CN105940115B

CN105940115B - 恶性疟原虫青蒿素耐药性的分子标记物

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Publication number: CN105940115B
Application number: CN201480062113.2A
Authority: CN
Inventors: F·阿里埃; O·普加朗; D·迈纳德; F·贝诺特-维卡尔; J·贝格哈恩; B·维特科斯基; J-C·巴拉勒; C·博契尔; N·基姆
Original assignee: Guo Jiakeyanzhongxin; Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur du Cambodge
Current assignee: Guo Jiakeyanzhongxin; Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur du Cambodge
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2034-11-14
Also published as: EP3068903B1; BR112016011046A2; AU2014349828A1; JP2020043873A; JP6667445B2; KR20160119753A; EP3068903A1; CN105940115A; ZA201602703B; WO2015071759A1; US20210198755A1; ES2720728T3; JP2016537030A; US11732312B2; AU2014349828B2; CA2928014A1; WO2015071759A9; KR102283408B1; US10900093B2; HK1225757A1

Abstract

K13‑推进器多态性是用于追踪耐受ART的恶性疟原虫(P.falciparum)的出现和扩散的有用的分子标记物。本发明包括用于检测疟原虫(Plasmodium)(例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum))并对疟原虫进行基因分型的方法、组合物和试剂盒。该方法、组合物和试剂盒可以被用于检测样品中突变的K‑13推进器核酸或蛋白的存在与否。

Description

恶性疟原虫青蒿素耐药性的分子标记物

发明背景

在柬埔寨出现的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)对青蒿素衍生物(ART)的耐药性威胁到全世界防治和消除疟疾的努力^1,2。如之前已发生的耐受氯喹和耐受磺胺多辛/乙胺嘧啶的寄生虫那样^3-5，耐受ART的寄生虫从柬埔寨西部向大湄公河次区域以及向非洲传播的风险是极其令人担忧的。临床上ART耐药性被定义为降低的寄生虫清除率^1,6-10，被表示为增加的寄生虫清除半衰期^11,12，或者在基于青蒿素的组合治疗(ACT)²的第三天显微镜下可检测的寄生虫的残留率(persistence)。半衰期参数与体外环状体期存活测定(RSA⁰ ^-3h)和离体RSA¹³的结果强烈相关，它们测量环状体期幼小的寄生虫在药理学相关暴露(700nM暴露6h)于双氢青蒿素(DHA)(所有ART的主要代谢物)下的存活率。但是，目前缺乏分子标记物阻碍了在已记录耐受ART的寄生虫的区域中对这些寄生虫的重点遏制，并且妨碍了在ACT仍然是价格最实惠、最有效的抗疟药的其他地方中对这些寄生虫的快速检测。为了检测和监测ART耐药性的扩散，需要广泛使用的分子标记物。

最近恶性疟原虫分离物的全基因组分析已经提供了在ART耐药性的地理区域中阳性选择的最新证据^9,14-16。尽管该临床表型的寄生虫遗传率大于50％，仍然没有鉴定出可靠的分子标记物。一个可能的解释是，寄生虫清除半衰期不仅由分离寄生虫对ART的固有敏感性确定，而且由其ART治疗时的发育阶段和宿主相关参数(诸如药动力学和免疫力)确定¹⁷。最近在体内寄生虫清除半衰期和体外RSA^0-3h存活率之间呈现失调数据的患者中强调了该问题¹³。此外，全基因组关联研究(GWAS)受到与寄生虫群体结构有关的不确定性的困扰。最近柬埔寨西部针对耐受ART的寄生虫的几个高度分化亚群的证据¹⁵表明可能发生独特的紧急事件。发现分子标记物的可选策略是分析由体外高剂量ART筛选存活的、适应实验室的寄生虫克隆特异性获得的突变，并使用该信息引导分析来自以下区域的临床寄生虫分离物中的多态性：在时间水平和地理水平充分记载ART耐药性的区域。在此，我们使用该策略探索柬埔寨的临床ART耐药性的分子特征(molecular signature)，该表型首次在柬埔寨得到报道^1,8。

基于青蒿素的组合治疗(ACT)是全球疟疾防治努力的关键方面。Nkhoma等人，JID208:346-349(2013)。但是，耐受青蒿素的疟疾的出现已经威胁到这些努力。同上。目前没有用于可靠测量ART耐药性的体外测试。同上。因此，已经测量了ART治疗之后血液寄生虫下降的患者中ART的敏感性。同上。该方法昂贵、费力又费时。同上。

目前缺乏分子标记物阻碍了在已有耐药性记录的疫源地中的遏制努力，并且妨碍了在ART仍然是价格最实惠和最有效的抗疟药的其他地方病区域中对ART耐药性的快速检测。为了大范围监测ART耐药性，迫切需要与ART耐药性相关的分子标记物。本发明满足了本领域的这一需要。

发明概述

本发明包括用于检测疟原虫(Plasmodium)并对疟原虫进行基因分型的方法、组合物和试剂盒。在一个实施方案中，该方法包括提供含有疟原虫的样品；以及检测样品中突变的K-13推进器(propeller)核酸或蛋白的存在。优选地，疟原虫是恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)。

在一个实施方案中，通过测序检测样品中突变的K-13推进器核酸的存在。在一个实施方案中，通过PCR检测样品中突变的K-13推进器核酸的存在。

本发明包括用于检测感染患者中疟原虫感染的方法、组合物和试剂盒。在一个实施方案中，该方法包括提供患者的血液样品并检测血液样品中野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在与否。该方法可以包括确定疟原虫是否具有野生型或突变K-13推进器核酸或蛋白序列。

优选地，疟原虫是恶性疟原虫。

在一个实施方案中，通过测序检测样品中突变的K-13推进器核酸的存在。在一个实施方案中，通过PCR检测样品中野生型或突变的K-13推进器核酸的存在与否。

在一个实施方案中，用于检测疟原虫感染的试剂盒包含用于扩增K-13推进器核酸的引物和用于检测扩增产物的试剂。

在一个实施方案中，试剂盒含有用于检测突变K-13推进器核酸的探针。优选地，探针以荧光标记或酶标记进行标记。

在各种实施方案中，试剂盒检测编码Y493H、R539T、I543T和C580Y等位基因的突变K-13推进器核酸。

在一个实施方案中，试剂盒检测编码Y493H、R539T、I543T或C580Y等位基因的突变K-13推进器核酸。

在各种实施方案中，试剂盒包含以下引物中的至少一种：

5'-cggagtgaccaaatctggga-3’(SEQ ID NO:9)；

5'-gggaatctggtggtaacagc-3’(SEQ ID NO:10)；

5'-cgccagcattgttgactaat-3’(SEQ ID NO:11)；以及

5'-gcggaagtagtagcgagaat-3’(SEQ ID NO:12)；

或者试剂盒包含以下引物中的至少一种：

5'-cggagtgaccaaatctggga-3’(SEQ ID NO:9)；

5'-gggaatctggtggtaacagc-3’(SEQ ID NO:10)；

5'-cgccagcattgttgactaat-3’(SEQ ID NO:11)；

5'-gcggaagtagtagcgagaat-3’(SEQ ID NO:12)；

5'-gccaagctgccattcatttg-3’(SEQ ID NO:13)；以及

5'-gccttgttgaaagaagcaga-3’(SEQ ID NO:14)。

在各种实施方案中，试剂盒检测编码F446I、N458Y、C469Y、Y493H、K503N、R539T、I543T、P553L、P574L、A578S、C580Y和D584V等位基因的突变K13推进器核酸。

在各种实施方案中，试剂盒检测编码F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突变K13推进器核酸。

在各种实施方案中，试剂盒包含以下引物对中的至少一种：

PCR引物对1

5’aggtggatttgatggtgtagaat 3’(正向)(SEQ ID NO:15)

5’catacacctcagtttcaaataaagc 3’(反向)(SEQ ID NO:16)

PCR引物对2

5’aatttcttatacgtttttggtggtaa 3’(正向)(SEQ ID NO:17)

5’ctctacccatgctttcatacgat 3’(反向)(SEQ ID NO:18)

PCR引物对3

5’ggatatgatggctcttctattataccg 3’(正向)(SEQ ID NO:19)

5’acttcaatagaatttaatctctcacca 3’(反向)(SEQ ID NO:20)

PCR引物对4

5’atgtcattggtggaactaatggt 3’(正向)(SEQ ID NO:21)

5’ttaaatggttgatattgttcaacg 3’(反向)(SEQ ID NO:22)

PCR引物对5

5’ttcaggagcagcttttaattacc 3’(正向)(SEQ ID NO:23)

5’ctggtgaaaagaaatgacatgaa 3’(反向)(SEQ ID NO:24)

PCR引物对6

5’ccttgttgaaagaagcagaattt 3’(正向)(SEQ ID NO:25)

5’attcaatacagcacttccaaaataa 3’(反向)(SEQ ID NO:26)

在各种实施方案中，试剂盒包含与以下SNP之一杂交的至少一种探针：

本发明包括用于检测含有疟原虫的生物样品中野生型K13推进器核酸或突变K13推进器核酸的存在的方法，该方法包括：

提供含有疟原虫DNA的生物样品；

任选地从生物样品提取DNA；

使疟原虫DNA与至少一种引物对接触，所述引物对与K13推进器核酸在100-300bp的长度范围特异性杂交，以及在嵌入式染料的存在下进行PCR反应；

使扩增产物经历解链步骤；

通过分析扩增产物的解链曲线确定突变等位基因或野生型等位基因的存在。

在一些实施方案中，该方法包括检测编码F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突变K13推进器核酸。

本发明包括用于检测含有疟原虫的生物样品中突变K13推进器核酸的存在的方法，该方法包括通过PCR反应扩增突变K13推进器核酸，以及使扩增的核酸与特异性针对突变K13推进器核酸的探针接触。

在一些实施方案中，探针与荧光珠或生物素结合。

在一些实施方案中，该方法包括使探针与突变K13推进器域核酸结合，以及用与结合的K13推进器域核酸结合的第二探针检测结合的K13推进器域核酸。

在一些实施方案中，突变的K13推进器核酸或蛋白的存在表示患者感染了耐受青蒿素衍生物的疟原虫。

在一些实施方案中，该方法包括向感染了耐受青蒿素衍生物的疟原虫的所述患者给予比常规方案更持久的基于青蒿素衍生物的治疗，和/或给予基于另一种抗疟药的治疗，优选奎宁、氯喹或甲氟喹。

在一些实施方案中，该方法包括向感染了耐受青蒿素衍生物的疟原虫的所述患者给予基于新的抗疟药的治疗，并在给予所述治疗之后重复步骤a)和b)，其中突变的K13推进器核酸或蛋白的不存在表示该患者不再感染耐受青蒿素衍生物的疟原虫并且所述治疗对于耐受青蒿素衍生物的疟原虫是有效的。

附图的简要说明

图1–F32-ART5中突变的时间获取。通过全基因组测序在五个时间点(灰色箭头)对连续120个循环暴露于增加的青蒿素浓度的F32-坦桑尼亚寄生虫¹⁸进行了分析。显示了给定数量的药物压力循环之后突变的位置(方框)。示出了通过PCR检测的三个突变的最早时间点(黑色箭头)，

表示PF3D7_1343700，*表示PF3D7_0213400和#表示PF3D7_1115700。圆圈分别表示F32-ART5和F32-TEM寄生虫的RSA^0-3h存活率。

图2–通过K13-推进器等位基因分层(stratified)的RSA^0-3h中柬埔寨分离寄生虫的存活率。通过挖掘全基因组序列数据(n＝21)或对PCR产物进行测序(n＝28)获得基因型。突变寄生虫具有显著高于野生型寄生虫的RSA^0-3h存活率：野生型(n＝17，中位值0.16％，IQR0.09-0.24，范围0.04-0.51)；C580Y(n＝26，中位值14.1％，IQR 11.3-19.6，范围3.8-27.3，野生型对C580Y的P<10^-6，Mann-Whitney U检验)；R539T(n＝5，中位值24.2％，IQR12.6-29.5，范围5.8-31.3，野生型对R539T的P<10^-3)；Y493H(51.4％)；以及I543T(58.0％)。星号表示的是对照3D7寄生虫的RSA^0-3h存活率(0.04％)。

图3–2001-2012年中在六个柬埔寨省里886份寄生虫分离物中K13-推进器等位基因频率。从存档血液样品通过对PCR产物进行测序获得基因型。所有突变等位基因携带单个非同义SNP(颜色编码，野生型、C580Y、R539T、Y493H和I543T的颜色编码与图2中相同)。在拜林市、马德望省、菩萨省和桔井省中观察到野生型等位基因频率随着时间显著降低(Fisher精确检验)(参见实施例)。

图4–A、2009-2010年中菩萨省和腊塔纳基里省中寄生虫分离物的寄生虫清除半衰期与K13-推进器等位基因的相关性。野生型寄生虫比C580Y(7.19h，6.47-8.31，n＝51，P<10^-6，Mann-Whitney U检验)、R539T(6.64h，6.00-6.72，n＝6，P<10^-6)或Y493H(6.28h，5.37-7.14，n＝21，P<10^-6)寄生虫具有更短的半衰期(中位值3.30h，IQR 2.59-3.95，n＝72)。C580Y寄生虫的半衰期显著长于Y493H寄生虫的半衰期(P＝0.007)。B、相同的150份寄生虫分离物的寄生虫清除半衰期、KH亚群¹⁵和K13-推进器等位基因的相关性。显示了通过KH分组和K13-推进器等位基因分层的菩萨省(方块)和腊塔纳基里省(三角)的半衰期(如上图A中进行颜色编码)。通过K13-推进器等位基因分层的中位半衰期是：[KH1：野生型(2.88)和Y493H(6.77)；KH2：C580Y(7.13)和Y493H(4.71)；KH3：野生型(3.65)、C580Y(8.73)和R539T(6.65)；KH4：Y493H(6.37)；以及KHA：野生型(4.01)、C580Y(7.09)、Y493H(6.18)和R539T(5.73)]。

图5–比较F32-ART5和F32-TEM的全基因组序列的SNP读出(calling)算法(a)，以及在F32-TEM和F-32ART5中7个候选基因中SNP的序列和覆盖度的不同(b)。

图6–2011-2012年中柬埔寨K13-推进器等位基因的地理分布。

饼状图显示柬埔寨十个省的300份寄生虫分离物中的K13-推进器等位基因频率。饼的大小与分离物的数量成比例，并且如图3中对不同等位基因进行颜色编码。突变K13-推进器等位基因的频率(95％CI)为：拜林市(Pailin)(95％,88-99,n＝84)、马德望省(Battambang)(93％,87-99,n＝71)、菩萨省(Pursat)(89％,67-99,n＝19)、贡布省(Kampot)(83％,52-98,n＝12)、西哈努克市(Kampong Som)(71％,29-96,n＝7)、奥多棉吉省(Oddar Meanchey)(76％,58-89,n＝33)、柏威夏省(Preah Vihear)(16％,3-40,n＝19)、桔井省(Kratie)(71％,44-90,n＝17)、蒙多基里省(Mondulkiri)(67％,9-99,n＝3)和腊塔纳基里省(Ratanakiri)(6％,1-19,n＝35)。

图7–在柬埔寨八个省中野生型K13-推进器等位基因频率与ACT治疗后第3天阳性患病率之间的相关性。

针对野生型K13-推进器等位基因的频率绘制第3天阳性频率。数据源自在柬埔寨八个省中在2010-2012年中针对恶性疟原虫疟疾用ACT进行治疗的患者(图4)：拜林市(n＝86，2011年WHO疗效研究，青蒿琥酯-甲氟喹)；菩萨省(n＝32，2012年WHO疗效研究，双氢青蒿素-哌喹)；奥多棉吉省(n＝32，2010年NAMRU-2疗效研究，青蒿琥酯-甲氟喹)；西哈努克市/磅士卑省(Kampong Som/Speu)(n＝7，2012年WHO疗效研究，双氢青蒿素-哌喹)；马德望省(n＝18，2012年WHO疗效研究，双氢青蒿素-哌喹)；桔井省(n＝15，2011年WHO疗效研究，双氢青蒿素-哌喹)；柏威夏省(n＝19，2011年WHO疗效研究，双氢青蒿素-哌喹)；腊塔纳基里省(n＝32，2010年WHO疗效研究，双氢青蒿素-哌喹)。Spearman的秩相关性系数(8个位置):r＝-0.99,95％CI-0.99to-0.96,P<0.0001。

图8–恶性疟原虫K13和人KEAP1蛋白质之间同源性(A)和K13-推进器域的三维结构模型(B)的示意图。

A、预测的PF3D7_1343700蛋白与人Keap1同源性的示意图。与Keap1类似，PF3D7_1343700含有BTB/POZ域和C-末端6-叶片推进器，其组装成由四个反平行β片层组成的kelch模体。B、K13-推进器域的三维结构模型，其显示从N-末端至C-末端编号1-6的六个kelch叶片。

蛋白的K13-推进器和kelch域与经解析的三维结构(包括人Keap1^46,47)之间的氨基酸同一性水平使得我们能够对K13-推进器的三维结构进行建模并对在ART压力下选择的突变进行作图(表4)。由建模器特异性模型/折叠标准的可靠性确认K13-推进器三维模型的准确性(参见实施例)。我们预测，K13-推进器折叠成由C-末端β-片层和N-末端叶片之间的相互作用封闭^46,48形成的六叶片β-推进器结构⁴⁸。在图9中，第一域具有三个β-片层，第四个片层(the 4^th one)由额外的称为β'1的C-末端β-片层贡献。

在人肺癌⁴⁶和高血压⁴⁷中影响叶片内部和叶片之间相互作用的各种突变使得人Keap1kelch推进器支架变得不稳定。通过球表示各种突变的位置。以深灰色表示F32-ART5中突变的M476残基。如同在人Keap1中所观察到的突变一样^46,47，预测许多K13-推进器突变改变推进器的结构或改变表面电荷，并且因此改变该蛋白质的生物学功能。重要的是，在柬埔寨观察到的两个主要突变C580Y和R539T均为非保守的并分别位于有组织的二级结构中：位于叶片4的β-片层(经预测在此改变该支架的完整性)和位于叶片3的表面。

Keap1的kelch推进器域涉及如同大多数含有kelch的模块一样的蛋白质-蛋白质相互作用⁴³。Keap1是诱导型Nrf2依赖的细胞保护性应答的负调节子，其在稳定状态下螯合细胞质中的Nrf2。一旦发生氧化应激，Nrf2/Keap1复合物被破坏，Nrf2易位至细胞核，在那里它诱导细胞保护性ARE依赖基因的转录^49,50。我们推断恶性疟原虫中的PF3D7_1343700可能具有类似功能，使得K13-推进器的突变损害它与未知蛋白质伴侣的相互作用，从而产生去调控的抗氧化/细胞保护性应答。当血红蛋白的消化和代谢最高时，恶性疟原虫的抗氧化应答在裂殖体晚期过程中最大。它的调控仍然知之甚少，并且在疟原虫基因组中没有能够鉴定出Nrf2的直系同源物。

图9A和B–PF3D7_1343700的参考核酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ ID NO:2)编码序列(3D7-型)和突变位置。

图9A颜色编码：深灰色，疟原虫特异性(1-225)和顶复门(Apicomplexa)特异性(225-345)位置；浅灰色，BTB/POZ域。在图9B中以黑色方块框住在9.3版的PlasmoDB(http://www.plasmodb.org/plasmo/)中报道的多态性密码子的位置和在本研究中观察到的那些。注意，大多数报道的多态性位于与来自冈比亚的一份分离物中观察到的E621D隔开的N-末端域中(参考文献44)。六个单个kelch域分别位于第443-473、474-526、527-573、574-614、615-666和667-726位残基。

图10A-C–来自七个疟原虫种的PF3D7_1343700直系同源物的蛋白序列的ClustalW-比对。

代码：

F-XP_001350158恶性疟原虫(PF3D7_1343700)(SEQ ID NO:2)

V-XP_001614215间日疟原虫(P.vivax)Sal1(SEQ ID NO:3)

C-XP_004223579食蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)(SEQ ID NO:4)

K-XP_002259918诺氏疟原虫(P.knowlesi)(SEQ ID NO:5)

B-XP_674094柏氏疟原虫(P.berghei)(SEQ ID NO:6)

Y-XP_730901约氏疟原虫(P.yoelii)(SEQ ID NO:7)

PCHAS_136130夏氏疟原虫(P.chabaudi)(SEQ ID NO:8)

恶性疟原虫多态性残基有灰色阴影。

图11–实时PCR–HRM：检测突变的K13推进器等位基因对野生型K13推进器等位基因。核酸序列是SEQ ID NO:1的第1261-2181位nt。氨基酸序列是SEQ ID NO:2的第421-726位aa。

就K13基因的推进器域的序列设计了六对引物以扩增所有域并通过箭头标出。

图12A-B–A)通过实时PCR–HRM检测突变的K13推进器等位基因对野生型K13推进器等位基因(SEQ ID NO:1的第1279-2127位nt)。

B)六个引物对的序列，它们在K13推进器域的核酸序列上的位置和扩增产物的大小。(SEQ ID NO:27-38)。

图13–通过

多重测定(多重连接酶检测反应-荧光微球测定)通过PCR反应和探针杂交检测突变的K13推进器等位基因中20个。核酸序列是SEQ ID NO:1的第1261-2181位nt。氨基酸序列是SEQ ID NO:2的第421-726位aa。

黑色箭头显示用于PCR反应的引物，

引物F 5’gccttgttgaaagaagcaga 3’(SEQ ID NO:14)

引物R 5'-gccaagctgccattcatttg-3’(SEQ ID NO:13)

设计特异性引物(浅灰色和深灰色)以检测K13推进器域中的单核苷酸多态性(SNP)。浅灰色探针是等位基因特异性的并与荧光珠结合。对于每个浅灰色位置，有两个探针，一个在3’端具有突变的核苷酸，一个在3’端具有野生型核苷酸。在保守序列区域中设计深灰色探针并将其与生物素结合。

SNP列表：

表1–用于扩增F32-ART5中含有非同义单核苷酸多态性的基因的引物的序列。显示了正向引物(SEQ ID NO 39-45)和反向引物(SEQ ID NO 46-52)。

表2–在5年非连续有效暴露于增加浓度的青蒿素过程中与F32-TEM谱系相比在F32-ART5中获得的八个非同义单核苷酸多态性的说明。

^#3D7-型序列；在亲本F32-坦桑尼亚系中也观察到相同的密码子序列。

^*用于相应的药物压力循环过程中的青蒿素(ART)剂量。

^a在Takala-Harrison等人¹⁶的选择中排在前列的特征的染色体位置中发现的基因。

表3–在F32-ART5寄生虫中突变基因已报道的特征。

表4–用于研究K13-推进器多态性的存档血液样品收集的地理起源和年份。

表5–在2001-2012年收集的柬埔寨恶性疟原虫分离物中和在冈比亚(参考文献42)中的K13-推进器中观察到的多态性。

*在F32-ART中观察到，而在柬埔寨中未观察到。

**在冈比亚中报道过(参考文献42)，而在柬埔寨在未观察到。

表6–在K13-推进器和KH亚群(参考文献15)中观察到的多态性之间的相关性，其观察于在柬埔寨菩萨省(n＝103)和腊塔纳基里省(n＝47)中于2009-2010年收集的150份恶性疟原虫分离物中。

表7–在亚洲和非洲的K13推进器域中鉴定的最频繁的突变列表。

表8–如Witkowski等人⁴⁵所述将来自柬埔寨(于2010年和2011年收集)的五十份临床恶性疟原虫分离物适应于体外培养。显示了RSA和多态性。

发明详述

恶性疟原虫在东南亚对青蒿素衍生物的耐药性威胁全世界的疟疾控制和清除活动。为了监测青蒿素耐药性的扩散，迫切需要分子标记物。在此，我们对来自非洲的耐受青蒿素的寄生虫和来自柬埔寨的临床分离寄生虫使用全基因组测序，将PF3D7_1343700kelch推进器域(‘K13-推进器’)中的突变与青蒿素耐药性在体外和体内相关联。耐药性流行的柬埔寨省份中突变K13-推进器等位基因簇和显性突变K13-推进器等位基因的增加的频率与柬埔寨西部最近耐药性的扩散相关。突变等位基因存在、体外寄生虫存活率和体内寄生虫清除率之间强烈的相关性表明，K13-推进器突变是青蒿素耐药性的重要决定因素。K13-推进器多态性构成有效用于大范围监控努力的分子标记物，所述努力是在大湄公河次区域中遏制青蒿素耐药性并阻止其全球扩散。

鉴定ART耐药性的候选分子标记物

耐受ART的F32-ART5寄生虫系是通过以下方法被选择出来的：在青蒿素剂量增加、125个循环的方案下培养ART敏感性F32-坦桑尼亚克隆5年¹⁸。以分别为460x和500x的平均核苷酸覆盖度获得F32-ART5和F32-TEM(在没有青蒿素的情况下培养的同胞克隆)的全基因组序列。与F32-TEM相比，在F32-ART5中没有鉴定出缺失的基因。在排除以下内容后比较了F32-ART5和F32-TEM的外显子组：(i)来自高度可变的、多基因家族的基因(var、rifin和stevor)，(ii)具有寄生虫系的平均覆盖度低于25％的覆盖度的位置，(iii)被发现在F32-ART5中混合的单核苷酸多态性(SNP)，只要能够预期所获得的ART耐药性突变在5年的连续压力之后被固定于样品中，(iv)在F32-ART5和ART敏感的3D7寄生虫株之间共享的SNP以及(v)同义SNP(图5)。

该分析在七个基因中鉴定出八个突变，其随后通过对PCR产物进行Sanger测序得到确认(表1)。与F32-TEM、F32-坦桑尼亚或3D7相比，每个基因在F32-ART5中带有一个突变密码子(表2)。表3列出了关于基因表达和蛋白质生物学功能的信息。据之前的报道，这些基因中仅有一个基因半胱氨酸蛋白酶falcipain 2a(PF3D7_1115700)与体外对ART的应答相关¹⁹。为了确定每个突变何时出现在F32-ART5谱系中，我们分析了处于各种药物压力循环中的寄生虫的全基因组序列(图1)。该分析显示，在ART耐药性急剧增加的过程中，首先获得PF3D7_0110400D56V和PF3D7_1343700M476I突变，并在此后保持稳定。重要的是，这两个突变的出现与环状体期存活测定(RSA^0-3h)的存活率从小于0.01％至12.8％的增加相关。随后对PF3D7_1343700基因座的PCR分析检测到在30个药物压力循环后的M476I突变，这与此后观察到RSA^0-3h存活率的激增一致。在选择的较后的阶段逐步出现的其他SNP：PF3D7_0213400(68个循环)；PF3D7_1115700(98个循环)；PF3D7_1302100、PF3D7_1459600和PF3D7_1464500(120个循环)(表2)。这些数据表明，在RSA^0-3h中PF3D7_1343700M476I突变增加了F32-坦桑尼亚对DHA的耐药性。

为了探索这些突变是否与柬埔寨的ART耐药性相关，我们通过挖掘在2010-2011年收集的49份适应培养的寄生虫分离物的全基因组或Sanger序列研究了所有七个基因中的序列多态性(参见实施例)。我们基于它们差异RSA^0-3h存活率(表8)选择这些分离物并将它们的序列与对照寄生虫系3D7、89F5²⁰和K1992的序列进行比较(参见实施例)。对于所有寄生虫分离物，三个基因(PF3D7_0110400、PF3D7_0213400和PF3D7_1302100)编码野生型序列。其他四个基因显示群体内多样性，具有之前报道过的或新的SNP(表8)。PF3D7_1115700具有11个SNP，它们与RSA^0-3h存活率不相关(P＝0.06,Kruskal-Wallis检验)。PF3D7_1459600具有6个SNP，它们与存活率不相关(P＝0.65)。PF3D7_1464500具有之前在来自东南亚的更早的分离物(包括ART-敏感性Dd2系²¹)中的12个SNP，可能反映了地理特征。这些SNP也显示与存活率没有显著相关性(P＝0.42)。因此，没有进一步研究这六个基因。

相反，PF3D7_1343700多态性显示与RSA^0-3h存活率具有显著相关性(图2)。实际上，RSA^0-3h存活率在具有野生型(中位值0.17％，范围0.06-0.51％，n＝16)或突变(18.8％，3.8-58％，n＝33)K13-推进器等位基因的寄生虫分离物之间实质上不同(P<10^-4，Mann-Whitney U检验)(表8)。观察到四个突变等位基因，每个等位基因在C-末端K13-推进器域的kelch重复内带有单个非同义SNP，即分别位于重复#2、#3、#3和#4内的Y493H、R539T、I543T和C580Y。K1992和ART敏感性89F5系二者均携带野生型K13-推进器。在K-13推进器多态性和其他候选基因中的多态性之间没有相关性(表8)。基于这些观察结果和F32-ART5在kelch重复#2中获得的M476I，我们研究了在柬埔寨K13-推进器多态性是否是ART耐药性的分子特征。

突变K13-推进器等位基因在柬埔寨的出现和扩散

在过去十年，ART耐药性的流行已经在柬埔寨西部省份稳定增加，但在该国的其他地方还没有²。为了测试K13-推进器突变的时空分布是否与ART耐药性的时空分布相关，我们对2001-2012年患有疟疾的柬埔寨患者的存档寄生虫分离物的K13-推进器进行测序(表4)。比较了来自六个省份的数据(n＝886)：在西部的拜林市、马德望省和菩萨省，ART耐药性已经建立^1,6,8,22，在东南部的桔井省，最近几年ART耐药性已经增加²，在北部的柏威夏省和东北部的腊塔纳基里省，在该时间段期间实际上没有ART耐药性的证据²。该分析总共揭示了17个突变等位基因，包括三个高频(≥5％)等位基因(C580Y、R539T和Y493H)。在所有三个西部省份中野生型序列的频率随时间显著降低，但在柏威夏省和腊塔纳基里省中则没有。在拜林市和马德望省中，C580Y等位基因的频率从2001-2002年至2011-2012年显著增加，表明其快速侵入群体并在这些区域接近固定(图3)。

为了进一步研究K13-推进器多态性在柬埔寨的地理多样性，我们扩展了我们的序列分析以包括来自2011-2012年的另外四个省份的数据(n＝55，西哈努克市、贡布省、蒙多基里省和奥多棉吉省)(表4)。尽管观察到大量突变(图9和表5)，C580Y等位基因占在2011-2012年中观察到的所有突变等位基因的85％(189/222)(图6)。这个地图概括了带有K13-推进器中的单个非同义突变的寄生虫的升高的频率(74％,222/300)及其分布的地理差异。重要的是，不同省中突变等位基因的分布频率与用ACT治疗疟疾的患者中第3天阳性的分布频率匹配(Spearman's r＝0.99,95％CI 0.96-0.99,P<0.0001)——被认为是暗示临床ART耐药性的标志(图7)。

K13-推进器多态性、耐受ART的亚群和临床ART耐药性之间的关系

为了确认K13-推进器多态性是临床ART耐药性的分子标记物，我们首先鉴定了来自菩萨省和腊塔纳基里省的163个患者，其中我们测量了2009-2010年中寄生虫清除半衰期(范围1.58-11.53h)⁶，并且之前基于全基因组序列数据的起源分析(ancestry analysis)将寄生虫分配到KH亚群(KH1、KH2、KH3、KH4或KHA)¹⁵。排除了具有混合基因型(野生型和一个或多个突变K13-推进器等位基因)的十三个患者。在剩下的150个患者中，72个患者携带具有野生型等位基因的寄生虫，其他患者携带在K13-推进器中仅具有单个非同义SNP的寄生虫：C580Y(n＝51)、R539T(n＝6)以及Y493H(n＝21)(表6)。具有野生型寄生虫的患者的寄生虫清除半衰期(中位值3.30h，IQR 2.59-3.95)显著短于具有C580Y(7.19h,6.47-8.31,P<10^-6,Mann-Whitney U检验)、R539T(6.64h,6.00-6.72,P<10^-4)或Y493H(6.28h,5.37-7.14,P<10^-6)寄生虫的患者(图4A)。而且，携带C580Y寄生虫的患者的寄生虫清除半衰期显著长于具有Y493H寄生虫的患者(P＝0.007,Mann-Whitney U检验)。这些数据表明，在用ART治疗的疟疾患者中，C580Y、R539T和Y493H鉴定清除慢的寄生虫。

由于KH2、KH3、KH4和KHA寄生虫比KH1寄生虫具有更长的半衰期¹⁵，我们推测K13-推进器中的等位基因变异解释这些差异。在150份寄生虫中，55、26、14、12和43个分别被分类为KH1、KH2、KH3、KH4和KHA。三个K13-推进器等位基因与KH分组强烈相关：KH1的96％(53/55)、KH2的96％(25/26)和KH4的100％(12/12)的寄生虫分别携带野生型、C580Y和Y493H等位基因(表6)。尽管KH3寄生虫(n＝14)携带野生型、C580Y和R539T等位基因，在KH1、KH2或KH4寄生虫中没有观察到R539T。与预期的一样，KHA寄生虫具有混合的等位基因组成。重要的是，K13-推进器突变比KH分组更精确地鉴定清除慢的寄生虫(图4B)，这证实了在柬埔寨中K13-推进器多态性与临床ART耐药性的相关性部分独立于KH亚群的遗传背景。在KH1组(n＝55)内，具有野生型寄生虫的患者的寄生虫清除半衰期(n＝53，中位值2.88h，IQR 2.52-3.79)显著短于具有Y493H寄生虫的患者(n＝2，中位值6.77h，P＝0.02，Mann-Whitney U检验)。在KH3亚群内(n＝14)，具有野生型寄生虫的患者中的半衰期(n＝3，中位值3.65h)短于具有C580Y(n＝7，中位值8.73h，IQR 7.35-9.06，P＝0.02)或者R539T(n＝4，6.65h，6.29-6.80，P＝0.03)寄生虫的患者。

如F32-ART5谱系在RSA^0-3h中存活于药理学相关暴露于DHA的能力所示，随着F32-ART5谱系产生ART耐药性，它获得了K13-推进器突变。在F32-ART5的5年选择期间，推断与ART耐药性相关的基因(Pfcrt^23,24,Pftctp^25,26,Pfmdr1^8,27,28,Pfmrp1^27-29和ABC转运蛋白³⁰)或编码推断的ART目标的基因(PfATPase6 ^31,32和Pfubcth–P.chabaudi ubp1的直系同源物^33,34)没有突变，并且没有观察到Pfmdr1扩增^35-40。另外，除了由Takala-Harrison等人鉴定的、位于连锁不平衡窗口的PF3D7_1343700和PF3D7_1459600之外¹⁶，使用群体遗传学方法最近鉴定的所有候选ART耐药性基因^14,40,41在F32-ART5谱系中均保持不变。这些发现使我们在柬埔寨自然循环的寄生虫中鉴定了另外17个单独的K13-推进器突变。这些突变中的几个突变与柬埔寨ART耐药性的时空分布强烈相关，体外对DHA应答的寄生虫存活率增加，并且体内对ART治疗的寄生虫清除半衰期长。F32-ART5中突变的其他六个基因中没有一个与柬埔寨寄生虫分离物的RSA^0-3h存活率相关。

K13-推进器多态性满足ART耐药性的分子标记物的定义，有以下几个原因：(i)在柬埔寨西部出现ART耐药性的十年期间在该区域已经有野生型寄生虫的渐进性丧失；(ii)在已充分建立ART耐药性的柬埔寨省份中突变寄生虫聚集，而在罕见ART耐药性的省份中则不太普遍；(iii)PF3D7_1343700位于由Cheeseman等人¹⁴作为在最近阳性选择之下鉴定的35-kb基因座上游5.9kb，并且在由Takala-Harrison等人¹⁶概括的选择中排在前列的特征区域内；(iv)多个突变(均为非同义突变)存在于K13-推进器中，反映这是阳性选择而不是搭便车效应或者遗传漂变；(v)突变发生在恶性疟原虫的高度保守的域中，只有一个非同义SNP记载于来自非洲的单独的寄生虫分离物中⁴²；(vi)在柬埔寨观察到的所有多态性均是新的，并且除了一个(V568G)之外所有的均发生于在疟原虫种之间严格保守的位置上(图9和图10)，表明对该蛋白质强烈的结构和功能约束；(vii)三个最流行的K13-推进器突变分别在个别寄生虫分离物和疟疾患者水平上与体外RSA^0-3h存活率和体内寄生虫清除半衰期强烈相关；以及(viii)突变等位基因频率与ACT治疗后第3天阳性患病率在柬埔寨人群体水平上强烈相关。

基于与其他kelch推进器域的同源性，我们预期所观察到的K13-推进器突变使得域支架不稳定并改变其功能。PF3D7_1343700的C-末端部分编码六个kelch模体，其见于大量具有各种各样的细胞功能的蛋白质^43,44。鉴于ART衍生物的毒性主要基于它们的氧化促进剂(pro-oxidant)活性，所报道的一些含有kelch的蛋白质在调控对外部应激的细胞保护和蛋白质降解应答中的作用特别吸引人。K13-推进器显示与涉及基于泛素的蛋白质降解的人KLHL12和KLHL2以及涉及细胞对氧化应激的适应的KEAP1具有同源性(图8)。显然，未来需要进行工作以描绘K13的正常功能和各种突变的影响。突变体和野生型寄生虫中等位基因的交换研究可以帮助定义不同遗传背景下K13-推进器多态性对RSA^0-3h存活率的贡献。实际上，特别令人担忧的是，少至两个突变(即K13-推进器M476I和PF3D7_0110400D56V)就足以赋予F32-坦桑尼亚(其具有典型的非洲遗传背景)ART耐药性。由于具有突变K13-推进器的柬埔寨寄生虫表现出宽范围的RSA^0-3h存活率(3.8％-58％)和寄生虫清除半衰期(4.5-11.5h)，需要进一步研究以鉴定ART耐药性另外的遗传决定因素，其可能位于最近所鉴定的被强烈选择的区域^16，14。在这种情形下，在带有相同K13-推进器突变的寄生虫中，分析作为数量性状的RSA^0-3h存活率可以帮助鉴定涉及ART耐药性的另外的遗传基因座。

总之，K13-推进器多态性是用于追踪耐受ART恶性疟原虫的出现和扩散的有用的分子标记物。

对疟原虫进行基因分型的方法

本发明包括用于对疟原虫(特别是恶性疟原虫)进行基因分型的方法。在体外进行的该方法包括检测生物样品中野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在与否的步骤。之前已经从患者获得所述样品，并且其特别是血液样品。在一个优选的实施方案中，该方法包括提供含有疟原虫的生物学样品并检测该样品中野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在与否。通过本领域的常规技术检测野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白。例如，可以使用实施例中或本文其他地方所描述的技术。

生物学样品有利地为血液样品。

可以通过本领域已知的许多技术检测野生型或突变的K-13推进器核酸，诸如测序、杂交或扩增测定。

在本发明的情形中，“野生型恶性疟原虫K-13推进器核酸”是指具有SEQ ID NO:1的序列的核酸或者编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的变体核酸序列。在本发明的情形中，“野生型恶性疟原虫K-13推进器蛋白”是指具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质。其他野生型疟原虫K-13推进器蛋白示于图10中。

在本发明的情形中，“突变恶性疟原虫K-13推进器核酸”与“突变的恶性疟原虫K-13推进器核酸”同义并且是指与SEQ ID NO:1的核酸序列具有一个或多个差异的核酸序列，其导致与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少一个氨基酸的差异。优选地，根据本发明的突变恶性疟原虫K-13推进器核酸在羧基-末端的K13-推进器域的kelch重复内带有单个非同义单核苷酸多态性(SNP)。更优选地，单个非同义SNP是以下SNP之一：

在本发明的情形中，“突变恶性疟原虫K-13推进器蛋白”与“突变的恶性疟原虫K-13推进器蛋白”同义并且是指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有一个或多个差异的氨基酸序列。与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有的一个或多个差异是恶性疟原虫K-13推进器蛋白的羧基-末端的K13-推进器域的kelch重复内一个或多个突变氨基酸。

优选的突变恶性疟原虫K-13推进器蛋白具有图9或13中所示的突变中的一个或多个突变。

更优选的突变恶性疟原虫K-13推进器蛋白具有选自图9或13中所示的突变中的单个突变。

还根据上文提供的SNP列表定义这些突变。

在各种实施方案中，该方法包括检测生物学样品中野生型或突变的K-13推进器蛋白的存在与否。这可以通过使用在野生型和突变K-13推进器蛋白之间区分的特异性抗体来进行。可以将这些抗体与患者的样品接触，可以通过检测免疫反应的存在与否确定野生型或突变的K-13推进器蛋白的存在与否。优选地，该方法包括ELISA测定。

在一个优选的实施方案中，该方法包括提供含有疟原虫的样品；并检测样品中突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在。优选地，通过测序或通过PCR检测样品中突变的K-13推进器核酸的存在。

优选地，疟原虫选自恶性疟原虫,间日疟原虫(Plasmodium vivax),Plasmodiumovale curtisi,Plasmodium ovale wallikeri,三日疟原虫(Plasmodium malariae),诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi),巴西疟原虫(Plasmodium brasilianum),食蟹猴疟原虫(Plasmodium cynomolgi),Plasmodium cynomolgi bastianellii,猪尾猴疟原虫(Plasmodium inui),Plasmodium rhodiani,Plasmodium schweitzi,Plasmodiumsemiovale,Plasmodium simium,伯氏疟原虫(Plasmodium berghei),约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)和夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)。

本发明包括用于对疟原虫进行基因分型的方法。优选地，该方法区分青蒿素敏感的疟原虫(具有野生型K13等位基因)和耐受青蒿素的疟原虫(具有突变K13等位基因)。

本发明包括用于检测K13推进器域核酸序列中至少一个突变的体外方法。本发明包括用于检测含有疟原虫的生物学样品中存在突变K13推进器核酸的方法，其包括将K13推进器核酸与特异性针对突变K13推进器的探针接触并检测探针与K13推进器核酸的结合。可以通过本领域常规技术检测探针与K13推进器核酸的结合。例如，可以使用本文所描述的任何技术。示例性突变体和探针被描绘于实施例15和图13中。优选地，探针大小为至少15、20、25或30bp。更优选地，它们大小为15-20、15-25、15-30、20-25或25-30nt。

在一些实施方案中，探针与荧光珠结合。在一些实施方案中，该方法包括使探针与突变K13推进器域核酸结合并检测结合的K13推进器域核酸具有与结合的K13推进器域核酸结合的探针。在一些实施方案中，在检测之前扩增K13推进器核酸。

在一个实施方案，疟原虫的核酸经历K13推进器域核酸序列的扩增。在各种实施方案中，扩增K13推进器域核酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个片段。所扩增片段的大小可为至少50、75、100、125、150、175或200nt到至少75、100、125、150、175、200、250或300nt。用于该扩增的引物可以是本文所列的任意引物。

优选地，扩增方法是PCR，更优选为实时PCR、PCR-HRM(高分辨率DNA解链)(参见Andriantsoanirina等人Journal of Microbiological Methods,78:165(2009))或与基于荧光微球(

微球)的连接酶检测反应偶联的PCR。这最后一种方法允许进行多重测定以同时检测几个突变的K13推进器等位基因。

其他优选的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)(例如Wu和Wallace,Genomics 4,560(1989)、Landegren等人，Science 241,1077(1988)和Barringer等人，Gene 89:117(1990))、转录扩增(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173(1989)和WO88/10315)、自主序列复制(Guatelli等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,1874(1990)和WO90/06995)、目标多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)和基于核酸的序列扩增(NABSA)(美国专利号5,130,238、5,409,818、5,554,517和6,063,603)。可以使用的其他扩增方法被描述于美国专利号5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中。上述关于核酸扩增的参考文献通过引用就其中用于每个扩增方法中的扩增的具体反应条件的公开内容而具体并入。

在一个实施方案中，该方法包括提供疟原虫核酸，PCR扩增疟原虫核酸中K13推进器域核酸序列的至少一个片段，并检测K13推进器域核酸序列中的至少一个突变。本发明包括用于检测含有疟原虫的生物样品中突变K13推进器核酸的存在的方法，其包括通过PCR反应扩增突变K13推进器核酸，并使扩增的核酸与特异性针对突变K13推进器的探针接触。示例性突变体和探针被描绘于实施例15和图13中。优选地，探针大小为至少15、20、25或30bp。

在一个实施方案中通过高分辨率DNA解链检测突变。在各种实施方案中，扩增K13推进器域核酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个片段并通过高分辨率DNA解链评估突变的存在。更优选地，扩增K13推进器域核酸序列的6个片段并通过高分辨率DNA解链评估突变的存在。

在一个实施方案中，该方法包括提供含有疟原虫的DNA的生物学样品；任选地从生物学样品提取DNA；将疟原虫的DNA与至少一对引物接触，所述引物与K13推进器核酸特异性杂交，优选在100-300bp范围的距离上，并进行PCR反应，优选在嵌入式染料的存在下进行。优选地，扩增产物经历解链步骤并产生扩增产物的解链曲线。解链步骤可以允许通过分析扩增产物的解链曲线确定突变等位基因或野生型等位基因的存在。

在一个实施方案中，通过特异性探针检测突变，设计该特异性探针以检测K13推进器域中的单核苷酸多态性(SNP)。在一个实施方案中，等位基因特异性探针与固相基质结合，优选珠，最优选荧光珠。探针可以特异性针对K13推进器域中的突变或者特异性针对野生型K13推进器域。探针可以结合(即捕获)突变或野生型K13推进器域核酸。然后可以用探针检测结合的(即捕获的)K13推进器域核酸，该探针与结合的(即捕获的)K13推进器域核酸结合。优选地，测定是基于荧光微球(

微球)。示例性突变体和探针被描绘于实施例15和图13中。优选地，探针大小为至少15、20、25或30bp。优选地，探针包括实施例15和图13中列出的突变之一。

在各种实施方案中，使用至少一种具有选自SEQ ID NO 15-26的核苷酸序列的引物扩增K13推进器域核酸的至少一个片段。优选地，用于扩增的一个或多个引物组选自以下引物对：

PCR引物对1：

5’AGGTGGATTTGATGGTGTAGAAT 3’(正向)(SEQ ID NO:15)

5’CATACACCTCAGTTTCAAATAAAGC 3’(反向)(SEQ ID NO:16)

PCR引物对2：

5’AATTTCTTATACGTTTTTGGTGGTAA 3’(正向)(SEQ ID NO:17)

5’CTCTACCCATGCTTTCATACGAT 3’(反向)(SEQ ID NO:18)

PCR引物对3

5’GGATATGATGGCTCTTCTATTATACCG 3’(正向)(SEQ ID NO:19)

5’ACTTCAATAGAATTTAATCTCTCACCA 3’(反向)(SEQ ID NO:20)

PCR引物对4

5’ATGTCATTGGTGGAACTAATGGT 3’(正向)(SEQ ID NO:21)

5’TTAAATGGTTGATATTGTTCAACG 3’(反向)(SEQ ID NO:22)

PCR引物对5

5’TTCAGGAGCAGCTTTTAATTACC 3’(正向)(SEQ ID NO:23)

5’CTGGTGAAAAGAAATGACATGAA 3’(反向)(SEQ ID NO:24)

PCR引物对6

5’CCTTGTTGAAAGAAGCAGAATTT 3’(正向)(SEQ ID NO:25)

5’ATTCAATACAGCACTTCCAAAATAA 3’(反向)(SEQ ID NO:26)。

在各种实施方案中，扩增K13推进器域核酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个片段并评估突变的存在。更优选地，扩增K13推进器域核酸序列的6个片段并通过高分辨率DNA解链评估突变的存在。优选地，所检测的突变选自以下突变(从/至)：

最优选地，所检测的突变是以下突变中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或所有的突变：

监测ART耐药性的方法

本发明包括用于监测疟原虫的ART耐药性的方法。在一个优选的实施方案中，该方法包括生长疟原虫，将疟原虫与青蒿素接触，以及检测K-13推进器核酸或蛋白中的突变。优选地，将疟原虫在体外生长，优选地如van Schalkwyk等人，Malaria Journal 2013,12:320中所述，其通过引用并入本文。

在一个实施方案中，该方法包括生长疟原虫，将疟原虫与青蒿素接触，以及在多个时间点对K-13推进器核酸或蛋白进行测序。

在一个实施方案中，该方法包括提供疟原虫的多个样品(来自单个或多个地理区域)，以及检测K-13推进器核酸或蛋白中的突变。

检测疟原虫感染的方法

本发明包括用于检测疟原虫感染和诊断感染的患者中的感染的方法。可以通过提供患者的细胞样品对患者进行诊断。在一个优选的实施方案中，该方法包括提供患者的细胞样品并检测细胞样品中野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在与否。

通过本领域的常规技术检测野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白。例如，可以使用本文所描述的任何技术。

细胞样品可以是从含有疟原虫的患者获得的任何细胞样品。优选地，通过抽血产生细胞样品。细胞样品优选为血液样品。可以进一步处理血液样品以在体外培养样品中的疟原虫。例如，可以使用van Schalkwyk等人，Malaria Journal 2013,12:320中所描述的技术。

在一个实施方案中，该方法包括提供患者的血液样品；任选地在体外培养样品中的疟原虫，以及检测细胞样品中野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在与否。

在一个实施方案中，该方法包括提供患者的血液样品并检测样品中野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在与否。优选地，通过测序或通过PCR检测样品中突变的K-13推进器核酸的存在。

优选地，核酸测序被用于检测细胞样品中野生型或突变的K-13推进器核酸的存在与否。可以采用本领域已知的任何测序方法。本文使用的术语“测序”被广义使用并且是指本领域技术人员已知的任何技术，包括但不限于Sanger双脱氧终止法测序、全基因组测序、通过杂交测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行特征测序(MPSS)、通过可逆染料终止子测序、双向(paired-end)测序、near-term测序、外切核酸酶测序、通过连接测序、短读数测序、单分子测序、合成测序、实时测序、反向终止子测序、纳米孔测序、454测序、Solexa基因组分析仪测序、SOLiD(R)测序、MS-PET测序、质谱及其组合。在具体的实施方案中，本发明的方法适于运行在ABI PRISM(R)377DNA测序仪、ABI PRISM(R)310,3100,3100-Avant,3730或3730x1基因分析仪、ABI PRISM(R)3700DNA分析仪，或Applied Biosystems的SOLiD(TM)系统(所有均来自AppliedBiosystems)、基因组测序仪20系统(Roche Applied Science)上。

优选地，细胞样品的疟原虫中的K-13推进器具有图9或13或表7中所示的突变中的一个或多个突变。

在一个实施方案中，该方法包括检测编码图9或13或表7中所示的任意突变的任意核酸序列。可以通过本领域已知的许多技术具体检测这些序列，诸如测序、杂交或扩增测定。

例如，扩增方法可以是RCA、MDA、NASBA、TMA、SDA、LCR、b-DNA、PCR(所有形式包括RT-PCR)、RAM、LAMP、ICAN、SPIA、QB-复制酶、或Invader。优选的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)扩增。参见例如PCR Technology:Principles and Applications for DNAAmplification(Ed.H.A.Erlich,Freeman Press,NY,N.Y.,1992)；PCR Protocols:A Guideto Methods and Applications(Eds.Iinis等人,Academic Press,San Diego,Calif.,1990)；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19,4967(1991)；Eckert等人,PCR Methods andApplications 1,17(1991)PCR(Eds.McPherson等人,IRL Press,Oxford)；以及美国专利号4,683,202、4,683,195,4,800,159、4,965,188和5,333,675。更优选的PCR方法是实时PCR、PCR-HRM(高分辨率DNA解链)(参见Andriantsoanirina等人Journal of MicrobiologicalMethods,78:165(2009))以及与基于荧光微球(

在一个优选的实施方案中，以下引物的至少一个被用于扩增：

正向K13-15'-cggagtgaccaaatctggga-3’(SEQ ID NO:9)；

反向K13-45'-gggaatctggtggtaacagc-3’(SEQ ID NO:10)；

正向K13-25'-cgccagcattgttgactaat-3’(SEQ ID NO:11)；

反向K13-35'-gcggaagtagtagcgagaat-3’(SEQ ID NO:12)；

正向5'-gccaagctgccattcatttg-3’(SEQ ID NO:13)；以及

反向5'-gccttgttgaaagaagcaga-3’(SEQ ID NO:14)。

核酸可以是RNA或DNA。在一个实施方案中，提取RNA并逆转录成cDNA。然后对cDNA进行扩增或测序。

因此，该方法可以包括从患者样品分离RNA，将RNA逆转录成cDNA，对cDNA进行扩增或测序，以及确定野生型或突变的K-13推进器核酸的存在与否。

在各种实施方案中，该方法包括检测细胞样品中野生型或突变的K-13推进器蛋白的存在与否。这可以通过使用在野生型和突变K-13推进器蛋白之间区分的特异性抗体来进行。可以将这些抗体与患者的样品接触，可以通过检测免疫反应的存在与否确定野生型或突变的K-13推进器蛋白的存在与否。优选地，该方法包括ELISA测定。

抗体可以是合成的、单克隆的或多克隆的，并且可以通过本领域众所周知的技术进行制备。这样的抗体特异性经抗体的抗原结合位点进行结合(而不是非特异性结合)。可以将K-13推进器多肽、片段、变体、融合蛋白等作为免疫原用于生产与其发生免疫反应的抗体。更具体地，多肽、片段、变体、融合蛋白等含有诱发抗体形成的抗原决定簇或表位。

这些抗原决定簇或表位可以是线性的或者构象的(非连续的)。线性表位由组成多肽单个氨基酸部分(section)组成，而构象或非连续表位由来自多肽链的不同区域的氨基酸部分组成，蛋白折叠时使它们紧密靠近(C.A.Janeway,Jr.and P.Travers,ImmunoBiology 3:9(Garland Publishing Inc.,2nd ed.1996))。因为折叠蛋白质具有复杂表面，可用表位的数量非常多；但是由于蛋白质的构象和空间位阻，实际上结合表位的抗体的数量小于可用表位的数量(C.A.Janeway,Jr.and P.Travers,Immuno Biology 2:14(GarlandPublishing Inc.,2nd ed.1996))。可以通过本领域已知的任何方法鉴定表位。可以通过常规技术制备多克隆和单克隆抗体。

可以利用基于野生型和突变K-13推进器蛋白的氨基酸序列的K-13推进器肽制备特异性结合野生型和/或突变K-13推进器的抗体。术语“抗体”旨在包括多克隆抗体、单克隆抗体及其片段，诸如F(ab')2和Fab片段、单链可变片段(scFv)、单域抗体片段(VHH或纳米抗体)、双价抗体片段(双价抗体(diabody))以及任何重组和合成生产的结合伴侣。

如果抗体以大于或等于大约10⁷M-1的Ka结合野生型和/或突变K-13推进器多肽，则抗体被定义为特异性结合。可以使用常规技术容易地确定结合伴侣或抗体的亲和力，例如由Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,51:660(1949)所述的那些。

可以使用本领域众所周知的方法从各种来源容易地产生多克隆抗体，例如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠或大鼠。一般而言，通常通过肠胃外注射将纯化的K-13推进器或者基于适当缀合的K-13推进器的氨基酸序列的肽给予宿主动物。可以通过使用佐剂(例如弗氏完全或不完全佐剂)增强K-13推进器的免疫原性。加强免疫之后，收集少量血清样品并测试其对K-13推进器多肽的反应性。用于这样的确定的各种测定的实例包括在Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane(eds.),Cold Spring HarborLaboratory Press,1988中所描述的那些，以及以下方法，诸如对流免疫电泳(CIEP)、放射免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹测定和夹心法测定。参见美国专利号4,376,110和4,486,530。

可以使用众所周知的方法容易地制备单克隆抗体。参见例如在美国专利号RE 32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993；Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A NewDimension in Biological Analyses,Plenum Press,Kennett,McKeam和Bechtol(eds.),1980中所描述的方法。

例如可以任选在佐剂的存在下，采用分离并纯化的野生型或突变K-13推进器蛋白或缀合的K-13推进器肽，以大约3周间隔腹膜内注射宿主动物(诸如小鼠)至少一次和优选至少两次。然后通过常规斑点印迹技术或抗体捕获(ABC)测定小鼠血清以确定哪只动物最适合进行融合。大约两到三周后，给予小鼠蛋白质或肽的静脉内加强。后来处死小鼠，并且按照建立的操作步骤将脾细胞与市售可得的骨髓瘤细胞(诸如Ag8.653(ATCC))融合。简而言之，在培养基中洗涤骨髓瘤细胞几次，并以大约三个脾细胞比一个骨髓瘤细胞的比例与小鼠脾细胞进行融合。融合剂可以是本领域使用的任何合适的药剂，例如聚乙二醇(PEG)。将融合均铺到含有允许融合细胞的选择性生长的培养基的板中。然后使融合细胞生长大约八天。收集所得杂交瘤的上清并将其加至先包被了山羊抗小鼠Ig的板中。洗涤之后，将标记(诸如标记的K-13推进器多肽)加至每个孔，接着孵育。随后可以检测阳性细胞。可以大量培养生长阳性克隆，随后在蛋白A柱(Pharmacia)上纯化上清。

可以使用替代的技术生产本发明的单克隆抗体，诸如由Alting-Mees等人,"Monoclonal Antibody Expression Libraries:A Rapid Alternative to Hybridomas",Strategies in Molecular Biology 3:1-9(1990)所描述的那些，将其通过引用并入本文。类似地，可以使用重组DNA技术构建结合伴侣以引入编码特异性结合抗体的基因的可变区。这样的技术被描述于Larrick等人,Biotechnology,7:394(1989)中。

本发明还包括这样的抗体的抗原结合片段，其可以通过常规技术进行生产。这样的片段的实例包括、但不限于Fab和F(ab')2片段。本发明还提供了通过基因工程技术生产的抗体片段和衍生物。

本发明的单克隆抗体包括嵌合抗体，例如人源化形式的鼠单克隆抗体。可以通过已知技术制备这样的人源化抗体，并当将这样的抗体施用于人时其提供降低的免疫原性的优点。在一个实施方案中，人源化的单克隆抗体包含鼠抗体的可变区(或仅仅包含其抗原结合部位)和源自人抗体的恒定区。或者，人源化的抗体片段可以包含鼠单克隆抗体的抗原结合部位和源自人抗体的可变区片段(缺少抗原结合部位)。用于生成嵌合和进一步工程化的单克隆抗体的方法包括以下文献中所描述的那些：Riechmann等人(Nature 332:323,1988)、Liu等人(PNAS 84:3439,1987)、Larrick等人(Bio/Technology 7:934,1989)以及Winter和Harris(TIPS 14:139,May,1993)。转基因产生抗体的方法可见于GB 2,272,440、美国专利号5,569,825和5,545,806。

可以使用通过基因工程方法生产的抗体，诸如嵌合和人源化的单克隆抗体，包含人和非人两部分，其可以使用标准重组DNA技术进行制备。可以使用本领域已知的标准DNA技术通过基因工程生产这样的嵌合和人源化的单克隆抗体，例如使用以下文献中所描述的方法：Robinson等人，国际公开号WO 87/02671；Akira等人，欧洲专利申请号0184187；Taniguchi,M.，欧洲专利申请号0171496；Morrison等人，欧洲专利申请号0173494；Neuberger等人，PCT国际公开号WO 86/01533；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请号0125023；Better等人，Science 240:1041 1043,1988；Liu等人，PNAS 84:3439 3443,1987；Liu等人，J.Immunol.139:3521 3526,1987；Sun等人，PNAS84:214 218,1987；Nishimura等人，Canc.Res.47:999 1005,1987；Wood等人，Nature 314:446 449,1985；和Shaw等人，J.Natl.Cancer Inst.80:1553 1559,1988)；Morrison,S.L.，Science229:1202 1207,1985；Oi等人，BioTechniques 4:214,1986；Winter美国专利号5,225,539；Jones等人，Nature 321:552 525,1986；Verhoeyan等人，Science 239:1534,1988；和Beidler等人，J.Immunol.141:40534060,1988。

关于合成和半合成抗体，这样的术语旨在涵盖但不限于抗体片段、同种型转换的抗体、人源化抗体(例如小鼠-人、人-小鼠)、杂交体、具有多种特异性的抗体和完全合成抗体样分子。

对于治疗应用，具有人恒定区和可变区的“人”单克隆抗体常常是优选的，以使得患者对抗抗体的免疫应答最小化。可以通过免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因动物产生这样的抗体。参见Jakobovits等人，Ann NY Acad Sci 764:525-535(1995)。

也可以使用由源自受试者淋巴细胞的mRNA制备的免疫球蛋白轻链和重链cDNA，通过构建组合免疫球蛋白文库(诸如Fab噬菌体展示文库或scFv噬菌体展示文库)，制备抗K-13推进器多肽的人单克隆抗体。参见例如McCafferty等人，PCT公开号WO 92/01047；Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.222:581 597；和Griffths等人，(1993)EMBO J 12:725 734。此外，可以通过突变已知的人抗体产生抗体可变区组合文库。例如可以通过例如使用随机改变的、诱变的寡核苷酸突变已知结合K-13推进器的人抗体的可变区，以产生突变的可变区文库，其然后可以被筛选以结合K-13推进器。在免疫球蛋白重链和/或轻链的CDR区内诱导随机诱变的方法、杂交随机化的重链和轻链以形成配对的方法和筛选方法可见于，例如Barbas等人，PCT公开号WO 96/07754；Barbas等人，(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:4457 4461。

可以通过一群展示包(优选源自丝状噬菌体)表达免疫球蛋白文库以形成抗体展示文库。特别适用于产生抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于，例如Ladner等人，美国专利号5,223,409；Kang等人，PCT公开号WO 92/18619；Dower等人，PCT公开号WO 91/17271；Winter等人，PCT公开号WO 92/20791；Markland等人，PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人，PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人，PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人，PCT公开号WO 92/09690；Ladner等人，PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9:1370 1372；Hay等人，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81 85；Huse等人，(1989)Science 246:1275 1281；Griffths等人，(1993)同上；Hawkins等人，(1992)J MolBiol 226:889 896；Clackson等人，(1991)Nature 352:624 628；Gram等人，(1992)PNAS89:3576 3580；Garrad等人，(1991)Bio/Technology 9:1373 1377；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19:4133 4137；和Barbas等人，(1991)PNAS 88:7978 7982。一旦抗体文库展示于展示包(例如丝状噬菌体)表面，筛选抗体文库以鉴定和分离表达结合K-13推进器多肽的抗体的包。在一个优选的实施方案中，主要的文库筛选涉及用固定化的K-13推进器多肽进行淘洗(panning)并选择表达结合固定化的K-13推进器多肽的抗体的展示包。

在一个优选的实施方案中，该方法包括检测疟原虫感染。该方法可以进一步包括确定疟原虫是否具有野生型或突变的K-13推进器核酸或蛋白序列。

治疗疟原虫感染的方法

本发明包括用于治疗疟原虫感染的方法。在一个实施方案中，该方法包括确定患者是否被含有野生型或突变K-13推进器核酸的疟原虫感染并基于患者是否被含有野生型或突变K-13推进器的疟原虫感染调整抗寄生虫治疗。

在一个优选的实施方案中，如果患者被含有野生型K-13推进器的疟原虫感染，那么用青蒿素衍生物对患者进行治疗。

在一个优选的实施方案中，如果患者被含有突变K-13推进器的疟原虫感染，那么用不含有青蒿素的抗寄生虫治疗对患者进行治疗，优选用选自奎宁、氯喹和甲氟喹的疟疾药物。

在另一个实施方案中，如果患者被含有突变K-13推进器的疟原虫感染，那么用青蒿素衍生物对患者进行比常规使用的时间段更持久的时间段的治疗。

本发明还涉及用于治疗感染了疟原虫的患者的青蒿素衍生物，所述疟原虫具有野生型K-13推进器，其中对之前从所述患者获得的生物学样品进行体外检测疟原虫是否含有野生型K-13推进器的步骤。

本发明进一步涉及用于治疗感染了疟原虫的患者的青蒿素衍生物，所述疟原虫具有突变的K-13推进器，其中对之前从所述患者获得的生物学样品进行体外检测疟原虫是否含有突变的K-13推进器的步骤，并且其中青蒿素的施用方案和/或施用剂量随时间延长和/或剂量比独自施加于由含有野生型K-13推进器带来的感染的剂量方案更高。

本发明还涉及用于治疗感染了疟原虫的患者的奎宁、氯喹或甲氟喹，所述疟原虫具有突变的K-13推进器，其中对之前从所述患者获得的生物学样品进行体外检测疟原虫是否含有突变的K-13推进器的步骤。

因此，根据感染谱使用所述药物首先包括如根据各种实施方案的本发明所提供的检测并对疟原虫感染进行基因分型的步骤，以确定疟原虫携带的是野生型K-13推进器还是突变的K-13推进器。

用于对疟原虫进行基因分型的试剂盒

本发明包括用于对疟原虫进行基因分型或用于检测疟原虫感染的试剂盒。优选地，试剂盒含有用于扩增K-13推进器核酸的引物。试剂盒可以含有用于检测扩增的产物的试剂。试剂盒可以含有本文所列出的引物中的任意引物或任意组合。试剂盒可以含有本文所列出的引物中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种引物。在一个实施方案中，试剂盒包含至少一对引物，其与K13推进器核酸在100-300bp的长度范围特异性杂交。在试剂盒的一个优选的实施方案中，该至少一对引物(其与K13推进器核酸在100-300bp的长度范围特异性杂交)包围至少一个单核苷酸多态性(SNP)。

优选地，试剂盒含有用于检测K-13推进器核酸的探针，特别是经扩增的K-13推进器核酸。优选地，探针以荧光标记或酶标记进行标记。

在一个实施方案中，试剂盒特异性检测突变K-13推进器核酸，特别是编码Y493H、R539T、I543T或C580Y等位基因的核酸。在一个实施方案中，试剂盒特异性检测野生型K-13推进器核酸。

在一个优选的实施方案中，试剂盒包含以下引物中的至少一种：

5'-cggagtgaccaaatctggga-3’(SEQ ID NO:9)；

5'-gggaatctggtggtaacagc-3’(SEQ ID NO:10)；

5'-cgccagcattgttgactaat-3’(SEQ ID NO:11)；以及

5'-gcggaagtagtagcgagaat-3’(SEQ ID NO:12)；

5'-gccaagctgccattcatttg-3’(SEQ ID NO:13)；以及

5'-gccttgttgaaagaagcaga-3’(SEQ ID NO:14)。

在一些实施方案中，试剂盒检测编码F446I、N458Y、C469Y、Y493H、K503N、R539T、I543T、P553L、P574L、A578S、C580Y和D584V等位基因的突变K13推进器核酸。

在一些实施方案中，试剂盒检测编码F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突变K13推进器核酸。

在一些实施方案中，试剂盒包含以下引物对中的至少一种：

PCR引物对1：

5’AGGTGGATTTGATGGTGTAGAAT 3’(正向)(SEQ ID NO:15)

5’CATACACCTCAGTTTCAAATAAAGC 3’(反向)(SEQ ID NO:16)

PCR引物对2：

5’AATTTCTTATACGTTTTTGGTGGTAA 3’(正向)(SEQ ID NO:17)

5’CTCTACCCATGCTTTCATACGAT 3’(反向)(SEQ ID NO:18)

PCR引物对3

5’GGATATGATGGCTCTTCTATTATACCG 3’(正向)(SEQ ID NO:19)

5’ACTTCAATAGAATTTAATCTCTCACCA 3’(反向)(SEQ ID NO:20)

PCR引物对4

5’ATGTCATTGGTGGAACTAATGGT 3’(正向)(SEQ ID NO:21)

5’TTAAATGGTTGATATTGTTCAACG 3’(反向)(SEQ ID NO:22)

PCR引物对5

5’TTCAGGAGCAGCTTTTAATTACC 3’(正向)(SEQ ID NO:23)

5’CTGGTGAAAAGAAATGACATGAA 3’(反向)(SEQ ID NO:24)

PCR引物对6

5’CCTTGTTGAAAGAAGCAGAATTT 3’(正向)(SEQ ID NO:25)

5’ATTCAATACAGCACTTCCAAAATAA 3’(反向)(SEQ ID NO:26)。在各种实施方案中，试剂盒包含与以下SNP之一杂交的至少一种探针：

筛选新疟疾药的方法

本发明包括用于筛选新疟疾药的方法，所述新疟疾药有效用于治疗感染了耐受ART的疟原虫的患者。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

·对感染了根据本发明的疟原虫的患者的生物学样品中的疟原虫进行基因分型；

·如果疟原虫感染的患者具有突变K13-推进器等位基因，则测量寄生虫清除半衰期和/或疟原虫的存活率；

·如果疟原虫感染的患者具有突变K13-推进器等位基因，则将待测新药与生物学样品接触；

·测量施用该药之后测量寄生虫清除半衰期和/或RSA_0-3h中的疟原虫的存活率；

如果施用该药之后寄生虫清除半衰期和/或疟原虫的存活率减小，则选择该药作为有效用于治疗感染了耐受ART的疟原虫的患者的疟疾药。

在另一个实施方案中，该方法进一步包括如果疟原虫感染的患者具有突变K13-推进器等位基因，则将待测新药施用于该患者。

表3

表7

突变

SNP

非洲

亚洲

总计

446

F446I

0,0％

42

5,4％

4,8％

449

G449A

1

1,00％

1

0,13％

0,23％

458

N458Y

0,0％

7

0,9％

0,8％

469

C469Y

0,0％

4

0,5％

470

W470终止

1

1,00％

1

0,13％

0,23％

481

A481V

1

0,13％

0,20％

检测于南美洲(n＝1)

493

Y493H

1

1,1％

32

4,1％

3,8％

503

K503N

0,0％

4

0,5％

522

S522C

5

5,3％

0,0％

0,6％

534

V534A

3

3,2％

0,0％

0,3％

539

R539T

0,0％

35

4,5％

4,0％

543

I543T

0,0％

8

1,0％

0,9％

548

G548D

2

2,1％

0,0％

0,2％

553

P553L

0,0％

15

1,9％

1,7％

555

V555A

3

3,2％

0,0％

0,3%

557

A557S

2

2,1％

0,0％

0,2％

561

R561H

1

1,00％

1

0,13％

0,23％

563

K563R

2

2,1％

0,0％

0,2％

568

V568G

2

0,26％

574

P574L

0,0％

11

1,4％

1,3％

578

A578S

21

22,1％

1

0,1％

2,5%

580

C580Y

1

1,1％

591

75,9％

67,7％

583

F583L

2

2,1％

0,0％

0,2％

584

D584V

0,0％

3

0,4％

0,3％

589

V589I

2

2,1％

0,0％

0,2％

613

Q613E

2

2,1％

0,0％

0,2％

641

D641G

2

2,1％

0,0％

0,2％

参考文献

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实施例

实施例1.青蒿素加压和模拟加压的恶性疟原虫F32谱系

耐受ART的F32-ART5寄生虫系是通过以下方法被选择出来的：在青蒿素剂量增加的方案下培养ART敏感性F32-坦桑尼亚克隆5年。通过在没有青蒿素暴露的情况下平行培养F32-坦桑尼亚获得F32-TEM。从恶性疟原虫系3D7、89F5Palo Alto Uganda和K1992提取参考DNA。按照¹³所述进行环状体期存活测定(RSA^0-3h)。使用Illumina双向测序(paired-readssequencing)技术对F32-坦桑尼亚、F32-TEM、F32-ART5(4个时间点)、三个参考株(3D7、89F5和K1992)和21份柬埔寨寄生虫分离物进行全基因组测序。从2001-2012年参与ACT效力研究的患者收集一组1091份临床恶性疟原虫分离物。使用巢式PCR扩增K13-推进器。由Macrogen,Korea进行PCR产物的双链测序。用MEGA 5软件(版本5.10)分析序列以鉴定特异性SNP组合。用Microsoft Excel和MedCalc(版本12，Mariakerke,Belgium)分析数据。当P值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。从柬埔寨国立健康研究伦理委员会、海军医学研究中心伦理审查委员会(Institutional Review Board)、WHO西太平洋区办公室技术审查小组和国立变态反应和传染病研究所伦理审查委员会获得寄生虫分离物收集的伦理许可。

在稀释至2.5％的血细胞比容的人O型红细胞(RBC)(Etablisssement

du Sang)并补充有5％人血清的RPMI-1640培养基(Invitrogen,San Diego,CA)中培养无支原体的F32-坦桑尼亚寄生虫。在5％CO₂的气氛中、在37℃下培养寄生虫培养物。每天检查血液寄生虫并保持其低于10％。对于耐受ART的寄生虫选择，将非同步的培养物调整至5-7％的血液寄生虫并在增加剂量的青蒿素(10nM-9μM)的存在下生长24h以用于头3年的药物压力¹⁸。在随后2年中，以9μM-18μM的剂量范围完成每个药物48h的压力循环。药物暴露之后，弃去培养基并用补充人血清(20％)的无药物培养基代替。每天监测血液寄生虫直到其达到5％。此时，重新施加药物压力。将5年非连续有效ART压力后获得的寄生虫系命名为F32-ART5。在相同的时间、相同的条件(即RBC、血清和培养基)下但没有青蒿素处理，将亲本F32-坦桑尼亚系平行保持为连续培养中的对照。将得到的对照系称为F32-TEM。

实施例2.实验室适应的恶性疟原虫系

参考DNA提取自实验室适应的恶性疟原虫系3D7(MR4,Manassas,VA)，89F5PaloAlto Uganda(来自Palo Alto系的克隆，1978年起源于乌干达，其在松鼠猴(Saimirisciureus)实验宿主中对蒿甲醚表现出高敏感性[O.Mercereau-Puijalon,H.Contamin,andJ.C.Barale，未公开数据])和K1992(1992年在拜林在该区域大规模部署ART之前收集的分离物(由法国国家疟疾参考中心提供))。使用迷你血液试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据制造商的说明书从冰冻血液等分试样(200μl)提取寄生虫DNA。

实施例3.培养适应的柬埔寨恶性疟原虫分离物

如Witkowski等人⁴⁵所述将来自柬埔寨(于2010年和2011年收集)的五十份临床恶性疟原虫分离物适应于体外培养。它们的地理起源示于表8中。没有确定这些患者分离物的寄生虫清除率，因为这些分离物是在现场试验(field trial)期间收集的，其没有包括这样的测量。使用迷你血液试剂盒(Qiagen)从冰冻血液等分试样(200μl)提取寄生虫DNA。

实施例4.环状体期存活测定

如Witkowski等人¹³所述使用高度同步的寄生虫培养物进行环状体期存活测定(RSA^0-3h)。简而言之，将0-3h侵入后环状体期寄生虫暴露于700nM DHA[双氢青蒿素，获得自WWARN(www.wwarn.org/research/tools/qaqc)]或其溶剂DMSO中6h，洗涤，然后在没有药的情况下接着培养66h。通过显微镜对Giemsa染色的薄涂片中活的寄生虫的比例进行计数来评估存活率，所述寄生虫发育成第二代环状体或具有正常形态的营养子。

实施例5.时间和地理样品收集

从参与作为2001-2012年柬埔寨国家疟疾控制计划的常规抗疟药效力检测的一部分进行的ACT治疗效力研究的患者和从NAMRU-2进行的研究收集一组941份临床恶性疟原虫分离物(表4)。将收集在EDTA或ACD中的静脉血液样品(5ml)在收集的48h内于4℃下运输至金边的柬埔寨巴斯德研究所，然后保存于-20℃下直至DNA提取。使用迷你血液试剂盒(Qiagen)从冰冻血液等分试样(200μl)提取寄生虫DNA。

实施例6.测量寄生虫清除半衰期

如^6,13所述，2009年和2010年在菩萨省和腊塔纳基里省对患有轻症或重症恶性疟原虫疟疾且初始寄生虫密度≥10,000/μl的患者进行登记。用ART对患者进行治疗，每6h从厚血液膜测量他们的寄生虫密度直到血液寄生虫检测不到。使用WWARN的在线寄生虫清除估计法(http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator)从这些寄生虫计数衍生出163个患者中的寄生虫清除半衰期。该研究登记于ClinicalTrials.gov(编号NCT00341003)。

实施例7.寄生虫DNA的全基因组测序

使用Illumina双向测序技术对F32-坦桑尼亚、F32-TEM、F32-ART5谱系(4个时间点)、三个参考株(3D7、89F5和K1992)和21份柬埔寨寄生虫分离物进行全基因组测序。按照供应商开发的标准操作步骤进行Illumina文库制备和测序。简而言之，通过喷雾剪切基因组DNA，并将所剪切的片段进行末端修复和磷酸化。将平端片段进行A尾化，并将测序接头连接至片段。使用Agencourt AMPure XP珠(±500bp；Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)将插入物按大小排列并在文库定量和验证之前使用10个循环的PCR进行富集。进行文库与流动槽(flow cell)的杂交和桥式扩增以产生簇，并在HiSeq 2000仪(Illumina,SanDiego,CA)上收集100个循环的双向读出数。测序完成之后，使用Illumina分析流水线(版本1.7)进行图像分析、碱基读出(base calling)和错误估计。

使用Fqquality工具过滤原始序列文件，Fqquality工具是由N.Joly(Biology ITCenter,Institut Pasteur,Paris)开发的读出质量过滤软件，其能够修剪读出中第一和最后的低质量碱基。将来自受控的Fastq文件的修剪的读出用Burrows-Wheeler Alignment(BWA)映射到参考基因组(恶性疟原虫3D7)，产生BAM文件(标签区分格式SAM的二进制文件)。接下来，我们使用Samtools来准备pileup文件，其被使用内部开发的软件格式化以实现数据进入全基因组数据管理器(WDM)数据库(Beghain等人，准备中)。WDM软件被设计成用来比较和/或比对部分或全部恶性疟原虫基因组。

实施例8.对F32-ART5中含有非同义SNP的基因进行测序

使用表1中列出的引物进行选定基因的PCR扩增。用1μM的每种引物、0.2mM dNTP(Solis Biodyne,Tartu,Estonia)、3mM MgCl₂和2U Taq DNA聚合酶(Solis Biodyne)使用以下循环程序对2μl DNA进行扩增：94℃5min，然后40个循环的94℃30sec、60℃90sec、72℃90sec，以及72℃最后延伸10min。通过2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检测PCR产物。由Beckman Coulter Genomics,France进行PCR产物的双链测序。用MEGA 5软件(版本5.10)列以鉴定特异性SNP组合。

实施例9.对K13-推进器域进行测序

使用以下引物扩增K13-推进器域：对于主要PCR(K13-1 5'-cggagtgaccaaatctggga-3’(SEQ ID NO:9)和K13-4 5'-gggaatctggtggtaacagc-3’(SEQ IDNO:10))，以及对于巢式PCR(K13-2 5'-gccaagctgccattcatttg-3’(SEQ ID NO:13)和K13-35'-gccttgttgaaagaagcaga-3’(SEQ ID NO:14))。用1μM的每种引物、0.2mM dNTP(SolisBiodyne)、3mM MgCl₂和2U Taq DNA聚合酶(Solis Biodyne)使用以下循环程序对1μl DNA进行扩增：94℃5min，然后40个循环的94℃30sec、60℃90sec、72℃90sec，以及72℃最后延伸10min。对于巢式PCR，除了MgCl₂浓度不同(2.5mM)之外，将2μl的主要PCR产物在相同的条件下进行扩增。使用2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检测PCR产物。由Macrogen,Korea进行PCR产物的双链测序。用MEGA 5软件(版本5.10)列以鉴定特异性SNP组合。

实施例10.对临床寄生虫分离物进行深度测序和群体结构分析

之前已经描述了获得自柬埔寨的菩萨省和腊塔纳基里省的疟疾患者的临床寄生虫分离的DNA提取、

测序和SNP基因分型¹⁵。对这些寄生虫的群体结构分析鉴定出四个亚群：KH1、KH2、KH3和KH4。具有<80％来自这四组的任意祖先的寄生虫被视为混合型(KHA)。

实施例11.F32-ART5谱系中突变的时间获取

使用在0时(原始F32-坦桑尼亚克隆系)、第196天(0.2-μM压力循环#23)、第385天(1.8-μM压力循环#39)、第618天(9-μM压力循环#56)和第2250天(9-μM压力循环#120)收集的样品通过全基因组测序探索了F32-ART5谱系。在第2250天收集F32-TEM样品。通过PCR研究了在第30、33、34、36、68和98个压力循环时收集的另外的样品。使用高纯PCR模板制备试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)根据制造商的说明书提取寄生虫培养物的DNA。

分别在第17、48和122个压力循环(0.04、2.7和9μM ART)时收集在环状体期存活测定(RSA^0-3h)中测试的F32-ART5样品。在最后一个模拟压力循环收集F32-TEM样品。用不同批的红细胞以一式三份实验的形式确定RSA0-3h存活率，并使用Giemsa染色薄涂片读出由两个独立显微技术人员(B.W.和F.B.-V.)如上进行评估。使用Mann-Whitney U检验比较存活率。F32-ART5样品的RSA0-3h存活率如下：在药物压力循环：#17(n＝3,中位值0％,IQR 0-0.07％),#48(n＝3,中位值11.7％,IQR 10.3-14.6；P＝0.04对于#17vs.#48,Mann-WhitneyU检验)和#122(n＝3,中位值12.8％,IQR 10.6-14.5,P＝0.04和P＝0.82对于#17vs.#122和#48vs.#122)。也以一式三份实验的形式确定F32-TEM系的RSA^0-3h存活率(n＝3,中位值0％,IQR 0-0.05,P＝0.81对于#TEM vs.#17,Mann-Whitney U检验)。

实施例12.2001-2012年在六个柬埔寨省份中收集的886份临床寄生虫分离物中的K13-推进器突变的流行

通过对扩增自886份存档的血液样品的PCR产物进行测序来对K13-推进器进行基因分型。来自每年每省分析的样品数示于图3中。Fisher精确检验被用于比较每个省份中带有野生型K13-推进器序列的分离物随时间的频率。观察到西部省份在十年期间野生型K13-推进器等位基因频率的显著降低。在拜林市，它从2001-2002年的30.0％(12/40)降至2011-2012年的4.8％(4/84)，P＝0.0002，Fisher精确检验；马德望省从2001-2002年的71.9％(46/64)降至2011-2012年的7.0％(5/71)，P<10-6；菩萨省从2003-2004年的50.0％(5/10)降至2011-2012年的10.5％(2/19)，P＝0.03；以及在桔井省从2001-2002年的93.3％(14/15)降至2011-2012年的29.4％(5/17)，P＝0.0003。在柏威夏省[从2001-2002年的92.6％(25/27)降至2011-2012年的84.2％(16/19)，P＝0.63]或腊塔纳基里省[从2001-2002年的96.4％(54/56)降至2011-2012年的94.3％(33/35)，P＝0.63]中没有观察到野生型等位基因频率的显著降低。在拜林市，C580Y的频率从2001-2002年的45.0％(18/40)增加至2011-2012年的88.1％(74/84)(P<10-6)，并且在马德望省从从2001-2002年的7.8％(5/64)增加至2011-2012年的87.3％(62/71)(P<10-6)，表明其快速侵入群体并在这些省中接近固定。

实施例13.K13-推进器的三维结构建模

使用建模器(v9.11)通过满足空间限制的同源性建模获得PF3D7_1343700(‘K13-推进器’)的kelch推进器域的三维结构模型(Fiser A,Sali A(2003)."Modeller:generation and refinement of homology-based protein structure models".Meth.Enzymol.374:461–91.)。组成K13-推进器的295个氨基酸与人keap1[蛋白质数据库(PDB)2FLU]、KLHL12(PDB 2VPJ)和KLHL2(PDB 2XN4)蛋白分别具有22％、25％和25％的同一性，它们被用作对K13-推进器的三维结构进行建模的模板。使用两个经典标准评估所获得的模型的可靠性。第一，由建模器使用Built-Profile程序计算得到E-值＝0确认了K13kelch域和一个模板之间的序列比对的显著性。第二，该模型获得GA341模型得分＝1(得分≥0.7对应于高度可靠的模型)。使用PyMOL分子图形系统(版本1.5.0.4)(

Portland,OR)准备K13三维模型中突变的位置。

实施例14.统计学分析

用Microsoft Excel和MedCalc(版本12，Mariakerke,Belgium)分析数据。定量数据表示为中位值，四分位数间距(IQR)。Mann-Whitney U检验(独立样品，双侧)用于比较两个组，Kruskal-Wallis检验(H-检验，双侧)用于比较超过两个组。Spearman的rho秩相关性系数(以及相关性系数的95％置信区间)用于测量野生型K13-推进器等位基因的患病率和第3天阳性频率(定义为在基于青蒿素的组合治疗的第三天显微镜下可检测的寄生虫的残留率)之间关系的强度²。Fisher精确检验用于比较频率数据，基于β分布的Clopper-Pearson精确方法用于确定比例的95％置信区间。当P值小于0.05时认为统计学上具有显著差异。

实施例15.另外的SNP。在如实施例5中所述从柬埔寨患者第一次收集941例临床恶性疟原虫之后，在几个非洲国家(如贝宁、安哥拉和喀麦隆)进一步收集了感染恶性疟原虫的患者的血液样品，并按照与实施例5中相同的实验方法在南美洲进行。总共收集了9523份血液样品。

NI：不可解释的样品

通过对扩增自如实施例9中所述的寄生虫DNA的PCR产物进行测序来对K13-推进器域进行基因分型。

在K13推进器域中发现了另外的非同义SNP。最终，发明人鉴定了下列27个SNP：

实施例16：同时检测K13推进器域中所有突变的方法(图13)

本实施例详细描述了涉及同时检测K13推进器域中所有突变的方法(图13)。以下面的三步进行SNP检测：

用扩增的DNA与所有探针杂交(第一步)；将保守探针与等位基因特异性探针连接(第二步)以及读取生物素发出的荧光和等位基因特异性荧光(第三步)

检测到的突变的列表

具有所有突变的K13推进器域的序列

GCCTTGTTGAAAGAAGCAGAATTTTATGGTATTAAATTTTTACCATTCCCATTAGTATTTTGTATAGGTGGATTTGATGGTGTAGAATATTTAAATTCGATGGAATTATTAGATATTAGTCAACAATGCTGGCGTATGTGTACACCTATGTCTACCAAAAAAGCTTATTTTGGAAGTGCTGTATTGAATAATTTCTTATACGTTTTTGGTGGTAATAACTATGATTATAAGGCTTTATTTGAAACTGAGGTGTATGATCGTTTAAGAGATGTATGGTATGTTTCAAGTAATTTAAATATACCTAGAAGAAATAATTGTGGTGTTACGTCAAATGGTAGAATTTATTGTATTGGGGGATATGATGGCTCTTCTATTATACCGAATGTAGAAGCATATGATCATCGTATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAATGGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCTTTTAATTACCTTAATCAAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAAGATGGCAATTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTAAATTCATGTCATTTCTTTTCACCAGATACAAATGAATGGCAGCTTGGC(SEQ ID NO:1的第1279-2127位nt)。

第一步：PCR扩增K13推进器域的序列

按照实施例9进行PCR扩增。对于主要PCR，引物是：

K13_1_F 5’-CGGAGTGACCAAATCTGGGA-3’(SEQ ID NO:9)

K13_4_R 5’-GGGAATCTGGTGGTAACAGC-3’(SEQ ID NO:10)

对于巢式PCR，引物是：

K13_3_F 5’-GCCTTGTTGAAAGAAGCAGA-3’(SEQ ID NO:14)

K13_2_R 5’-GCCAAGCTGCCATTCATTTG-3’(SEQ ID NO:13)

第二步：SNP检测

对于每个SNP，使用一个保守的探针，其与突变的核苷酸下游保守序列杂交。该探针在5'末端有一个磷酸[Phos]以允许连接，并在3'末端有一个生物素标签[BtnTg]；对于每个SNP还使用与野生型密码子或突变体密码子杂交的两个等位基因特异性探针。每个等位基因特异性探针具有特异性荧光标签(Tag WT是特异性针对野生型密码子的标签，Tag MT是特异性针对突变体密码子的标签)。

探针列表：

Claims

1.检测含有疟原虫(Plasmodium)的样品中突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在的试剂在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于对疟原虫进行基因分型的方法，所述方法包括：

(a)提供含有疟原虫的样品；以及

(b)检测所述样品中突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在，

其中所述试剂盒检测：(i)编码F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突变K-13推进器核酸，或(ii)具有选自F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G的至少一种SNP的突变K-13推进器蛋白。

2.权利要求1所述的用途，其中所述疟原虫是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。

3.权利要求1或2所述的用途，其中通过测序检测所述样品中突变的K-13推进器核酸的存在。

4.权利要求1或2所述的用途，其中通过PCR检测所述样品中突变的K-13推进器核酸的存在。

5.用于检测患者中疟原虫感染的试剂在制备试剂盒中的用途，其中在用于检测患者中疟原虫感染的方法中使用所述试剂盒，所述方法包括：

(a)提供患者的血液样品，以及

(b)检测所述血液样品中突变的K-13推进器核酸或蛋白的存在与否，

其中所述突变的K-13推进器核酸编码F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因，或所述突变的K-13推进器蛋白具有选自F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G的至少一种SNP。

6.权利要求5所述的用途，其中所述疟原虫是恶性疟原虫。

7.权利要求5或6所述的用途，其中通过测序检测所述样品中突变的K-13推进器核酸的存在。

8.权利要求5或6所述的用途，其中通过PCR检测所述样品中突变的K-13推进器核酸的存在。

9.权利要求5或6所述的用途，包括确定疟原虫是否具有突变K-13推进器核酸或蛋白序列。

10.用于检测疟原虫感染的试剂盒，其包含用于扩增K-13推进器核酸的引物和用于检测扩增产物的试剂，其中所述试剂盒检测编码F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突变K-13推进器核酸。

11.权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂盒含有用于检测突变K-13推进器核酸的探针。

12.权利要求11所述的试剂盒，其中所述探针以荧光标记、放射性标记或酶标记进行标记。

13.权利要求10-12任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒检测编码Y493H、R539T、I543T和C580Y等位基因的突变K-13推进器核酸。

14.权利要求10-12任一项所述的试剂盒，其中试剂盒包含以下引物中的至少一种：

5'-cggagtgaccaaatctggga-3’(SEQ ID NO:9)；

5'-gggaatctggtggtaacagc-3’(SEQ ID NO:10)；

5'-cgccagcattgttgactaat-3’(SEQ ID NO:11)；以及

5'-gcggaagtagtagcgagaat-3’(SEQ ID NO:12)；

5'-gccaagctgccattcatttg-3’(SEQ ID NO:13)；以及

5'-gccttgttgaaagaagcaga-3’(SEQ ID NO:14)。

15.权利要求10-12任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒检测编码F446I、N458Y、C469Y、Y493H、K503N、R539T、I543T、P553L、P574L、A578S、C580Y和D584V等位基因的突变K13推进器核酸。

16.权利要求10-12任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下引物对中的至少一种：

PCR引物对1

5’AGGTGGATTTGATGGTGTAGAAT 3’(正向)(SEQ ID NO:15)

5’CATACACCTCAGTTTCAAATAAAGC 3’(反向)(SEQ ID NO:16)

PCR引物对2

5’AATTTCTTATACGTTTTTGGTGGTAA 3’(正向)(SEQ ID NO:17)

5’CTCTACCCATGCTTTCATACGAT 3’(反向)(SEQ ID NO:18)

PCR引物对3

5’GGATATGATGGCTCTTCTATTATACCG 3’(正向)(SEQ ID NO:19)

5’ACTTCAATAGAATTTAATCTCTCACCA 3’(反向)(SEQ ID NO:20)

PCR引物对4

5’ATGTCATTGGTGGAACTAATGGT 3’(正向)(SEQ ID NO:21)

5’TTAAATGGTTGATATTGTTCAACG 3’(反向)(SEQ ID NO:22)

PCR引物对5

5’TTCAGGAGCAGCTTTTAATTACC 3’(正向)(SEQ ID NO:23)

5’CTGGTGAAAAGAAATGACATGAA 3’(反向)(SEQ ID NO:24)

PCR引物对6

5’CCTTGTTGAAAGAAGCAGAATTT 3’(正向)(SEQ ID NO:25)

5’ATTCAATACAGCACTTCCAAAATAA 3’(反向)(SEQ ID NO:26)。

17.权利要求10-12任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含与以下SNP之一杂交的至少一种探针：

· F446I ttt/att

· G449A ggt/gct

· N458Y aat/tat

· C469Y tgc/tac

· W470终止 tgg/tga

· A481V gct/gtt

· Y493H tac/cac

· K503N aag/aat

· S522C agt/tgt

· V534A gtt/gct

· R539T aga/aca

· I543T att/act

· G548D ggc/gac

· P553L ccg/ctg

· V555A gta/gca

· A557S gca/tca

· R561H cgt/cat

· K563R aaa/aga

· V568G gtg/ggg

· P574L cct/ctt

· A578S gct/tct

· C580Y tgt/tat

· F583L ttt/tta/g

· D584V gat/gtt

· V589I gtc/atc

· Q613E caa/gaa

· D641G gat/ggt。

18.用于检测含有疟原虫的生物样品中突变K13推进器核酸的存在的试剂在制备试剂盒中的用途，其中在用于检测含有疟原虫的生物样品中突变K13推进器核酸的存在的方法中使用所述试剂盒，该方法包括：

a)提供含有疟原虫的DNA的生物样品；

b)任选地从生物样品提取DNA；

c)使疟原虫的DNA与至少一对引物接触，所述引物与K13推进器核酸在100-300bp的长度范围特异性杂交，以及在嵌入式染料的存在下进行PCR反应；

d)使扩增产物经历解链步骤；

e)通过分析扩增产物的解链曲线确定突变等位基因的存在，其中所述方法包括检测编码F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突变K13推进器核酸。

19.用于检测含有疟原虫的生物样品中突变K13推进器核酸的存在的试剂在制备试剂盒中的用途，其中在用于检测含有疟原虫的生物样品中编码F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470终止、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E和D641G等位基因的突变K13推进器核酸的存在的方法中使用所述试剂盒，该方法包括通过PCR反应扩增突变K13推进器核酸，以及使扩增的核酸与特异性针对突变K13推进器的探针接触。

20.权利要求19所述的用途，其中所述探针与荧光珠结合。

21.权利要求19或20所述的用途，其中所述方法进一步包括使探针与突变K13推进器核酸结合，以及用与结合的K13推进器核酸结合的第二探针检测结合的K13推进器核酸。