。

图2-3为HLA-DQα1:160D阳性样本——Sample 3荧光PCR扩增曲线。

图2-4为HLA-DQα1:160D阴性样本——Sample 4荧光PCR扩增曲线。

图2-5为HLA-DQα1:160D阴性样本——Sample 5荧光PCR扩增曲线。

图3-1为Sample 1测序图。

图3-2为Sample 2测序图。

图3-3为Sample 3测序图。

图3-4为Sample 4测序图。

图3-5为Sample 5测序图。

具体实施方式

实施例1

1.原料和设备：

1.1试剂盒内含物：

1)荧光定量PCR反应8连管，每条8连管可进行8个样本检测，每个检测需1管：

2)每个反应管中包含一对特异性上下游扩增引物及相应探针，还添加一对内对照引物及相应探针：

特异性上下游扩增引物及相应探针，序列如下：

内对照引物及相应探针，序列如下：

3)PCR反应试剂

DNA聚合酶：为热启动Taq聚合酶；

PCR反应混合液：包括0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)、二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。

1.2样本的来源

1)血液样本采集

血液样本可以用含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium citrate)及乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管进行采集，以新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本作为实验样本。

2)核酸样本萃取

可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取，取得足量且质量合格的核酸以进行聚合酶链式反应。

3)核酸样本定量

萃取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其它适当的溶液(如TE Buffer)之中，且浓度应介于15-40ng/μl，不可将核酸样本溶解于含有超过0.5mM螯化物如乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液。

4)核酸样本质量规范

核酸样本的A260/A280比值应介于1.6到2.0之间。

1.3所需实验设备

荧光定量PCR仪、不同量程的移液器、小型台式离心机(含8连管水平头)。

2.基因分型过程

2.1反应体系的配置：以一次进行8个样本的检测为例，反应体系如表1所示：

表1：PCR反应体系

组分名称	加量μL/管	8人份(9孔)
			PCR反应混合液	9	81
灭菌水	6.8	61.2
			Taq核酸聚合酶	0.2	1.8
核酸样本	2	-
			总体积	18	144

取16μL的上述混合液至各反应管中；每个反应管加入2μL核酸样本，确认样本与上述混合液充分混合均匀；将反应管盖上盖子，短暂离心后，放入荧光定量PCR仪中。

2.2PCR反应程序：如表2所示：

表2：PCR反应程序

请依各型号的自动循环控温仪操作手册进行程序设定，荧光信号采集点设定在65℃；荧光信号采集波长设定FAM(520nm)和VIC(560nm)，其中VIC为内对照基因报告荧光。

2.3实验结果分析：在上述PCR反应体系中，观察样本中FAM(检测HLA-DQα1:160D编码基因的报告荧光)和VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线及Ct值。

检测样本具备如下条件，判为HLA-DQα1:160D阳性：Ct(FAM)＜32且扩增曲线正常，Ct(HEX)＜35且扩增曲线正常，表示该样本为HLA-DQα1:160D阳性。

检测样本具备如下条件，判为HLA-DQα1:160D阴性：Ct(FAM)≥32或UD(表示无扩增)，Ct(HEX)＜35且扩增曲线正常，表示该样本为HLA-DQα1:160D阴性。

图2-1—图2-3为3个HLA-DQα1:160D阳性样本——Sample1、Sample2、Sample3使用本方法和试剂盒检测图。图中，各样本内对照(VIC)Ct值均＜35，提示聚合酶链式反应正常进行；FAM扩增曲线呈典型S型曲线，Ct值＜32。样本判为HLA-DQα1:160D阳性。

图2-4—图2-5为2个HLA-DQα1:160D阴性样本——Sample4、Sample5使用本方法和试剂盒检测图。图中，各样本内对照(VIC)Ct值均＜35，提示聚合酶链式反应正常进行；FAM无扩增曲线升起。样本判为HLA-DQα1:160D阴性。

图3-1—图3-5为这5个样本HLA-DQA1位点测序图。测序结果显示Sample1、Sample2、Sample3为HLA-DQα1:160D编码基因阳性。本发明的试剂盒检测结果与测序结果一致。

结论：整个实验流程仅需约1.5个小时，实验结果准确，通过本发明的试剂盒可以准确判断实验样本的HLA-DQα1:160D阴阳性。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神所做的等效修饰或变化，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏伟禾生物科技有限公司

<120> 一种用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的引物组及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccaagtcta ccgtgaca 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttgcagtca taaatctaat cat 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggtcagcc caacaccct 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catctggaca tgcttgct 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acacatggaa gaccaca 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgttaaagct ctgaataa 18

Claims

1.一种用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的PCR扩增引物组和Taqman探针包含一对根据HLA-DQα1:160D编码基因特异性序列设计的引物及相应一条探针，序列如下：

名称序列引物1 5’-TCCAAGTCTACCGTGACA-3’ 引物2 5’-CTTGCAGTCATAAATCTAATCAT-3’ 探针1 5’-TGGGTCAGCCCAACACCCT-3’

名称序列引物3 5’-CATCTGGACATGCTTGCT-3’ 引物4 5’-ACACATGGAAGACCACA-3’ 探针2 5'-TGTTAAAGCTCTGAATAA-3'

。

2.根据权利要求1所述的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX或VIC，3’端的淬灭基团为BHQ-1。

3.如权利要求1或2所述PCR扩增引物组和Taqman探针在制备检测HLA-DQα1:160D编码基因的试剂盒中的应用。

4.含有如权利要求1或2所述用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的PCR扩增引物组和Taqman探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂包括PCR反应混合液和Taq酶。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应混合液包括：0.18mM脱氧核苷酸dNTP、1.8mM氯化镁MgCl₂、60.3mM氯化钾，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl、甘油0.6％v/v、二甲基亚砜5％v/v和甲酰胺2.5％v/v，DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。