KR20170134432A - 개체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 측정하는 방법 - Google Patents

개체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 측정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질환을 앓거나 질환의 치료를 위한 치료를 받는 개체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 건강상의 사건 전에, 중에 또는 후에 개체에서 보이는 면역 세포 다양성의 수준에서의 변화간의 차이를 이용하여 개체에 있어서 질환의 효과, 또는 치료 요법의 효과를 결정한다. 면역 세포 다양성의 수준에서의 차이는 델타 지수로 지칭되며 경시적으로 개체의 가장 역동적인 면역 세포의 정량적 및 정성적 변화(클론의 수득 또는 손실)로 정의된다.

Description

개체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 측정하는 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 3월 6일자 출원된, 발명의 명칭이 "개체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 측정하는 방법(Method for Measuring a Change in an Individual's Immunorepertoire)"인 미국 특허 가출원 제62/129,706호에 대해 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은, 림프구의 상이하게 발현된 수용체 및 고유한 CDR3 서열에 기초하여, 단일 세포 수준에서 개체의 T 및 B 림프구를 분류하는 방법, 및 질환 및/또는 그러한 질환의 치료 전에, 중에 및/또는 후에 개체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 결정하는 방법에 관한 것이다.
항상성 유지 과정을 통해, 면역계는 개체의 "면역 레퍼토리"로 통칭되는 T 및 B 림프구의 특정 수와 레퍼토리를 유지한다. 그러나, 개체의 면역 레퍼토리는 지속적으로 변화하며, 이는 지속적인 세포 전환 및 항원에의 노출로 인한 것이다. 이러한 면역 레퍼토리 변화는 예를 들어 새로운 (나이브) T 및 B 림프구의 생성, 활성 T 및 B 림프구의 확장, 및 새로운 메모리 T 및 B 림프구의 형성을 포함할 수 있다.
면역 요법 및 세포 요법은 암 및 자가면역 질환의 치료에 있어 점점 더 대중적인 도구가 되어가고 있다. 면역 요법은 면역 경로를 조절하거나 질환에 대한 환자의 면역 반응을 증대시기기 위한 항체 치료를 포함할 수 있다. 세포 요법은 생체 외에서 환자의 혈액 또는 백혈구를 질환 항원에 노출시키고 이후 처리된 혈액 또는 백혈구를 환자에게 재도입시키는 것을 포함할 수 있다. 기존 방법이 특정 질환 경로를 표적화하기 위한 합성 소분자를 이용하나, 면역 요법 및 세포 요법은 환자의 면역계를 교육하여 질환을 퇴치하게 함으로써 작용할 수 있다.
질환 상태에 있는 경우, 또는 이러한 질환 상태의 치료 중에, 환자의 면역계는 질환과 싸우도록 동원된다. 그 결과, 면역 레퍼토리의 전환 속도가 변화할 수 있다. 이러한 변화의 측정은 치료의 유효성의 표지를 제공할 수 있다. 그러나, 현재는, 과학자 또는 의사가 면역 레퍼토리 전환 속도를 측정할 수 있게 하는 도구나 방법이 이용 가능하지 않으며; 현재의 방법, 예컨대 백혈구 계수 및 유동 세포 계측법은 이상적이지 않다. 환자의 백혈구 수를 측정하는 것은 림프구의 전체 수 또는 림프구 카테고리에 속하는 세포의 수만을 제공하며, 유동 세포 계측법은 표면 마커에 기초한 T 및 B 림프구의 분류를 가능하게 한다. 그러나 상기 방법 중 어느 쪽도 면역 레퍼토리 전환 속도의 정확한 측정은 제공하지 않는다. 따라서, 현재의 방법들은 면역 요법과 같은 요법의 치료적 결과의 평가, 환자의 프리스크리닝(pre-screening)을 위한 마커의 생성 및 특정 치료법에 가장 적합한 환자의 확인에 이상적이지 않다. 그러므로, 필요한 것은, 상이하게 발현된 T 또는 B 림프구 수용체에 기초하여 단일 세포 수준에서 T 및 B 림프구를 분류하는 도구와 이 정보를 이용하여 개체의 면역 레퍼토리에서 변화를 결정하는 방법이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 개체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 계산하는 방법에 관한 것으로, 이러한 변화는 가장 동적인 면역 세포의 전환 속도의 측정이다. 상기 방법은 동일한 환자로부터 수집한 2 이상의 샘플 유래의 면역 세포의 집단에서 클론형(즉, 클론 종류)을 정량하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 빈도 데이터는 각각의 클론형의 빈도를 확인함으로써 2가지 이상의 샘플에 대해 계산되며, 상기 빈도 데이터는 샘플 차를 교정하도록 정규화된다. 그 후, 환자 샘플에서의 각 클론형의 빈도에서 절대적 정량적 및 정성적 차이가 계산되어, 각 샘플에 공통적인, 최대 빈도 변화를 갖는 클론형을 결정할 수 있다. 그 후, 상기 방법은 샘플간 최대 수준의 변화를 갖는 클론형의 백분율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플은 개체의 기준선 면역 레퍼토리를 결정하도록 동일한 시점에 수집되거나, 면역 레퍼토리 변화 속도를 계산하도록 상이한 시점에 수집될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역 레퍼토리 변화 속도는 건강상의 사건 전의, 중의 또는 후의 시점에 결정된다. 현재 개시된 방법은, 이전에 면역 레퍼토리 변화의 계산을 불가능하게 만들었던 샘플링 및 시퀀싱 불일치를 제거하면서 막대한 양의 시퀀싱 데이터의 분석을 가능하게 한다.
본 개시내용은 하기 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 상이한 시점에서 환자로부터 얻은 미가공 CDR3 시퀀싱 데이터의 예시이다.
도 2는 정규화된 서열 데이터의 결정에 사용되는 계산을 예시하며: 컬럼 A는 미가공 서열 데이터를 나타내고 컬럼 B 및 C는 정규화된 데이터를 나타낸다.
도 3은 동일한 환자로부터 수집된 2가지 샘플의 델타 지수를 결정하는 데 사용되는 계산을 나타내며: 컬럼 D는 각 샘플에서 각 CDR3 판독 수(read count)의 빈도간의 절대차를 나타내고; 컬럼 E는 2가지 샘플의 임팩트 범위(impact range)의 계산을 나타내고; 컬럼 F는 2가지 샘플에 대한 델타 지수의 계산을 나타낸다.
도 4는 샘플의 신호 최적화를 나타낸다: 컬럼 H는 100의 임팩트 범위에 대한 신호 대 잡음 비율의 계산을 나타내고; 컬럼 I는 1,000의 임팩트 범위에 대한 신호 대 잡음 비율의 계산을 나타내고; 컬럼 J는 10,000의 임팩트 범위에 대한 신호 대 잡음 비율의 계산을 나타낸다.
도 5는 여러 샘플 군에 대해 계산된 델타 지수를 예시한다: 군 A는 한 환자로부터 취한 단일 샘플을 나타내고, 상기 샘플은 2개의 하위샘플로 분할되며; 군 B는 동일한 시점에 동일한 개체로부터 취한 다수의 샘플을 나타내며; 군 C는 1일 또는 2일의 간격을 갖는 두 상이한 시점에 동일한 개체로부터 취한 샘플을 나타내며; 군 D는 3개월의 간격을 갖는 두 상이한 시점에 동일한 개체로부터 취한 샘플을 나타내며; 군 E는 상이한 시점에 상이한 개체로부터 취한 샘플을 나타낸다. 이 상황에서 델타 지수는 거의 100%인 것으로 예상된다.
본 발명자는 질환을 앓거나 질환의 치료를 위한 요법을 받는 개체의 면역 레퍼토리의 변화를 결정하는 방법을 개발하였다. 상기 방법은 건강상의 사건 전에, 중에 또는 후에 개체에서 보이는 면역 세포 다양성의 수준에서의 변화간의 차이를 이용하여 개체에 대한 질환의 효과, 또는 치료 요법의 효과를 결정한다. 한 실시양태에서, 이러한 건강상의 사건은, 자연 발생(즉 질환의 발병) 또는 인공 발생(즉 질환 치료의 개시)를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 면역 세포 다양성의 수준에서의 차이는 델타 지수로 지칭된다. 델타 지수는 본원에서 경시적으로 개체의 가장 역동적인 면역 세포의 정량적 변화(CDR3의 상향 또는 하향 조절) 및 정성적 변화(클론의 수득 또는 손실)로 정의된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 제3 상보성 결정 부위(CDR3)에서의 변화를 결정하며, 상기 부위의 뉴클레오티드 서열은 각각의 T 또는 B 세포 클론에 있어서 고유하다. 한 실시양태에서, 개체의 면역계 중에서 가장 역동적인 면역 세포는 면역 레퍼토리 임팩트 범위로 지칭된다. 한 실시양태에서, 임팩트 범위는 이의 뉴클레오티드 서열에서 최대 변화를 나타내는 샘플 집단 내의 100종의 CDR3 클론으로 정의된다. 다른 실시양태에서, 임팩트 범위는 최대 변화를 나타내는 다른 수의 클론, 예를 들어 1,000종 또는 10,000종의 클론을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역 세포"는 T 림프구 및/또는 B 림프구를 지칭한다.
본 발명의 방법은 경시적으로 개체의 가장 역동적인 면역 세포에서의 변화의 속도를 평가하는 하기 단계를 이용하여 수행될 수 있다: (a) 피험체로부터 2 이상의 백혈구 샘플 집단을 수집하는 단계; (b) 표적 특이적 네스티드(nested) 프라이머를 포함하는 반응 혼합물에서 각 백혈구 집단으로부터 유래한 폴리뉴클레오티드를 개별적으로 증폭시켜 제1 앰플리콘 세트를 생성하는 단계로서, 표적 특이적 네스티드 프라이머의 적어도 일부는, 증폭 중에, 1 이상의 공통 프라이머에 대한 결합 부위를 제1 앰플리콘 내로 도입하기 위한 주형으로서 작용하는 추가 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계; (c) 제1 앰플리콘을 함유하는 제1 반응 혼합물의 각각의 일부를 1 이상의 공통 프라이머를 포함하는 제2 반응 혼합물로 개별적으로 이송하는 단계; (d) 각 집단에 대해, 1 이상의 공통 프라이머를 이용하여, 제1 앰플리콘을 증폭시켜 제2 앰플리콘 세트를 생성하는 단계; (e) 제2 앰플리콘의 각각을 시퀀싱하여 샘플에 존재하는 특정 CDR3 부위의 빈도를 확인하는 단계; (f) CDR3 빈도 데이터를 정규화하는 단계; (g) 제1 샘플 및 제2 샘플의 정규화된 CDR3 빈도 데이터를 비교하여 각 CDR3 서열의 빈도간의 절대차를 결정하는 단계; (h) 제1 샘플과 제2 샘플에 공통인, 최대 빈도 변화를 갖는 CDR3 서열을 결정하는 단계; 및 (i) 높은 수준의 변화를 갖는 단계 (h)로부터 유래한 서열을 결정하는 단계. 본원에서 사용된 바와 같이, "피험체"는 인간 또는 동물을 의미한다.
이전에는 넓은 방식으로 면역계를 평가하는 것이 어려웠는데, 이는 인간 또는 동물 면역계의 세포의 수 및 다양성이 너무 커서 작은 서브셋의 세포보다 시퀀싱이 비현실적이었기 때문이다. 본 발명자는 반정량적(semi-quantitative) PCR법(arm-PCR, 본원에 그 전체가 참고로 포함된 미국 특허 출원 제7,999,092호에 상세히 기술됨)을 개발하였으며, 이는 반정량적 결과를 산출하면서도 이전에 이용 가능했던 방법에 비해 증가된 민감성 및 특이성을 제공한다. 특이성 및 민감성을 증가시키고, 이로써 단일 샘플 내에서 검출 가능한 표적의 수를 증가시키는 이 능력이, 상기 방법을 면역 레퍼토리의 클론형의 상대적인 수를 검출하는 데 이상적이게 한다. 본 발명자는 최근 이 시퀀싱 방법을 사용하여 개별 피험체의 면역 레퍼토리의 변화, 또는 전환 속도를 비교할 수 있음을 발견하였으며, 이로써 본 방법을 개발하게 되었다. 이 방법은 특정 질환, 예를 들어 암에 대한 치료를 받는 피험체를 평가하는 데 사용되었다. 본 발명자는 면역 레퍼토리 다양성에서의 변화가 본 발명의 방법을 이용하여 용이하게 검출될 수 있음을 입증하였다. 그러므로, 세포 계수 및 생화학 시험이 임상 실습에서 현재 사용되고 있지만, 이러한 방법이 치료 효과의 지표로서 유용할 수 있다.
면역 레퍼토리의 클론형은 면역계의 이뮤노글로불린(Ig) 및 T 세포 수용체(TCR) 생성의 초기 단계에서 체세포 재조합을 통한 가변(V), 다양성(D) 및 연결(J) 유전자 분절의 재배열에 의해 결정된다. V(D)J 재배열은 증폭되어 T 세포 수용체 알파, 베타, 감마, 및 델타 사슬로부터, 및 또한 이뮤노글로불린 중쇄(IgH) 및 경쇄(IgK, IgL)로부터 검출될 수 있다. 세포는 예를 들어 말초 혈액, 림프 조직, 암 조직, 또는 기타 기관 및/또는 기관계 유래 조직 또는 유체를 얻음으로써 환자로부터 얻을 수 있다. 이러한 샘플, 예컨대 혈액 샘플을 얻는 기법은 당업자에게 공지되어 있다. "클론형을 정량하는 것"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 클론형에 속하는 세포의 수를 세거나, 또는 이의 믿을만한 근사치를 얻는 것을 의미한다. 세포 계수는 PCR 증폭 및 시퀀싱에 의해 검출된 서열의 수로부터 외삽될 수 있다.
약 30-90 뉴클레오티드를 포함하는 CDR3 부위는, 유전자의 재조합된 가변(V), 다양성(D) 및 연결(J) 분절의 접합을 포괄한다. 이는 수용체의 결합 특이성을 암호화하고 고유한 V(D)J 재배열을 확인하기 위한 서열 태그로서 유용하다.
본 발명의 양태는 T 세포, B 세포, 및/또는 T 또는 B 세포의 서브셋 유래의 CDR3 부위의 arm-PCR 증폭을 포함한다. 그러므로 용어 세포의 "집단"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 세포의 "집단" 또는 "아집단"으로서 일반적으로 지칭되는 것을 포괄한다. 이후 다수의 증폭 생성물을 차세대 시퀀싱 플랫폼을 이용하여 효과적으로 시퀀싱할 수 있다.
arm-PCR법은 하나의 반응으로 다수의 폴리뉴클레오티드의 고도로 민감하고 반정량적인 증폭을 제공한다. arm-PCR법은 또한 폐쇄된 카세트 시스템에서 자동화된 방법으로 수행할 수 있으며(iCubate®, 미국 알라바마주 헌츠빌), 이는 예를 들어 다양한 T 및 B 세포의 레퍼토리가 꽤 크기 때문에 본 방법에서 유익하다. arm-PCR법에서, 표적 수는 DNA 폴리머라제에 의해 구동되는 반응에서 증가하며, 이는 반응 내로 도입된 표적 특이적 프라이머의 결과이다. 이러한 증폭 반응의 추가 결과는 제1 세트의 앰플리콘을 함유하는 제1 반응 혼합물의 일부를 공통 프라이머를 포함하는 제2 반응 혼합물로 이송하는 것에 의한 후속 증폭에서 사용될 공통 프라이머에 대한 결합 부위의 도입이다. "1 이상의 공통 프라이머"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 이러한 결합 부위에 결합할 1 이상의 프라이머를 지칭하며, 순방향 및 역방향 프라이머와 같은 프라이머의 쌍을 포함한다. 이러한 이송은, 제1 증폭 반응으로부터 반응 혼합물의 일부를 회수하고 그 샘플을 제2 반응 튜브 또는 챔버 내로 도입시킴으로써, 또는 완료된 제1 증폭으로부터 액체의 일부를 제거하고 일부를 남겨둔 후, 제1 증폭이 수행된 튜브 내로 새로운 시약을 첨가함으로써 수행될 수 있다. 어느 경우에나, 추가 버퍼, 폴리머라제 등이 이후 공통 프라이머와 함께 첨가되어 검출을 위한 증폭된 생성물을 생성한다. 공통 프라이머를 이용하는 표적 분자의 증폭은 반정량적 결과를 제공하며, 여기서 제1 증폭에서 증폭된 정량적 수의 표적이 표적 특이적이기보다는 공통인 프라이머를 이용하여 증폭되며, 검출을 위한 현저히 큰 수의 표적을 생성하고 환자의 혈액 샘플 내의 다양한 재배열을 포함하는 세포의 상대적 수를 결정하는 것을 가능하게 한다. 또한, 제2 반응 혼합물을 제1 반응 혼합물의 일부와 배합하는 것은 제1 반응 혼합물에 보다 높은 농도의 표적 특이적 프라이머가 첨가될 수 있게 하여, 제1 증폭 반응에서의 더 큰 민감성을 유도한다. arm-PCR법과 같은 방법을 이용하여 정량적인 결과를 달성하는 능력과 함께, 특이성과 민감성의 조합이, 세포의 집단에서 클론형의 종류와 수의 충분히 민감성이며 정량적인 평가를 가능하게 하여 진단 용도인 델타 지수를 생성한다.
항원의 인식으로 인한 클론 확장은 그 특정 항원을 인식하는 세포의 보다 큰 집단을 유도하며, 이의 상대적 수에 의한 세포의 평가는 항원 노출이 항체 생산 B 세포 또는 수용체 보유 T 세포의 확장에 영향을 미쳤는지를 결정하는 방법을 제공한다. 이는 특정 질환을 갖는 것으로 진단받은 개체에게 특정 집단의 세포가 주로 있는지 평가할 때 유용하다. 예를 들어, 상기 방법은 치료 또는 백신이, 그 치료 또는 백신이 제공된 개체에게 원하는 면역 반응을 달성했는지를 평가할 때 특히 유용할 수 있다.
면역계 세포의 가변 부위의 증폭 및 시퀀싱을 위한 프라이머는 시판되며, 본 발명자의 공개된 특허 출원 WO2009137255 및 US201000021896A1과 같은 문헌에 기재되어 있고, 상기 특허문헌은 둘 다 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
Hoffman-LaRoche, Inc.사의 454 시퀀싱 시스템과 같은 여러 시판 대용량 시퀀싱 기술이 있다. 예를 들어, 454° 시퀀싱 방법에서, A 및 B 아답터는 PCR 중에 PCR 생성물에 연결되거나 PCR 반응 후에 결찰된다. 아답터는 증폭 및 시퀀싱 단계를 위해 사용된다. arm-PCR 기법과 함께 사용되는 경우, A 및 B 아답터는 증폭 반응에서 공통 프라이머(이는 때때로 "공동 프라이머" 또는 "슈퍼프라이머"로 지칭됨)로서 이용될 수 있다. A 및 B 아답터가 샘플 라이브러리(예컨대 PCR 앰플리콘)에 물리적으로 부착된 후, 단일 가닥 DNA 라이브러리를 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 제조한다. 단일 가닥 DNA 라이브러리는 특이적으로 디자인된 DNA 포집 비드 상에 고정된다. 각 비드는 고유한 단일 가닥 DNA 라이브러리 단편을 보유한다. 비드 결합 라이브러리는 유중수 혼합물에 증폭 시약과 함께 유화되어 각각 하나의 고유한 샘플-라이브러리 단편을 갖는 단 하나의 비드가 들어있는 마이크로반응기를 생성한다. 각각의 고유한 샘플 라이브러리 단편은, 서열의 경쟁 또는 오염을 배제하면서, 이의 마이크로반응기 내에서 증폭된다. 전체 단편 수집물의 증폭은 병행으로 수행한다. 각 단편에 대해, 이는 비드당 수백만의 복제수를 유도한다. 후속하여, 증폭된 단편이 이의 특이적 비드에 결합해 있는 채로 에멀션 PCR(emulsion PCR)을 파괴한다. 클론으로 증폭된 단편을 농후화하고 시퀀싱을 위해 PicoTiterPlate® 장치 상에 로딩하였다. PicoTiterPlate® 웰의 직경은 웰당 단 하나의 비드만을 허용한다. 시퀀싱 효소를 첨가한 후, 시퀀싱 기기의 유체공학적 서브시스템이 각각 단일 비드를 함유하는 수십만 개의 웰을 고정된 순서로 가로질러 개별 뉴클레오티드를 흘려보낸다. 주형 가닥에 상보적인 1개(또는 그 이상)의 뉴클레오티드(들)의 첨가는 기기 내의 CCD 카메라에 의해 녹화되는 화학 발광 신호를 유도한다. PicoTiterPlate® 장치를 가로질러 생성된 신호 강도와 위치 정보의 조합은 소프트웨어가 GS FLX 시스템을 이용하여 각각 약 450 이하의 염기쌍인 1,000,000 초과의 개별 판독의 서열을 결정하게 한다.
본 발명의 한 실시양태에서, T 세포, B 세포, 및/또는 T 또는 B 세포의 서브셋의 CDR3 부위 유래의 시퀀싱 정보는 단일 환자로부터 얻는다. 도 1에 예시된 바와 같이, 이들 세포는 다양한 시점에 수집될 수 있다. 예를 들어, 다수의 샘플이 동일한 환자로부터 동일한 시점에 수집될 수 있다(PAT1S1, PAT1S2). 이 실시양태에서, 샘플은 치료 요법의 개시 전에 수집된다. 하기에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 동일한 시점에 취해진 샘플로부터의 서열 정보의 분석은 환자의 가장 역동적인 면역 세포의 초기 또는 기준선 면역 레퍼토리 전환 속도의 설정을 가능하게 한다. 한 추가 실시양태에서, 본 발명의 방법은 동일한 환자로부터 상이한 시점에 수집된 샘플(PAT1S1, PAT2S1) 상에 실시된다(도 1). 한 실시양태에서, 샘플은 치료 요법 전에, 중에 및 후에 수집될 수 있으며, 이의 시점은 환자의 담당의에 의해 지시될 수 있다. 이 서열 정보의 분석은 치료 요법으로부터 기인하는 환자의 가장 역동적인 면역 세포의 면역 레퍼토리 전환 속도에서의 변화를 결정할 수 있게 한다.
샘플의 수집 방법, 수집된 세포의 수, 얻어진 시퀀싱 판독의 수(즉 샘플로부터 얻은 서열의 수) 및 샘플링된 CDR3 서열의 수에서의 차이는 공통 판독 수로 샘플을 먼저 정규화하지 않고는 두 샘플의 비교를 불가능하게 한다. 그러므로 이후의 측정에 대한 비교의 기준으로서 기준치를 설정해야 한다. 따라서, 정량적 및/또는 반정량적 방법을 이용하여 서열을 얻으면, 이러한 차이를 해결하도록 데이터를 정규화하는 것이 바람직하다.
도 2 및 도 3은 면역 레퍼토리에서 기준선 변화를 계산하는 과정을 예시한다. 도 2의 컬럼 A는 제1 환자 샘플 유래 면역 세포 집단의 CDR3 부위의 수에 대한 미가공 서열 데이터를 나타낸다. 컬럼 A로부터 명백한 바와 같이, 각각의 검출된 유전자 서열은 1천만(판독)의 수반하는 빈도를 가진다. 본 발명의 한 실시양태에서, 각 샘플은 이러한 불일치를 처리하도록 1천만 판독으로 정규화된다. 이 실시양태에서, 정규화된 판독 수는 각 CDR3 서열에 대한 판독 수(즉 각 고유한 CDR3 서열이 샘플에서 검출된 횟수)를 정규화 지수(1천만/샘플에 대한 판독의 총 수)로 곱하여 얻어지며(컬럼 B), 이후 이는 1천만으로 나누어진다(컬럼 C). 본 실시예가 판독 수를 1천만으로 정규화하지만, 수는 다른 실시양태에서 다른 세포 농도로 정규화될 수 있다.
이후, 개체에 대한 기준선 레퍼토리 전환 속도를 설정하기 위해, 단일 기간에 수집된 두 샘플(PAT1S1 및 PAT1S2)로부터의 정규화된 데이터를 비교하였다. 이제 도 3을 참조하여, 각 샘플에서의 각 CDR3 판독 수의 빈도간의 절대차를 결정하였다(컬럼 D). 본 방법이 개체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 결정하는 데 사용되기 때문에, 모든 정량적 변화(즉 고유한 CDR3 서열의 빈도에서의 증가 또는 감소)가 이 계산에 포함된다. 한 추가 실시양태에서, 각 CDR3 서열의 빈도간 절대차는 또한 정성적 변화를 포함할 것이다. 예를 들어, 특정 CDR3 서열이 제1 샘플에 존재하지만 제2 샘플에는 존재할 수 없다는 사실(또는 그 반대)은 두 샘플간의 클론형 다양성에서 절대차를 결정하는 계산에 있을 것이다.
도 3을 다시 참조하여, 환자에 대한 기준선 면역 레퍼토리 전환 속도를 결정하는 다음 단계는 두 샘플의 임팩트 범위의 계산을 포함한다(컬럼 E). 본원에서 사용된 바와 같이, 임팩트 범위는 가장 역동적인 클론에 의해 기여된 환자의 면역 레퍼토리의 백분율을 결정함으로써 계산된다. 임팩트 범위를 결정하여 두 집단간의 샘플링 차이를 제거할 수 있는 것이 필요하다. 상기 기술된 바와 같이, 이러한 샘플링 불일치는 예를 들어, 환자 샘플에 포함된 세포의 수의 차이, arm-PCR 중 증폭 효율의 차이, 시퀀싱 편향의 도입 및 시퀀싱 깊이에서의 차이를 포함할 수 있다. 이러한 샘플 변수의 존재는 두 집단간의 빈도 변동성을 비교하는 것을 불가능하게 한다. 상기 기술된 바와 같이, 시퀀싱 데이터를 1천만 판독으로 정규화하는 것은, 이러한 불일치 중 일부를 제거하는 것을 돕는다. 그러나, 추가 단계, 예컨대 임팩트 범위를 계산하는 것은, 막대한 양의 시퀀싱 데이터의 분석을 가능하게 하고 두 샘플의 직접 비교를 가능하게 하도록 수행되어야 한다. 상기 논의된 변수들은 어떠한 빈도 변화도 마스킹하고 그러한 비교를 불가능하게 만들 것이다. 한 실시양태에서, 임팩트 범위는 샘플들 사이의 최대 빈도 차를 갖는 100종의 클론에 의해 기여된 환자의 면역 레퍼토리의 백분율을 계산함으로써 결정된다. 도 4에 예시된 바와 같이, 샘플간의 최대 빈도 차를 갖는 1,000종 또는 10,000종 클론과 같이, 다른 수의 클론이 다른 실시양태에서의 임팩트 범위의 계산에 포함될 수 있다.
도 3, 컬럼 F에 예시된 다음 단계에서, 델타 지수는 두 샘플에 대해 계산된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 델타 지수는 제1 샘플과 제2 샘플간의 빈도 차이를 나타내는 임팩트 범위 내의 시퀀싱된 CDR3 클론의 전체 백분율을 나타낸다. 도 4, 컬럼 H에 예시된 실시예에서, 샘플 1 및 2의 임팩트 범위(평균)은 7.27%이며, 100종의 가장 역동적인 CDR3 클론이 환자의 시퀀싱된 면역 레퍼토리의 7.27%를 이룬다는 것을 나타낸다. 최종 단계에서, 델타 지수는 2개의 샘플에 대해 계산된다. 이 실시양태에서, 델타 지수는 샘플 1과 샘플 2 사이의 변화된 임팩트 범위 내에 포함되는 CDR3 클론의 백분율이다. 도 4, 컬럼 H에 예시된 바와 같이, 6.53%의 델타 지수는, 건강상의 사건의 시작 전과 같은 동일한 시점에 수집된 두 샘플로부터 계산되는, 환자에 대한 기준선 면역 레퍼토리의 계산이다.
기준선 면역 레퍼토리 전환 속도를 설정한 후, 델타 지수는 이후 상이한 기간에 수집된 두 샘플에 대해 계산된다. 한 실시양태에서, 제1 샘플은 치료의 시작 전에 수집되고, 제2 샘플은 치료 중에, 또는 치료가 완료된 후에 수집된다. 도 4에 예시된 바와 같이, 상이한 시점에 수집된 두 샘플(PAT1S1 및 PAT2S1)로부터의 미가공 CDR3 서열 데이터는, (1) 정규화되고; (2) 빈도간 절대차가 계산되고; (3) 두 샘플의 임팩트 범위가 계산되고; (4) 두 샘플에 대해 델타 지수가 결정된다. 상기 단계들은 도 2-도 4에 대해 이전에 기술된 바와 동일한 방식(즉 기준선 델타 지수를 계산하는 것과 동일한 방식)으로 수행된다. 도 4에 추가로 예시된 바와 같이, 델타 지수 계산의 신호 대 잡음 비율은 이후 이하의 계산에 예시된 바와 같이 기준선 델타 지수를 실험 델타 지수에 비교하여 결정될 수 있다:
신호/잡음 = 델타 지수 (PAT1S1-PAT2S1) / 델타 지수 (PAT1S1-PAT1S2)
도 4에 예시된 실시양태에서, 100의 임팩트 범위의 선택은 가장 낮은 신호 대 잡음 비율을 생성하고 적은 잡음을 갖는 결과를 제공한다.
본 발명은 가장 역동적인 면역 세포의 레퍼토리 속도의 계산을 가능하게 한다. 본 방법의 단계는 막대한 양의 서열 데이터의 조작을 수반하며, 예를 들어 샘플 크기를 정규화하는 경우, 각 CDR3에 대한 빈도 값을 구하고, 절대 빈도 변화를 구하고, 임팩트 범위를 계산한다. 이러한 계산은, 일부 클론이 건강상의 사건 중에 상향 조절될 수 있고, 다른 클론이 하향 조절될 수 있으며, 일부 클론은 제2 시점에서 사라질 수 있고, 일부 새로운 클론이 상이한 시점에서 나타날 수 있다는 점을 고려하는 것이 필요하다. 본 발명은 전체 레퍼토리 변화를 결정하고 각 CDR3와 관련된 변화를 정량하여 이러한 문제점을 극복한다. 본 방법은, 이전에 면역 레퍼토리 변화의 비교를 불가능하게 만들었던 샘플링 및 시퀀싱 불일치를 제거하면서 막대한 양의 시퀀싱 데이터의 분석을 가능하게 한다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 환자 샘플에 대한 델타 지수 계산
두 전혈 샘플을 3개월의 간격으로 두 건강한 개체 각각으로부터 수집하였다. 두 차세대 시퀀싱(NGS) 프로토콜을 각 개체로부터 유래한 샘플 상에 수행하였다. RNA를 평균하여 1백만 세포로부터 추출하고, arm-PCR을 이용하여 NGS 라이브러리를 생성하였다. 시퀀싱을 Illumina HiSeq® 기기를 이용하여 수행하였다.
도 5는 여러 샘플 군에 대해 계산된 델타 지수를 예시한다:
군 A는 한 환자로부터 취해진 단일 샘플을 나타내며, 상기 샘플은 2개의 하위 샘플로 분할된다. 델타 지수는 이 집단에 대해 0.00%이며 이는 두 샘플이 샘플 변화 없이 동일한 시점에 수집되었기 때문이다.
군 B는 동일한 개체로부터 동일한 시점에 취해진 다수의 샘플을 나타낸다. 레퍼토리 변화(델타 지수)는 3.88% 내지 6.53%에서 측정되었다. 이러한 종류의 샘플은 개체에 대한 기준선 레퍼토리 변화를 계산하는 데 유용하다.
군 C는 동일한 개체로부터 1일 또는 2일의 간격을 갖는 두 상이한 시점에 취해진 샘플을 나타낸다. 이러한 계산된 레퍼토리 변화는 0% 내지 100%로 달라질 수 있고 건강상의 사건에 의해 야기된 레퍼토리 변화를 결정하는 데 유용하다.
군 D는 동일한 개체로부터 3개월의 간격을 갖는 두 상이한 시점에 취해진 샘플을 나타낸다. 이러한 계산된 레퍼토리 변화는 0% 내지 100%로 달라질 수 있고 건강상의 사건에 의해 야기된 레퍼토리 변화를 결정하는 데 유용하다.
군 E는 상이한 시점에서 상이한 개체로부터 취한 샘플을 나타낸다. 이 상황에서 델타 지수는 거의 100%인 것으로 예상된다.
실시예 2: 건강한 환자 샘플
19명의 건강한 개체 각각으로부터 3개월의 간격으로 2개의 전혈 샘플을 수집하였다. 2회의 NGS 프로토콜을 각 개체로부터의 샘플 상에 수행하였다. RNA를, 평균하여, 1백만 세포로부터 추출하고, arm-PCR를 사용하여 NGS 라이브러리를 생성하였다. Illumina HiSeq® 기기를 이용하여 시퀀싱을 수행하였다. 평균하여, 5백만 T 세포 수용체 분자를 각 샘플에 대해 시퀀싱하였다(개체당 1천만 총 판독). 대략 100,000 내지 300,000종의 고유한 CDR3 서열을 각 샘플로부터 얻었다.
하기 표 1은 계산된 델타 지수를 포함하여 거의 2억 서열 판독(1 판독 = 1 분자)의 분석 결과를 예시하며, 5.52% 내지 23.33%의 범위이고, 평균은 13%이었다.
계산된 델타 지수
정규 샘플 델타 지수 ( % )
1 14.95
2 7.29
3 23.33
4 11.05
5 22.77
6 8.53
7 10.91
8 6.5
9 14.37
10 9.93
11 20.64
12 20.26
13 6.23
14 10.26
15 6.23
16 21.16
17 5.52
18 13.62
19 14.25
실시예 3: 유방암 샘플
네오아주반트 치료, 즉 수술 전에 종양 부하를 감소시키기 위해 수술 전 화학치료를 받는 12명의 유방암 환자로부터 샘플을 얻었다.
말초 혈액 샘플을 치료 전 및 치료 후에 수집하였다. 2회 NGS 프로토콜을 각 개체로부터 유래한 샘플 상에 수행하였다. RNA를 평균하여 1백만 세포로부터 추출하고, arm-PCR을 이용하여 NGS 라이브러리를 생성하였다. 시퀀싱을 Illumina HiSeq® 기기를 이용하여 수행하였다. 하기 표 2에 예시된 바와 같이, 계산된 델타 지수 범위는 20.49% 내지 97%였고, 평균은 58.85%였다.
계산된 델타 지수
환자 # 델타 지수 ( % )
1 21.72
2 20.49
3 83.39
4 64.21
5 75.62
6 66.30
7 59.19
8 97.86
9 72.57
10 61.77
11 48.06
12 35.12
이러한 계산된 델타 지수 범위는 건강한 개체에 대해 관찰된 레퍼토리 전환 속도에 비해 현저히 높은 레퍼토리 전환 속도를 나타내었다(표 1). 본원에 기술된 방법론을 이용하여, 면역 레퍼토리 전환 속도를 계산하는 것은, 현재의 방법과 비교하여 몇가지 장점을 제공하였다. 본원에 개시된 방법론은, 예를 들어, 치료 결과를 평가하거나 질환 상태의 발병을 나타내는 데 도움이 되었다.
본원에 개시된 방법론 및 이의 다양한 실시양태는 예시적이다. 본원에 개시된 방법론의 다양한 다른 실시양태가 가능하다.

Claims (18)

  1. 동일한 환자로부터 수집된 제1 샘플 및 제2 샘플 중 면역세포의 집단 또는 아집단에서의 면역 세포의 클론형을 정량하는 단계;
    각 클론형의 빈도를 확인함으로써 제1 샘플 및 제2 샘플에 대한 빈도 데이터를 계산하는 단계;
    제1 샘플 및 제2 샘플에 대한 빈도 데이터를 정규화하는 단계;
    제1 샘플 및 제2 샘플에 존재하는 각 클론형의 빈도에서의 절대차를 결정하는 단계; 및
    제1 샘플과 제2 샘플에 공통인, 최대 빈도 변화를 갖는 클론형을 결정하는 단계
    를 포함하는, 피험체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 계산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 면역 세포의 클론형을 arm-PCR 및 차세대 시퀀싱을 이용하여 정량하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 클론형은 CDR3 클론형인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1 샘플과 제2 샘플은 동일한 시점에 수집되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제1 샘플과 제2 샘플은 상이한 시점에 수집되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 최대 빈도 변화를 갖는 100종 이상의 클론형을 확인하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 각 샘플은 백혈구를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 피험체는 건강한 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 피험체는 질환을 갖는 것으로 진단받았거나 질환을 가진 것으로 추정되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 피험체를 면역 요법으로 치료하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 피험체는 제1 샘플이 수집된 후 면역 요법을 받는 것인 방법.
  12. 피험체로부터 2 이상의 백혈구 샘플 집단을 수집하는 단계;
    표적 특이적 네스티드(nested) 프라이머를 포함하는 반응 혼합물에서 각 백혈구 집단으로부터 유래한 폴리뉴클레오티드를 개별적으로 증폭시켜 제1 앰플리콘 세트를 생성하는 단계로서, 상기 표적 특이적 네스티드 프라이머의 적어도 일부는, 증폭 중에, 1 이상의 공통 프라이머에 대한 결합 부위를 제1 앰플리콘 내로 도입하기 위한 주형으로서 작용하는 추가 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    제1 앰플리콘을 함유하는 제1 반응 혼합물의 각각의 일부를 1 이상의 공통 프라이머를 포함하는 제2 반응 혼합물로 개별적으로 이송하는 단계;
    각 집단에 대해, 1 이상의 공통 프라이머를 이용하여, 제1 앰플리콘을 증폭시켜 제2 앰플리콘 세트를 생성하는 단계;
    제2 앰플리콘의 각각을 시퀀싱하여 샘플에 존재하는 특이적 CDR3 부위의 빈도를 확인하는 단계;
    CDR3 빈도 데이터를 정규화하는 단계;
    제1 샘플 및 제2 샘플의 정규화된 CDR3 빈도 데이터를 비교하여 각 CDR3 서열의 빈도간의 절대차를 결정하는 단계; 및
    제1 샘플과 제2 샘플에 공통인, 최대 빈도 변화를 갖는 CDR3 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는, 피험체의 면역 레퍼토리에서의 변화를 계산하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제1 샘플과 제2 샘플은 동일한 시점에 수집되는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 제1 샘플과 제2 샘플은 상이한 시점에 수집되는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 피험체는 건강한 것인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 피험체는 질환을 갖는 것으로 진단받았거나 질환을 가진 것으로 추정되는 것인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 피험체를 면역 요법으로 치료하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 피험체는 제1 샘플이 수집된 후 면역 요법을 받는 것인 방법.
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