CN102066578B - 用于评价和比较免疫组库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种方法，该方法扩增来自免疫细胞群的RNA和/或DNA，使用扩增的产物以产生免疫应答谱和评价正常或异常免疫应答与诸如自身免疫性疾病、癌症、糖尿病或心脏疾病的疾病的发生之间的可能的相关性。

Description

用于评价和比较免疫组库的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年4月16日申请的美国临时专利申请号61/045,586的优选权权益。
发明领域
本发明涉及鉴定生物标志物的方法，和鉴定细胞群中T细胞受体、抗体和MHC重排的方法。
发明背景
许多年来，科学家已经知道某些疾病与特定的基因或遗传突变有关。然而，遗传原因仅能解释人类中诊断的一部分疾病。许多疾病似乎在某种程度上与免疫系统对传染原和环境因素的应答有联系，但免疫系统如何在疾病诸如癌症、阿尔兹海默病、肋软骨炎、纤维肌痛、狼疮和其他疾病中发挥作用仍然需要确定。
人类基因组包含总数为567-588个的Ig(免疫球蛋白)和TR(T细胞受体)基因(339-354个Ig基因和228-234个TR基因)/单倍体基因组，它们位于7个主要基因座中。它们包括405-418个V、32个D、105-109个J和25-29个C基因。功能性Ig和TR基因的数目为每个单倍体基因组321-353个。它们包括187-216个V、28个D、86-88个J和20-21个C基因(http://imgt.cines.fr)。通过这些基因的重排，已经估计可以产生大概2.5×107种可能的抗体或T细胞受体。
尽管在种系水平，人类能够产生大量不同的Ig和TR，但对于特定个体，由于B细胞和T细胞发育期间的阴性选择，可用的Ig和TR的数目实际上少得多。在一些个体中，此过程可能不能去除一些将与机体的自身组织交叉反应的细胞，并且这可能是一些类型的自身免疫性疾病的原因。
迄今少数疾病与机体对共同抗原的反应(Prinz，J.等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)(1999)29(10)：3360-3368，″SelectionofConservedTCRVDJRearrangementsinChronicPsoriaticPlaquesIndicatesaCommonAntigeninPsoriasisVulgaris(在慢性银屑病斑块中保守的TCRVDJ重排的选择指示寻常性银屑病中的共同抗原)″)和/或对特定的VDJ重排(Tamaru，J.等，Blood(血液)(1994)84(3)：708-715，″Hodgkin′sDiseasewithaB-cellPhenotypeOftenShowsaVDJRearrangementandSomaticMutationsintheVHGenes(具有B细胞表型的霍奇金病经常显示VDJ重排和VH基因中的体细胞突变)″)相关。所需要的是用于评价人免疫应答的变化和将这些变化与特定疾病相关的更好方法。
发明概述
本发明涉及一种产生人和/或动物的免疫状态谱(immunestatusprofile，ISP)的方法。在本发明的一个方面，该方法包括以下的步骤：使用靶特异性引物在第一次扩增反应中扩增来自至少一个人或动物受试者的白细胞样品中的至少一种RNA和/或DNA从而产生至少一种扩增子，所述靶特异性引物的至少一部分包含另外的核苷酸从而将共用引物的结合位点引入至所得的扩增子中；从所述第一次扩增反应中拯救所述至少一种扩增子；通过在第二次扩增反应中加入共用引物，扩增具有共用引物的至少一个结合位点的所述第一次扩增反应的扩增子；以及将所述所述第二次扩增反应的扩增子测序以鉴定和量化表现抗体和/或受体重排的DNA序列，从而建立免疫状态谱。
在本发明的另一个方面，从所述第一次扩增反应中拯救所述至少一种扩增子的步骤可以省略，并且第一次和第二次扩增反应可以在不将扩增子与靶特异性引物分开的条件下进行。基因组DNA也可以扩增，并且扩增DNA的步骤可以替代扩增RNA的步骤，尤其是在需要分析免疫系统组分诸如主要组织相容性复合物(MHC)的情况下。
在本发明的多个方面中，自细胞亚群可以通过流式细胞术分离，从而将幼稚B细胞、成熟B细胞、记忆B细胞、幼稚T细胞、成熟T细胞和记忆T细胞分开。在该方法的多个方面中，细胞亚群的重组是B细胞免疫球蛋白重链(IgH)，κ和/或λ轻链(IgK，IgL)，T细胞受体β、γ、δ和/或主要组织相容性复合物(MHC)分子I或II的重排。
在本发明的另一个方面中，该方法还可以包括将正常个体的群体的免疫细胞谱与已经诊断有疾病的个体的群体的免疫细胞谱进行汇编和比较，以确定特定的重排或重排组和所述疾病之间是否存在相关性。
在本发明的另一个方面中，该方法可以包括将对已经施用了疫苗的个体的群体鉴定的免疫细胞谱与没有施用疫苗的个体的群体的免疫细胞谱进行比较以评价所述疫苗在产生免疫应答中的功效。
附图简要说明
图1a和图1b是图示说明通过本发明的方法使用本文公开的引物获得的扩增产物的存在的凝胶的照片。
图2说明用于(a)健康对照样品中的Ig重链，(b)来自结肠癌患者的血样中的TCRβ链，(c)来自慢性淋巴细胞性白血病患者(CLL)的血样中的Igκ链，和(d)来自系统性红斑狼疮患者(SLE)的血样中的Igλ链的结构域的分布。空的斑点表示缺少与相应的V-J组合相关的序列，并且柱的高度表示特定序列出现的频率。
详述
本发明人已经开发了一种用于评价来自大量细胞的抗体和受体重排的方法，该方法用于比较在个体的群体中鉴定的重排，以确定特定的重排或重排组和疾病，或疾病的某些症状之间是否存在相关性。该方法还用于建立一个或多个个体响应于传染原和/或环境因素的免疫应答史，以及用于评价疫苗的功效。
本发明涉及一种用于产生人和/或动物的免疫状态谱(ISP)的方法。在本发明的一个方面中，该方法包括以下的步骤：使用靶特异性引物在第一次扩增反应中扩增来自至少一个人或动物受试者的白细胞样品中的至少一种RNA，从而产生至少一种扩增子，所述靶特异性引物的至少一部分包含另外的核苷酸以将共用引物的结合位点引入至所得的扩增子中；从所述第一次扩增反应中拯救所述至少一种扩增子；通过在第二次扩增反应中加入共用引物，扩增具有共用引物的至少一个结合位点的所述第一次扩增反应的扩增子；以及将所述第二次扩增反应的扩增子测序以鉴定和量化表现抗体和/或受体重排的DNA序列，从而建立免疫状态谱。
在本文使用术语“包含”时，还可以使用“基本上由……组成”和“由……组成”。术语“免疫状态谱”意指个体或个体的群体的谱，该谱指示存在和/或不存在代表特定的重排的序列以及它们出现的频率，所述特定的重排代表人和/或动物免疫系统的B细胞、T细胞和/或其他细胞的多样性。在本文中提到扩增子“被拯救”时，要理解的是扩增子拯救可以通过将扩增子与用来形成它们的引物分离而发生，或可以通过如下而发生，即，稀释扩增子/引物混合物从而，由于来自第一次扩增反应的扩增子显著多于引物的事实，使得那些引物的作用在使用不同引物的第二次扩增反应中被最小化。“共用引物”是可以用来扩增通常具有非全同序列但因为它们含有相同引物的结合位点而享有序列相似性的多核苷酸(例如，通过靶特异性引物产生的来自第一次扩增的扩增子)的那些引物。共用引物通常针对其在引导成功的扩增时的效率来选择，因此它们的应用有效地在本发明的方法中以非靶特异性的方式实现较高水平的扩增。共用引物结合位点可以引入至由第一次扩增获得的扩增子中，这通过将它们的序列或它们的互补序列与靶特异性引物的序列相连接而实现。共用引物可以由本领域技术人员通过许多引物设计方法来选择。
白细胞亚群可以通过流式细胞术分离，从而将幼稚B细胞、成熟B细胞、记忆B细胞、幼稚T细胞、成熟T细胞和记忆T细胞分开。在这些细胞亚群中的重组通常是B细胞免疫球蛋白重链(IgH)，κ和/或λ轻链(IgK，IgL)，T细胞受体β、γ、δ和/或主要组织相容性复合物(MHC)分子I或II的重排。
通过进行另外的步骤，即，将正常个体的群体的平均免疫状态谱与已经诊断有疾病的个体的群体的平均免疫状态谱进行汇编和比较的步骤，可能使用免疫细胞谱来确定在特定的重排或重排组和所述疾病之间是否存在相关性。
本发明还提供了一种评价关于形成免疫细胞谱变化的疫苗功效的方法，该方法通过执行所述方法的各个步骤，并将对已经施用了疫苗的个体的群体鉴定的免疫细胞谱与没有施用疫苗的个体的群体的免疫细胞谱进行比较以评价所述疫苗在产生免疫应答中的功效。
在本发明的一个实施方案中，外周血样品取自患者并且可以通过流式细胞术分离白细胞的亚群从而将幼稚B细胞、成熟B细胞、记忆B细胞、幼稚T细胞、成熟T细胞和记忆T细胞分开。在所述方法的不同实施方案中，细胞的亚群中的重组可以包括B细胞免疫球蛋白重链(IgH)，κ和/或λ轻链(IgK，IgL)，T细胞受体β、γ、δ和/或主要组织相容性复合物(MHC)分子I或II的重排。
在一些方面，从第一次扩增反应中拯救扩增子的步骤可以省略，并且两次扩增反应可以在同一反应管中进行而无需扩增子拯救或稀释由第一次扩增反应剩余的引物。
本发明人以前开发了一种已知为tem-PCR的PCR方法，其已经描述在公开号WO2005/038039中。最近，本发明已经开发了一种称为扩增子拯救多重聚合酶链式反应(arm-PCR)的方法，其描述在U.S.PCT/US09/39552和本文中。tem-PCR和arm-PCR两种方法在一次反应中提供了对多种多核苷酸的半定量扩增。另外，arm-PCR提供了增加的灵敏度。两种方法均提供了在一次反应中扩增多种多核苷酸的能力，这在本发明的方法中是有益的，因为例如多种T细胞和B细胞的组库(repertoire)是如此之大。在扩增反应中加入共用引物结合位点，和随后使用共用引物对靶分子的扩增，得到了定量或半定量的结果，这使得可能确定患者血样内包含各种重排的细胞的相对量。由于识别抗原引起的克隆增殖产生较大的识别该抗原的细胞群，并且通过其相对数目来对细胞进行的评价提供了一种确定抗原暴露是否已经影响了产生抗体的B细胞和携带受体的T细胞的增殖的方法。例如，这有助于评价是否可能存在特殊的细胞群，该细胞群在已经诊断有特定疾病的个体中很普遍，并且可以特别地有助于评价疫苗是否已经在已经给药该疫苗的个体中实现了所需的免疫应答。
存在有几种市售的高通量测序技术，诸如RocheLifeSciences454Sequencing在此测序方法中，454A和454B引物在PCR期间连接(link)在PCR产物上或在PCR反应后连接(ligate)在PCR产物上。当结合tem-PCR或arm-PCR进行时，454A和454B引物可以用作扩增反应中的共用引物。将PCR产物，通常是不同序列的混合物，稀释至约200拷贝/μl。在“乳液PCR”反应中，(半固体凝胶状环境)稀释的PCR产物在微珠的表面上由引物(454A或454B)扩增。因为PCR模板是如此稀的，通常仅一个微珠靠近一个模板，并且被限制在半固体的环境中，因此扩增仅在微珠上和周围发生。然后微珠被洗脱并置于带有专门设计的孔的板上。每个孔仅可以容纳一个微珠。然后将试剂加入至孔中以进行焦磷酸测序(pyrosequencing)。可以使用纤维光学检测器从各孔中读取测序反应并且由计算机平行采集数据。一次这样的高通量反应可以生成至多达6000万个读数(6000万个微珠)并且每个读数可以生成约300bp序列。
本发明的一个方面涉及免疫状态谱，或“个人免疫组库”(personalimmunorepertoires，PIRs)的数据库的开发，使得每个个体可以建立基线并且在几年的时间内追踪对已知和未知抗原的免疫应答的发展。如果此信息收集自大量的个体，则该信息可以提供流行病学数据库，其将产生有价值的信息，特别是关于诸如癌症和心脏疾病的那些疾病的发生，这些疾病被认为经常是由暴露于病毒或其他传染原引起，所述病毒或其他传染原中的许多仍未被确认。本发明的方法的一种特别重要的应用是能够进行对儿童的研究以确定感染性疾病、环境因素或疫苗是否可能是孤独症的病因。例如，许多人已经假设疫苗施用可以引发孤独症的发生。然而，许多人也将该潜在的相关性归因于疫苗中诸如硫柳汞的试剂的使用，并且研究已经证明硫柳汞似乎不是该疾病的致病因子。仍存在着这样的推测，即混合疫苗(cocktailvaccine)的开发与孤独症的病例数增加相关，然而，但收集数据以评价多种抗原的潜在因果关系是非常困难的。本发明的方法简化了该过程并且可以提供关键性信息以更好地理解孤独症和其他疾病，在这些疾病中不同个体的免疫应答可以对暴露于试剂或一组试剂的一些个体中疾病的差异性发展，而其他同样暴露的个体不发生该疾病提供了解释。
由感染引发的PIR的不平衡可以导致许多疾病，包括癌症、白血病、神经元疾病(阿尔茨海默病、多发性硬化症、帕金森病、孤独症等)、自身免疫性疾病和代谢性疾病。这些疾病可以称为PIR疾病。可能存在着两种PIR疾病形式。(1)“功能缺失”形式，和(2)“功能获得”兴趣。在“功能缺失”形式中，人对疾病易感，因为他/她的受限制的和/或有限的PIR缺少产生最有效的和必需的Ig和TR的细胞。在“功能获得”形式中，人对疾病易感，因为他/她的PIR获得了产生正常情况下不应存在的Ig和TR的细胞。在“功能缺失”(LOF)PIR疾病中，个体不具有合适的功能性B细胞或T细胞以对抗疾病。他/她的HLA分型决定了那些细胞在免疫细胞成熟过程的早期期间被清除，所述细胞通常被清除的原因是它们与他/她的自身蛋白强烈地反应。
本发明的一个方面还包括将患者免疫细胞谱结合识别信息输入至数据库中，所述识别信息诸如，例如，患者标识号，包括患者的HLA类型的代码，包括可能已经作出的一个或多个临床诊断的疾病代码，包括样品的日期的“分期代码”，包括从其扩增和测序RNA的细胞亚群的类型的细胞类型代码，以及包括对所述样品鉴定的序列的一个或多个序列代码。
所述的方法包括新的引物组，该引物组不仅允许扩增整个免疫组库，而且还允许多重扩增，所述多重扩增是半定量的。多重扩增要求仅需要很少的PCR或RT-PCR反应。例如，使用对IgH、IgL或IgK特异的引物，存在的所有免疫球蛋白(Ig)序列可以在一个反应中扩增，或可以单独地进行两个或三个反应。类似地，T细胞受体(TRs)可以在仅仅一个反应中扩增，或可以在少数的反应中扩增，包括命名为TRA，TRB，TRD和TRG的T细胞受体。MHC基因可以在仅仅一个PCR反应中扩增。半定量扩增允许多重反应中的所有靶标独立地扩增，使得扩增产物的终点分析反映靶标中的初始内比(internalratio)。因为保持了该比率，因此可能产生指示多种免疫系统细胞的存在或缺乏，以及相对数目的免疫细胞谱。根据本发明的方法的RNA扩增可以使用表1、2和/或3中列举的任一或所有引物来进行。因此本发明提供一种方法，该方法使用选自由下列各项组成的组的至少一个(其可以当然，更优选地包括至少2个、至少3个、至少4个等)引物以进行产生至少一种第一扩增子的第一次扩增：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20、SEQIDNO：31、SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36、SEQIDNO：37、SEQIDNO：38、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40、SEQIDNO：41、SEQIDNO：42、SEQIDNO：43、SEQIDNO：44、SEQIDNO：45、SEQIDNO：46、SEQIDNO：47、SEQIDNO：48、SEQIDNO：49、SEQIDNO：50、SEQIDNO：51、SEQIDNO：52、SEQIDNO：53、SEQIDNO：54、SEQIDNO：55、SEQIDNO：56、SEQIDNO：57、SEQIDNO：58、SEQIDNO：59、SEQIDNO：60、SEQIDNO：61、SEQIDNO：62、SEQIDNO：63、SEQIDNO：64、SEQIDNO：65、SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68、SEQIDNO：69、SEQIDNO：70、SEQIDNO：71、SEQIDNO：72、SEQIDNO：73、SEQIDNO：74、SEQIDNO：75、SEQIDNO：76、SEQIDNO：77、SEQIDNO：78、SEQIDNO：79、SEQIDNO：80、SEQIDNO：81、SEQIDNO：82、SEQIDNO：83、SEQIDNO：84、SEQIDNO：85、SEQIDNO：86、SEQIDNO：87、SEQIDNO：88、SEQIDNO：89、SEQIDNO：90、SEQIDNO：101、SEQIDNO：102、SEQIDNO：103、SEQIDNO：104、SEQIDNO：105、SEQIDNO：106、SEQIDNO：107、SEQIDNO：108、SEQIDNO：109、SEQIDNO：110、SEQIDNO：111、SEQIDNO：112、SEQIDNO：113、SEQIDNO：114、SEQIDNO：115、SEQIDNO：116、SEQIDNO：117、SEQIDNO：118、SEQIDNO：119、SEQIDNO：120、SEQIDNO：121、SEQIDNO：122、SEQIDNO：123、SEQIDNO：124、SEQIDNO：125、SEQIDNO：126、SEQIDNO：127、SEQIDNO：128、SEQIDNO：129、SEQIDNO：130、SEQIDNO：131、SEQIDNO：132、SEQIDNO：133、SEQIDNO：134、SEQIDNO：135、SEQIDNO：136、SEQIDNO：137、SEQIDNO：138、SEQIDNO：139、SEQIDNO：140、SEQIDNO：151、SEQIDNO：152、SEQIDNO：153、SEQIDNO：154、SEQIDNO：155、SEQIDNO：156、SEQIDNO：157、SEQIDNO：158、SEQIDNO：159、SEQIDNO：160、SEQIDNO：161、SEQIDNO：162、SEQIDNO：163、SEQIDNO：164、SEQIDNO：165、SEQIDNO：166、SEQIDNO：167、SEQIDNO：168、SEQIDNO：169、SEQIDNO：170、SEQIDNO：171、SEQIDNO：172、SEQIDNO：173、SEQIDNO：174、SEQIDNO：175、SEQIDNO：176、SEQIDNO：177、SEQIDNO：178、SEQIDNO：179、SEQIDNO：180、SEQIDNO：181、SEQIDNO：182、SEQIDNO：183、SEQIDNO：184、SEQIDNO：185、SEQIDNO：186、SEQIDNO：187、SEQIDNO：188、SEQIDNO：189、SEQIDNO：190、SEQIDNO：191、SEQIDNO：192、SEQIDNO：193、SEQIDNO：194、SEQIDNO：195、SEQIDNO：196、SEQIDNO：197、SEQIDNO：198、SEQIDNO：199、SEQIDNO：200、SEQIDNO：201、SEQIDNO：202、SEQIDNO：203、SEQIDNO：204、SEQIDNO：205、SEQIDNO：206、SEQIDNO：207、SEQIDNO：208、SEQIDNO：209、SEQIDNO：210、SEQIDNO：211、SEQIDNO：212、SEQIDNO：213、SEQIDNO：214、SEQIDNO：215、SEQIDNO：216、SEQIDNO：217、SEQIDNO：218、SEQIDNO：219、SEQIDNO：220、SEQIDNO：221、SEQIDNO：222、SEQIDNO：223、SEQIDNO：224、SEQIDNO：225、SEQIDNO：226、SEQIDNO：227、SEQIDNO：228、SEQIDNO：229、SEQIDNO：230、SEQIDNO：231、SEQIDNO：232、SEQIDNO：233、SEQIDNO：234、SEQIDNO：235、SEQIDNO：236、SEQIDNO：237、SEQIDNO：238、SEQIDNO：239、SEQIDNO：240、SEQIDNO：241、SEQIDNO：242、SEQIDNO：243、SEQIDNO：244、SEQIDNO：245、SEQIDNO：246、SEQIDNO：247、SEQIDNO：248、SEQIDNO：249、SEQIDNO：250、SEQIDNO：251、SEQIDNO：252、SEQIDNO：253、SEQIDNO：254、SEQIDNO：255、SEQIDNO：256、SEQIDNO：257、SEQIDNO：258、SEQIDNO：259、SEQIDNO：260、SEQIDNO：261、SEQIDNO：262、SEQIDNO：263、SEQIDNO：264、SEQIDNO：265、SEQIDNO：266、SEQIDNO：267、SEQIDNO：268、SEQIDNO：269、SEQIDNO：270、SEQIDNO：271、SEQIDNO：272、SEQIDNO：273、SEQIDNO：274、SEQIDNO：275、SEQIDNO：276、SEQIDNO：277、SEQIDNO：278、SEQIDNO：279、SEQIDNO：280、SEQIDNO：281、SEQIDNO：282、SEQIDNO：283、SEQIDNO：284、SEQIDNO：285、SEQIDNO：286、SEQIDNO：287、SEQIDNO：288、SEQIDNO：289、SEQIDNO：290、SEQIDNO：291、SEQIDNO：292、SEQIDNO：293、SEQIDNO：294、SEQIDNO：295、SEQIDNO：296、SEQIDNO：297、SEQIDNO：298、SEQIDNO：299、SEQIDNO：300、SEQIDNO：301、SEQIDNO：302、SEQIDNO：303、SEQIDNO：304、SEQIDNO：305、SEQIDNO：306、SEQIDNO：307、SEQIDNO：308、SEQIDNO：309、SEQIDNO：310、SEQIDNO：311、SEQIDNO：312和它们的组合，所述靶特异性引物的至少一种包含另外的碱基对，使得所述扩增导致将关于至少一种共用引物的结合序列加入至所述至少一种第一扩增子中；使用至少一种共用引物在第二次扩增中扩增所述至少一种第一扩增子以产生至少一种第二扩增子；以及将所述至少一种第二扩增子测序以鉴定和量化由所述第一次和第二次扩增产生的序列。列举的引物由发明人设计以提供对其各自RNA和/或DNA靶标的有效扩增。整组引物的使用有效地为个体产生详细的免疫状态谱。然而，当例如，特定的T细胞或B细胞的群体是特别感兴趣的目标时可能需要使用子集。
通过进一步解释，下面的实施例可以说明本发明的方法。在施用任一种疫苗之前可以从儿童取血样，每个儿童的那些血样在本发明的方法中用来建立“基线”免疫状态谱或个人免疫组库(PIR)，由其可以比较由以后几年期间所取的血样建立并通过本发明的方法分析的未来免疫细胞谱。对于每名儿童，未来样品可以利用来确定是否已经存在对试剂的暴露，所述暴露已经增殖了已知与疾病相关的细胞群，并且这可以用作未来发生疾病的风险的“标志物”。然后如此鉴定的个体可以被更密切地监测使得可能进行早期检测，并且可以在疾病过程中的较早期提供任何可利用的治疗选择。
例如，本发明的方法可以特别用于鉴定个体与自体免疫性疾病之间的共性，并且可以提供流行病学数据，该数据将更好地描述感染性因素和环境因素与疾病诸如心脏疾病、动脉粥样硬化、糖尿病和癌症之间的相关性，这提供发出疾病存在，或发生疾病的倾向的信号的生物标志物。
该方法还可以用于开发被动免疫治疗。例如，在暴露于传染原后，某些产生抗体的B细胞和/或T细胞增殖。本发明的方法能够鉴定例如，保护性抗体，并且那些抗体可以用于在需要被动免疫治疗的情况下提供此种治疗。
本发明的方法还可以提供实现靶向地去除具有不合乎需要的重排的细胞的能力，该方法提供了可以鉴定这样的细胞重排的方式。
本发明人已经鉴定和开发了用于本发明的方法中的靶特异性引物。T细胞特异性引物显示在表1中，抗体特异性引物显示在表2中，和HLA特异性引物显示在表3中。因此，该方法可以包括使用表1、表2和/或表3的引物的任意组合来扩增来自血样的RNA和/或DNA，并且更特别地来鉴定细胞群内的抗体、T细胞受体和HLA分子。例如，T细胞分布的分析可以利用表1(SEQIDNO：1-SEQIDNO：157)中列举的所有或部分引物。Ig的分析可以利用表2(SEQIDNO：158-SEQIDNO：225)中列举的所有或部分引物，和HLA分布的分析可以利用表3(SEQIDNO：159-SEQIDNO：312)中列举的所有或部分引物。
在tem-PCR反应中，重叠基因特异性引物被设计成在初始PCR循环期间富集靶标。此后，使用通用“超级”引物来扩增所有靶标。引物被命名为Fo(正向外侧)、Fi(正向内侧)、Ri(反向内侧)、Ro(反向外侧)、FS(正向超级引物)和RS(反向超级引物)，超级引物对于多种分子是共用的，这归因于在靶特异性引物的末端处加入了那些引物的结合位点。基因特异性引物(Fo、Fi、Ri和Ro)以非常低的浓度使用。不同的引物在三个主要阶段之一参与tem-PCR过程。首先，在“富集”阶段，给予低浓度的基因特异性引物以足够的时间来发现模板。对于每个目的靶标，取决于使用哪种引物，可以生成四种可能的产物：Fo/Ro、Fi/Ro、Fi/Ri和Fo/Ri。富集阶段典型地进行10个循环。在第二个，或“标记”阶段，退火温度升高至72℃，并且仅长度为40个核苷酸内侧引物(Fi和Ri)将起作用。在此标记阶段的10个循环后，所有PCR产物被通用超级引物序列“标记”。然后，在第三个“扩增”阶段，高浓度超级引物有效地起作用以扩增所有靶标并在该过程期间用生物素标记pCR产物。特异性探针可以与Luminex颜色涂覆珠共价连接。
为了扩增编码免疫球蛋白超家族分子的基因，本发明人基于公共领域中可获得的序列信息设计了嵌套引物。为了研究B细胞和T细胞VDJ重排，本发明人设计了用于扩增重排的和表达的RNA的引物。通常，一对嵌套正向引物由V基因设计，且一组反向嵌套引物由J或C基因设计。平均扩增子大小为250-350bp。例如，对于IgHV基因，存在有123个基因，它们可以分成7种不同的家族，并且本发明的引物被设计成家族特异性的。然而，如果对扩增的cDNA序列测序，则存在着足够的序列多样性，从而允许相同家族内的基因中的进一步分化。对于MHC基因座，目的是扩增基因组DNA。
本发明可以进一步借助于下面非限制性实施例来说明。
实施例
T细胞或B细胞重排位点的扩增
所有寡聚物使用1xTE重悬。除454A和454B以外的所有寡聚物重悬至100pmol/μL的浓度。454A和454B重悬至1000pmol/μL的浓度。454A和454B在功能上是相同的，均用作前面所述的共用引物，不同的序列用于追踪高通量测序步骤。
制备三种不同的引物混合物。αδ引物混合物包含82种引物(所有均为TRAV-C+TRDV-C)，βγ引物混合物包含79种引物(所有均为TRBVC和TRGV-C)，和B细胞引物混合物包含总计70种引物。Fo、Fi和Ri引物处于1pmol/μL的浓度。Ro引物处于5pmol/μL的浓度。454A和454B处于30pmol/μL的浓度。
三种不同的RNA样品定购自ALLCELLS(www.allcells.com)。所有样品稀释至4ng/μL的终浓度。使用的样品为：ALL-PB-MNC(获自急性淋巴细胞性白血病患者)、NPB-PanT细胞(正常T细胞)和NPB-B细胞(正常B细胞)。
使用Qiagen一步RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。每个样品含有下列成分：
10μLQiagen缓冲液
2μLDNTP′s
2μl酶
23.5μLdH2O
10μL适当的引物混合物
2.5μL适当的模板(总计10ngRNA)
使用下列的循环条件运行样品：
50℃30分钟
95℃15分钟
94℃30秒
15循环的
55℃1分钟
72℃1分钟
94℃15秒
6循环的
70℃1分30秒
94℃15秒
30循环的
55℃15秒
72℃15秒
72℃3分钟
4℃保持
置于图1a中所示凝胶上的样品的顺序为：(1)梯度标志物(ladder)(500bp为最大，以20bp的梯度降低，图1a中的中间明亮条带为200bp)；(2)含有10ngPanT细胞模板的α+δ引物混合物；(3)含有10ngPanT细胞模板的β+γ引物混合物；(4)含有10ngB细胞模板的B细胞引物混合物；(5)含有10ng全细胞(AllCell)模板的B细胞引物混合物；(6)含有10ng全细胞模板的α+δ引物混合物；(7)含有10ng全细胞模板的β+γ引物混合物；8.α+δ引物混合物空白；(9)β+γ引物混合物空白；(10)B细胞引物混合物空白；(11)电泳缓冲液空白。这些样品在预成型的ClearPAGESDS10％凝胶上使用1XClearPAGEDNA非变性电泳缓冲液进行电泳。
初步的试验显示由包含模板的PCR反应生成成片条带。成片条带表示生成了不同大小的PCR产物，其代表不同的VDJ重排的混合物。存在一些来自B细胞反应的背景扩增。对引物混合物的进一步改良使反应净化。
为了确定PCR产物是否真正地包含不同的VDJ重排，需要分离和测序单个克隆。代替使用常规的克隆方法，本发明人使用了不同的策略。由αδ混合物和βγ混合物产生的PCR产物(图1a中的2道和3道)稀释1∶1000，并且将2μl等分试样用作下面反应中的PCR模板。然后，代替使用靶向整个组库的引物混合物，使用一对特异性Fi和Ri引物(每种5pmol)来仅扩增一种特异性PCR产物。使用下面的循环条件来扩增样品：
95℃5分钟
30循环的
94℃30秒
72℃1分钟
72℃3分钟
4℃保持
使用QiagenPCR试剂盒来扩增产物。用于PCR的MasterMix包含下列成分：5μL10xPCR缓冲液，1μLdNTP，0.25μLHotStartTaqPlus，和39.75μLH2O。(对于用于12次反应的混合物：60μL10xPCR缓冲液，12μLdNTP，3μLHotStartTaqPlus，和477μLH2O。)
图1b中的凝胶照片显示下列反应的PCR产物：(1)梯度标志物；(2)含有αδPanTPCR产物的TRAV1Fi+TRACRi；(3)含有αδPanTPCR产物的TRAV2Fi+TRACRi(4)含有αδPanTPCR产物的TRAV3Fi+TRACRi；(5)含有αδPanTPCR产物的TRAV4Fi+TRACRi；(6)含有αδPanTPCR产物的TRAV5Fi+TRACRi；(7)含有αδPanTPCR产物的TRAV1Fi+TRACRi(8)含有αδPanTPCR产物的TRAV2Fi+TRACRi；(9)含有αδPanTPCR产物的TRAV3Fi+TRACRi；(10)含有αδPanTPCR产物的TRAV4Fi+TRACRi；(11)含有αδPanTPCR产物的TRAV5Fi+TRACRi；(12)PCR空白。作为Fi列举的引物为“正向内侧”引物，作为Fo列举的引物是“正向外侧”引物，Ri和Ro分别表示“反向内侧”和“反向外侧”引物。
如图1b所示，从每个反应中产生了单个PCR产物。从不同的反应中产生不同尺寸的条带。出于两种主要的原因，此PCR克隆方法是成功的--(1)此反应中使用的PCR模板是稀释的前次反应的PCR产物(1∶1000)，所述前次反应使用引物混合物来扩增所有可能的VDJ重排(例如，使用包含总计82种引物的引物混合物来扩增T细胞受体α和δ基因)和(2)在此“克隆”试验期间的每个反应中仅使用一对靶向特定的V基因的PCR引物。在每种情况下，获得单个克隆，并且鉴定与Fi引物相匹配的特定的T细胞受体V基因。
使用引物SEQIDNO：1-SEQIDNO：312对免疫细胞RNA测序
使用用对某些细胞类型特异的单克隆抗体包被的超顺磁聚苯乙烯珠(DynabeadsInvitrogenCorp.，Carlsbad，加利福尼亚)根据生产厂商的说明书进行Pan-T、pan-B和嗜中性粒细胞分离。抗CD3珠用来分离pan-T细胞，抗CD19珠用于分离pan-B细胞和抗CD15珠用于分离嗜中性粒细胞。分离的细胞重悬在300μlRNAProtect(Qiagen)试剂中，并用血细胞计数器计数。
T细胞亚群分离自正常的48岁亚洲男性患者。PMBC获自通过密度离心经FicollPrepPlus试剂在肝素钠中收集的40ml全血。Pan-T细胞使用磁珠分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Auburn，加利福尼亚)根据生产厂商的说明书分离自单核层。抗CD4和抗CD25珠用来分离调节性T细胞，抗CD56用于分离NKT细胞，抗CD8用于分离细胞毒T细胞，和抗CD4和抗CD294用于分离Th2细胞。Th1细胞经阴性选择分离。单独的40ml收集在肝素钠中的全血的样品用来获得初始(naive)、活化和记忆T细胞亚群。抗CD45RA珠用来分离初始T细胞，抗CD69用于分离活化的T细胞和抗CD45RO珠用于分离记忆T细胞。分离的细胞重悬在300μlRNAProtect试剂(Qiagen)中。细胞使用血细胞计数器计数。
使用QIAmpDNA微型试剂盒(Qiagen)使用生产厂商提供的试验方案从分离的嗜中性粒细胞进行DNA提取。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)根据生产厂商提供的试验方案从T细胞亚群提取RNA。提取的DNA和RNA的浓度使用Nanodrop技术(NanodropTechnologies，Wilmington，特拉华)测量。样品保存在-80℃。
根据本发明的方法使用嵌套式PCR进行RT-PCR以扩增多个靶标和靶特异性引物，从而将共用引物结合序列引入至第一次扩增反应中所得的扩增子中。然后共用引物在第二次扩增反应中使用，以指数性地扩增从第一次扩增反应中拯救的扩增子，同时保持每种扩增子的相对比率。使用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行PCR。类似地进行用于HLA分型的DNA扩增，但使用多重PCR试剂盒(Qiagen)。每种扩增子混合物使用Roche454测序平台进行高通量测序。
通过在不同时间点采样外周血中不同的淋巴细胞亚群，对一个单个体(正常的48岁亚洲男性)产生了超过160万个有效序列。另外，对于结肠癌、CLL、SLE和第二名健康患者(32岁白种男性)产生了170,734个有效序列。在此研究中产生的独特读数的数目与表1中的公共数据库中现有的独特读数的数目相比较。通过用′human[orgn]AND(immunoglobulin[titl]ORT-cellreceptor[titl])ANDmRNA[titl]′(‘人[orgn]和(免疫球蛋白[titl]或T细胞受体[titl])和mRNA[titl]’)的词条搜索Genbank核苷酸数据库汇编公共序列数据集。另外，使用Python脚本(Pythonscript)收集注解的IMGT/LIGM-DB(Brezinschek等，1995)cDNA序列。合并两个数据集，并且对任何冗余序列保持一个拷贝。
分析健康对照、CLL、结肠癌和SLE样品中V、和J基因片段的偏向性使用(Biasedusage)。在结肠癌样品和SLE样品中结构域使用的偏向性对TCRβ链非常突出，而在健康对照样品中结构域的使用十分正常，没有对于任何特定结构域的显著偏向性。显然结肠癌和SLE谱型不仅显示克隆增殖，而且证明还丧失了整体的多样性。
在来自正常患者的pan-T和pan-B群中见到的功能性种系V、J基因片段的分布表明87.2％的潜在组合具有观察到的序列。在此研究中仅没有观察到IGHV3-d，而在其他样品中以极低的频率观察到TRBV4-3、IGHV3-d、IGHV4-30-4和IGHV4-31和IGHL3-22。以前的研究没有揭示与IGHV3-d相关的任何cDNA序列，这表明IGHV3-d可能很少被使用。一些序列以很高的数目(例如，1000)存在，而另一些以显著较低的数目存在。本发明人认为较高的数目代表淋巴细胞克隆增殖，反映受试者中的真实免疫应答。正常个体中VH基因分布的研究以前已经发现使用的频率通常与种系复杂性类似，而许多免疫应答显示V、D和J基因片段的使用中的一定水平的偏向性。
表1
引物 序列 序列ID号
TRAV1Fo 5′-TGCACGTACCAGACATCTGG-3′ SEQ ID NO：1
TRAV1Fi AGGTCGTTTTTCTTCATTCC SEQ ID NO：2
TRAV2Fo TCTGTAATCACTCTGTGTCC SEQ ID NO：3
TRAV2Fi AGGGACGATACAACATGACC SEQ ID NO：4
TRAV3Fo CTATTCAGTCTCTGGAAACC SEQ ID NO：5
TRAV3Fi ATACATCACAGGGGATAACC SEQ ID NO：6
TRAV4Fo TGTAGCCACAACAACATTGC SEQ ID NO：7
TRAV4Fi AAAGTTACAAACGAAGTGGC SEQ ID NO：8
TRAV5Fo GCACTTACACAGACAGCTCC SEQ ID NO：9
TRAV5Fi TATGGACATGAAACAAGACC SEQ ID NO：10
TRAV6Fo GCAACTATACAAACTATTCC SEQ ID NO：11
TRAV6Fi GTTTTCTTGCTACTCATACG SEQ ID NO：12
TRAV7Fo TGCACGTACTCTGTCAGTCG SEQ ID NO：13
TRAV7Fi GGATATGAGAAGCAGAAAGG SEQ ID NO：14
TRAV8Fo AATCTCTTCTGGTATGTSCA SEQ ID NO：15
TRAV8Fi GGYTTTGAGGCTGAATTTA SEQ ID NO：16
TRAV9Fo GTCCAATATCCTGGAGAAGG SEQ ID NO：17
TRAV9Fi AACCACTTCTTTCCACTTGG SEQ ID NO：18
TRAV10Fo AATGCAATTATACAGTGAGC SEQ ID NO：19
TRAV10Fi TGAGAACACAAAGTCGAACG SEQ ID NO：20
TRAV11Fo TCTTAATTGTACTTATCAGG SEQ ID NO：21
TRAV11Fi TCAATCAAGCCAGAAGGAGC SEQ ID NO：22
TRAV12Fo TCAGTGTTCCAGAGGGAGCC SEQ ID NO：23
TRAV12Fi ATGGAAGGTTTACAGCACAG SEQ ID NO：24
TRAV13Fo ACCCTGAGTGTCCAGGAGGG SEQ ID NO：25
TRAV13Fi TTATAGACATTCGTTCAAAT SEQ ID NO：26
TRAV14Fo TGGACTGCACATATGACACC SEQ ID NO：27
TRAV14Fi CAGCAAAATGCAACAGAAGG SEQ ID NO：28
TRAV16Fo AGCTGAAGTGCAACTATTCC SEQ ID NO：29
TRAV16Fi TCTAGAGAGAGCATCAAAGG SEQ ID NO：30
TRAV17Fo AATGCCACCATGAACTGCAG SEQ ID NO：31
TRAV17Fi GAAAGAGAGAAACACAGTGG SEQ ID NO：32
TRAV18Fo GCTCTGACATTAAACTGCAC SEQ ID NO：33
TRAV18Fi CAGGAGACGGACAGCAGAGG SEQ ID NO：34
TRAV19Fo ATGTGACCTTGGACTGTGTG SEQ ID NO：35
TRAV19Fi GAGCAAAATGAAATAAGTGG SEQ ID NO：3611 -->
TRAV20Fo ACTGCAGTTACACAGTCAGC SEQ ID NO：37
TRAV20Fi AGAAAGAAAGGCTAAAAGCC SEQ ID NO：38
TRAV21Fo ACTGCAGTTTCACTGATAGC SEQ ID NO：39
TRAV21Fi CAAGTGGAAGACTTAATGCC SEQ ID NO：40
TRAV22Fo GGGAGCCAATTCCACGCTGC SEQ ID NO：41
TRAV22Fi ATGGAAGATTAAGCGCCACG SEQ ID NO：42
TRAV23Fo ATTTCAATTATAAACTGTGC SEQ ID NO：43
TRAV23Fi AAGGAAGATTCACAATCTCC SEQ ID NO：44
TRAV24Fo GCACCAATTTCACCTGCAGC SEQ ID NO：45
TRAV24Fi AGGACGAATAAGTGCCACTC SEQ ID NO：46
TRAV25Fo TCACCACGTACTGCAATTCC SEQ ID NO：47
TRAV25Fi AGACTGACATTTCAGTTTGG SEQ ID NO：48
TRAV26Fo TCGACAGATTCMCTCCCAGG SEQ ID NO：49
TRAV26Fi GTCCAGYACCTTGATCCTGC SEQ ID NO：50
TRAV27Fo CCTCAAGTGTTTTTTCCAGC SEQ ID NO：51
TRAV27Fi GTGACAGTAGTTACGGGTGG SEQ ID NO：52
TRAV29Fo CAGCATGTTTGATTATTTCC SEQ ID NO：53
TRAV29Fi ATCTATAAGTTCCATTAAGG SEQ ID NO：54
TRAV30Fo CTCCAAGGCTTTATATTCTG SEQ ID NO：55
TRAV30Fi ATGATATTACTGAAGGGTGG SEQ ID NO：56
TRAV34Fo ACTGCACGTCATCAAAGACG SEQ ID NO：57
TRAV34Fi TTGATGATGCTACAGAAAGG SEQ ID NO：58
TRAV35Fo TGAACTGCACTTCTTCAAGC SEQ ID NO：59
TRAV35Fi CTTGATAGCCTTATATAAGG SEQ ID NO：60
TRAV36Fo TCAATTGCAGTTATGAAGTG SEQ ID NO：61
TRAV36Fi TTTATGCTAACTTCAAGTGG SEQ ID NO：62
TRAV38Fo GCACATATGACACCAGTGAG SEQ ID NO：63
TRAV38Fi TCGCCAAGAAGCTTATAAGC SEQ ID NO：64
TRAV39Fo TCTACTGCAATTATTCAACC SEQ ID NO：65
TRAV39Fi CAGGAGGGACGATTAATGGC SEQ ID NO：66
TRAV40Fo TGAACTGCACATACACATCC SEQ ID NO：67
TRAV40Fi ACAGCAAAAACTTCGGAGGC SEQ ID NO：68
TRAV41Fo AACTGCAGTTACTCGGTAGG SEQ ID NO：69
TRAV41Fi AAGCATGGAAGATTAATTGC SEQ ID NO：70
TRACRo GCAGACAGACTTGTCACTGG SEQ ID NO：71
TRACRi AGTCTCTCAGCTGGTACACG SEQ ID NO：72
TRBV1Fo AATGAAACGTGAGCATCTGG SEQ ID NO：7312 -->
TRBV1Fi CATTGAAAACAAGACTGTGC SEQ ID NO：74
TRBV2Fo GTGTCCCCATCTCTAATCAC SEQ ID NO：75
TRBV2Fi TGAAATCTCAGAGAAGTCTG SEQ ID NO：76
TRBV3Fo TATGTATTGGTATAAACAGG SEQ ID NO：77
TRBV3Fi CTCTAAGAAATTTCTGAAGA SEQ ID NO：78
TRBV4Fo GTCTTTGAAATGTGAACAAC SEQ ID NO：79
TRBV4Fi GGAGCTCATGTTTGTCTACA SEQ ID NO：80
TRBV5Fo GATCAAAACGAGAGGACAGC SEQ ID NO：81
TRBV5aFi CAGGGGCCCCAGTTTATCTT SEQ ID NO：82
TRBV5bFi GAAACARAGGAAACTTCCCT SEQ ID NO：83
TRBV6aFo GTGTGCCCAGGATATGAACC SEQ ID NO：84
TRBV6bFo CAGGATATGAGACATAATGC SEQ ID NO：85
TRBV6aFi GGTATCGACAAGACCCAGGC SEQ ID NO：86
TRBV6bFi TAGACAAGATCTAGGACTGG SEQ ID NO：87
TRBV7Fo CTCAGGTGTGATCCAATTTC SEQ ID NO：88
TRBV7aFi TCTAATTTACTTCCAAGGCA SEQ ID NO：89
TRBV7bFi TCCCAGAGTGATGCTCAACG SEQ ID NO：90
TRBV7CFi ACTTACTTCAATTATGAAGC SEQ ID NO：91
TRBV7dFi CCAGAATGAAGCTCAACTAG SEQ ID NO：92
TRBV9Fo GAGACCTCTCTGTGTACTGG SEQ ID NO：93
TRBV9Fi CTCATTCAGTATTATAATGG SEQ ID NO：94
TRBV10Fo GGAATCACCCAGAGCCCAAG SEQ ID NO：95
TRBV10Fi GACATGGGCTGAGGCTGATC SEQ ID NO：96
TRBV11Fo CCTAAGGATCGATTTTCTGC SEQ ID NO：97
TRBV11Fi ACTCTCAAGATCCAGCCTGC SEQ ID NO：98
TRBV12Fo AGGTGACAGAGATGGGACAA SEQ ID NO：99
TRBV12aFi TGCAGGGACTGGAATTGCTG SEQ ID NO：100
TRBV12bFi GTACAGACAGACCATGATGC SEQ ID NO：101
TRBV13Fo CTATCCTATCCCTAGACACG SEQ ID NO：102
TRBV13Fi AAGATGCAGAGCGATAAAGG SEQ ID NO：103
TRBV14Fo AGATGTGACCCAATTTCTGG SEQ ID NO：104
TRBV14Fi AGTCTAAACAGGATGAGTCC SEQ ID NO：105
TRBV15Fo TCAGACTTTGAACCATAACG SEQ ID NO：106
TRBV15Fi AAAGATTTTAACAATGAAGC SEQ ID NO：107
TRBV16Fo TATTGTGCCCCAATAAAAGG SEQ ID NO：108
TRBV16Fi AATGTCTTTGATGAAACAGG SEQ ID NO：109
TRBV17Fo ATCCATCTTCTGGTCACATG SEQ ID NO：110
TRBV17Fi AACATTGCAGTTGATTCAGG SEQ ID NO：111
TRGV9Fo AGCCCGCCTGGAATGTGTGG SEQ ID NO：150
TRGV9Fi GCACTGTCAGAAAGGAATCC SEQ ID NO：15114 -->
TRGV10Fo AAGAAAAGTATTGACATACC SEQ ID NO：152
TRGV10Fi ATATTGTCTCAACAAAATCC SEQ ID NO：153
TRGV11Fo AGAGTGCCCACATATCTTGG SEQ ID NO：154
TRGV11Fi GCTCAAGATTGCTCAGGTGG SEQ ID NO：155
TRGCRo GGATCCCAGAATCGTGTTGC SEQ ID NO：156
TRGCRi GGTATGTTCCAGCCTTCTGG SEQ ID NO：157
表2
引物 序列 序列ID号
IgHV1aFo AGTGAAGGTCTCCTGCAAGG SEQ ID NO：158
IgHV1bFo AGTGAAGGTTTCCTGCAAGG SEQ ID NO：159
IgHV1aFi AGTTCCAGGGCAGAGTCAC SEQ ID NO：160
IgHV1bFi AGTTTCAGGGCAGGGTCAC SEQ ID NO：161
IgHV1cFi AGTTCCAGGAAAGAGTCAC SEQ ID NO：162
IgHV1dFi AATTCCAGGACAGAGTCAC SEQ ID NO：163
IgHV2Fo TCTCTGGGTTCTCACTCAGC SEQ ID NO：164
IgHV2Fi AAGGCCCTGGAGTGGCTTGC SEQ ID NO：165
IgHV3aFo TCCCTGAGACTCTCCTGTGC SEQ ID NO：166
IgHV3bFo CTCTCCTGTGCAGCCTCTGG SEQ ID NO：167
IgHV3cFo GGTCCCTGAGACTCTCCTGT SEQ ID NO：168
IgHV3dFo CTGAGACTCTCCTGTGTAGC SEQ ID NO：169
IgHV3aFi CTCCAGGGAAGGGGCTGG SEQ ID NO：170
IgHV3bFi GGCTCCAGGCAAGGGGCT SEQ ID NO：171
IgHV3cFi ACTGGGTCCGCCAGGCTCC SEQ ID NO：172
IgHV3dFi GAAGGGGCTGGAGTGGGT SEQ ID NO：173
IgHV3eFi AAAAGGTCTGGAGTGGGT SEQ ID NO：174
IgHV4Fo AGACCCTGTCCCTCACCTGC SEQ ID NO：175
IgHV4Fi AGGGVCTGGAGTGGATTGGG SEQ ID NO：176
IgHV5Fo GCGCCAGATGCCCGGGAAAG SEQ ID NO：177
IgHV5Fi GGCCASGTCACCATCTCAGC SEQ ID NO：178
IgHV6Fo CCGGGGACAGTGTCTCTAGC SEQID NO：179
IgHV6Fi GCCTTGAGTGGCTGGGAAGG SEQ ID NO：180
IgHV7Fo GTTTCCTGCAAGGCTTCTGG SEQ ID NO：181
IgHV7Fi GGCTTGAGTGGATGGGATGG SEQ ID NO：182
IgHJRo ACCTGAGGAGACGGTGACC SEQ ID NO：183
IgHJ1Ri CAGTGCTGGAAGTATTCAGC SEQ ID NO：184
IgHJ2Ri AGAGATCGAAGTACCAGTAG SEQ ID NO：185
IgLC1-7Ro GCTCCCGGGTAGAAGTCACT SEQ ID NO：224
IgLC1-7Ri AGTGTGGCCTTGTTGGCTTG SEQ ID NO：225
表3

Claims (3)

1.一种产生人的免疫状态谱的方法，其中所述方法包括在一次反应中提供多种靶多核苷酸扩增的多重聚合酶链式反应，并且所述方法包括：
(a)使用嵌套靶特异性正向外侧、正向内侧、反向内侧和反向外侧引物，在第一次扩增中，富集来自人受试者的白细胞样品中的DNA和/或RNA从而产生第一扩增子，并且使用包含另外的核苷酸的内侧引物将共用引物的结合位点标记至所述第一扩增子中；
(b)从所述第一次扩增中拯救所述第一扩增子；
(c)使用至少一个共用引物，在第二次扩增中，扩增所述第一扩增子以产生第二扩增子；以及
(d)将所述第二扩增子测序以鉴定和量化表现重排的多个DNA序列，从而建立免疫状态谱，
其中所述嵌套靶特异性正向外侧、正向内侧、反向内侧和反向外侧引物选自下列各项组成的组：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57、SEQIDNO:58、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:79、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:84、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:101、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112、SEQIDNO:113、SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116、SEQIDNO:117、SEQIDNO:118、SEQIDNO:119、SEQIDNO:120、SEQIDNO:121、SEQIDNO:122、SEQIDNO:123、SEQIDNO:124、SEQIDNO:125、SEQIDNO:126、SEQIDNO:127、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139、SEQIDNO:140、SEQIDNO:151、SEQIDNO:152、SEQIDNO:153、SEQIDNO:154、SEQIDNO:155、SEQIDNO:156、SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185、SEQIDNO:186、SEQIDNO:187、SEQIDNO:188、SEQIDNO:189、SEQIDNO:190、SEQIDNO:191、SEQIDNO:192、SEQIDNO:193、SEQIDNO:194、SEQIDNO:195、SEQIDNO:196、SEQIDNO:197、SEQIDNO:198、SEQIDNO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:202、SEQIDNO:203、SEQIDNO:204、SEQIDNO:205、SEQIDNO:206、SEQIDNO:207、SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:211、SEQIDNO:212、SEQIDNO:213、SEQIDNO:214、SEQIDNO:215、SEQIDNO:216、SEQIDNO:217、SEQIDNO:218、SEQIDNO:219、SEQIDNO:220、SEQIDNO:221、SEQIDNO:222、SEQIDNO:223、SEQIDNO:224、SEQIDNO:225、SEQIDNO:226、SEQIDNO:227、SEQIDNO:228、SEQIDNO:229、SEQIDNO:230、SEQIDNO:231、SEQIDNO:232、SEQIDNO:233、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:236、SEQIDNO:237、SEQIDNO:238、SEQIDNO:239、SEQIDNO:240、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、SEQIDNO:244、SEQIDNO:245、SEQIDNO:246、SEQIDNO:247、SEQIDNO:248、SEQIDNO:249、SEQIDNO:250、SEQIDNO:251、SEQIDNO:252、SEQIDNO:253、SEQIDNO:254、SEQIDNO:255、SEQIDNO:256、SEQIDNO:257、SEQIDNO:258、SEQIDNO:259、SEQIDNO:260、SEQIDNO:261、SEQIDNO:262、SEQIDNO:263、SEQIDNO:264、SEQIDNO:265、SEQIDNO:266、SEQIDNO:267、SEQIDNO:268、SEQIDNO:269、SEQIDNO:270、SEQIDNO:271、SEQIDNO:272、SEQIDNO:273、SEQIDNO:274、SEQIDNO:275、SEQIDNO:276、SEQIDNO:277、SEQIDNO:278、SEQIDNO:279、SEQIDNO:280、SEQIDNO:281、SEQIDNO:282、SEQIDNO:283、SEQIDNO:284、SEQIDNO:285、SEQIDNO:286、SEQIDNO:287、SEQIDNO:288、SEQIDNO:289、SEQIDNO:290、SEQIDNO:291、SEQIDNO:292、SEQIDNO:293、SEQIDNO:294、SEQIDNO:295、SEQIDNO:296、SEQIDNO:297、SEQIDNO:298、SEQIDNO:299、SEQIDNO:300、SEQIDNO:301、SEQIDNO:302、SEQIDNO:303、SEQIDNO:304、SEQIDNO:305、SEQIDNO:306、SEQIDNO:307、SEQIDNO:308、SEQIDNO:309、SEQIDNO:310、SEQIDNO:311、SEQIDNO:312和它们的组合。
2.权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：(e)将所述DNA序列输入至数据库中以提供可以存储在计算机、服务器或其他电子存储设备上的数据，(f)将鉴定与所述序列对应的个体的信息和特征的数据集作为可以存储在计算机、服务器或其他电子存储设备上的数据输入，以及(g)对于一个或多个个体评价步骤(e)和步骤(f)的数据，以确定在所述序列和与所述序列对应的所述个体的一个或多个特征之间是否存在相关性。
3.一种用于产生免疫应答谱的方法，其中所述方法包括在一次反应中提供多种靶多核苷酸扩增的多重聚合酶链式反应，并且所述方法包括：
使用选自由以下各项组成的组的靶特异性引物扩增来自人白细胞样品的RNA和/或DNA以进行第一次扩增，产生第一扩增子：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57、SEQIDNO:58、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:79、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:84、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:101、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112、SEQIDNO:113、SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116、SEQIDNO:117、SEQIDNO:118、SEQIDNO:119、SEQIDNO:120、SEQIDNO:121、SEQIDNO:122、SEQIDNO:123、SEQIDNO:124、SEQIDNO:125、SEQIDNO:126、SEQIDNO:127、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139、SEQIDNO:140、SEQIDNO:151、SEQIDNO:152、SEQIDNO:153、SEQIDNO:154、SEQIDNO:155、SEQIDNO:156、SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185、SEQIDNO:186、SEQIDNO:187、SEQIDNO:188、SEQIDNO:189、SEQIDNO:190、SEQIDNO:191、SEQIDNO:192、SEQIDNO:193、SEQIDNO:194、SEQIDNO:195、SEQIDNO:196、SEQIDNO:197、SEQIDNO:198、SEQIDNO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:202、SEQIDNO:203、SEQIDNO:204、SEQIDNO:205、SEQIDNO:206、SEQIDNO:207、SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:211、SEQIDNO:212、SEQIDNO:213、SEQIDNO:214、SEQIDNO:215、SEQIDNO:216、SEQIDNO:217、SEQIDNO:218、SEQIDNO:219、SEQIDNO:220、SEQIDNO:221、SEQIDNO:222、SEQIDNO:223、SEQIDNO:224、SEQIDNO:225、SEQIDNO:226、SEQIDNO:227、SEQIDNO:228、SEQIDNO:229、SEQIDNO:230、SEQIDNO:231、SEQIDNO:232、SEQIDNO:233、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:236、SEQIDNO:237、SEQIDNO:238、SEQIDNO:239、SEQIDNO:240、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、SEQIDNO:244、SEQIDNO:245、SEQIDNO:246、SEQIDNO:247、SEQIDNO:248、SEQIDNO:249、SEQIDNO:250、SEQIDNO:251、SEQIDNO:252、SEQIDNO:253、SEQIDNO:254、SEQIDNO:255、SEQIDNO:256、SEQIDNO:257、SEQIDNO:258、SEQIDNO:259、SEQIDNO:260、SEQIDNO:261、SEQIDNO:262、SEQIDNO:263、SEQIDNO:264、SEQIDNO:265、SEQIDNO:266、SEQIDNO:267、SEQIDNO:268、SEQIDNO:269、SEQIDNO:270、SEQIDNO:271、SEQIDNO:272、SEQIDNO:273、SEQIDNO:274、SEQIDNO:275、SEQIDNO:276、SEQIDNO:277、SEQIDNO:278、SEQIDNO:279、SEQIDNO:280、SEQIDNO:281、SEQIDNO:282、SEQIDNO:283、SEQIDNO:284、SEQIDNO:285、SEQIDNO:286、SEQIDNO:287、SEQIDNO:288、SEQIDNO:289、SEQIDNO:290、SEQIDNO:291、SEQIDNO:292、SEQIDNO:293、SEQIDNO:294、SEQIDNO:295、SEQIDNO:296、SEQIDNO:297、SEQIDNO:298、SEQIDNO:299、SEQIDNO:300、SEQIDNO:301、SEQIDNO:302、SEQIDNO:303、SEQIDNO:304、SEQIDNO:305、SEQIDNO:306、SEQIDNO:307、SEQIDNO:308、SEQIDNO:309、SEQIDNO:310、SEQIDNO:311、SEQIDNO:312和它们的组合，所述靶特异性引物包含另外的碱基对，使得所述扩增导致将关于至少一种共用引物的结合序列加入至所述第一扩增子中；
从所述第一次扩增中拯救所述第一扩增子；
使用至少一种共用引物在第二次扩增中扩增所述第一扩增子以产生第二扩增子；以及将所述第二扩增子测序以鉴定和量化由所述第一次和第二次扩增产生的序列。
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