CN103923981B

CN103923981B - Hla-b*27等位基因检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN103923981B
Application number: CN201410105779.3A
Authority: CN
Inventors: 阙秋华; 肖伟明; 刘志文; 孙祖勇
Original assignee: SHANGHAI GENEONE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guangdong Ruiqi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-03-20
Also published as: CN103923981A

Abstract

本发明涉及用于检测人类白细胞HLA‑B*27抗原基因的方法，包括提供待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系混合物；通过扩增反应循环扩增靶多核苷酸；使荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；测定荧光发生基团产生的荧光量，确定靶多核苷酸的存在及其相对量；所述核酸扩增体系由耐热DNA聚合酶、2’‑脱氧核苷三磷酸、能够与靶多核苷酸的第一、二条链结合的引物组成。本发明还公开了与其配套使用的试剂盒。本发明方法与试剂盒应用于人HLA‑B*27等位基因检测，可实现HLA‑B*27等位基因的杂合型与纯合型的定量区分，对于HLA‑B*27等位基因强关联性疾病的早期预警更具优势。

Description

HLA-B*27等位基因检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光定量技术，检测人类白细胞HLA-B*27抗原基因的检测方法及其配套使用的试剂盒。

背景技术

HLA(human leukocyte antigen)，即人类白细胞抗原是人体重要的免疫遗传体系，也是目前所知人体最复杂的多态系统。HLA作为抗原刺激机体产生相应抗体的性质或分子结构，这是器官移植产生排异反应的主要原因，也是血清学和细胞学配型的基础。HLA有Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类基因，HLA-B*是Ⅰ类HLA基因的三个位点(HLA-A*、HLA-B*、HLA-C*)之一。而HLA-B27基因即人类HLA-I类分子B位点上的等位基因，位于第6号染色体短臂上，由8个外显子和7个内含子组织，编码分子质量为43KD的糖蛋白。该基因主要表达在机体所有的有核细胞表面，尤其是淋巴细胞表面有丰富的含量。

强直性脊椎炎(Ankylosing Spondylitis AS)是以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状的疾病。该病以脊柱为主要病变部位的慢性病，累及骶髂关节，引起脊柱强直和纤维化，造成不同程度眼、肺、肌肉、骨骼病变，属自身免疫性疾病。据资料统计，我国约有400余万强直性脊柱炎病人。它最为显著的变化为关节的纤维化和骨性强直。若不及时诊治，很容易导致患者关节畸形，终身痛苦，故有“不死的癌症”之称。上个世纪70年代Brewerlon等首先发现HLA-B*27抗原与强直性脊椎炎密切相关。此后，国内外对HLA与疾病的相关性研究层层递进，不断深入。研究结果不断证实了HLA-B*27抗原与强直性脊椎炎的强关联性：90％-95％的强直性脊椎炎患者表达了HLA-B*27基因，而普通人群中HLA-B*27的表达频率仅为5％-10％。在强直性脊椎炎患者中已检测到B*2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2710、2715相关亚型的表达，其中白种人强直性脊椎炎患者与B*2707、B*2705亚型相关，亚洲人强直性脊椎炎患者与B*2704、B*2705亚型相关，而与中国强直性脊椎炎患者相关的亚型主要是B*2702、B*2704和B*2705。强直性脊柱炎的诊断主要依据患者骨侵蚀、硬化等形态学变化，从治疗角度讲，此时已发病4-10年，失去最佳的治疗时机，因此早期诊断成为争取良好预后的关键。临床上，对疑似病例或早期患者开展HLA-B27的检测，可起到辅助诊断的效果，对于疑难病例的诊断、鉴别诊断及预后判断，对患者亲属或子女患病风险的预测，尤其对于症状不明显的早期患者的确诊，均具有非常重要的参考价值。此外，还有许多疾病与HLA-B*27抗原的表达有着或多或少的关联性，如Reiter S综合症的HLA-B*27阳性率为70-90％，银屑病性关节炎的HLA-B*27阳性率为50-60％，葡萄膜炎的HLA-B*27阳性率为40-50％等等。因此，HLA-B*27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。

近年来，随着人们对HLA-B*27与疾病相关性研究的逐渐深入，HLA-B*27 的检测在临床上日益受到重视。HLA-B*27的检测技术也不断发展，目前常见的HLA-B27检测方法有流式细胞术(FCM)、微量淋巴细胞毒法(MLCT)、ELISA法、PCR-SSP法、实时荧光定量PCR等。在这些技术中，流式细胞术(FCM)、微量淋巴细胞毒法(MLCT)、ELISA法、PCR-SSP等方法或者硬件要求高，标本存放不易、或者操作复杂，检测容量小、或者准确性不高、，已很难适应临床检验的要求。而实时荧光定量PCR技术是近年在普通PCR基础上发展起来的核酸检测方法，它将荧光值的积累与PCR产物的扩增过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的原始量。相较于传统的HLA等位基因分型检测方法，FQ-PCR除了具有灵敏度高、特异性强等特点外，还具有着操作简便、耗时短、可定量等传统方法无可比拟的优点。将FQ-PCR应用于HLA等位基因的检测是PCR技术领域的一项创新。

Taqman PCR技术是FQ-PCR技术中更具技术优势的一种，本发明即将Taqman PCR技术应用于HLA-B*27等位基因的检测，使Taqman PCR的技术优点(灵敏度高、特异性强、着操作简便、耗时短、可定量)在HLA-B*27等位基因检测中得到完美继承。特别是本试剂盒利用设计了严谨的内对照体系，利用相对定量的原理对HLA-B*27等位基因的纯合型和杂合型进行了鉴定。本发明涉及的试剂盒可广泛应用于人HLA-B*27等位基因的检测，可区分HLA-B*27等位基因的杂合型与纯合型，其结果可量化，对于HLA-B*27等位基因强关联性疾病的早期预警更具优势。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种HLA-B*27等位基因检测方法及其试剂盒，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的一个目的是提供一种HLA-B*27等位基因检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；

(2)通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；

(3)使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；

(4)测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量。

所述核酸扩增体系由如下组分组成：耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物a和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物a，能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物b和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物b；

所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。

作为一种优选的技术方案，本发明所述核酸扩增体系和荧光检测体系共1组，其中：

核酸扩增体系中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物1和引物2，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物3和引物4，并且荧光检测体系中所使用的寡核苷酸探针为探针1和探针2；

其中，各引物和探针具体组成如下：

引物1：5’-GCTGTTCGTGAGGTTCGACA-3’，

引物2：5’-TCCGCAGGTCCTCTCGGTCA-3’，

引物3：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，

引物4：5’-ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3’，

探针1：5’-GCGGGGAGCCCCGCTTCATCACCGT-3’，

探针2：5’-CGCCTGGTCACCAGGGCTGC-3’。

其中，引物1、2来源于人HLA-B位点的基因序列，引物1位于165-184位，含20个碱基，引物2位于291-310位，含20个碱基，扩增片段长度为146bp；引物3、4来自源人GAPDH基因序列的HBB基因第9外显子的序列，引物3含20个碱基，引物4含25个碱基，扩增片段长度为123bp。探针1来源于HLA-B位点基因序列的122-145位，其长度为24bp；探针2来源于人GAPDH基因第9外显子的一段序列，其长度为20bp。

可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的FAM或HEX，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联的作为荧光淬灭基团的TAMRA或BHQ。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针，然后使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针的纯度。

所述扩增反应循环是重复30-35次的聚合酶链反应循环。

所述待测样品是指需要检测其中是否含有HLA-B*27基因型的临床血液样本。

所述靶多核苷酸来自人血液全基因组DNA。

作为本发明的一个优选实施方案，步骤(4)中，先确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环数；然后将上述测定的阈循环数与标准溶液中的靶多核苷酸的阈循环数相比较，以确定样品中靶多核苷酸的相对量，从而判断样品包含靶多核苷酸基因的纯合型与杂合型。

使用磁珠法或DNA柱回收法(可购买市售DNA提取试剂盒)从得自受试者的血液样本中提取基因组DNA，然后将提取合格的DNA产物用于后续的PCR扩增。

在含有引物1、2和引物3、4，探针1、2，DNA模板(PCR扩增靶序列)，dNTPs(10mM)，耐热DNA聚合酶，Mg2+，PCR缓冲液和水的反应体系中使用ABI7500、Roche LightCycler480、Mx3000P等其它结构类似的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的DNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件是：95℃预变性3分钟，95℃30秒→62℃30秒，共进行35个循环；最后25℃下至少30秒。

1.无效结果判定：与存在于扩增体系中的寡核苷酸荧光探针2相关的扩增曲线不呈现“S”型或Ct值空白又或Ct值＞30的样本，报告为无效；

2.阳性结果判定：满足与体系中的寡核苷酸探针1和探针4相关的扩增曲线呈现“S”型且同体系中探针1和探针4的CT值＜30的样本，报告为阳性；

3.阴性结果判定：属于无效结果判定和阳性结果判定以外的情况则报告为阴性；

可利用已知为HLA-B*27纯合型和杂合型等位基因的样本与待检样本(DNA浓度为20ng/μl)同批次进行PCR扩增反应，在获得相应的CT值后，利用双△Ct法，将标准品(HLA-B*27纯合型和杂合型样本)扩增体系中与探针1、探针2相关的扩增曲线的CT值，与待检样本(根据扩增试验结果已确定为HLA-B*27等位基因型)扩增体系中探针1、探针2相关的扩增曲线的CT值进行比较分析，从而判断出待检样本(根据扩增试验结果已确定为HLA-B*27等位基因型)HLA-B*27等位基因的纯合型或杂合型。也就是说，为了基于上述的扩增反应结果推断出待检样本HLA-B*27等位基因的纯合型或杂合型。

本发明的另一个目的是提供一种用于上述HLA-B*27等位基因检测的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有反应液、EZTaq酶混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，(2)分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中：

反应液由如下组分组成：由PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物1和引物2，寡核苷酸探针为探针1；用于靶多核苷酸扩增的引物3和引物4，寡核苷酸探针为探针2；

EZ Taq混合液：主要成份为热启动Taq酶；

标准液1：纯合型HLA-B*27基因组DNA；

标准液2：杂合型HLA-B*27基因组DNA。

与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时荧光定量聚合酶链反应方法可以在扩增反应进行的过程中随时监测扩增产物的产生，从而极大的提高了定量检测的准确性和精密度。实时荧光定量PCR(Taqman探针法)在PCR的扩增中，同时加入了引物和在5’末端和3’末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，探针序列保持完整，荧光发生基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故没有荧光信号的产生，而当探针与靶序列能够互补结合时，在PCR扩增进行的过程中，DNA聚合酶在引导DNA序列复制的同时其5’-3’端外切酶活性将切断荧光探针，导致荧光发生基团与荧光淬灭基团的分离，从而荧光检测系统可以接收并记录荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光信号的产生，荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步，故可以实时地监测整个PCR反应过程，并可借助标准曲线或表达量恒定的内对照产物对未知的靶多核苷酸进行绝对或相对的定量分析。

如上所述，为了检测出临床血液样本中HLA(human leukocyte antigen)的基因型为HLA-B*27等位基因型，特别是能够准确区分与HLA-B*27等位基因有着较高相似度DNA序列的其他等位基因型，设计并制备实现这些目的的寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件(如DNA Star)对HLA-B*的核苷酸序列进行分析，进一步使用适当的引物设计软件(如Primer primer5.0)选择并设计具有特定核苷酸序列的寡核苷酸引物；选择并设计具有特定核苷酸序列的寡核苷酸探针。

如上所述，为了检测出临床血液样本中HLA(human leukocyte antigen)的基因型为HLA-B*27等位基因型，特别是能够准确区分与HLA-B*27等位基因有着较高相似度DNA序列的其他等位基因型，本发明将HLA-B*27等位基因型的DNA序列与其它与之有着高度同源性的等位基因型的DNA序列进行了同源性比较和分析，特别设计适用本发明检测试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使用这些引物和探针完成的HLA-B*27等位基因实时定量检测，极大的简化了HLA-B*27等位基因检测的操作步骤，缩短了检测时间，提高了检测灵敏度，降低了模板使用量。实验证明，本发明对HLA-B*27等位基因型检测的准确度在99％以上。

值得特别说明的是，我们使用了已知为HLA-B*27等位基因纯合型和杂合型的基因组DNA参考品，作为检测体系中的阳性对照。此外，参考品的存在，使完成HLA-B*27等位基因型检测的同时，进一步提高了待检样本HLA-B*27等位基因纯合型或杂合型判断的准确度。

本发明即将Taqman PCR技术应用于HLA-B*27等位基因的检测，使Taqman PCR的技术优点(灵敏度高、特异性强、着操作简便、耗时短、可定量)在HLA-B*27等位基因检测中得到完美继承的同时对HLA-B*27等位基因的纯合型和杂合型进行了鉴定。本发明涉及的试剂盒可广泛应用于人HLA-B*27等位基因的检测，为强直性脊椎炎、Reiter S综合症、银屑病性关节炎、葡萄膜炎的早期预警提供了便捷的诊断工具。

具体实施方式

下面给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。

实施例1：

HLA-B*27等位基因检测试剂盒(SSP-PCR荧光探针法)及其使用。

(1)制备包括下列组成成份的试剂盒：反应液(900μl/管)1管、EZ Taq酶混合液(100μl/管)1管、标准液1(30μl/管)、标准液2(30μl/管)。

(2)样本采集、运送和保存：用一次性真空采血器，无菌操作，取待检个体血液样本，做好标示后将获取的血液样本置于低温冰箱(-70℃或-20℃)中冷冻保存。如集中检验，标本需在0℃以下环境中运送并于24小时内送达实验室。(3)检验步骤和结果分析：

将待检测血样取300μl，用柱回收法提取血液样本中的DNA，用分光光度计或类似的仪器确认提取的DNA的质量(OD260/280在1.8-2.0之间)，将提取的每份待检样本DNA和标准品DNA分别置于1个PCR反应管或PCR板的1个孔中，每孔2μl。然后，在加入DNA样本的孔中加入PCR反应液16μl，再在每个孔中加入2μl的酶混合液。混匀离心后，将PCR反应体系置于自动荧光检测热循环仪上，选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)收集特异扩增信号；选择HEX或VIC通道(Reporter:HEX/VIC,Quencher:none)检测内标；参比荧光(PassiveReference)设置为none；设置Sample Volume 为20。按照仪器操作说明做好相应设置后开始试验。本试剂盒的所使用的反应条件是：95℃预变性3分钟，95℃30秒→62℃30秒，共进行35个循环；最后25℃下至少30秒。

反应结束后保存检测数据文件，点选仪器的数据分析选项后可查看各个PCR反应体系的结果，如PCR扩增曲线，待检样本和标准样本的CT值等，具体PCR扩增反应条件、标准品和样品的检测结果见表1～表3。

表1PCR扩增反应条件

表2阳性标准品和阴性标准品中HLA-B*27

等位基因目标序列和内对照序列扩增结果

阳性标准品在扩增体系中有HLA-B*27等位基因目标序列和内标基因目标序列的扩增，且HLA-B*27等位基因目标序列和内标基因序列的CT值(荧光阈值)＜30；阴性标准品在扩增体系中没有HLA-B*27等位基因目标序列的扩增，但可检测到内标基因目标序列的扩增信号，且内标基因序列的CT值(荧光阈值)＜30。根据判定规则，阳性标准品和阴性标准品的检测结果符合预期，扩增结果有效。“/”表示没有Ct值，体系中没有目标或内标基因的扩增。

表3阳性样本、阴性样本和无效样本中HLA-B*27

等位基因目标序列和内对照序列扩增结果

阳性样本1、2在扩增体系中有HLA-B*27等位基因目标序列和内标基因目标序列的扩增，且HLA-B*27等位基因目标序列和内标基因序列的CT值(荧光阈值)＜30。阴性样本1、2在扩增体系中没有HLA-B*27等位基因目标序列的扩增，但检测到内标基因目标序列的扩增信号，且内标基因序列的CT值(荧光阈值)＜30；按照判定规则，阴性样本与阳性样本的扩增为有效扩增，且其检测结果符合预期。无效样本1-4在扩增体系中或者仅有HLA-B*27等位基因目标序列的扩增，或者仅有内标基因目标序列的扩增，或者HLA-B*27等位基因目标序列和内标基因序列均有扩增，但其CT值(荧光阈值)同时≥30。根据判定规则，判定扩增反应无效，该检测样本为无效样本，需重复试验或者重新提取样本DNA后再进行复核。“/”表示没有Ct值，体系中没有目标或内标基因的扩增。

实施例2：使用本发明的试剂盒检测47例临床血液样本的结果与分析

采用双盲实验法，从来自沈阳市血液中心的500例血液样本中选择47例用本发明的试剂盒进行试验，采用TBG公司的HLAssure ABCDRDQ SBT测序试剂盒，以PCR-SBT金标准方法对实验结果进行复核。

试验数据显示：47例临床血液样本的PCR扩增均为有效扩增。所有样本的内对照基因的目标序列均有扩增，9例样本在扩增体系中有HLA-B*27等位基因目标序列和内标基因目标序列的扩增，且HLA-B*27等位基因目标序列和内标基因目标序列的CT值小于30；38例在扩增体系中有内标基因目标序列的扩增，且CT值小于30。试验数据表明使用本试剂盒，在47例临床血液样本中检出HLA-B*27等位基因型9例，其中杂合型7例，纯合型2例，其余38例为非HLA-B*27等位基因型。采用TBG公司的HLAssure ABCDRDQ SBT测序试剂盒对47例临床血液样本进行复核，PCR结果与复核结果一致的判定为真阴(阳)性，PCR结果与复核结果不一致的判定为假阴(阳)性。样本复核结果为：47例临床血液样本中，38例为非HLA-B*27等位基因型，9例为HLA-B*27等位基因型，其中杂合型7例，纯合型2例。本次试验结果表明：本发明的试剂盒与TBG公司的HLAssure ABCDRDQ SBT测序试剂盒检测结果的阴、阳性符合率均为100％。具体检测数据见表4。

表430例临床血液样本的扩增结果

47例临床血液样本的PCR扩增均为有效扩增。其中，编号4、14、16、19、26、31、34、38、45及Positive Control在扩增体系中有HLA-B*27等位基因目标序列和内标基因目标序列的扩增，同体系中HLA-B*27等位基因目标序列的CT与内标基因目标序列CT均值小于30，判定检测结果为HLA-B*27等位基因阳性；编号31、38样本的HLA-B*27等位基因目标序列的CT值明显小于其余7个(在同一DNA浓度下20ng/μl)HLA-B*27等位基因阳性样本，判定为HLA-B*27等位基因阳性纯合子。应用PCR-SBT方法对47例临床血液样本的HLA-B*基因型进行复检，结果表明阳性与阴性符合率均为100％，本试剂盒检验结果准确。PositiveControl与Negative Control结果符合预期表明本次试验结果有效。

Claims

1.一种用于HLA-B*27等位基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：(1)分别装有反应液、EZ Taq混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，(2)分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中：

反应液由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物1和引物2，寡核苷酸探针为探针1；用于靶多核苷酸扩增的引物3和引物4，寡核苷酸探针为探针2；

EZ Taq混合液：有效成份为热启动Taq酶；