KR102283408B1 - 플라스모듐 팔시파룸 아르테미시닌 내성의 분자 마커 - Google Patents

플라스모듐 팔시파룸 아르테미시닌 내성의 분자 마커 Download PDF

Info

Publication number
KR102283408B1
KR102283408B1 KR1020167015777A KR20167015777A KR102283408B1 KR 102283408 B1 KR102283408 B1 KR 102283408B1 KR 1020167015777 A KR1020167015777 A KR 1020167015777A KR 20167015777 A KR20167015777 A KR 20167015777A KR 102283408 B1 KR102283408 B1 KR 102283408B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
asn
propeller
leu
glu
ser
Prior art date
Application number
KR1020167015777A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160119753A (ko
Inventor
프레드릭 아리에이
오딜 푸이잘론
디디에 메나르
프랑소와 브누아-비칼
요한 베그하인
벤와 위트코우스키
장-크로스토프 바랄
크리스티앙 바우치어
니몰 킴
Original Assignee
앵스티띠 파스퇴르
엥스띠뛰 파스퇴르 두 캄보즈
쌍트르 나셔날 드 라 르쉐르쉐 씨앙띠피끄
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 앵스티띠 파스퇴르, 엥스띠뛰 파스퇴르 두 캄보즈, 쌍트르 나셔날 드 라 르쉐르쉐 씨앙띠피끄 filed Critical 앵스티띠 파스퇴르
Publication of KR20160119753A publication Critical patent/KR20160119753A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102283408B1 publication Critical patent/KR102283408B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
    • G01N2333/445—Plasmodium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Quinoline Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

K13-프로펠러 다형성(propeller polymorphism)은 ART 내성 플라스모듐 팔시파룸(P. falciparum)의 출현 및 확산을 추적하기 위한 유용한 분자 마커이다. 본 발명은 플라스모듐(Plasmodium), 예를 들면, 플라스모듐 팔시파룸을 검출하고 유전형분석하는 방법, 조성물 및 키트를 포괄한다. 상기 방법, 조성물 및 키트는 샘플에서 돌연변이된 K13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 데에 사용될 수 있다.

Description

플라스모듐 팔시파룸 아르테미시닌 내성의 분자 마커{A MOLECULAR MARKER OF PLASMODIUM FALCIPARUM ARTEMISININ RESISTANCE}
K13-프로펠러 다형성(propeller polymorphism)은 ART 내성 플라스모듐 팔시파룸(P. falciparum)의 출현 및 확산을 추적하기 위한 유용한 분자 마커이다. 본 발명은 플라스모듐(Plasmodium), 예를 들면, 플라스모듐 팔시파룸을 검출하고 유전형분석하는 방법, 조성물 및 키트를 포괄한다. 상기 방법, 조성물 및 키트는 샘플에서 돌연변이된 K13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 데에 사용될 수 있다.
캄보디아에서 아르테미시닌(artemisinin) 유도체(ART)에 대한 플라스모듐 팔시파룸 내성의 출현은 전세계의 말라리아 구제 및 제거 노력을 위협한다1,2. 서부 캄보디아로부터 메콩강 유역권 및 아프리카로 퍼지는 ART 내성 기생충의 위험은 이전에 클로로퀸 및 설파독신/피리메타민 내성 기생충이 발생하였기 때문에3 -5 매우 걱정스럽다. 임상 ART 내성은 증가된 기생충 제거 반감기11 ,12로서 표현된 감소된 기생충 제거율1 ,6-10, 또는 아르테미시닌-기초 조합 요법(ACT)2의 세 번째 날 미시적으로 검출가능한 기생충의 지속으로서 정의된다. 반감기 파라미터는 모든 ART들의 주요 대사물질인 디하이드로아르테미시닌(DHA)에의 약리학적으로 유의한 노출(6시간 동안 700 nM)에 대한 어린 윤상체-단계(ring-stage) 기생충의 생존율을 측정하는, 시험관내 윤상체-단계 생존 분석(RSA0 -3h) 및 생체외 RSA13로부터의 결과와 강한 상관관계를 가진다. 그러나, 현재 분자 마커의 결여는 ART 내성 기생충들을 이들이 문서로 기록된 지역에 집중적으로 봉쇄하는 것을 방해하고 ART가 가장 입수가능한 효과적인 항말라리아제로 남아있는 다른 곳에서의 이 기생충들의 신속한 검출을 방해한다. ART 내성의 확산을 검출하고 모니터링하기 위해 널리 사용될 분자 마커가 필요하다.
플라스모듐 팔시파룸 단리물의 최근 게놈-범위 분석은 ART 내성의 지리적 지역에서 최근 양성 선택의 증거를 제공하였다9 , 14-16. 임상 표현형의 기생충 유전력이 50%를 초과하지만, 신뢰할만한 분자 마커는 아직 확인되지 않았다. 한 가능한 설명은 기생충 제거 반감기가 ART에 대한 기생충 단리물의 고유 민감성에 의해 결정될 뿐만 아니라, ART 치료 시 그의 발생학적 단계 및 숙주 관련 파라미터, 예컨대, 약물동력학 및 면역에 의해서도 결정된다는 것이다17. 이 문제는 생체내 기생충 제거 반감기와 시험관내 RSA0-3h 생존율 사이에 불일치 데이터를 제시하는 환자들에서 최근에 강조되었다. 더욱이, 게놈-범위 연관성 연구(GWAS)는 기생충 집단 구조에 대한 불확실성에 의해 혼란에 빠졌다. 서부 캄보디아에서 ART 내성 기생충의 여러 고도로 분화된 하위집단들에 대한 최근 증거15는 상이한 출현 사건들이 일어날 것임을 암시한다. 분자 마커를 발견하기 위한 대안적 방법은 시험관내에서 고용량의 ART에서 생존하도록 선택된 실험실-개조된 기생충 클론에 의해 특이적으로 획득된 돌연변이를 분석하고, 이 정보를 이용하여, ART 내성이 시간적 및 지리적 수준 둘 다에서 잘 문서로 기록되어 있는 지역으로부터의 임상적 기생충 단리물에서의 다형성 분석을 안내하는 것이다. 여기서 본 발명자들은 이 방법을 이용하여, 이 표현형이 처음 보고된1,8 캄보디아에서 임상적 ART 내성의 분자 시그너처(signatures)를 조사하였다.
아르테미시닌-기초 조합 요법(ACT)은 전세계적 말라리아 구제 노력의 핵심 양상이다(Nkhoma et al., JID 208:346-349 (2013)). 그러나, 아르테미시닌 내성 말라리아의 출현은 이 노력을 위협하였다(상기 문헌). ART 내성을 측정하기 위한 신뢰할만한 시험관내 검사가 현재 존재하지 않는다(상기 문헌). 따라서, ART 민감성은 환자에서 ART 치료 후 기생충혈증의 감소로부터 측정되었다(상기 문헌). 이 방식은 비싸고 노동 집약적이고 시간 소모적이다(상기 문헌).
현재 분자 마커의 결여는 내성이 문서로 기록된 지역에의 봉쇄 노력을 방해하고 ART가 가장 입수가능한 효과적인 항말라리아 약물로서 남아있는 다른 유행 지역에서의 ART 내성의 신속한 검출을 방해한다. 대규모로 ART 내성을 모니터링하기 위해, ART 내성과 관련된 분자 마커가 절실히 필요하다. 본 발명은 당분야에서 이 필요성을 충족시킨다.
본 발명은 플라스모듐을 검출하고 유전형분석하는(genotyping) 방법, 조성물 및 키트를 포괄한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 플라스모듐을 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 및 상기 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 플라스모듐은 플라스모듐 팔시파룸이다.
한 실시양태에서, 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재는 서열결정에 의해 검출된다. 한 실시양태에서, 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재는 PCR에 의해 검출된다.
본 발명은 감염된 환자에서 플라스모듐 감염을 감출하는 방법, 조성물 및 키트를 포괄한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 환자로부터 혈액 샘플을 제공하는 단계, 및 혈액 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 플라스모듐이 야생형 프로펠러 핵산 또는 단백질 서열을 갖는지 아니면 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질 서열을 갖는지를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 플라스모듐은 플라스모듐 팔시파룸이다.
한 실시양태에서, 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재는 서열결정에 의해 검출된다. 한 실시양태에서, 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재 또는 부재는 PCR에 의해 검출된다.
한 실시양태에서, 플라스모듐 감염을 검출하는 키트는 K-13 프로펠러 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 및 증폭된 생성물을 검출하기 위한 시약을 포함한다.
한 실시양태에서, 키트는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 검출하기 위한 프로브를 함유한다. 바람직하게는, 상기 프로브는 형광 또는 효소 표지로 표지된다.
다양한 실시양태들에서, 키트는 Y493H, R539T, I543T 및 C580Y 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 검출한다.
한 실시양태에서, 키트는 Y493H, R539T, I543T 또는 C580Y 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 검출한다.
다양한 실시양태들에서, 키트는 프라이머 5'-cggagtgaccaaatctggga-3'(서열번호 9); 5'-gggaatctggtggtaacagc-3'(서열번호 10); 5'-cgccagcattgttgactaat-3'(서열번호 11); 및 5'-gcggaagtagtagcgagaat-3'(서열번호 12) 중 하나 이상을 포함하거나, 키트는 프라이머 5'-cggagtgaccaaatctggga-3'(서열번호 9); 5'- gggaatctggtggtaacagc-3'(서열번호 10); 5'-cgccagcattgttgactaat-3'(서열번호 11); 5'-gcggaagtagtagcgagaat-3'(서열번호 12); 5'- gccaagctgccattcatttg-3'(서열번호 13); 및 5'-gccttgttgaaagaagcaga -3'(서열번호 14) 중 하나 이상을 포함한다.
다양한 실시양태들에서, 키트는 F446I, N458Y, C469Y, Y493H, K503N, R539T, I543T, P553L, P574L, A578S, C580Y 및 D584V 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산을 검출한다.
다양한 실시양태들에서, 키트는 F446I, G449A, N458Y, C469Y, W470stop, A481V, Y493H, K503N, S522C, V534A, R539T, I543T, G548D, P553L, V555A, A557S, R561H, K563R, V568G, P574L, A578S, C580Y, F583L, D584V, V589I, Q613E 및 D641G 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산을 검출한다.
다양한 실시양태들에서, 키트는 하기 프라이머 쌍들 중 하나 이상을 포함한다:
Figure 112016056900663-pct00001
다양한 실시양태들에서, 키트는 하기 SNP들 중 하나와 혼성화하는 하나 이상의 프로브를 포함한다:
Figure 112016056900663-pct00002
본 발명은 플라스모듐을 함유하는 생물학적 샘플에서 야생형 K13 프로펠러 핵산 또는 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 포괄한다:
플라스모듐의 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
임의적으로 상기 생물학적 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계;
플라스모듐의 DNA를, 100 내지 300 bp 범위의 거리에서 K13 프로펠러 핵산과 특이적으로 혼성화하는 한 쌍 이상의 프라이머들과 접촉시키고 인터칼레이팅(intercalating) 염료의 존재 하에서 PCR 반응을 수행하는 단계;
증폭 생성물을 용융 단계로 처리하는 단계; 및
증폭 생성물의 용융 프로파일을 분석함으로써 돌연변이체 대립형질 또는 야생형 대립형질의 존재를 확인하는 단계.
일부 실시양태들에서, 상기 방법은 F446I, G449A, N458Y, C469Y, W470stop, A481V, Y493H, K503N, S522C, V534A, R539T, I543T, G548D, P553L, V555A, A557S, R561H, K563R, V568G, P574L, A578S, C580Y, F583L, D584V, V589I, Q613E 및 D641G 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 플라스모듐을 함유하는 생물학적 샘플에서 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서, 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산을 PCR 반응으로 증폭하는 단계 및 증폭된 핵산을 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산에 대해 특이적인 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포괄한다.
일부 실시양태들에서, 상기 프로브는 형광 비드 또는 바이오틴에 결합된다.
일부 실시양태들에서, 상기 방법은 상기 프로브를 돌연변이체 K13 프로펠러 도메인 핵산에 결합시키는 단계 및 결합된 K13 프로펠러 도메인 핵산에 결합하는 제2 프로브로 상기 결합된 K13 프로펠러 도메인 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 돌연변이된 K13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재는 환자가 아르테미시닌 유도체에 대한 내성을 나타내는 플라스모듐으로 감염되어 있다는 것을 나타낸다.
일부 실시양태들에서, 상기 방법은 일반(routine) 프로토콜보다 더 긴 아르테미시닌 유도체에 기초한 치료, 및/또는 또 다른 항-말라리아 약물, 바람직하게는 퀴닌, 클로로퀸 또는 메플로퀸을, 아르테미시닌 유도체에 대한 내성을 나타내는 플라스모듐으로 감염된 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 상기 방법은 신규 항-말라리아 약물에 기초한 치료를, 아르테미시닌 유도체에 대한 내성을 나타내는 플라스모듐으로 감염된 상기 환자에게 투여하는 단계, 및 상기 치료의 투여 후 단계 a) 및 b)를 반복하는 단계를 포함하고, 이때 돌연변이된 K13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 부재는 상기 환자가 아르테미시닌 유도체에 대한 내성을 나타내는 플라스모듐으로 더 이상 감염되어 있지 않고 상기 치료가 아르테미시닌 유도체에 대한 내성을 나타내는 플라스모듐에 효율적이라는 것을 나타낸다.
도 1 - F32-ART5에서의 돌연변이의 시간적 획득. 120회의 연속 주기 동안 증가하는 아르테미시닌 농도에 노출된 F32-탄자니아 기생충18을 5개의 시점들에서 전체 게놈 서열결정으로 분석하였다(회색 화살표). 주어진 수의 약물-압력 주기 후 돌연변이된 좌위들이 표시되어 있다(상자). 3개의 돌연변이들이 PCR에 의해 검출된 가장 빠른 시점(흑색 화살표)은 PF3D7 _1343700의 경우 Φ로 표시되어 있고 PF3D7_0213400의 경우 *으로 표시되어 있고 PF3D7 _1115700의 경우 #로 표시되어 있다. 원은 각각 F32-ART5 및 F32-TEM 기생충에 대한 RSA0-3h 생존율을 표시한다.
도 2 - K13-프로펠러 대립형질에 의해 분류된, RSA0-3h에서 캄보디아 기생충 단리물의 생존율. 전체 게놈 서열 데이터(n=21)를 분석하거나 PCR 생성물(n=28)을 서열결정함으로써 유전형을 수득하였다. 돌연변이체 기생충은 야생형 기생충보다 유의하게 더 높은 RSA0 -3h 생존율을 가진다: 야생형(n=17, 중간 0.16%, IQR 0.09-0.24, 범위 0.04-0.51); C580Y(n=26, 중간 14.1%, IQR 11.3-19.6, 범위 3.8-27.3, 야생형 대 C580Y에 대한 P<10-6, 만-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test)); R539T(n=5, 중간 24.2%, IQR 12.6-29.5, 범위 5.8-31.3, 야생형 대 R539T에 대한 P<10-3); Y493H(51.4%); 및 I543T(58.0%). 대조군 3D7 기생충의 RSA0 -3h 생존율(0.04%)은 별표로 표시되어 있다.
도 3 - 2001년부터 2012년까지 6개의 캄보디아 지역들에서 886개의 기생충 단리물들에서의 K13-프로펠러 대립형질들의 빈도. 보관된 혈액 샘플로부터의 PCR 생성물을 서열결정함으로써 유전형을 수득하였다. 모든 돌연변이체 대립형질들은 동일하지 않은 의미(non-synonymous)의 단일 SNP를 보유한다(유색-코드화됨, 야생형, C580Y, R539T, Y493H 및 I543T에 대한 도 2에서와 동일한 유색-코드). 파일린(Pailin), 바탐방(Battambang), 푸르사트(Pursat) 및 크라티에(Kratie)에서 시간의 경과에 따라 야생형 대립형질 빈도에서의 유의한 감소(피셔의 정확 검정)가 관찰되었다(실시예 참조).
도 4 - A, 2009년부터 2010년까지 푸르사트 및 라타나키리(Ratanakiri)에서 기생충 단리물들에 대한 기생충 제거 반감기와 K13-프로펠러 대립형질의 상관관계. 야생형 기생충은 C580Y(7.19시간, 6.47-8.31, n=51, P<10-6, 만-휘트니 U 검정), R539T(6.64시간, 6.00-6.72, n=6, P<10-6) 또는 Y493H(6.28시간, 5.37-7.14, n=21, P<10-6) 기생충보다 더 짧은 반감기(중간 3.30시간, IQR 2.59-3.95, n=72)를 가진다. C580Y 기생충의 반감기는 Y493H 기생충의 반감기보다 유의하게 더 길다(P=0.007). B, 동일한 150개의 기생충 단리물들에 대한 기생충 제거 반감기, KH 하위집단15 및 K13-프로펠러 대립형질의 상관관계. KH 군 및 K13-프로펠러 대립형질에 의해 분류된, 푸르사트(정사각형) 및 라타나키리(정삼각형) 기생충들에 대한 반감기가 표시되어 있다(패널 A에서와 같이 유색-코드화됨). K13-프로펠러 대립형질에 의해 분류된 중간 반감기는 다음과 같다: [KH1: 야생형(2.88) 및 Y493H(6.77); KH2: C580Y(7.13) 및 Y493H(4.71); KH3: 야생형(3.65), C580Y(8.73) 및 R539T(6.65); KH4: Y493H(6.37); 및 KHA: 야생형(4.01), C580Y(7.09), Y493H(6.18) 및 R539T(5.73)].
도 5 - F32-ART5와 F32-TEM의 전체 게놈 서열 비교의 SNP-판정 알고리즘(a), 및 F32-TEM과 F-32 ART5에서 상이한 7개의 후보 유전자들에서 SNP들의 서열 및 커버리지(coverage)(b)
도 6 - 2011년부터 2012년까지 캄보디아에서 K13-프로펠러 대립형질들의 지리적 분포.
파이 도표(Pie chart)는 10개의 캄보디아 지역들에서 300개의 기생충 단리물들 사이의 K13-프로펠러 대립형질 빈도를 보여준다. 파이 크기는 단리물의 수에 비례하고, 상이한 대립형질들이 도 3에서와 같이 유색-코드화되어 있다. 돌연변이체 K13-프로펠러 대립형질들의 빈도(95% CI)는 다음과 같다: 파일린(95%, 88-99, n=84), 바탐방(93%, 87-99, n=71), 푸르사트(89%, 67-99, n=19), 캄포트(Kampot)(83%, 52-98, n=12), 캄퐁솜(Kampong Som)(71%, 29-96, n=7), 오다르 민쩨이(Oddar Meanchey)(76%, 58-89, n=33), 프레아 비히어(Preah Vihear)(16%, 3-40, n=19), 크라티에(71%, 44-90, n=17), 몬둘키리(67%, 9-99, n=3) 및 라타나키리(6%, 1-19, n=35).
도 7 - 8개의 캄보디아 지역들에서 ACT 치료 후 야생형 K13-프로펠러 대립형질의 빈도와 3일째 날 양성의 우세 사이의 상관관계.
3일째 날 양성의 빈도가 야생형 K13-프로펠러 대립형질의 빈도와 대비되어 작도되어 있다. 데이터는 8개의 캄보디아 지역들에서 2010년부터 2012년까지 플라스모듐 팔시파룸 말라리아에 대해 ACT로 치료받은 환자들로부터 유도되었다(도 4): 파일린(n = 86, 2011 WHO 치료 효능 연구, 아르테수네이트-메플로퀸); 푸르사트(n = 32, 2012 WHO 치료 효능 연구, 디하이드로아르테미시닌-피페라퀸); 오다르 민쩨이(n = 32, 2010 NAMRU-2 치료 효능 연구, 아르테수네이트-메플로퀸); 캄퐁솜/Speu(n = 7, 2012 WHO 치료 효능 연구, 디하이드로아르테미시닌-피페라퀸); 바탐방(n = 18, 2012 WHO 치료 효능 연구, 디하이드로아르테미시닌-피페라퀸); 크라티에(n = 15, 2011 WHO 치료 효능 연구, 디하이드로아르테미시닌-피페라퀸); 프레아 비히어(n = 19, 2011 WHO 치료 효능 연구, 디하이드로아르테미시닌-피페라퀸); 라타나키리(n = 32, 2010 WHO 치료 효능 연구, 디하이드로아르테미시닌-피페라퀸). 스피어만의 순위 상관관계 계수(8개 장소들): r=-0.99, 95% CI -0.99 내지 -0.96, P < 0.0001.
도 8 - 플라스모듐 팔시파룸 K13과 인간 KEAP1 단백질 사이의 상동성의 개략적 표시(A) 및 K13-프로펠러 도메인의 구조적 3D-모델(B).
A: 예측된 PF3D7 _1343700 단백질, 및 인간 Keap1과의 상동성의 개략적 표시. Keap1과 유사하게, PF3D7 _1343700은 4개의 역평행 베타 시트들로 구성된 켈치(kelch) 모티프를 조립하는, BTB/POZ 도메인 및 C-말단 6-블레이드 프로펠러를 함유한다. B: N-말단부터 C-말단까지 1부터 6까지 넘버링된 6개의 켈치 블레이드들을 보여주는 K13-프로펠러 도메인의 구조적 3D-모델.
인간 Keap146,47을 비롯한, 해상된 3D-구조를 가진 단백질들의 K13-프로펠러와 켈치 도메인 사이의 아미노산 동일성의 수준은 본 발명자들로 하여금 K13-프로펠러의 3D-구조를 모델링할 수 있게 하였고 ART 압력 하에서 선택된 돌연변이를 맵핑할 수 있게 하였다(표 4). K13-프로펠러 3D-모델의 정확성을 모델러(Modeller) 특이적 모델/신뢰성의 폴드(fold) 기준으로 확인하였다(실시예 참조). 본 발명자들은 K13-프로펠러가 C-말단 베타 시트와 N-말단 블레이드 사이의 상호작용46,48에 의해 폐쇄된 6개 블레이드 보유 β-프로펠러 구조48로 폴딩된다고 예상한다. 제1 도메인은 3개의 베타 시트를 갖고, 4번째 시트는 도 9에서 β'1로 지칭된 가외의 C-말단 베타 시트에 의해 기증된다.
인간 Keap1 켈치 프로펠러 스카폴드(scaffold)는 인간 폐암46 및 고혈압47에서 블레이드내 또는 블레이드간 상호작용에 영향을 미치는 다양한 돌연변이들에 의해 불안정화된다. 다양한 돌연변이들의 위치가 구형으로 표시되어 있다. F32-ART5에서 돌연변이된 M476 잔기는 짙은 회색으로 표시되어 있다. 인간 Keap1에서 관찰된 돌연변이와 마찬가지로46 , 47, 많은 K13-프로펠러 돌연변이들이 프로펠러의 구조를 변경시키거나 표면 전하를 변경시킴으로써 단백질의 생물학적 기능을 변경시킬 것으로 예상된다. 중요하게는, 캄보디아에서 관찰된 2개의 주요 돌연변이들 C580Y 및 R539T는 둘 다 비-보존적이고 조직화된 이차 구조, 즉 각각 이 스카폴드의 통합성을 변경시킬 것으로 예상되는 블레이드 4의 β-시트 및 블레이드 3의 표면에 위치한다.
Keap1의 켈치 프로펠러 도메인은 대다수의 켈치 함유 모듈들처럼 단백질-단백질 상호작용에 관여한다43. Keap1은 정상 상태 하에서 세포질에서 Nrf2를 격리시키는, 유도성 Nrf2 의존적 세포보호 반응의 음성 조절제이다. 산화적 스트레스 하에서, Nrf2/Keap1 복합체는 파괴되고, Nrf2는 핵으로 전위하고 핵에서 세포보호 ARE 의존적 유전자의 전사를 유도한다49 , 50. 본 발명자들은 K13-프로펠러의 돌연변이가 비공지된 단백질 파트너와 그의 상호작용을 손상시켜 탈조절된 항산화/세포보호 반응을 초래하므로, PF3D7 _1343700이 플라스모듐 팔시파룸에서 유사한 기능을 전담할 수 있다고 생각한다. 플라스모듐 팔시파룸 항산화 반응은 헤모글로빈 분해 및 대사가 가장 높을 때인 후기 영양체(trophozoite) 단계 동안 최대가 된다51. 그의 조절은 여전히 잘 이해되어 있지 않고 어떤 Nrf2 오르톨로그(ortholog)도 플라스모듐 게놈에서 확인될 수 없었다.
도 9a 및 9b - PF3D7 _1343700 기준 핵산(서열번호 1) 및 아미노산(서열번호 2) 코딩 서열(3D7-유형) 및 돌연변이체 위치.
도 9a - 유색 코드: 짙은 회색, 플라스모듐 특이적(1-225) 및 아피콤플렉사(Apicomplexa) 특이적(225-345) 위치; 옅은 회색, BTB/POZ 도메인. 도 9b에는 PlasmoDB 버전 9.3(http://www.plasmodb.org/plasmo/)에서 보고된 다형성 코돈의 위치 및 본 연구에서 관찰된 위치가 흑색 상자로 표시되어 있다. 감비아(Gambia)로부터의 한 단리물에서 관찰된 E621D와는 별개로 대다수의 보고된 다형성들이 N-말단 도메인에 위치한다는 것을 주목한다(참고문헌 44). 6개의 개별 켈치 도메인들이 각각 잔기 443부터 473까지, 474부터 526까지, 527부터 573까지, 574부터 614까지, 615부터 666까지, 및 667부터 726까지 위치한다.
도 10a 내지 10c - 7개의 플라스모듐 종들로부터의 PF3D7_1343700 오르톨로그들의 단백질 서열의 ClustalW-정렬.
코드:
F-XP_001350158 플라스모듐 팔시파룸(PF3D7_1343700)(서열번호 2)
V-XP_001614215 플라스모듐 비박스(P. vivax) Sal1(서열번호 3)
C-XP_004223579 플라스모듐 사이노몰기(P. cynomolgi)(서열번호 4)
K-XP_002259918 플라스모듐 날레시(P. knowlesi)(서열번호 5)
B-XP_674094 플라스모듐 베르게이(P. berghei)(서열번호 6)
Y-XP_730901 플라스모듐 요엘리이(P. yoelii)(서열번호 7)
PCHAS_136130 플라스모듐 차바우디(P. chabaudi)(서열번호 8)
다형성 플라스모듐 팔시파룸 잔기들은 회색 음영으로 표시되어 있다.
도 11 - 실시간 PCR - HRM: 돌연변이된 K13 프로펠러 대립형질 대 야생형 K13 프로펠러 대립형질의 검출. 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 1261-2181이다. 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 421-726이다.
모든 도메인을 증폭하기 위해 K13 유전자의 프로펠러 도메인의 서열에 대해 디자인된 6개 프라이머 쌍들이 화살표로 표시되어 있다.
도 12a 및 12b - 도 12a) 실시간 PCR에 의한 돌연변이된 K13 프로펠러 대립형질 대 야생형 K13 프로펠러 대립형질의 검출 - HRM(서열번호 1의 뉴클레오티드 1279-2127). 도 12b) 상기 6개 프라이머 쌍들의 서열, K13 프로펠러 도메인의 핵산 서열 상에서의 그들의 위치, 및 증폭 생성물의 크기(서열번호 27 내지 38).
도 13 - PCR 반응, 및 루미넥스(Luminex)® 다중 분석에 의한 프로브 혼성화에 의한 20개의 돌연변이된 K13 프로펠러 대립형질들의 검출(다중 리가제(Ligase) 검출 반응 - 형광 마이크로스피어 분석). 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 1261-2181이다. 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 421-726이다.
흑색 화살표는 PCR 반응을 위한 프라이머를 보여준다.
프라이머 F 5'-gccttgttgaaagaagcaga-3'(서열번호 14)
프라이머 R 5'-gccaagctgccattcatttg -3'(서열번호 13)
K13 프로펠러 도메인에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출하기 위해 특이적 프로브(옅은 회색 및 짙은 회색)가 디자인된다. 옅은 회색 프로브는 대립형질 특이적이고 형광 비드에 결합된다. 각각의 옅은 회색 위치에 대해 2개의 프로브들, 즉 3' 말단에서 돌연변이된 뉴클레오티드를 가진 프로브 및 3' 말단에서 야생형 뉴클레오티드를 가진 프로브가 존재한다. 짙은 회색 프로브는 보존된 서열 영역에서 디자인되고 바이오틴에 결합된다.
SNP들의 목록:
Figure 112016056900663-pct00003

Figure 112016056900663-pct00004

표 1 - F32-ART5에서 동일하지 않은 의미의 단일뉴클레오티드 다형성을 함유하는 유전자를 증폭하기 위해 사용된 프라이머의 서열. 정방향 프라이머(서열번호 39 내지 45) 및 역방향 프라이머(서열번호 46 내지 52)가 표시되어 있다.
표 2 - 증가하는 농도의 아르테미시닌에의 효과적인 5년 불연속 노출 동안 F32-TEM 계통(lineage)에 비해 F32-ART5에서 획득된 8개의 동일하지 않은 의미의 단일 뉴클레오티드 다형성들의 설명.
# 3D7-유형 서열; 동일한 코돈 서열이 F32-탄자니아 모세포주에서도 관찰된다.
* 상응하는 약물-압력 주기 동안 선택을 위해 사용된 아르테미시닌(ART) 용량.
a 문헌(Takala-Harrison et al.16)에서 선택의 상위 순위 시그너처의 염색체 위치에서 발견된 유전자.
표 3 - F32-ART5 기생충에서 돌연변이된 유전자의 보고된 특성.
표 4 - K13-프로펠러 다형성에 대해 연구된, 보관된 혈액 샘플의 지리적 기원 및 수집 년도.
표 5 - 2001년부터 2012년까지 감비아(참고문헌 42)에서 수집된 캄보디아 플라스모듐 팔시파룸 단리물들 내의 K13-프로펠러에서 관찰된 다형성.
* F32-ART5에서 관찰되었으나, 캄보디아에서는 관찰되지 않았다.
** 감비아(참고문헌 42)에서 보고되었으나, 캄보디아에서는 관찰되지 않았다.
표 6 - 2009년부터 2010년까지 캄보디아의 푸르사트(n=103) 및 라타나키리(n=47) 지역들에서 수집된 150개의 플라스모듐 팔시파룸 단리물들에서 관찰된 K13-프로펠러 및 KH 하위집단(참고문헌 15)에서 관찰된 다형성들 사이의 연관성.
표 7 - 아시아 및 아프리카에서 K13 프로펠러 도메인에서 확인된 가장 빈번한 돌연변이들의 목록.
표 8 - 캄보디아로부터의 50개 임상 플라스모듐 팔시파룸 단리물들(2010년부터 2011년까지 수집됨)은 문헌(Witkowski et al.45)에 기재된 바와 같이 시험관내 배양에 적응되었다. RSA 및 다형성이 표시되어 있다.
동남아시아에서의 아르테미시닌 유도체에 대한 플라스모듐 팔시파룸 내성은 전세계적 말라리아 구제 및 제거 활동을 위협한다. 아르테미시닌 내성의 확산을 모니터링하기 위해, 분자 마커가 절실히 필요하다. 본원에서, 본 발명자들은 아프리카로부터의 아르테미시닌 내성 기생충 세포주 및 캄보디아로부터의 임상 기생충 단리물의 전체 게놈 서열결정을 이용하여, PF3D7_1343700 켈치 프로펠러 도메인('K13-프로펠러') 내의 돌연변이와 시험관내 및 생체내에서의 아르테미시닌 내성을 연관시킨다. 돌연변이체 K13-프로펠러 대립형질은 내성이 우세한 캄보디아 지역에 밀집되어 있고, 서부 캄보디아에서 우성 돌연변이체 K13-프로펠러 대립형질의 증가하는 빈도는 내성의 최근 확산과 상관관계를 가진다. 돌연변이체 대립형질의 존재, 시험관내 기생충 생존율 및 생체내 기생충 제거율 사이의 강한 상관관계는 K13-프로펠러 돌연변이가 아르테미시닌 내성의 중요한 결정인자라는 것을 시사한다. K13-프로펠러 다형성은 메콩강 유역권에서의 아르테미시닌 내성을 함유하고 그의 전세계적 확산을 예방하기 위한 대규모 감시 노력에 유용한 분자 마커를 구성한다.
ART 내성에 대한 후보 분자 마커의 확인
5년 동안 아르테미시닌의 용량 상승 125-주기 요법 하에서 ART 민감성 F32-탄자니아 클론을 배양함으로써 ART 내성 F32-ART5 기생충 세포주를 선택하였다18. 각각 460x 및 500x 평균 뉴클레오티드 커버리지에서 F32-ART5 및 F32-TEM(아르테미시닌 없이 배양된 그의 형제(sibling) 클론) 둘 다에 대한 전체 게놈 서열을 수득하였다. F32-TEM에 비해 F32-ART5에서 어떠한 결실된 유전자도 확인되지 않았다. (i) 고도 가변성 다중-유전자 패밀리(var, rifin 및 stevor)로부터의 유전자, (ii) 기생충 세포주의 평균 커버리지의 25%보다 더 낮은 커버리지를 가진 위치, (iii) 획득된 ART 내성 돌연변이(들)가 5년의 연속 압력 후 샘플에서 고정될 것으로 예상될 수 있다는 점을 고려할 때, F32-ART5에서 혼합되어 있는 것으로 발견된 단일 뉴클레오티드 다형성들(SNP들), (iv) F32-ART5와 ART 민감성 3D7 기생충 균주 사이에 공유된 SNP들, 및 (v) 동일한 의미(동의)(synonymous)의 SNP들을 배제한 후 F32-ART5 및 F32-TEM의 엑솜들(exomes)을 비교하였다(도 5).
이 분석은 추후에 PCR 생성물의 생거(Sanger) 서열결정에 의해 확인된 7개의 유전자들에서 8개의 돌연변이들을 확인하였다(표 1). 각각의 유전자는 F32-TEM, F32-탄자니아 또는 3D7에 비해 F32-ART5에서 1개의 돌연변이체 코돈을 보유한다(표 2). 유전자의 발현 및 단백질의 생물학적 기능에 대한 정보는 표 3에 나열되어 있다. 이 유전자들 중 하나, 즉 시스테인 프로테아제 칼시파인(falcipain) 2a(PF3D7_1115700)만이 ART에 대한 시험관내 반응과 이미 연관되어 있었다19. 각각의 돌연변이가 F32-ART5 계통에서 언제 발생하였는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 다양한 약물-압력 주기들에서 기생충의 전체 게놈 서열을 분석하였다(도 1). 이 분석은 ART 내성의 급격한 증가 동안 PF3D7_0110400 D56V 및 PF3D7_1343700 M476I 돌연변이가 가장 먼저 획득되었고 그 후 안정하게 유지되었다는 것을 보여주었다. 중요하게는, 이들 2개의 돌연변이들의 출현은 윤상체-단계 생존 분석(RSA0 -3h) 생존율이 0.01% 미만부터 12.8%까지 증가한 것과 연관되어 있다. PF3D7 _1343700 좌위의 후속 PCR 분석은 30회 약물-압력 주기 후 M476I 돌연변이를 검출하였고, 이것은 그 후 관찰된 RSA0-3h 생존율의 급격한 증가와 일치한다. 다른 SNP들은 선택의 후기 단계에서 단계적으로 출현하였다: PF3D7 _0213400(68회 주기); PF3D7 _1115700(98회 주기); PF3D7 _1302100, PF3D7 _1459600 및 PF3D7 _1464500(120회 주기)(표 2). 이 데이터는 PF3D7 _1343700 M476I 돌연변이가 RSA0 -3h에서 DHA에 대한 F32-탄자니아의 내성을 증가시켰다는 것을 암시한다.
이들 돌연변이들이 캄보디아에서의 ART 내성과 연관되어 있는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 2010년부터 2011년까지 수집된 49개의 배양-적응된 기생충 단리물들에 대한 전체 게놈 또는 생거 서열을 분석함으로써 모든 7개의 유전자들에서 서열 다형성을 연구하였다(실시예 참조). 본 발명자들은 이들 단리물들을 이들의 상이한 RSA0-3h 생존율(표 8)에 기초하여 선택하였고, 이들의 서열들을 대조군 기생충 세포주 3D7, 89F520 및 K1992의 서열들과 비교하였다(실시예 참조). 3개의 유전자들(PF3D7_0110400, PF3D7 _0213400 및 PF3D7 _ 1302100)은 모든 기생충 단리물들에 대한 야생형 서열을 코딩한다. 다른 4개의 유전자들은 이전에 보고된 집단내 다양성 및 신규 SNP들을 보인다(표 8). PF3D7 _1115700은 RSA0 -3h 생존율과 연관되지 않은 11개의 SNP들을 가진다(P=0.06, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정). PF3D7 _1459600은 생존율과 연관되지 않은 6개의 SNP들을 가진다(P=0.65). PF3D7_1464500은 ART 민감성 Dd2 세포주21를 비롯한, 동남아시아로부터의 오래된 단리물들에서 이미 보고된 12개의 SNP들(아마도 지리적 시그너처를 반영함)을 가진다. 이 SNP들도 생존율과의 유의한 연관성을 보이지 않는다(P=0.42). 따라서, 이들 6개의 유전자들은 더 연구되지 않았다.
대조적으로, PF3D7 _1343700 다형성은 RSA0 -3h 생존율과의 유의한 연관성을 보인다(도 2). 실제로, RSA0 -3h 생존율은 야생형 K13-프로펠러 대립형질을 가진 기생충 단리물(중간 0.17%, 범위 0.06-0.51%, n=16)과 돌연변이체 K13-프로펠러 대립형질을 가진 기생충 단리물(18.8%, 3.8-58%, n=33) 사이에 실질적으로 상이하다(P<10-4, 만-휘트니 U 검정)(표 8). C-말단 K13-프로펠러 도메인의 켈치 반복부 내의 동일하지 않은 의미의 단일 SNP, 즉 각각 반복부 #2, #3, #3 및 #4 내에 위치하는 Y493H, R539T, I543T 및 C580Y를 각각 보유하는 4개의 돌연변이체 대립형질들이 관찰된다. K1992 및 ART 민감성 89F5 세포주 둘 다가 야생형 K13-프로펠러를 보유한다. K-13 프로펠러에서의 다형성과 다른 후보 유전자에서의 다형성 사이에는 연관성이 없다(표 8). 본 발명자들은 이들 관찰결과들 및 F32-ART5에 의한 켈치 반복부 #2에서의 M476I의 획득에 기초하여 K13-프로펠러 다형성이 캄보디아에서 ART 내성의 분자 시그너처인지를 조사하였다.
캄보디아에서 돌연변이체 K13-프로펠러 대립형질의 출현 및 확산
지난 수십 년에 걸쳐, ART 내성의 확산은 캄보디아의 서부 지역에서 꾸준히 증가되었으나, 상기 국가의 다른 지역에서는 증가하지 않았다2. K13-프로펠러 돌연변이의 시공간적 분포가 ART 내성의 시공간적 분포와 상관관계를 갖는지를 검사하기 위해, 본 발명자들은 2001년부터 2012년까지 말라리아를 가진 캄보디아 환자들로부터의 보관된 기생충 단리물들의 K13-프로펠러를 서열결정하였다(표 4). 6개의 지역들로부터의 데이터를 비교하였다(n=886): ART 내성이 확립된 서부의 파일린, 바탐방 및 푸르사트1, 6, 8, 22, ART 내성이 최근에 증가한 남동부의 크라티에2, 및 이 기간 동안 ART 내성의 증거가 사실상 없는 북부의 프레아 비히어 및 북동부의 라타나키리2. 이 분석은 3개의 고빈도(≥ 5%) 대립형질들(C580Y, R539T 및 Y493H)을 비롯한 총 17개의 돌연변이체 대립형질들을 보여준다. 야생형 서열의 빈도는 모든 3개의 서부 지역들에서 시간의 경과에 따라 유의하게 감소하였으나, 프레아 비히어 또는 라타나키리에서는 감소하지 않았다. C580Y 대립형질의 빈도는 파일린 및 바탐방에서 2001 내지 2002년부터 2011년 내지 2012년까지 유의하게 증가하였는데, 이것은 이 지역들에서의 그의 빠른 인구 침습 및 가까운 고착을 시사한다(도 3).
캄보디아에서 K13-프로펠러 다형성의 지리적 다양성을 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 2011년부터 2012년까지 4개의 추가 지역들(n=55, 캄퐁솜, 캄포트, 몬둘키리 및 오다르 민쩨이)로부터의 데이터를 포함하도록 본 발명자들의 서열 분석을 확장하였다(표 4). 다수의 돌연변이들이 관찰되지만(도 9 및 표 5), C580Y 대립형질은 2011년부터 2012년까지 관찰된 모든 돌연변이체 대립형질들의 85%(189/222)를 차지한다(도 6). 이 맵핑은 K13-프로펠러에서 동일하지 않은 의미의 단일 돌연변이를 보유하는 기생충들의 상승된 빈도(74%, 222/300) 및 그들의 분포의 지리적 차이를 개략적으로 보여준다. 중요하게는, 다양한 지역들에 걸쳐 돌연변이체 대립형질들의 빈도 분포는 ACT로 말라리아에 대해 치료받은 환자들에서의 3일째 날 양성(임상 ART 내성의 암시적 징후로서 간주됨)의 빈도 분포와 일치한다(스피어만의 r=0.99, 95% CI 0.96-0.99, P<0.0001)(도 7).
K13-프로펠러 다형성, ART 내성 하위집단 및 임상 ART 내성 사이의 관계
K13-프로펠러 다형성이 임상 ART 내성의 분자 마커인지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 푸르사트 및 라타나키리로부터 163명의 환자들을 먼저 확인하였고, 본 발명자들은 2009년부터 2010년까지 이 환자들에서 기생충 제거 반감기(범위 1.58-11.53시간)6를 측정하였고 전체 게놈 서열 데이터15의 혈통 분석에 기초하여 이 환자들에 대해 기생충들을 KH 하위집단(KH1, KH2, KH3, KH4 또는 KHA)으로 미리 배정하였다. 혼합된 유전형(야생형 및 하나 이상의 돌연변이체 K13-프로펠러 대립형질)을 가진 13명의 환자들이 배제되었다. 남은 150명의 환자들 중 72명의 환자들은 야생형 대립형질을 가진 기생충을 보유하였고, 나머지 환자들은 K13-프로펠러 내에 동일하지 않은 의미의 단일 SNP만을 가진 기생충을 보유하였다: C580Y(n=51), R539T(n=6) 및 Y493H(n=21)(표 6). 야생형 기생충을 가진 환자에서 기생충 제거 반감기(중간 3.30시간, IQR 2.59-3.95)는 C580Y(7.19시간, 6.47-8.31, P<10-6, 만-휘트니 U 검정), R539T(6.64시간, 6.00-6.72, P<10-4) 또는 Y493H(6.28시간, 5.37-7.14, P<10-6) 기생충을 가진 환자들의 기생충 제거 반감기보다 유의하게 더 짧다(도 4의 A). 또한, C580Y 기생충을 보유하는 환자의 기생충 제거 반감기는 Y493H 기생충을 가진 환자의 기생충 제거 반감기보다 유의하게 더 길다. 이 데이터는 C580Y, R539T 및 Y493H가 ART로 치료받은 말라리아 환자에서 기생충의 느린 제거를 확인시켜준다는 것을 시사한다.
KH2, KH3, KH4 및 KHA가 KH1 기생충보다 더 긴 반감기를 갖기 때문에15, 본 발명자들은 K13-프로펠러에서의 대립형질 변이가 이 차이를 설명한다는 가설을 세웠다. 150개의 기생충들 중에서 55개, 26개, 14개, 12개 및 43개의 기생충들이 각각 KH1, KH2, KH3, KH4 및 KHA로서 분류된다. 3개의 K13-프로펠러 대립형질들이 KH 군과 강하게 연관되어 있다: 96%(53/55)의 KH1, 96%(25/26)의 KH2 및 100%(12/12)의 KH4 기생충들이 각각 야생형, C580Y 및 Y493H 대립형질을 보유한다(표 6). KH3 기생충(n=14)이 야생형, C580Y 및 R539T 대립형질을 보유하지만, R539T는 KH1, KH2 또는 KH4 기생충에서 관찰되지 않는다. 예상된 바와 같이, KHA 기생충은 혼합된 대립형질 조성을 가진다. 중요하게는, K13-프로펠러 돌연변이는 기생충의 느린 제거를 KH 군보다 더 정확하게 확인시켜주고(도 4의 B), 이것은 캄보디아에서 임상 ART 내성을 나타내는 K13-프로펠러 다형성의 연관성이 KH 하위집단의 유전적 배경과 부분적으로 무관하다는 것을 입증한다. KH1 군(n=55) 내에서, 야생형 기생충을 가진 환자에서의 기생충 제거 반감기(n=53, 중간 2.88시간, IQR 2.52-3.79)는 Y493H 기생충을 가진 환자에서의 기생충 제거 반감기(n=2, 중간 6.77시간, P=0.02, 만-휘트니 U 검정)보다 유의하게 더 짧다. KH3 하위집단(n=14) 내에서, 야생형 기생충을 가진 환자에서의 반감기(n=3, 중간 3.65시간)는 C580Y(n=7, 중간 8.73시간, IQR 7.35-9.06, P=0.02) 또는 R539T(n=4, 6.65시간, 6.29-6.80, P=0.03) 기생충을 가진 환자에서의 반감기보다 더 짧다.
F32-ART5 계통은 RSA0 -3h에서 DHA에의 약리학적으로 유의한 노출에서 생존하는 그의 능력에 의해 표시된 바와 같이 ART 내성을 발달시킴에 따라 K13-프로펠러 돌연변이를 획득하였다. ART 내성과 잠정적으로 연관된 유전자(Pfcrt 23 , 24, Pftctp 25 , 26, Pfmdr1 8 , 27, 28, Pfmrp1 27 -29 및 ABC 수송체30) 또는 ART의 잠정적 표적을 코딩하는 유전자(PfATPase6 31, 32 및 Pfubcth - 플라스모듐 차바우디 ubp1의 오르톨로그33 , 34)는 F32-ART5의 5년 선택 동안 돌연변이되지 않았고, Pfmdr1 증폭은 관찰되지 않았다35 -40. 추가로, 문헌(Takala-Harrison et al.16)에 의해 확인된 계통-불균형 윈도우에 위치하는 PF3D7 _1343700 및 PF3D7 _1459600을 제외한, 집단 유전학 방법14 , 40, 41을 이용함으로써 최근에 확인된 모든 후보 ART 내성 유전자들은 F32-ART5 계통에서 변경되지 않은 상태로 남아있었다. 이 발견은 본 발명자들로 하여금 캄보디아에서 천연 순환 기생충에서 또 다른 17개의 단일 K13-프로펠러 돌연변이들을 확인하게 하였다. 이 돌연변이들 중 여러 돌연변이들이 캄보디아에서의 ART 내성의 시공간적 분포, 시험관내 DHA에 반응한 증가된 기생충 생존율, 및 생체내 ART 치료에 반응한 긴 기생충 제거 반감기와 강하게 연관되어 있다. F32-ART5에서 돌연변이된 6개의 다른 유전자들 중 어느 유전자도 캄보디아로부터의 기생충 단리물에서의 RSA0-3h 생존율과 연관되어 있지 않다.
K13-프로펠러 다형성은 여러 이유들로 ART 내성의 분자 마커의 정의를 충족시킨다: (i) 서부 캄보디아에서 ART 내성 출현의 십년 동안 이 지역에서 야생형 기생충의 점진적인 손실이 있었고; (ii) 돌연변이체 기생충들은 ART 내성이 잘 확립되어 있는 캄보디아 지역에 밀집되어 있고 ART 내성이 흔하지 않은 지역에서 덜 우세하고; (iii) PF3D7 _1343700은 최근 양성 선택 하에서 존재하는 것으로 문헌(Cheeseman et al.14)에 의해 확인된 35 kb 좌위의 5.9 kb 업스트림에 위치하고, 문헌(Takala-Harrison et al.16)에 의해 요약된 선택의 상위 순위 시그너처의 영역 내에 위치하고; (iv) 모두 동일하지 않은 의미의 돌연변이들인 다수의 돌연변이들이 K13-프로펠러에 존재하는데, 이것은 히치하이킹(hitchhiking) 효과 또는 유전적 표류(genetic drift)보다는 오히려 양성 선택을 반영하고; (v) 돌연변이들은 플라스모듐 팔시파룸에서 고도로 보존되어 있는 도메인에서 발생하고, 이때 동일하지 않은 의미의 1개 SNP만이 아프리카로부터의 단일 기생충 단리물에서 문서로 기록되어 있고42; (vi) 본 발명자들이 캄보디아에서 관찰한 모든 다형성들이 신규하고 하나(V568G)를 제외한 모두가 플라스모듐 종들 사이에 엄격히 보존된 위치에서 발생하는데(도 9 및 도 10), 이것은 상기 단백질에 대한 강한 구조적 및 기능적 구속을 암시하고; (vii) 3개의 가장 우세한 K13-프로펠러 돌연변이들은 각각 개별 기생충 단리물 및 말라리아 환자의 수준에서 시험관내 RSA0 -3h 생존율 및 생체내 기생충 제거 반감기와 강한 상관관계를 갖고; (viii) 돌연변이체 대립형질의 빈도는 캄보디아에서 인간 집단의 수준에서 ACT 치료 후 3일째 날 양성의 우세와 강한 상관관계를 가진다.
본 발명자들은 다른 켈치 프로펠러 도메인과의 상동성을 기초로 관찰된 K13-프로펠러 돌연변이가 도메인 스카폴드를 불안정화시키고 그의 기능을 변경시킬 것이라고 예상한다. PF3D7 _1343700의 C-말단 부분은 다양한 세포 기능들을 가진 다수의 단백질들에서 발견되는 6개의 켈치 모티프들을 코딩한다43 , 44. ART 유도체들의 독성이 그들의 전구-산화제 활성에 주로 의존한다는 점을 고려할 때, 외부 스트레스에 대한 세포보호 및 단백질 분해 반응을 조절함에 있어서 일부 켈치 함유 단백질들의 보고된 역할은 특히 매우 흥미롭다. K13-프로펠러는 유비퀴틴(ubiquitin)-기초 단백질 분해에 관여하는 인간 KLHL12 및 KLHL2, 및 산화적 스트레스에의 세포 적응에 관여하는 KEAP1과의 상동성을 보인다(도 8). 분명하게는, K13의 정상 기능 및 다양한 돌연변이들의 영향을 설명하기 위해 향후 연구가 필요하다. 돌연변이체 및 야생형 기생충에서의 대립형질 교환 연구는 상이한 유전적 배경 상의 K13-프로펠러 다형성이 RSA0 -3h 생존율에 기여하는 정도를 정의하는 데에 도움을 줄 수 있다. 실제로, 2개만큼 적은 돌연변이들, 즉 K13-프로펠러 M476I 및 PF3D7_0110400 D56V가 전형적인 아프리카인 유전적 배경을 가진 F32-탄자니아에게 ART 내성을 부여하기에 충분하였다는 것은 특히 우려스럽다. 돌연변이체 K13-프로펠러를 가진 캄보디아 기생충이 광범위한 RSA0 -3h 생존율(3.8%-58%) 및 기생충 제거 반감기(4.5-11.5시간)를 나타내기 때문에, 최근에 확인된16 , 14 강하게 선택된 영역에 존재할 수 있는, ART 내성의 추가 유전적 결정인자들을 확인하기 위한 추가 연구가 요구된다. 이 내용에서, 동일한 K13-프로펠러 돌연변이를 보유하는 기생충들 사이에 정량적 특징으로서의 RSA0 -3h 생존율을 분석하는 것은 ART 내성에 관여하는 추가 유전적 좌위를 확인하는 데에 도움을 줄 수 있었다.
요약하건대, K13-프로펠러 다형성은 ART 내성 플라스모듐 팔시파룸의 출현 및 확산을 추적하기에 유용한 분자 마커이다.
플라스모듐을 유전형분석하는 방법
본 발명은 플라스모듐, 특히 플라스모듐 팔시파룸을 유전형분석하는 방법을 포괄한다. 시험관내에서 수행되는 상기 방법은 생물학적 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 샘플은 환자로부터 이미 수득되어 있고 특히 혈액 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 플라스모듐을 함유하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계 및 상기 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질은 당분야에서 일반 기법에 의해 검출된다. 예를 들면, 실시예 또는 본원의 다른 부분에 기재된 기법이 이용될 수 있다.
생물학적 샘플은 유리하게는 혈액 샘플이다.
야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산은 당분야에서 공지된 다수의 기법들, 예컨대, 서열결정, 혼성화 또는 증폭 분석에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 내용 내에서, "야생형 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 핵산"은 서열번호 1의 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 변이체 핵산 서열을 가진 핵산을 의미한다. 본 발명의 내용 내에서, "야생형 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 단백질"은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 단백질을 의미한다. 다른 야생형 플라스모듐 K-13 프로펠러 단백질들은 도 10에 제시되어 있다.
본 발명의 내용 내에서, "돌연변이체 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 핵산"은 "돌연변이된 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 핵산"과 동의어이고 서열번호 2의 아미노산 서열과의 하나 이상의 아미노산의 차이를 초래하는, 서열번호 1의 핵산 서열과의 하나 이상의 차이를 가진 핵산 서열을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 돌연변이체 플라스모듐 팔시파룸 K13-프로펠러 핵산은 카복시-말단 K13-프로펠러 도메인의 켈치 반복부 내에서 동일하지 않은 의미의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 보유한다. 보다 바람직하게는, 동일하지 않은 의미의 단일 SNP는 하기 SNP들 중 하나이다:
Figure 112016056900663-pct00005
본 발명의 내용 내에서, "돌연변이체 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 단백질"은 "돌연변이된 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 단백질"과 동의어이고 서열번호 2의 아미노산 서열과의 하나 이상의 차이를 가진 아미노산 서열을 의미한다. 서열번호 2의 아미노산 서열과의 하나 이상의 차이는 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 단백질의 카복시-말단 K13-프로펠러 도메인의 켈치 반복부 내의 하나 이상의 돌연변이체 아미노산이다.
바람직한 돌연변이체 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 단백질은 도 9 또는 13에 표시된 돌연변이들 중 하나 이상을 가진다.
보다 바람직한 돌연변이체 플라스모듐 팔시파룸 K-13 프로펠러 단백질은 도 9 또는 13에 표시된 돌연변이들 중에서 선택된 단일 돌연변이를 가진다.
또한, 이 돌연변이들은 상기 제공된 SNP들의 목록에 따라 정의된다.
다양한 실시양태들에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 이것은 야생형 K13 프로펠러 단백질과 돌연변이체 K-13 프로펠러 단백질을 구별하는 특정 항체를 사용함으로써 수행될 수 있다. 이 항체는 환자 샘플과 접촉될 수 있고, 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 단백질의 존재 또는 부재는 면역학적 반응의 존재 또는 부재를 검출함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 ELISA 분석을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 플라스모듐을 함유하는 샘플을 제공하는 단계 및 상기 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재는 서열결정 또는 PCR에 의해 검출된다.
바람직하게는, 플라스모듐은 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레 쿠르티시(Plasmodium ovale curtisi), 플라스모듐 오발레 왈리케리(Plasmodium ovale wallikeri), 플라스모듐 말라리애(Plasmodium malariae), 플라스모듐 날레시(Plasmodium knowlesi), 플라스모듐 브라실리아눔(Plasmodium brasilianum), 플라스모듐 사이노몰기(Plasmodium cynomolgi), 플라스모듐 사이노몰기 바스티아넬리이(Plasmodium cynomolgi bastianellii), 플라스모듐 이누이(Plasmodium inui), 플라스모듐 로디아니(Plasmodium rhodiani), 플라스모듐 슈바이치(Plasmodium schweitzi), 플라스모듐 세미오발레(Plasmodium semiovale), 플라스모듐 시뮴(Plasmodium simium), 플라스모듐 베르게이(Plasmodium berghei), 플라스모듐 요엘리이(Plasmodium yoelii) 및 플라스모듐 차바우디(Plasmodium chabaudi)로부터 선택된다.
본 발명은 플라스모듐을 유전형분석하는 방법을 포괄한다. 바람직하게는, 상기 방법은 (야생형 K13 대립형질을 가진) 아르테미시닌 민감성 플라스모듐을 (돌연변이체 K13 대립형질을 가진) 아르테미시닌 내성 플라스모듐으로부터 구별한다.
본 발명은 K13 프로펠러 도메인 핵산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 시험관내 방법을 포괄한다. 본 발명은 플라스모듐을 함유하는 생물학적 샘플에서 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서, K13 프로펠러 핵산을 돌연변이체 K13 프로펠러에 대해 특이적인 프로브와 접촉시키는 단계 및 상기 프로브와 K13 프로펠러 핵산의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 포괄한다. 상기 프로브와 K13 프로펠러 핵산의 결합은 당분야의 일반 기법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 기법들 중 임의의 기법이 이용될 수 있다. 예시적인 돌연변이체 및 프로브는 실시예 15 및 도 13에 제시되어 있다. 바람직하게는, 프로브는 15, 20, 25 또는 30 bp 이상의 크기를 가진다. 가장 바람직하게는, 프로브는 15 내지 20 nt, 15 내지 25 nt, 15 내지 30 nt, 20 내지 25 nt, 또는 25 내지 30 nt의 크기를 가진다.
일부 실시양태들에서, 프로브는 형광 비드에 결합된다. 일부 실시양태들에서, 상기 방법은 프로브를 돌연변이체 K13 프로펠러 도메인 핵산에 결합시키는 단계, 및 결합된 K13 프로펠러 도메인 핵산에 결합하는 프로브로 상기 결합된 K13 프로펠러 도메인 핵산을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, K13 프로펠러 핵산은 검출 전에 증폭된다.
한 실시양태에서, 플라스모듐의 핵산은 K13 프로펠러 도메인 핵산 서열의 증폭 단계로 처리된다. 다양한 실시양태들에서, K13 프로펠러 도메인 핵산 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 단편들이 증폭된다. 증폭된 단편은 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200 nt 이상의 크기 내지 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 또는 300 nt 이상의 크기를 가질 수 있다. 이 증폭을 위한 프라이머는 본원에 기재된 프라이머들 중 임의의 프라이머일 수 있다.
바람직하게는, 증폭 방법은 PCR, 가장 바람직하게는 실시간 PCR, PCR-HRM(고해상 DNA 용융)(문헌(Andriantsoanirina et al. Journal of Microbiological Methods, 78: 165 (2009)) 참조), 또는 형광 마이크로스피어(루미넥스® 마이크로스피어)에 기초한 리가제 검출 반응에 커플링된 PCR이다. 이 마지막 방법은 다중 분석을 수행하여 동시에 여러 돌연변이된 K13 프로펠러 대립형질들을 검출할 수 있게 한다.
다른 바람직한 증폭 방법은 리가제 연쇄 반응(LCR)(예를 들면, 문헌(Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989)), 문헌(Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)) 및 문헌(Barringer et al. Gene 89:117 (1990))), 전사 증폭(문헌(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)) 및 국제 특허출원 공보 제WO88/10315호), 자가-지속 서열 복제(문헌(Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)) 및 국제 특허출원 공보 제WO90/06995호), 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭(미국 특허 제6,410,276호) 및 핵산-기초 서열 증폭(NABSA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호)을 포함한다. 이용될 수 있는 다른 증폭 방법은 미국 특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 제6,582,938호에 기재되어 있다. 핵산의 증폭에 관한 상기 참고문헌들은 각각의 증폭 방법에서 증폭을 위해 사용된 구체적인 반응 조건의 개시에 대하여 참고로 구체적으로 도입된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 플라스모듐 핵산을 제공하는 단계, 상기 플라스모듐 핵산에서 K13 프로펠러 도메인 핵산 서열의 하나 이상의 단편을 PCR 증폭하는 단계, 및 상기 K13 프로펠러 도메인 핵산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명은 플라스모듐을 함유하는 생물학적 샘플에서 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서, 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산을 PCR 반응으로 증폭하는 단계, 및 증폭된 핵산을 돌연변이체 K13 프로펠러에 대해 특이적인 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포괄한다. 예시적인 돌연변이체 및 프로브는 실시예 15 및 도 13에 제시되어 있다. 바람직하게는, 프로브는 15, 20, 25 또는 30 bp 이상의 크기를 가진다.
한 실시양태에서, 돌연변이는 고해상 DNA 용융에 의해 검출된다. 다양한 실시양태들에서, K13 프로펠러 도메인 핵산 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 단편이 증폭되고 돌연변이의 존재에 대해 고해상 DNA 용융에 의해 평가된다. 가장 바람직하게는, K13 프로펠러 도메인 핵산 서열의 6개 단편들이 증폭되고 돌연변이의 존재에 대해 고해상 DNA 용융에 의해 평가된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 플라스모듐의 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 임의적으로 상기 생물학적 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계; 플라스모듐의 DNA를, 바람직하게는 100 내지 300 bp 범위의 거리에서 K13 프로펠러 핵산과 특이적으로 혼성화하는 한 쌍 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계; 및 바람직하게는 인터칼레이팅 염료의 존재 하에서 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 증폭 생성물은 용융 단계로 처리되고, 증폭 생성물의 용융 프로파일이 생성된다. 용융 단계는 증폭 생성물의 용융 프로파일을 분석함으로써 돌연변이체 대립형질 또는 야생형 대립형질의 존재의 확인을 가능하게 할 수 있다.
한 실시양태에서, 돌연변이는 K13 프로펠러 도메인에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출하기 위해 디자인된 특이적 프로브에 의해 검출된다. 한 실시양태에서, 대립형질 특이적 프로브는 고체 기판, 바람직하게는 비드, 가장 바람직하게는 형광 비드에 결합된다. 상기 프로브는 K13 프로펠러 도메인 내의 돌연변이 또는 야생형 K13 프로펠러 도메인에 대해 특이적일 수 있다. 상기 프로브는 돌연변이체 또는 야생형 K13 프로펠러 도메인 핵산에 결합(즉, 포획)할 수 있다. 그 다음, 결합된(즉, 포획된) K13 프로펠러 도메인 핵산은 결합된(즉, 포획된) K13 프로펠러 도메인 핵산에 결합하는 프로브로 검출될 수 있다. 바람직하게는, 분석은 형광 마이크로스피어(루미넥스® 마이크로스피어)에 기초한다. 예시적인 돌연변이체 및 프로브는 실시예 15 및 도 13에 제시되어 있다. 바람직하게는, 프로브는 15, 20, 25 또는 30 bp 이상의 크기를 가진다. 바람직하게는, 프로브는 실시예 15 및 도 13에 나열된 돌연변이들 중 하나에 걸친다.
다양한 실시양태들에서, K13 프로펠러 도메인 핵산 서열의 하나 이상의 단편은 서열번호 15 내지 26으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 가진 하나 이상의 프라이머를 사용함으로써 증폭된다. 바람직하게는, 증폭을 위해 사용된 하나 이상의 프라이머 세트는 하기 프라이머 쌍들로부터 선택된다:
Figure 112016056900663-pct00006
다양한 실시양태들에서, K13 프로펠러 도메인 핵산 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 단편이 증폭되고 돌연변이의 존재에 대해 평가된다. 가장 바람직하게는, K13 프로펠러 도메인 핵산 서열의 6개 단편들이 증폭되고 돌연변이의 존재에 대해 고해상 DNA 용융에 의해 평가된다. 바람직하게는, 검출된 돌연변이는 하기 돌연변이들(전/후)로부터 선택된다:
Figure 112016056900663-pct00007
가장 바람직하게는, 검출된 돌연변이는 하기 돌연변이들 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 전부이다:
Figure 112016056900663-pct00008
ART 내성을 모니터링하는 방법
본 발명은 플라스모듐의 ART 내성을 모니터링하는 방법을 포괄한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 플라스모듐을 생장시키는 단계, 플라스모듐과 아르테미시닌을 접촉시키는 단계, 및 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질에서 돌연변이를 검출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 플라스모듐은 바람직하게는 본원에 참고로 도입되는 문헌(van Schalkwyk et al. Malaria Journal 2013, 12:320)에 기재된 바와 같이 시험관내에서 생장된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 플라스모듐을 생장시키는 단계, 상기 플라스모듐을 아르테미시닌과 접촉시키는 단계, 및 다수의 시점들에서 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질을 서열결정하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 단일 또는 다수의 지리적 지역으로부터 다수의 플라스모듐 샘플들을 제공하는 단계 및 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질에서 돌연변이를 검출하는 단계를 포함한다.
플라스모듐 감염을 검출하는 방법
본 발명은 감염된 환자에서 플라스모듐 감염을 검출하고 감염을 진단하는 방법을 포괄한다. 환자는 환자로부터 세포 샘플을 제공함으로써 진단될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 환자로부터 세포 샘플을 제공하는 단계, 및 상기 세포 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질은 당분야의 일반 기법에 의해 검출된다. 예를 들면, 본원에 기재된 기법들 중 임의의 기법이 이용될 수 있다.
세포 샘플은 플라스모듐을 함유하는 환자로부터 수득된 임의의 세포 샘플일 수 있다. 바람직하게는, 세포 샘플은 채혈함으로써 생성된다. 세포 샘플은 바람직하게는 혈액 샘플이다. 혈액 샘플은 시험관내 상기 샘플에서 플라스모듐을 배양하도록 더 프로세싱될 수 있다. 예를 들면, 문헌(van Schalkwyk et al. Malaria Journal 2013, 12:320)에 기재된 기법이 이용될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 환자로부터 혈액 샘플을 제공하는 단계; 임의적으로 시험관내 상기 샘플에서 플라스모듐을 배양하는 단계; 및 상기 세포 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 환자로부터 혈액 샘플을 제공하는 단계, 및 상기 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재는 서열결정 또는 PCR에 의해 검출된다.
바람직하게는, 핵산 서열결정은 세포 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 데에 이용된다. 당분야에서 공지된 임의의 서열결정 방법이 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열결정"은 넓은 의미로 사용되고, 생거 디데옥시 종결 서열결정, 전체 게놈 서열결정, 혼성화에 의한 서열결정, 피로서열결정(pyrosequencing), 모세관 전기영동, 주기 서열결정, 단일 염기 연장 서열결정, 고체상 서열결정, 고속처리 서열결정, 대량 병렬 시그너처 서열결정(MPSS), 가역적 염료 종결자에 의한 서열결정, 페어링된-말단 서열결정, 단기(near-term) 서열결정, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 서열결정, 라이게이션(ligation)에 의한 서열결정, 짧은-리드(short-read) 서열결정, 단일 분자 서열결정, 합성에 의한 서열결정, 실시간 서열결정, 역-종결자(reverse-terminator) 서열결정, 나노공극 서열결정, 454 서열결정, 솔렉사(Solexa) 게놈 분석기 서열결정, SOLiD(R) 서열결정, MS-PET 서열결정, 질량 분광측정 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 임의의 기법을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 ABI PRISM(R) 377 DNA 서열결정기(Sequencer), ABI PRISM(R) 310, 3100, 3100-Avant, 3730 또는 3730x1 유전 분석기, ABI PRISM(R) 3700 DNA 분석기, 또는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) SOLiD(TM) 시스템(모두 어플라이드 바이오시스템스 제품), 게놈 서열결정기 20 시스템(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)) 상에서 실시되기에 적당하다.
바람직하게는, 세포 샘플의 플라스모듐 내의 K-13 프로펠러는 도 9 또는 13, 또는 표 7에 제시된 돌연변이들 중 하나 이상을 가진다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 도 9 또는 13, 또는 표 7에 제시된 돌연변이들 중 임의의 돌연변이를 코딩하는 핵산 서열들 중 임의의 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함한다. 이 서열들은 당분야에서 공지된 다수의 기법들, 예컨대, 서열결정, 혼성화 또는 증폭 분석에 의해 특이적으로 검출될 수 있다.
예를 들면, 증폭 방법은 RCA, MDA, NASBA, TMA, SDA, LCR, b-DNA, PCR(RT-PCR을 포함하는 모든 형태들), RAM, LAMP, ICAN, SPIA, QB-레플리카제(replicase), 또는 인베이더(Invader)일 수 있다. 바람직한 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭이다. 예를 들면, 문헌(PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992)); 문헌(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds. Iinis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990)); 문헌(Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991)); 문헌(Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991)); 문헌(PCR (Eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford)); 및 미국 특허 제4,683,202호, 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,965,188호 및 제5,333,675호를 참조한다. 보다 바람직한 PCR 방법은 실시간 PCR, PCR-HRM(고해상 DNA 용융)(문헌(Andriantsoanirina et al. Journal of Microbiological Methods, 78 : 165 (2009)) 참조), 및 형광 마이크로스피어(루미넥스® 마이크로스피어)에 기초한 리가제 검출 반응에 커플링된 PCR이다. 이 마지막 방법은 다중 분석을 수행하여 동시에 여러 돌연변이된 K13 프로펠러 대립형질들을 검출할 수 있게 한다.
다른 바람직한 증폭 방법은 리가제 연쇄 반응(LCR)(예를 들면, 문헌(Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989)), 문헌(Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)) 및 문헌(Barringer et al. Gene 89:117 (1990))), 전사 증폭(문헌(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)) 및 국제 특허출원 공보 제WO88/10315호), 자가-지속된 서열 복제(문헌(Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)) 및 국제 특허출원 공보 제WO90/06995호), 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭(미국 특허 제6,410,276호), 및 핵산-기초 서열 증폭(NABSA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호)을 포함한다. 이용될 수 있는 다른 증폭 방법은 미국 특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 제6,582,938호에 기재되어 있다. 핵산의 증폭에 관한 상기 참고문헌들은 각각의 증폭 방법에서 증폭을 위해 사용된 구체적인 반응 조건의 개시에 대하여 참고로 구체적으로 도입된다.
바람직한 실시양태에서, 하기 프라이머들 중 하나 이상이 증폭을 위해 사용된다:
Figure 112016056900663-pct00009
핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 한 실시양태에서, RNA는 추출되고 cNA로 역전사된다. 그 다음, cDNA에 대한 증폭 또는 서열결정이 수행된다.
따라서, 상기 방법은 환자로부터의 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계, 상기 RNA를 cDNA로 역전사하는 단계, cDNA를 증폭하거나 서열결정하는 단계, 및 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시양태들에서, 상기 방법은 세포 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 이것은 야생형 K-13 프로펠러 단백질과 돌연변이체 K-13 프로펠러 단백질을 구별하는 특정 항체를 사용함으로써 수행될 수 있다. 이 항체는 환자 샘플과 접촉될 수 있고, 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 단백질의 존재 또는 부재는 면역학적 반응의 존재 또는 부재를 검출함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 ELISA 분석을 포함한다.
항체는 합성, 단일클론 또는 다중클론 항체일 수 있고 당분야에서 잘 공지된 기법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 항체는 (비특이적 결합과 대조적으로) 항체의 항원 결합 부위를 통해 특이적으로 결합한다. K-13 프로펠러 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합 단백질 등이 그와 면역반응하는 항체를 생성하는 데에 있어서 면역원으로서 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합 단백질 등은 항체의 형성을 이끌어내는 항원성 결정인자 또는 에피토프를 함유한다.
이 항원성 결정인자 또는 에피토프는 선형 또는 입체구조형(불연속) 항원성 결정인자 또는 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드의 아미노산들의 단일 구획으로 구성되는 반면, 입체구조형 또는 불연속 에피토프는 단백질 폴딩 시 가깝게 인접하는, 폴리펩티드 쇄의 상이한 영역들로부터의 아미노산 구획들로 구성된다(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)). 폴딩된 단백질이 복잡한 표면을 갖기 때문에, 이용가능한 에피토프들의 수는 꽤 많으나, 단백질의 입체구조 및 입체장애로 인해 에피토프에 실제로 결합하는 항체의 수는 이용가능한 에피토프의 수보다 더 적다(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)). 에피토프는 당분야에서 공지된 방법들 중 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체 둘 다가 통상적인 기법에 의해 제조될 수 있다.
야생형 및 돌연변이체 K-13 프로펠러 단백질의 아미노산 서열에 기초한 K-13 프로펠러 펩티드는 야생형 및/또는 돌연변이체 K-13 프로펠러에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 용어 "항체"는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 이의 단편, 예컨대, F(ab')2 및 Fab 단편, 단일 쇄 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체 단편(VHH 또는 나노바디), 2가 항체 단편(디아바디)뿐만 아니라 임의의 재조합적으로 및 합성적으로 생성된 결합 파트너도 포함하기 위한 것이다.
항체는 약 107 M-1 이상의 Ka로 야생형 및/또는 돌연변이체 K-13 프로펠러 폴리펩티드에 결합하는 경우 특이적으로 결합한다고 정의된다. 결합 파트너 또는 항체의 친화성은 통상적인 기법, 예를 들면, 문헌(Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949))에 기재된 기법을 이용함으로써 용이하게 측정될 수 있다.
다중클론 항체는 당분야에서 잘 공지된 절차를 이용함으로써 다양한 공급원들, 예를 들면, 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스 또는 래트로부터 용이하게 생성될 수 있다. 일반적으로, 적절하게 접합된 K-13 프로펠러의 아미노산 서열에 기초한 정제된 K-13 프로펠러 또는 펩티드가 전형적으로 비경구 주사를 통해 숙주 동물에게 투여된다. K-13 프로펠러의 면역원성은 항원보강제(adjuvant), 예를 들면, 프로인트(Freund)의 완전 또는 불완전 항원보강제의 사용을 통해 증강될 수 있다. 부스터(booster) 면역화 후, 작은 혈청 샘플이 수집되고 K-13 프로펠러 폴리펩티드에 대한 반응성에 대해 검사된다. 이러한 확인에 유용한 다양한 분석들의 예는 문헌(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)에 기재된 분석들뿐만 아니라, 절차, 예컨대, 역류 면역전기영동(CIEP), 방사면역분석, 방사면역침전, 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA), 도트 블롯(dot blot) 분석 및 샌드위치(sandwich) 분석도 포함한다. 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호를 참조한다.
단일클론 항체는 잘 공지된 절차를 이용함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제RE 32,011호, 제4,902,614호, 제4,543,439호 및 제4,411,993호; 및 문헌(Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, and Bechtol (eds.), 1980)에 기재된 절차들을 참조한다.
예를 들면, 단리되고 정제된 야생형 또는 돌연변이체 K-13 프로펠러 단백질 또는 접합된 K-13 프로펠러 펩티드를 임의적으로 항원보강제의 존재 하에서 약 3주 간격으로 1회 이상, 바람직하게는 2회 이상 숙주 동물, 예컨대, 마우스에게 복강내 주사할 수 있다. 그 다음, 통상적인 도트 블롯 기법 또는 항체 포획(ABC)으로 마우스 혈청을 분석하여, 어느 동물이 융합에 사용되기에 가장 적합한지를 확인한다. 대략 2주 내지 3주 후, 단백질 또는 펩티드의 정맥내 부스트를 마우스에게 제공한다. 그 후, 마우스를 희생시키고, 확립된 프로토콜에 따라 비장 세포를 상업적으로 입수가능한 골수종 세포, 예컨대, Ag8.653(ATCC)과 융합시킨다. 요약하건대, 골수종 세포를 배지로 수회 세척하고 약 3개 비장 세포들 대 1개 골수종 세포의 비로 마우스 비장 세포와 융합시킨다. 융합제는 당분야에서 사용되는 임의의 적합한 융합제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 융합된 세포의 선택적 생장을 허용하는 배지를 함유하는 플레이트 내로 융합물을 플레이팅한다. 그 다음, 융합된 세포를 대략 8일 동안 생장시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마로부터의 상청액을 수집하고, 먼저 염소 항-마우스 Ig로 코팅된 플레이트에 첨가한다. 세척 후, 표지, 예컨대, 표지된 K-13 프로펠러 폴리펩티드를 각각의 웰에 첨가한 후 항온처리한다. 양성 웰을 후속적으로 검출할 수 있다. 양성 클론을 대량 배양으로 생장시킬 수 있고, 상청액을 단백질 A 컬럼(파마샤(Pharmacia)) 상에서 후속적으로 정제한다.
본 발명의 단일클론 항체는 대안적인 기법, 예컨대, 본원에 참고로 도입되는 문헌(Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990))에 기재된 기법을 이용함으로써 생성될 수 있다. 유사하게, 결합 파트너는 재조합 DNA 기법을 이용하여 특이적 결합 항체를 코딩하는 유전자의 가변 영역을 도입함으로써 구축될 수 있다. 이러한 기법은 문헌(Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989))에 기재되어 있다.
통상적인 기법에 의해 생성될 수 있는 이러한 항체의 항원 결합 단편도 본 발명에 의해 포괄된다. 이러한 단편의 예는 Fab 및 F(ab')2 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 유전공학 기법에 의해 생성된 항체 단편 및 유도체도 제공된다.
본 발명의 단일클론 항체는 키메라 항체, 예를 들면, 뮤린 단일클론 항체의 인간화된 버전을 포함한다. 이러한 인간화된 항체는 공지된 기법에 의해 제조될 수 있고, 상기 항체가 인간에게 투여될 때 감소된 면역원성이라는 이점을 제공한다. 한 실시양태에서, 인간화된 단일클론 항체는 뮤린 항체의 가변 영역(또는 단지 이의 항원 결합 부위) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 영역을 포함한다. 대안적으로, 인간화된 항체 단편은 뮤린 단일클론 항체의 항원 결합 부위 및 인간 항체로부터 유래된 가변 영역 단편(항원 결합 부위를 결여함)을 포함할 수 있다. 키메라 및 추가 조작된 단일클론 항체의 제조를 위한 절차는 문헌(Riechmann et al., Nature 332:323, 1988), 문헌(Liu et al., PNAS 84:3439, 1987), 문헌(Larrick et al., Bio/Technology 7:934, 1989) 및 문헌(Winter and Harris, TIPS 14:139, May, 1993)에 기재된 절차들을 포함한다. 항체를 형질전환적으로 생성하는 절차는 영국 특허 제2,272,440호, 미국 특허 제5,569,825호 및 미국 특허 제5,545,806호에서 발견될 수 있다.
유전공학 방법에 의해 생성된 항체, 예컨대, 표준 재조합 DNA 기법을 이용함으로써 제조될 수 있는, 인간 부분 및 비인간 부분 둘 다를 포함하는 키메라 및 인간화된 단일클론 항체가 사용될 수 있다. 이러한 키메라 및 인간화된 단일클론 항체는 당분야에서 공지된 표준 DNA 기법을 이용하는, 예를 들면, 하기 문헌들에 기재된 방법을 이용하는 유전공학에 의해 생성될 수 있다: PCT 공보 제WO 87/02671호(Robinson et al.); 유럽 특허출원 제0184187호(Akira et al.); 유럽 특허출원 제0171496호(Taniguchi M.); 유럽 특허출원 제0173494호(Morrison et al.); PCT 공보 제WO 86/01533호(Neuberger et al.); 미국 특허 제4,816,567호(Cabilly et al.); 유럽 특허출원 제0125023호(Cabilly et al.); 문헌(Better et al., Science 240:1041-1043, 1988); 문헌(Liu et al., PNAS 84:3439-3443, 1987); 문헌(Liu et al., J. Immunol. 139:3521-3526, 1987); 문헌(Sun et al. PNAS 84:214-218, 1987); 문헌(Nishimura et al., Canc. Res. 47:999-1005, 1987); 문헌(Wood et al., Nature 314:446-449, 1985); 문헌(Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559, 1988); 문헌(Morrison, S. L., Science 229:1202-1207, 1985); 문헌(Oi et al., BioTechniques 4:214, 1986); 미국 특허 제5,225,539호(Winter); 문헌(Jones et al., Nature 321:552-525, 1986); 문헌(Verhoeyan et al., Science 239:1534, 1988); 및 문헌(Beidler et al., J. Immunol. 141:4053-4060, 1988).
합성 항체 및 반합성 항체와 관련하여, 이러한 용어들은 항체 단편, 동종형(isotype) 전환된(switched) 항체, 인간화된 항체(예를 들면, 마우스-인간, 인간-마우스), 하이브리드, 복수의 특이성을 가진 항체, 및 전체 합성 항체 유사 분자를 커버하기 위한 것이나 이들로 한정되지 않는다.
치료 적용의 경우, 항체에 대한 환자의 면역 반응을 최소화하기 위해 인간 불변 영역 및 가변 영역을 가진 "인간" 단일클론 항체가 종종 바람직하다. 이러한 항체는 인간 면역글로불린 유전자를 함유하는 형질전환 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 문헌(Jakobovits et al. Ann NY Acad Sci 764:525-535 (1995))을 참조한다.
K-13 프로펠러 폴리펩티드에 대한 인간 단일클론 항체는 대상체의 림프구로부터 유래된 mRNA로부터 제조된 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 cDNA들을 사용하여 조합 면역글로불린 라이브러리, 예컨대, Fab 파지 디스플레이 라이브러리 또는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 구축함으로써 제조될 수도 있다. 예를 들면, PCT 공보 제WO 92/01047호(McCafferty et al.); 문헌(Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597); 및 문헌(Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734)을 참조한다. 추가로, 항체 가변 영역의 조합 라이브러리는 공지된 인간 항체를 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, K-13 프로펠러에 결합하는 것으로 공지된 인간 항체의 가변 영역을, 예를 들면, 무작위적으로 변경된 돌연변이유발된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 돌연변이시킴으로써, 추후에 K-13 프로펠러에 결합하는 것으로 스크리닝될 수 있는 돌연변이된 가변 영역들의 라이브러리를 생성할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 영역 내에서 무작위 돌연변이유발을 유도하는 방법, 무작위화된 중쇄와 경쇄를 교차시켜 폐어링을 형성하는 방법 및 스크리닝 방법은 예를 들면, PCT 공보 제WO 96/07754호(Barbas et al.); 및 문헌(Barbas et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4457-4461)에서 발견될 수 있다.
면역글로불린 라이브러리는 바람직하게는 사상 파지로부터 유래된 디스플레이 팩키지(display packages)의 집단에 의해 발현되어 항체 디스플레이 라이브러리를 형성할 수 있다. 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하는 데에 사용되기에 특히 적합한 방법 및 시약의 예는 예를 들면, 미국 특허 제5,223,409호(Ladner et al.); PCT 공보 제WO 92/18619호(Kang et al.); PCT 공보 제WO 91/17271호(Dower et al.); PCT 공보 제WO 92/20791호(Winter et al.); PCT 공보 제WO 92/15679호(Markland et al.); PCT 공보 제WO 93/01288호(Breitling et al.); PCT 공보 제WO 92/01047호(McCafferty et al.); PCT 공보 제WO 92/09690호(Garrard et al.); PCT 공보 제WO 90/02809호(Ladner et al.); 문헌(Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372); 문헌(Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85); 문헌(Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281); 상기 문헌(Griffths et al. (1993)); 문헌(Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896); 문헌(Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628); 문헌(Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580); 문헌(Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377); 문헌(Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137); 및 문헌(Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982)에서 발견될 수 있다. 일단 디스플레이 팩키지(예를 들면, 사상 파지)의 표면 상에서 디스플레이되면, 항체 라이브러리를 스크리닝하여 K-13 프로펠러 폴리펩티드에 결합하는 항체를 발현하는 팩키지를 확인하고 단리한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 라이브러리의 일차 스크리닝은 고정된 K-13 프로펠러 폴리펩티드를 사용한 패닝(panning)을 포함하고, 고정된 K-13 프로펠러 폴리펩티드에 결합하는 항체를 발현하는 디스플레이 팩키지가 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 방법은 플라스모듐 감염을 검출하는 단계를 포함한다. 방법은 플라스모듐이 야생형 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질 서열을 갖는지 아니면 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질 서열을 갖는지를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
플라스모듐 감염을 치료하는 방법
본 발명은 플라스모듐 감염을 치료하는 방법을 포괄한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 환자가 야생형 또는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질 서열을 함유하는 플라스모듐에 의해 감염되어 있는지를 확인하는 단계, 및 환자가 야생형 또는 돌연변이체 K-13 프로펠러를 함유하는 플라스모듐에 의해 감염되어 있는지에 기초하여 항-기생충 치료를 조절하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 환자가 야생형 K-13 프로펠러를 함유하는 플라스모듐에 의해 감염되어 있는 경우, 상기 환자는 아르테미시닌 유도체로 치료받는다.
바람직한 실시양태에서, 환자가 돌연변이체 K-13 프로펠러를 함유하는 플라스모듐에 의해 감염되어 있는 경우, 상기 환자는 아르테미시닌을 사용하지 않는 항-기생충 치료, 바람직하게는 퀴닌, 클로로퀴닌 및 메플로퀸으로부터 선택된 말라리아 약물로 치료받는다.
또 다른 실시양태에서, 환자가 돌연변이체 K-13 프로펠러를 함유하는 플라스모듐에 의해 감염되어 있는 경우, 상기 환자는 일반적으로 이용되는 기간보다 더 기간 동안 아르테미시닌 유도체로 치료받는다.
또한, 본 발명은 야생형 K-13 프로펠러를 가진 플라스모듐으로 감염된 환자의 치료에 사용되기 위한 아르테미시닌 유도체에 관한 것으로서, 이때 플라스모듐이 야생형 K-13 프로펠러를 함유하는지를 검출하는 시험관내 단계는 상기 환자로부터 미리 수득된 생물학적 샘플에 대해 수행된다.
추가로, 본 발명은 돌연변이된 K-13 프로펠러를 가진 플라스모듐으로 감염된 환자의 치료에 사용되기 위한 아르테미시닌 유도체에 관한 것으로서, 이때 플라스모듐이 돌연변이된 K-13 프로펠러를 함유하는지를 검출하는 시험관내 단계는 상기 환자로부터 미리 수득된 생물학적 샘플에 대해 수행되고, 아르테미시닌의 투여 용법 및/또는 투여되는 용량은 시간의 경과에 따라 확장되고/되거나 용법 면에서 용량은 야생형 K-13 프로펠러를 함유하는 플라스모듐에 의한 감염에 적용되는 용량보다 각각 더 높다.
또한, 본 발명은 돌연변이된 K-13 프로펠러를 가진 플라스모듐으로 감염된 환자의 치료에 사용되기 위한 퀴닌, 클로로퀴닌 또는 메플로퀸에 관한 것으로서, 이때 플라스모듐이 돌연변이된 K-13 프로펠러를 함유하는지를 검출하는 시험관내 단계는 상기 환자로부터 미리 수득된 생물학적 샘플에 대해 수행된다.
따라서, 감염의 프로파일에 따른 상기 약물들의 사용은 먼저 플라스모듐이 야생형 K13 프로펠러를 보유하는지 아니면 돌연변이된 K13 프로펠러를 보유하는지를 확인하기 위해 다양한 실시양태들에 따라 본 발명에서 제공된 플라스모듐 감염을 검출하고 유전형분석하는 단계를 포괄한다.
플라스모듐을 유전형분석하는 키트
본 발명은 플라스모듐을 유전형분석하거나 플라스모듐 감염을 검출하는 키트를 포괄한다. 바람직하게는, 상기 키트는 K-13 프로펠러 핵산의 증폭을 위한 프라이머를 함유한다. 상기 키트는 증폭된 생성물의 검출을 위한 시약을 함유할 수 있다. 상기 키트는 본원에 기재된 임의의 프라이머 또는 임의의 프라이머 조합물을 함유할 수 있다. 상기 키트는 본원에 기재된 프라이머들 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 이상의 프라이머를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 키트는 100 내지 300 bp 범위의 거리에서 K13 프로펠러 핵산과 특이적으로 혼성화하는 한 쌍 이상의 프라이머를 포함한다. 상기 키트의 바람직한 실시양태에서, 100 내지 300 bp 범위의 거리에서 K13 프로펠러 핵산과 특이적으로 혼성화하는 한 쌍 이상의 프라이머는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 둘러싼다.
바람직하게는, 상기 키트는 K-13 프로펠러 핵산, 특히 증폭된 K-13 프로펠러 핵산을 검출하기 위한 프로브를 함유한다. 바람직하게는, 상기 프로브는 형광 또는 효소 표지로 표지된다.
한 실시양태에서, 상기 키트는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산, 특히 Y493H, R539T, I543T 또는 C580Y 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 특이적으로 검출한다. 한 실시양태에서, 상기 키트는 야생형 K-13 프로펠러 핵산을 특이적으로 검출한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 하기 프라이머들 중 하나 이상을 포함한다:
Figure 112016056900663-pct00010
일부 실시양태들에서, 상기 키트는 F446I, N458Y, C469Y, Y493H, K503N, R539T, I543T, P553L, P574L, A578S, C580Y 및 D584V 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산을 검출한다.
일부 실시양태들에서, 상기 키트는 F446I, G449A, N458Y, C469Y, W470stop, A481V, Y493H, K503N, S522C, V534A, R539T, I543T, G548D, P553L, V555A, A557S, R561H, K563R, V568G, P574L, A578S, C580Y, F583L, D584V, V589I, Q613E 및 D641G 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K13 프로펠러 핵산을 검출한다.
일부 실시양태들에서, 상기 키트는 하기 프라이머 쌍들 중 하나 이상을 포함한다:
Figure 112016056900663-pct00011
일부 실시양태들에서, 상기 키트는 하기 SNP들 중 하나와 혼성화하는 하나 이상의 프로브를 포함한다:
Figure 112016056900663-pct00012
신규 말라리아 약물을 스크리닝하는 방법
본 발명은 ART 내성 플라스모듐에 의해 감염된 환자의 치료에 효과적인 신규 말라리아 약물을 스크리닝하는 방법을 포괄한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
Figure 112016056900663-pct00013
본 발명에 따라 플라스모듐에 의해 감염된 환자로부터의 생물학적 샘플에서 플라스모듐을 유전형분석하는 단계;
Figure 112016056900663-pct00014
환자를 감염시킨 플라스모듐이 돌연변이체 K13 프로펠러 대립형질을 가진 경우, 플라스모듐의 기생충 제거 반감기 및/또는 생존율을 측정하는 단계;
Figure 112016056900663-pct00015
환자를 감염시킨 플라스모듐이 돌연변이체 K13 프로펠러 대립형질을 가진 경우, 시험되는 신규 약물을 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계;
Figure 112016056900663-pct00016
상기 약물의 투여 후 RSA0 -3h에서 플라스모듐의 기생충 제거 반감기 및/또는 생존율을 측정하는 단계; 및
Figure 112016056900663-pct00017
플라스모듐의 기생충 제거 반감기 및/또는 생존율이 상기 약물의 투여 후 감소되는 경우, 상기 약물을 ART 내성 플라스모듐에 의해 감염된 환자의 치료에 효과적인 말라리아 약물로서 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 환자를 감염시킨 플라스모듐이 돌연변이체 K13 프로펠러 대립형질을 가진 경우, 상기 방법은 시험되는 약물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
[표 1]
Figure 112016056900663-pct00018
[표 2]
Figure 112016056900663-pct00019
[표 3]
Figure 112016056900663-pct00020
Figure 112016056900663-pct00021
[표 4]
Figure 112016056900663-pct00022
[표 5]
Figure 112016056900663-pct00023
[표 6]
Figure 112016056900663-pct00024
[표 7]
Figure 112016056900663-pct00025
[표 8A]
Figure 112016056900663-pct00026
[표 8B]
Figure 112016056900663-pct00027
[표 8C]
Figure 112016056900663-pct00028
참고문헌
Figure 112016056900663-pct00029
Figure 112016056900663-pct00030
Figure 112016056900663-pct00031
Figure 112016056900663-pct00032
실시예
실시예 1. 아르테미시닌 - 가압된 플라스모듐 팔시파룸 F32 계통 및 모의물 (mock)-가압된 플라스모듐 팔시파룸 F32 계통
ART 민감성 F32-탄자니아 클론을 5년 동안 아르테미시닌의 용량 상승 용법 하에서 배양함으로써 ART 내성 F32-ART5 기생충 세포주를 선택하였다. 아르테미시닌 노출 없이 F32-탄자니아를 동시에 배양함으로써 F32-TEM 세포주를 수득하였다. 기준 DNA를 플라스모듐 팔시파룸 세포주 3D7, 89F5 팔로 알토 우간다(Palo Alto Uganda) 및 K1992로부터 추출하였다. 윤상체-단계 생존 분석(RSA0 -3h)을 기재된 바와 같이 수행하였다13. 일루미나(Illumina) 페어링된-리드 서열결정 기술을 이용하여 F32-탄자니아, F32-TEM, F32-ART5(4개 시점들), 3개의 기준 균주들(3D7, 89F5 및 K1992) 및 21개의 캄보디아 기생충 단리물들에 대한 전체 게놈 서열결정을 수행하였다. 2001년부터 2012년까지 ACT 효능 연구에 참여한 환자들로부터 1091개의 임상 플라스모듐 팔시파룸 단리물들의 세트를 수집하였다. 네스티드(nested) PCR을 이용하여 K13-프로펠러를 증폭하였다. 마크로겐(Macrogen)(대한민국 소재)이 PCR 생성물의 이중 가닥 서열결정을 수행하였다. MEGA 5 소프트웨어 버전 5.10으로 서열을 분석하여 구체적인 SNP 조합을 확인하였다. 마이크로소프트 엑셀 및 메드칼크(MedCalc) 버전 12(마리아케르케(Mariakerke), 벨기에 소재)로 데이터를 분석하였다. P 값이 0.05 미만이었을 때 차이가 통계적으로 유의한 것으로서 간주되었다. 기생충 단리물 수집에 대한 윤리적 승인은 캄보디아 국립 보건원 윤리위원회, 나발(Naval) 의학 연구소의 심사위원회, WHO 서태평양 지역 사무소의 기술검토진, 및 국립 알레르기 및 감염 질환 연구소의 심사위원회로부터 수득되었다.
5% 인간 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에서 2.5% 적혈구용적률까지 희석된 인간 O형 적혈구 세포(RBC)(에따블리스망 프랑세 뒤 생(Etablisssement Francais du Sang))에서 마이코플라스마 무함유 F32-탄자니아 기생충을 유지하였다. 기생충 배양물을 5% CO2의 대기 중에서 37℃에서 유지하였다. 기생충혈증을 매일 확인하고 10% 미만으로 유지하였다. ART 내성 기생충의 선택을 위해, 비동시적 배양물을 5% 내지 7% 기생충혈증까지 조절하고 약물 압력의 처음 3년 동안 24시간 동안 상승 용량(10 nM부터 9 μM까지)의 아르테미시닌의 존재 하에서 생장시켰다18. 후속 2년에서, 9 μM 내지 18 μM의 용량으로 각각의 약물 압력 주기를 48시간 동안 수행하였다. 약물 노출 후, 배지를 버리고 인간 혈청으로 보충된(20%) 약물 무함유 배지로 대체하였다. 기생충혈증이 5%에 도달할 때까지 기생충혈증을 매일 모니터링하였다. 그 시간에, 약물 압력을 재적용하였다. 효과적인 5년의 불연속적 ART 압력 후에 수득된 기생충 세포주를 F32-ART5로서 명명하였다. 동시에, F32-탄자니아 모세포주를 동일한 조건(즉, RBC, 혈청 및 배지) 하에서 아르테미시닌 처리 없이 동일한 시간 동안 연속적 배양에서 대조군으로서 유지하였다. 생성된 대조군 세포주를 F32-TEM으로서 지칭하였다.
실시예 2. 실험실-적응된 플라스모듐 팔시파룸 세포주
실험실-적응된 플라스모듐 팔시파룸 세포주 3D7(MR4, 미국 버지니아주 마나사스 소재), 89F5 팔로 알토 우간다(사이미리 시우레우스(Saimiri sciureus) 실험 숙주에서 아르테메터(artemether) 치료에 대한 높은 민감성을 나타낸, 1978년 우간다로부터 유래하는 팔로 알토 세포주로부터의 클론[O. Mercereau-Puijalon, H. Contamin, and J.C. Barale, 미공개된 데이터]), 및 파일린에서 ART의 대량 배치 전 1992년에 파일린에서 수집된 단리물인 K1992(프랑스 국립 말라리아 자료 센터에 의해 제공됨)로부터 기준 DNA를 추출하였다. 미니 혈액 키트(퀴아젠(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 동결된 혈액 분취물(200 ㎕)로부터 기생충 DNA를 추출하였다.
실시예 3. 캄보디아로부터의 배양-적응된 플라스모듐 팔시파룸 단리물
(2010년 및 2011년에 수집된) 캄보디아로부터의 50개 임상 플라스모듐 팔시파룸 단리물들을 문헌(Witkowski et al.45)에 기재된 바와 같이 시험관내 배양에 적응시켰다. 이들의 지리적 기원은 표 8에 표시되어 있다. 이들 환자 단리물들에 대한 기생충 제거율은 측정되지 않았는데, 이는 상기 단리물들이 이러한 측정을 포함하지 않은 야외 시험 동안 수집되었기 때문이었다. 미니 혈액 키트(퀴아젠)를 사용하여 동결된 혈액 분취물(200 ㎕)로부터 기생충 DNA를 추출하였다.
실시예 4. 윤상체-단계 생존 분석
고도로 동시적인 기생충 배양을 이용하여 윤상체-단계 생존 분석(RSA0-3h)을 문헌(Witkowski et al.13)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하건대, 침습 후 0-3시간 윤상체-단계 기생충을 700 nM DHA[WWARN(www.wwarn.org/research/tools/qaqc)으로부터 수득된 디하이드로아르테미시닌)] 또는 이의 용매 DMSO에 6시간 동안 노출시키고 세척한 후, 약물 없이 다음 66시간 동안 배양하였다. 정상 형태를 가진 제2 세대 윤상체 또는 영양체로 발달한 보이는 기생충들의 비율을 김사(Giemsa)-염색된 얇은 스메어(smears)에서 카운팅함으로써 생존율을 미시적으로 평가하였다.
실시예 5. 시간적 및 지리적 샘플 수집
2001년부터 2012년까지 캄보디아의 국립 말라리아 구제 프로그램의 일반적인 항말라리아 약물 효능 모니터링의 일부로서 수행된 ACT의 치료 효능 연구에 참여한 환자들, 및 NAMRU-2에 의해 수행된 연구로부터 941개 임상 플라스모듐 팔시파룸 단리물들의 세트를 수집하였다(표 4). EDTA 또는 ACD에 수집된 정맥혈 샘플(5 ㎖)을 수집한지 48시간 이내에 4℃에서 프놈펜(Phnom Penh)의 캄보디아 파스퇴르 연구소로 수송한 후, DNA 추출까지 -20℃에서 보관하였다. 미니 혈액 키트(퀴아젠)를 사용하여 동결된 혈액 분취물(200 ㎕)로부터 기생충 DNA를 추출하였다.
실시예 6. 기생충 제거 반감기의 측정
합병증을 동반하지 않는 플라스모듐 팔시파룸 말라리아 또는 중증 플라스모듐 팔시파룸 말라리아 및 10,000/㎕ 이상의 초기 기생충 밀도를 가진 환자는 기재된 바와 같이 2009년 및 2010년 푸르사트 및 라타나키리 지역에 등록되었다6, 13. 환자들을 ART로 치료하였고 기생충혈증이 검출될 수 없을 때까지 그들의 기생충 밀도를 두꺼운 혈액 필름으로부터 6시간마다 측정하였다. WWARN의 온-라인 기생충 제거 평가기관(http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator)을 이용하여 163명의 환자들에서 기생충 제거 반감기를 이들 기생충 카운트로부터 유도하였다. 연구는 기관(ClinicalTrials.gov)(번호 NCT00341003)에 등록되어 있다.
실시예 7. 기생충 DNA의 전체 게놈 서열결정
일루미나 페어링된-리드 서열결정 기술을 이용하여 F32-탄자니아, F32-TEM, F32-ART5 계통(4개 시점들), 3개의 기준 균주들(3D7, 89F5 및 K1992) 및 캄보디아로부터의 21개 기생충 단리물들에 대한 전체 게놈 서열결정을 수행하였다. 일루미나 라이브러리 제조 및 서열결정은 공급자에 의해 개발된 표준 프로토콜을 따랐다. 요약하건대, 게놈 DNA를 분무로 전단시키고, 전단된 단편을 말단-복구시키고 인산화시켰다. 블런트(Blunt)-말단 단편을 A-테일링하고 서열결정 어댑터를 단편에 라이게이션시켰다. 아젠코트(Agencourt) AMPure XP 비드(± 500 bp; 벡크만 카울터 게노믹스(Beckman Coulter Genomics), 미국 매사추세츠주 댄버스 소재)를 사용하여 삽입체를 크기에 따라 분류하고 라이브러리 정량 및 검증 전에 10 주기의 PCR을 이용하여 농축하였다. 라이브러리와 유동 셀의 혼성화 및 가교 증폭을 수행하여 클러스터(clusters)를 생성하고 HiSeq 2000 기계(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 상에서 100 주기의 페어링된-말단 리드를 수집하였다. 서열결정이 완료된 후, 일루미나 분석 파이프라인 버전 1.7을 이용하여 영상 분석, 염기 판정 및 오류 평가를 수행하였다.
리드에서 첫 번째 및 마지막 저품질 염기들의 트리밍(trimming)을 가능하게 하는, 엔. 졸리(N. Joly)(생물학 IT 센터, 파스퇴르 연구소, 파리 소재)에 의해 개발된 리드-품질 여과 소프트웨어인 에프퀄리티(Fqquality) 수단을 이용하여 미처리 서열 파일을 여과하였다. 부로우스-휠러 얼라인먼트(Burrows-Wheeler Alignment(BWA))로 기준 게놈(플라스모듐 팔시파룸 3D7) 상에서 조절된 Fastq 파일로부터의 트리밍된 리드를 맵핑하여 BAM 파일(탭-단락 포맷(tab-delimited format) SAM의 이진 파일)을 생성하였다. 다음으로, 본 발명자들은 샘툴스(Samtools)를 이용하여 파일업(pileup) 파일을 준비하였고, 사내(in-house) 소프트웨어를 이용하여 상기 파일을 포맷팅함으로써 데이터를 전체 게놈 데이터 매니저(WDM) 데이터베이스(Beghain et al., in preparation)로 실행하였다. WDM 소프트웨어를 디자인하여 부분적 또는 전체적 플라스모듐 팔시파룸 게놈을 비교하고/하거나 정렬한다.
실시예 8. F32- ART5에서 동일하지 않은 의미의 SNP들을 함유하는 유전자의 서열결정
표 1에 나열된 프라이머들을 사용하여 선택된 유전자의 PCR 증폭을 수행하였다. 하기 순환 프로그램을 사용하여 1 μM의 각각의 프라이머, 0.2 mM dNTP(솔리스 바이오다인(Solis Biodyne), 에스토니아 타르투 소재), 3 mM MgCl2 및 2 U Taq DNA 중합효소(솔리스 바이오다인)로 2 ㎕의 DNA를 증폭하였다: 94℃에서 5분, 그 다음 94℃에서 30초, 60℃에서 90초 및 72℃에서 90초의 40 주기, 및 72℃에서 최종 연장 10분. PCR 생성물을 2% 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색으로 검출하였다. 벡크만 코울터 게노믹스(Beckman Coulter Genomics)(프랑스 소재)가 PCR 생성물의 이중 가닥 서열결정을 수행하였다. 구체적인 SNP 조합을 확인하기 위해 MEGA 5 소프트웨어 버전 5.10으로 서열을 분석하였다.
실시예 9. K13-프로펠러 도메인의 서열결정
하기 프라이머들을 사용하여 K13-프로펠러 도메인을 증폭하였다: 일차 PCR을 위한 프라이머(K13-1 5'-cggagtgaccaaatctggga-3'(서열번호 9) 및 K13-4 5'-gggaatctggtggtaacagc-3'(서열번호 10)) 및 네스티드 PCR을 위한 프라이머(K13-2 5'-gccaagctgccattcatttg-3'(서열번호 13) 및 K13-3 5'-gccttgttgaaagaagcaga-3'(서열번호 14)). 하기 순환 프로그램을 사용하여 1 μM의 각각의 프라이머, 0.2 mM dNTP(솔리스 바이오다인), 3 mM MgCl2 및 2 U Taq DNA 중합효소(솔리스 바이오다인)로 1 ㎕의 DNA를 증폭하였다: 94℃에서 5분, 그 다음 94℃에서 30초, 60℃에서 90초 및 72℃에서 90초의 40 주기, 및 72℃에서 최종 연장 10분. 네스티드 PCR을 위해, MgCl2 농도(2.5 mM)를 제외한 동일한 조건 하에서 2 ㎕의 일차 PCR 생성물을 증폭하였다. 2% 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색을 이용하여 PCR 생성물을 검출하였다. 마크로겐(대한민국 소재)이 PCR 생성물의 이중 가닥 서열결정을 수행하였다. 구체적인 SNP 조합을 확인하기 위해 MEGA 5 소프트웨어 버전 5.10으로 서열을 분석하였다.
실시예 10. 임상 기생충 단리물의 딥(Deep)-서열결정 및 집단 구조 분석
캄보디아의 푸르사트 및 라타나키리 지역에서 말라리아 환자로부터 수득된 임상 기생충 단리물의 DNA 추출, 일루미나® 서열결정 및 SNP 유전형분석은 이미 기재되어 있다15. 이 기생충들의 집단 구조 분석은 4개의 하위집단들을 확인시켜주었다: KH1, KH2, KH3 및 KH4. 이 4개의 군들 중 임의의 군으로부터의 <80% 계통(ancestry)을 가진 기생충은 혼합된 기생충(KHA)으로서 간주되었다.
실시예 11. F32-ART5 계통에서 돌연변이의 시간적 획득
0시간(최초의 F32-탄자니아 클론 세포주), 196일째 날(0.2 μM 압력 주기 #23), 385일째 날(1.8 μM 압력 주기 #39), 618일째 날(9 μM 압력 주기 #56) 및 2250일째 날(9 μM 압력 주기 #120)에 수집된 샘플들을 사용하여 전체 게놈 서열결정으로 F32-ART5 계통을 조사하였다. F32-TEM 샘플을 2250일째 날에 수집하였다. 30번째, 33번째, 34번째, 36번째, 68번째 및 98번째 압력 주기의 시간에서 수집된 추가 샘플들을 PCR로 연구하였다. 고순도 PCR 주형 제조 키트(로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 독일 만하임 소재)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 기생충 배양물로부터 DNA를 추출하였다.
윤상체-단계 생존 분석(RSA0-3h)에서 시험된 F32-ART5 샘플을 각각 17번째, 48번째 및 122번째 압력 주기(0.04, 2.7 및 9 μM ART)의 시간에서 수집하였다. F32-TEM 샘플을 마지막 모의물 압력 주기에서 수집하였다. 적혈구 세포의 상이한 회분들을 사용한 삼중 실험에서 RSA0 -3h 생존율을 측정하였고, 2명의 독립적인 현미경사용자들(B.W. and F. B.-V.)에 의해 판독된 김사-염색된 얇은 스메어를 사용하여 전술된 바와 같이 평가하였다. 만-휘트니 U 검정을 이용하여 생존율을 비교하였다. 약물-압력 주기에서 F32-ART5 샘플의 RSA0 -3h 생존율은 다음과 같았다: #17(n=3, 중간 0%, IQR 0-0.07%), #48(n=3, 중간 11.7%, IQR 10.3-14.6; #17 대 #48에 대한 P=0.04, 만-휘트니 U 검정) 및 #122(n=3, 중간 12.8%, IQR 10.6-14.5, #17 대 #122 및 #48 대 #122에 대한 P=0.04 및 P=0.82). F32-TEM 세포주의 RSA0 -3h 생존율도 삼중 실험에서 측정하였다(n=3, 중간 0%, IQR 0-0.05, #TEM 대 #17에 대한 P=0.81, 만-휘트니 U 검정).
실시예 12. 2001년부터 2012년까지 6개의 캄보디아 지역들에서 수집된 886개의 임상 기생충 단리물들에서 K13-프로펠러 돌연변이의 우세
886개의 보관된 혈액 샘플들로부터 증폭된 PCR 생성물을 서열결정함으로써 K13-프로펠러를 유전형분석하였다. 매년 각각의 지역으로부터 분석된 샘플들의 수는 도 3에 표시되어 있다. 피셔의 정확 검정을 이용하여 시간의 경과에 따라 각각의 지역에서 야생형 K13-프로펠러 서열을 보유하는 단리물들의 빈도를 비교하였다. 야생형 K13-프로펠러 대립형질의 빈도의 유의한 감소가 십년 동안 서부 지역에서 관찰되었다. 상기 빈도는 파일린에서 2001년 및 2002년 30.0%(12/40)로부터 2011년 및 2012년 4.8%(4/84)까지 감소하였고(P=0.0002, 피셔의 정확 검정); 바탐방에서 2001년 및 2002년 71.9%(46/64)로부터 2011년 및 2012년 7.0%(5/71)까지 감소하였고(P<10-6); 푸르사트에서 2003년 및 2004년 50.0%(5/10)로부터 2011년 및 2012년 10.5%(2/19)까지 감소하였고(P=0.03); 크라티에에서 2001년 및 2002년 93.3%(14/15)로부터 2011년 및 2012년 29.4%(5/17)까지 감소하였다(P=0.0003). 야생형 대립형질 빈도에서의 유의한 감소는 프레아 비히어[2001년 및 2002년 92.6%(25/27)로부터 2011년 및 2012년 84.2%(16/19)까지 감소됨, P=0.63]; 또는 라타나키리[2001년 및 2002년 96.4%(54/56)로부터 2011년 및 2012년 94.3%(33/35)까지 감소됨, P=0.63]에서 관찰되지 않았다. C580Y의 빈도는 파일린에서 2001년 및 2002년 45.0%(18/40)로부터 2011년 및 2012년 88.1%(74/84)까지 증가하였고(P<10-6), 바탐방에서 2001년 및 2002년 7.8%(5/64)로부터 2011년 및 2012년 87.3%(62/71)까지 증가하였는데(P<10-6), 이것은 이 지역들에서 그의 신속한 집단 침습 및 가까운 고착을 시사한다.
실시예 13. K13-프로펠러의 3D-구조 모델링
모델러 v9.11을 이용하여 공간적 제한을 충족시키는 상동성 모델링으로 PF3D7_1343700의 켈치 프로펠러 도메인('K13-프로펠러')의 3D-구조 모델을 수득하였다(Fiser A, Sali A (2003). "Modeller: generation and refinement of homology-based protein structure models". Meth. Enzymol. 374: 461-91). K13-프로펠러를 구성하는 295개의 아미노산은 K13-프로펠러의 3D-구조를 모델링하기 위해 주형으로서 사용된 인간 Keap1[단백질 데이터 뱅크(PDB) 2FLU], KLHL12(PDB 2VPJ) 및 KLHL2(PDB 2XN4) 단백질의 켈치 프로펠러 도메인과 각각 22%, 25% 및 25% 동일하다. 2개의 고전적인 기준을 이용하여 수득된 모델의 신뢰성을 평가하였다. 먼저, K13 켈치 도메인과 한 주형 사이의 서열 정렬의 유의성은 빌트-프로파일 루틴(Built-Profile routine)을 이용하는 모델러에 의해 계산되었을 때 E-값 = 0에 의해 확인되었다. 둘째, 상기 모델은 GA341 모델 점수 = 1(0.7 이상의 점수는 고도로 신뢰가능한 모델에 상응함)을 달성하였다. PyMOL 몰레큘라 그래픽스 시스템(Molecular Graphics System) 버전 1.5.0.4(슈뢰딩거(Schrodinger) 미국 오레곤주 포틀랜드 소재)를 이용하여 K13 3D-모델에서 돌연변이체의 위치확인을 준비하였다.
실시예 14. 통계학적 분석
마이크로소프트 엑셀 및 메드칼크 버전 12(마리아케르케, 벨기에 소재)로 데이터를 분석하였다. 정량적 데이터를 중간 사분 범위(IQR)로서 표현하였다. 만-휘트니 U 검정(독립적인 샘플들, 양측)을 이용하여 2개의 군들을 비교하고 크루스칼-왈리스 검정(H-검정, 양측)을 이용하여 2개 초과의 군들을 비교하였다. 스피어만의 rho 순위 상관계수(및 상기 상관계수에 대한 95% 신뢰구간)를 이용하여 야생형 K13-프로펠러 대립형질의 우세와 3일째 날 양성의 빈도(아르테미시닌-기초 조합 요법의 3일째 날 미시적으로 검출될 수 있는 기생충의 지속으로서 정의됨) 사이의 관계의 강도를 측정하였다2. 피셔의 정확 검정을 이용하여 빈도 데이터를 비교하고 베타 분포에 기초한 클롭퍼-피어슨(Clopper-Pearson) 정확 방법을 이용하여 비율에 대한 95% 신뢰구간을 결정하였다. P 값이 0.05 미만일 때 차이가 통계적으로 유의한 것으로서 간주되었다.
실시예 15. 추가 SNP들
실시예 5에 기재된 바와 같이 캄보디아 환자들로부터 941개 임상 플라스모듐 팔시파룸을 먼저 수집한 후, 플라스모듐 팔시파룸에 의해 감염된 환자로부터의 추가 혈액 샘플을 실시예 5의 실험 절차와 동일한 실험 절차 후 베냉, 앙골라 및 카메룬과 같은 여러 아프리카 국가들 및 남아메리카에서 수집하였다. 총 9523개의 혈액 샘플들을 수집하였다.
Figure 112016056900663-pct00033
실시예 9에 기재된 바와 같이 기생충 DNA로부터 증폭된 PCR 생성물을 서열결정함으로써 K13-프로펠러 도메인을 유전형분석하였다.
추가 동일하지 않은 의미의 SNP들을 K13 프로펠러 도메인에서 발견하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 하기 나열된 27개의 SNP들을 확인하였다:
Figure 112016056900663-pct00034
실시예 16: K13 프로펠러 도메인에서 모든 돌연변이들을 동시에 검출하는 방법(도 13)
본 실시예는 K13 프로펠러 도메인에서 모든 돌연변이들을 동시에 검출하는 방법에 관한 세부사항을 기술한다(도 13). SNP 검출은 3 단계로 수행된다: 모든 프로브들과 증폭된 DNA의 혼성화(제1 단계); 보존된 프로브와 대립형질 특이적 프로브의 라이게이션(제2 단계), 및 바이오틴으로부터 발생된 형광 및 대립형질 특이적 형광의 판독(제3 단계).
검출된 돌연변이들의 목록
Figure 112016056900663-pct00035
모든 돌연변이들을 가진 K13 프로펠러 도메인의 서열
Figure 112016056900663-pct00036
제1 단계: K13 프로펠러 도메인의 서열의 PCR 증폭
PCR 증폭을 실시예 9에 따라 수행한다. 일차 PCR을 위한 프라이머는 다음과 같다:
K13_1_F 5'-CGGAGTGACCAAATCTGGGA-3'(서열번호 9)
K13_4_R 5'-GGGAATCTGGTGGTAACAGC-3'(서열번호 10)
네스티드 PCR을 위한 프라이머는 다음과 같다:
K13_3_F 5'-GCCTTGTTGAAAGAAGCAGA-3'(서열번호 14)
K13_2_R 5'-GCCAAGCTGCCATTCATTTG-3'(서열번호 13)
제2 단계: SNP들 검출
각각의 SNP를 위해, 돌연변이된 뉴클레오티드의 위치의 다운스트림에 존재하는 보존된 서열과 혼성화하는 1개의 보존된 프로브를 사용한다. 이 프로브는 5' 말단에서 라이게이션을 허용하는 포스페이트[Phos]를 갖고 3' 말단에서 바이오틴 태그[BtnTg]를 갖고; 각각의 SNP를 위해 야생형 코돈 또는 돌연변이체 코돈과 혼성화하는 2개의 대립형질 특이적 프로브들도 사용하였다. 각각의 대립형질 특이적 프로브는 특이적 형광 태그(야생형 코돈에 대해 특이적인 태그를 위해 태그 WT, 및 돌연변이체 코돈에 대해 특이적인 태그를 위해 태그 MT)를 가진다.
프로브들의 목록:
Figure 112016056900663-pct00037
Figure 112016056900663-pct00038
Figure 112016056900663-pct00039
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR INSTITUT PASTEUR DU CAMBODGE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> A molecular marker of Plasmodium falciparum artemisinin resistance <130> B11017B - AD <140> PCT/IB2014/XXXXXX <141> 2014-11-14 <150> 61/904,651 <151> 2013-11-15 <150> 62/062,439 <151> 2014-10-10 <160> 134 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2181 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 1 atggaaggag aaaaagtaaa aacaaaagca aatagtatct cgaatttttc tatgacgtat 60 gatagggaat ctggtggtaa cagcaatagt gatgataaaa gcggaagtag tagcgagaat 120 gattctaatt catttatgaa tctaactagt gataaaaatg agaaaacgga aaataatagt 180 ttccttttaa ataatagtag ttatggaaat gttaaagata gcctattaga atccattgat 240 atgagtgtat tagattcgaa ctttgatagt aaaaaagatt ttttaccaag taatttatca 300 agaacattta ataatatgtc taaagataat ataggaaata aatatttaaa taaattgtta 360 aataaaaaaa aagatactat tacaaatgaa aataataata ttaatcataa taataataat 420 aataatctga cagcaaataa tataactaat aatcttatta ataataatat gaattctcca 480 tcaattatga ataccaacaa aaaagagaat tttttagatg cagcaaatct tataaatgat 540 gattctggat taaacaattt aaaaaaattt tcaactgtaa ataatgtaaa tgatacttat 600 gaaaagaaaa ttattgaaac ggaattaagt gatgctagtg attttgaaaa tatggtaggt 660 gatttaagaa ttacatttat taattggtta aaaaagacac aaatgaattt tattcgagaa 720 aaagataaat tatttaaaga taagaaagaa ctagaaatgg aaagagtacg attgtacaaa 780 gaattagaaa accgtaaaaa tattgaagaa cagaaattac atgatgaaag aaagaaatta 840 gatattgata tatctaatgg ttataaacaa ataaaaaaag aaaaagaaga acataggaaa 900 cgatttgatg aagaaagatt aagattttta caagaaatcg ataaaattaa attagtatta 960 tatttagaaa aagaaaaata ttatcaagaa tataaaaatt ttgagaatga taaaaaaaaa 1020 attgttgatg caaatattgc tactgaaact atgattgata ttaatgttgg tggagctatt 1080 tttgaaacat ctagacatac cttaacacaa caaaaagatt catttataga gaaattatta 1140 agtggaagac atcatgtaac cagagataaa caaggaagaa tattcttaga tagggatagt 1200 gagttattta gaattatact taacttctta agaaatccgt taactatacc cataccaaaa 1260 gatttaagtg aaagtgaagc cttgttgaaa gaagcagaat tttatggtat taaattttta 1320 ccattcccat tagtattttg tataggtgga tttgatggtg tagaatattt aaattcgatg 1380 gaattattag atattagtca acaatgctgg cgtatgtgta cacctatgtc taccaaaaaa 1440 gcttattttg gaagtgctgt attgaataat ttcttatacg tttttggtgg taataactat 1500 gattataagg ctttatttga aactgaggtg tatgatcgtt taagagatgt atggtatgtt 1560 tcaagtaatt taaatatacc tagaagaaat aattgtggtg ttacgtcaaa tggtagaatt 1620 tattgtattg ggggatatga tggctcttct attataccga atgtagaagc atatgatcat 1680 cgtatgaaag catgggtaga ggtggcacct ttgaataccc ctagatcatc agctatgtgt 1740 gttgcttttg ataataaaat ttatgtcatt ggtggaacta atggtgagag attaaattct 1800 attgaagtat atgaagaaaa aatgaataaa tgggaacaat ttccatatgc cttattagaa 1860 gctagaagtt caggagcagc ttttaattac cttaatcaaa tatatgttgt tggaggtatt 1920 gataatgaac ataacatatt agattccgtt gaacaatatc aaccatttaa taaaagatgg 1980 caatttctaa atggtgtacc agagaaaaaa atgaattttg gagctgccac attgtcagat 2040 tcttatataa ttacaggagg agaaaatggc gaagttctaa attcatgtca tttcttttca 2100 ccagatacaa atgaatggca gcttggccca tctttattag ttcccagatt tggtcactcc 2160 gttttaatag caaatatata a 2181 <210> 2 <211> 726 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 2 Met Glu Gly Glu Lys Val Lys Thr Lys Ala Asn Ser Ile Ser Asn Phe 1 5 10 15 Ser Met Thr Tyr Asp Arg Glu Ser Gly Gly Asn Ser Asn Ser Asp Asp 20 25 30 Lys Ser Gly Ser Ser Ser Glu Asn Asp Ser Asn Ser Phe Met Asn Leu 35 40 45 Thr Ser Asp Lys Asn Glu Lys Thr Glu Asn Asn Ser Phe Leu Leu Asn 50 55 60 Asn Ser Ser Tyr Gly Asn Val Lys Asp Ser Leu Leu Glu Ser Ile Asp 65 70 75 80 Met Ser Val Leu Asp Ser Asn Phe Asp Ser Lys Lys Asp Phe Leu Pro 85 90 95 Ser Asn Leu Ser Arg Thr Phe Asn Asn Met Ser Lys Asp Asn Ile Gly 100 105 110 Asn Lys Tyr Leu Asn Lys Leu Leu Asn Lys Lys Lys Asp Thr Ile Thr 115 120 125 Asn Glu Asn Asn Asn Ile Asn His Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Thr 130 135 140 Ala Asn Asn Ile Thr Asn Asn Leu Ile Asn Asn Asn Met Asn Ser Pro 145 150 155 160 Ser Ile Met Asn Thr Asn Lys Lys Glu Asn Phe Leu Asp Ala Ala Asn 165 170 175 Leu Ile Asn Asp Asp Ser Gly Leu Asn Asn Leu Lys Lys Phe Ser Thr 180 185 190 Val Asn Asn Val Asn Asp Thr Tyr Glu Lys Lys Ile Ile Glu Thr Glu 195 200 205 Leu Ser Asp Ala Ser Asp Phe Glu Asn Met Val Gly Asp Leu Arg Ile 210 215 220 Thr Phe Ile Asn Trp Leu Lys Lys Thr Gln Met Asn Phe Ile Arg Glu 225 230 235 240 Lys Asp Lys Leu Phe Lys Asp Lys Lys Glu Leu Glu Met Glu Arg Val 245 250 255 Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Glu Asn Arg Lys Asn Ile Glu Glu Gln Lys 260 265 270 Leu His Asp Glu Arg Lys Lys Leu Asp Ile Asp Ile Ser Asn Gly Tyr 275 280 285 Lys Gln Ile Lys Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Lys Arg Phe Asp Glu 290 295 300 Glu Arg Leu Arg Phe Leu Gln Glu Ile Asp Lys Ile Lys Leu Val Leu 305 310 315 320 Tyr Leu Glu Lys Glu Lys Tyr Tyr Gln Glu Tyr Lys Asn Phe Glu Asn 325 330 335 Asp Lys Lys Lys Ile Val Asp Ala Asn Ile Ala Thr Glu Thr Met Ile 340 345 350 Asp Ile Asn Val Gly Gly Ala Ile Phe Glu Thr Ser Arg His Thr Leu 355 360 365 Thr Gln Gln Lys Asp Ser Phe Ile Glu Lys Leu Leu Ser Gly Arg His 370 375 380 His Val Thr Arg Asp Lys Gln Gly Arg Ile Phe Leu Asp Arg Asp Ser 385 390 395 400 Glu Leu Phe Arg Ile Ile Leu Asn Phe Leu Arg Asn Pro Leu Thr Ile 405 410 415 Pro Ile Pro Lys Asp Leu Ser Glu Ser Glu Ala Leu Leu Lys Glu Ala 420 425 430 Glu Phe Tyr Gly Ile Lys Phe Leu Pro Phe Pro Leu Val Phe Cys Ile 435 440 445 Gly Gly Phe Asp Gly Val Glu Tyr Leu Asn Ser Met Glu Leu Leu Asp 450 455 460 Ile Ser Gln Gln Cys Trp Arg Met Cys Thr Pro Met Ser Thr Lys Lys 465 470 475 480 Ala Tyr Phe Gly Ser Ala Val Leu Asn Asn Phe Leu Tyr Val Phe Gly 485 490 495 Gly Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Phe Glu Thr Glu Val Tyr Asp 500 505 510 Arg Leu Arg Asp Val Trp Tyr Val Ser Ser Asn Leu Asn Ile Pro Arg 515 520 525 Arg Asn Asn Cys Gly Val Thr Ser Asn Gly Arg Ile Tyr Cys Ile Gly 530 535 540 Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Ile Ile Pro Asn Val Glu Ala Tyr Asp His 545 550 555 560 Arg Met Lys Ala Trp Val Glu Val Ala Pro Leu Asn Thr Pro Arg Ser 565 570 575 Ser Ala Met Cys Val Ala Phe Asp Asn Lys Ile Tyr Val Ile Gly Gly 580 585 590 Thr Asn Gly Glu Arg Leu Asn Ser Ile Glu Val Tyr Glu Glu Lys Met 595 600 605 Asn Lys Trp Glu Gln Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Glu Ala Arg Ser Ser 610 615 620 Gly Ala Ala Phe Asn Tyr Leu Asn Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ile 625 630 635 640 Asp Asn Glu His Asn Ile Leu Asp Ser Val Glu Gln Tyr Gln Pro Phe 645 650 655 Asn Lys Arg Trp Gln Phe Leu Asn Gly Val Pro Glu Lys Lys Met Asn 660 665 670 Phe Gly Ala Ala Thr Leu Ser Asp Ser Tyr Ile Ile Thr Gly Gly Glu 675 680 685 Asn Gly Glu Val Leu Asn Ser Cys His Phe Phe Ser Pro Asp Thr Asn 690 695 700 Glu Trp Gln Leu Gly Pro Ser Leu Leu Val Pro Arg Phe Gly His Ser 705 710 715 720 Val Leu Ile Ala Asn Ile 725 <210> 3 <211> 712 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 3 Met Glu Gly Glu Lys Ile Lys Ser Asn Ser Ile Ser Asn Phe Ser Val 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Arg Glu Ser Gly Ala Asn Ser Asn Ser Asp Asp Lys Ser 20 25 30 Val Ser Ser Ser Glu Asn Glu Ser Asn Ser Phe Met Asn Leu Thr Ser 35 40 45 Asp Lys Asn Glu Lys Thr Glu Asn Asn Ser Phe Ile Leu Asn Asn Ser 50 55 60 Ser Phe Ala Asn Met Lys Asp Ser Leu Leu Glu Ser Ile Asp Leu Ser 65 70 75 80 Val Leu Asp Ser Asn Phe Asp Ser Lys Lys Asp Phe Leu Pro Ser Asn 85 90 95 Leu Ser Lys Asn Phe Asn Asn Leu Ser Lys Glu Asn Leu Gly Asn Lys 100 105 110 Tyr Leu Asn Lys Leu Leu Asn Lys Ser Asp Ser Met Phe Met Ser Lys 115 120 125 Gly Lys Asp Met Asn Leu Met Glu Asn Asn Leu Gly Ser Asn Asn Leu 130 135 140 Pro Val Lys Ser Ser Asn Lys Lys Glu Gly Phe Met Asp Ser Ser Thr 145 150 155 160 Pro Ile Asn Ala Asn Glu Asp Asn Ala Met Asn Asn Leu Lys Lys Tyr 165 170 175 Ser Asn Ala Asn Asn Ile Asn Asp Thr Tyr Glu Lys Lys Ile Ile Glu 180 185 190 Thr Glu Leu Ser Asp Ser Ser Asp Phe Glu Asn Met Val Gly Asp Leu 195 200 205 Arg Ile Thr Phe Ile Asn Trp Leu Lys Lys Thr Gln Met Asn Phe Ile 210 215 220 Arg Glu Lys Asp Lys Leu Phe Lys Asp Lys Lys Glu Leu Glu Met Glu 225 230 235 240 Arg Ile Arg Leu Tyr Lys Glu Ile Glu Asn Arg Lys Ser Ile Glu Glu 245 250 255 Gln Lys Leu His Asp Glu Arg Lys Lys Leu Asp Ile Asp Ile Ser Asn 260 265 270 Gly Tyr Lys Gln Ile Lys Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Lys Arg Phe 275 280 285 Asp Glu Glu Arg Leu Arg Phe Leu Gln Glu Ile Asp Lys Ile Lys Leu 290 295 300 Val Leu Tyr Leu Glu Lys Glu Lys Tyr Phe Gln Glu Tyr Lys Asn Phe 305 310 315 320 Glu Asn Asp Lys Lys Lys Ile Val Asp Ala Asn Ile Ala Thr Glu Thr 325 330 335 Met Ile Asp Ile Asn Val Gly Gly Ala Ile Phe Glu Thr Ser Arg His 340 345 350 Thr Leu Thr Gln Gln Lys Asp Ser Phe Ile Glu Lys Leu Leu Ser Gly 355 360 365 Arg Tyr His Val Thr Arg Asp Lys Gln Gly Arg Ile Phe Leu Asp Arg 370 375 380 Asp Ser Glu Leu Phe Arg Ile Ile Leu Asn Phe Leu Arg Asn Pro Leu 385 390 395 400 Thr Val Pro Ile Pro Lys Asp Leu Ser Glu Ser Glu Ala Leu Leu Lys 405 410 415 Glu Ala Glu Phe Tyr Gly Ile Lys Phe Leu Pro Phe Pro Leu Val Phe 420 425 430 Cys Met Gly Gly Phe Asp Gly Val Glu Tyr Leu Asn Ser Met Glu Leu 435 440 445 Leu Asp Ile Ser Gln Gln Cys Trp Arg Met Cys Thr Pro Met Ser Thr 450 455 460 Lys Lys Ala Tyr Phe Gly Ser Ala Val Leu Asn Asn Phe Leu Tyr Val 465 470 475 480 Phe Gly Gly Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Phe Glu Thr Glu Val 485 490 495 Tyr Asp Arg Leu Arg Asp Thr Trp Phe Val Ser Ser Asn Leu Asn Ile 500 505 510 Pro Arg Arg Asn Asn Cys Gly Val Thr Ser Asn Gly Arg Ile Tyr Cys 515 520 525 Ile Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Ile Ile Pro Asn Val Glu Ala Tyr 530 535 540 Asp His Arg Met Lys Ala Trp Val Glu Ile Ala Pro Leu Asn Thr Pro 545 550 555 560 Arg Ser Ser Ser Met Cys Val Ala Phe Asp Asn Lys Ile Tyr Val Ile 565 570 575 Gly Gly Thr Asn Gly Glu Arg Leu Asn Ser Ile Glu Val Tyr Asp Glu 580 585 590 Lys Met Asn Lys Trp Glu Gln Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Glu Ala Arg 595 600 605 Ser Ser Gly Ala Ala Phe Asn Tyr Leu Asn Gln Ile Tyr Val Val Gly 610 615 620 Gly Ile Asp Asn Glu His Asn Ile Leu Asp Ser Val Glu Gln Tyr Gln 625 630 635 640 Pro Phe Asn Lys Arg Trp Gln Phe Leu Asn Gly Val Pro Glu Lys Lys 645 650 655 Met Asn Phe Gly Ala Ala Thr Leu Ser Asp Ser Tyr Ile Ile Thr Gly 660 665 670 Gly Glu Asn Gly Asp Val Leu Asn Ser Cys His Phe Phe Ser Pro Asp 675 680 685 Thr Asn Glu Trp Gln Ile Gly Pro Ser Leu Leu Val Pro Arg Phe Gly 690 695 700 His Ser Val Leu Ile Ala Asn Ile 705 710 <210> 4 <211> 703 <212> PRT <213> Plasmodium cynomolgi <400> 4 Met Glu Gly Glu Lys Ile Lys Thr Asn Ser Ile Ser Asn Phe Ser Val 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Arg Glu Ser Gly Ala Asn Ser Asn Ser Asp Asp Lys Ser 20 25 30 Val Ser Ser Ser Glu Asn Glu Ser Asn Ser Phe Met Asn Leu Thr Ser 35 40 45 Asp Lys Asn Glu Lys Thr Glu Asn Asn Ser Phe Ile Leu Asn Asn Ser 50 55 60 Ser Phe Ala Asn Met Lys Asp Ser Phe Leu Glu Ser Ile Asp Leu Ser 65 70 75 80 Val Leu Asp Ser Asn Phe Asp Ser Lys Lys Asp Phe Leu Pro Ser Asn 85 90 95 Leu Ser Lys Asn Phe Asn Asn Leu Ser Lys Glu Asn Leu Gly Asn Lys 100 105 110 Tyr Leu Asn Lys Leu Leu Asn Lys Ser Asp Ser Ile Phe Met Ser Lys 115 120 125 Ser Lys Asp Met Asn Leu Ile Glu Asn Asn Leu Gly Ser Asn Asn Leu 130 135 140 Pro Val Lys Ser Ser Asn Lys Lys Glu Gly Phe Met Asp Ser Ser Thr 145 150 155 160 Pro Ile Asn Ala Asn Glu Asp Asn Ala Met Asn Asn Arg Lys Lys Tyr 165 170 175 Ser Asn Ser Asn Asn Ile Asn Asp Thr Tyr Glu Lys Lys Ile Ile Glu 180 185 190 Thr Glu Leu Ser Asp Ser Ser Asp Phe Glu Asn Met Val Gly Asp Leu 195 200 205 Arg Ile Thr Phe Ile Asn Trp Leu Lys Lys Thr Gln Met Asn Phe Ile 210 215 220 Arg Glu Lys Asp Lys Leu Phe Lys Asp Lys Lys Glu Leu Glu Met Glu 225 230 235 240 Arg Ile Arg Leu Tyr Lys Glu Ile Glu Asn Arg Lys Ser Ile Glu Glu 245 250 255 Gln Lys Leu His Asp Glu Arg Lys Lys Leu Asp Ile Asp Ile Ser Asn 260 265 270 Gly Tyr Lys Gln Ile Lys Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Lys Arg Phe 275 280 285 Asp Glu Glu Arg Leu Arg Phe Leu Gln Glu Ile Asp Lys Ile Lys Leu 290 295 300 Val Leu Tyr Leu Glu Lys Glu Lys Tyr Phe Gln Glu Tyr Lys Asn Phe 305 310 315 320 Glu Asn Asp Lys Lys Lys Ile Val Asp Ala Asn Ile Ala Thr Glu Thr 325 330 335 Met Ile Asp Ile Asn Val Gly Gly Ala Ile Phe Glu Thr Ser Arg His 340 345 350 Thr Leu Thr Gln Gln Lys Asp Ser Phe Ile Glu Lys Leu Leu Ser Gly 355 360 365 Arg Tyr His Val Thr Arg Asp Lys Gln Gly Arg Ile Phe Leu Asp Arg 370 375 380 Asp Ser Glu Leu Phe Arg Ile Ile Leu Asn Phe Leu Arg Asn Pro Leu 385 390 395 400 Thr Val Pro Ile Pro Lys Asp Leu Ser Glu Ser Glu Ala Leu Leu Lys 405 410 415 Glu Ala Glu Phe Tyr Val Phe Cys Met Gly Gly Phe Asp Gly Val Glu 420 425 430 Tyr Leu Asn Ser Met Glu Leu Leu Asp Ile Ser Gln Gln Cys Trp Arg 435 440 445 Met Cys Thr Pro Met Ser Thr Lys Lys Ala Tyr Phe Gly Ser Ala Val 450 455 460 Leu Asn Asn Phe Leu Tyr Val Phe Gly Gly Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys 465 470 475 480 Ala Leu Phe Glu Thr Glu Val Tyr Asp Arg Leu Arg Asp Thr Trp Phe 485 490 495 Val Ser Ser Asn Leu Asn Ile Pro Arg Arg Asn Asn Cys Gly Val Thr 500 505 510 Ser Asn Gly Arg Ile Tyr Cys Ile Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Ile 515 520 525 Ile Pro Asn Val Glu Ala Tyr Asp His Arg Met Lys Ala Trp Val Glu 530 535 540 Ile Ala Pro Leu Asn Thr Pro Arg Ser Ser Ser Met Cys Val Ala Phe 545 550 555 560 Asp Asn Lys Ile Tyr Val Ile Gly Gly Thr Asn Gly Glu Arg Leu Asn 565 570 575 Ser Ile Glu Val Tyr Asp Glu Lys Met Asn Lys Trp Glu Gln Phe Pro 580 585 590 Tyr Ala Leu Leu Glu Ala Arg Ser Ser Gly Ala Ala Phe Asn Tyr Leu 595 600 605 Asn Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ile Asp Asn Glu His Asn Ile Leu 610 615 620 Asp Ser Val Glu Gln Tyr Gln Pro Phe Asn Lys Arg Trp Gln Phe Leu 625 630 635 640 Asn Gly Val Pro Glu Lys Lys Met Asn Phe Gly Ala Ala Thr Leu Ser 645 650 655 Asp Ser Tyr Ile Ile Thr Gly Gly Glu Asn Gly Asp Val Leu Asn Ser 660 665 670 Cys His Phe Phe Ser Pro Asp Thr Asn Glu Trp Gln Ile Gly Pro Ser 675 680 685 Leu Leu Val Pro Arg Phe Gly His Ser Val Leu Ile Ala Asn Ile 690 695 700 <210> 5 <211> 712 <212> PRT <213> Plasmodium knowlesi <400> 5 Met Glu Asp Glu Lys Ile Lys Ser Asn Ser Ile Ser Asn Phe Ser Val 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Arg Glu Ser Gly Ala Asn Ser Asn Ser Asp Asp Lys Ser 20 25 30 Val Ser Ser Ser Glu Asn Glu Ser Asn Ser Phe Met Asn Leu Thr Ser 35 40 45 Asp Lys Asn Glu Lys Thr Glu Asn Asn Ser Phe Ile Leu Asn Asn Ser 50 55 60 Ser Phe Ala Asn Met Lys Asp Ser Phe Leu Glu Ser Ile Asp Leu Ser 65 70 75 80 Ile Leu Asp Ser Asn Phe Asp Ser Lys Lys Asp Phe Leu Pro Ser Asn 85 90 95 Leu Ser Lys Asn Phe Asn Asn Leu Ser Lys Glu Asn Leu Gly Asn Lys 100 105 110 Tyr Leu Asn Lys Leu Leu Asn Lys Ser Asp Ser Leu Phe Met Ser Lys 115 120 125 Asn Lys Asp Met Asn Leu Met Asp Asn Asn Met Gly Ser Asn Asn Leu 130 135 140 Pro Val Lys Ser Ser Asn Arg Lys Glu Gly Phe Met Asp Ser Ser Thr 145 150 155 160 Pro Ile Asn Ala Asn Glu Asp Asn Ala Met Asn Asn Leu Lys Lys Tyr 165 170 175 Ser Asn Thr Asn Asn Ile Asn Asp Thr Tyr Glu Lys Lys Ile Ile Glu 180 185 190 Thr Glu Leu Ser Asp Ser Ser Asp Phe Glu Asn Met Val Gly Asp Leu 195 200 205 Arg Ile Thr Phe Ile Asn Trp Leu Lys Lys Thr Gln Met Asn Phe Ile 210 215 220 Arg Glu Lys Asp Lys Leu Phe Lys Asp Lys Lys Glu Leu Glu Met Glu 225 230 235 240 Arg Ile Arg Leu Tyr Lys Glu Ile Glu Asn Arg Lys Ser Ile Glu Glu 245 250 255 Gln Lys Leu His Asp Glu Arg Lys Lys Leu Asp Ile Asp Ile Ser Asn 260 265 270 Gly Tyr Lys Gln Ile Lys Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Lys Arg Phe 275 280 285 Asp Glu Glu Arg Leu Arg Phe Leu Gln Glu Ile Asp Lys Ile Lys Leu 290 295 300 Val Leu Tyr Leu Glu Lys Glu Lys Tyr Phe Gln Glu Tyr Lys Asn Phe 305 310 315 320 Glu Asn Asp Lys Lys Lys Ile Val Asp Ala Asn Ile Ala Thr Glu Thr 325 330 335 Met Ile Asp Ile Asn Val Gly Gly Ala Ile Phe Glu Thr Ser Arg His 340 345 350 Thr Leu Thr Gln Gln Lys Asp Ser Phe Ile Glu Lys Leu Leu Ser Gly 355 360 365 Arg Tyr His Val Thr Arg Asp Lys Gln Gly Arg Ile Phe Leu Asp Arg 370 375 380 Asp Ser Glu Leu Phe Arg Ile Ile Leu Asn Phe Leu Arg Asn Pro Leu 385 390 395 400 Thr Val Pro Ile Pro Lys Asp Leu Ser Glu Ser Glu Ala Leu Leu Lys 405 410 415 Glu Ala Glu Phe Tyr Gly Ile Lys Phe Leu Pro Phe Pro Leu Val Phe 420 425 430 Cys Met Gly Gly Phe Asp Gly Val Glu Tyr Leu Asn Ser Met Glu Leu 435 440 445 Leu Asp Ile Ser Gln Gln Cys Trp Arg Met Cys Thr Pro Met Ser Thr 450 455 460 Lys Lys Ala Tyr Phe Gly Ser Ala Val Leu Asn Asn Phe Leu Tyr Val 465 470 475 480 Phe Gly Gly Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Phe Glu Thr Glu Val 485 490 495 Tyr Asp Arg Leu Arg Asp Thr Trp Phe Val Ser Ser Asn Leu Asn Ile 500 505 510 Pro Arg Arg Asn Asn Cys Gly Val Thr Ser Asn Gly Arg Ile Tyr Cys 515 520 525 Ile Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Cys Ile Ile Pro Asn Val Glu Ala Tyr 530 535 540 Asp His Arg Met Lys Ala Trp Val Glu Ile Ala Pro Leu Asn Thr Pro 545 550 555 560 Arg Ser Ser Ser Met Cys Val Ala Phe Glu Asn Lys Ile Tyr Val Ile 565 570 575 Gly Gly Thr Asn Gly Glu Arg Leu Asn Ser Ile Glu Val Tyr Asp Glu 580 585 590 Lys Met Asn Lys Trp Glu Gln Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Glu Ala Arg 595 600 605 Ser Ser Gly Ala Ala Phe Asn Tyr Leu Asn Gln Ile Tyr Val Val Gly 610 615 620 Gly Ile Asp Asn Glu His Asn Ile Leu Asp Ser Val Glu Gln Tyr Gln 625 630 635 640 Pro Phe Asn Lys Arg Trp Gln Phe Leu Asn Gly Val Pro Glu Lys Lys 645 650 655 Met Asn Phe Gly Ala Ala Thr Leu Ser Asp Ser Tyr Ile Ile Thr Gly 660 665 670 Gly Glu Asn Gly Asp Val Leu Asn Ser Cys His Phe Phe Ser Pro Asp 675 680 685 Thr Asn Glu Trp Gln Ile Gly Pro Ser Leu Leu Val Pro Arg Phe Gly 690 695 700 His Ser Val Leu Ile Ala Asn Ile 705 710 <210> 6 <211> 708 <212> PRT <213> Plasmodium berghei <400> 6 Met Glu Asp Asp Lys Ile Lys Ser Asn Ser Ile Ser Asn Phe Ser Val 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Arg Glu Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ser Glu Glu Arg Asp 20 25 30 Met Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Asn Leu Tyr Met Asn Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Lys Asn Glu Lys Ile Glu Asp Asn Ser Ser Phe Val Asn Ile Lys 50 55 60 Asp Ser Leu Leu Glu Ser Ile Asp Leu Ser Val Leu Asp Ser Asn Phe 65 70 75 80 Asp Ser Lys Asn Asp Phe Leu Pro Asn Asn Phe Ser Lys Asn Leu Asn 85 90 95 Asn Ile Thr Lys Asp Asn Ile Asn Asn Lys Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu 100 105 110 Asn Lys Asn Asp Ser Ala Phe Met Ala Met Asn Lys Asp Leu Asn Val 115 120 125 Ser Asn Asn Asn Leu Asn Gly Asn Asn Ile Val Gly Ala Pro Thr Asn 130 135 140 Lys Lys Glu Ile Phe Met Asp Ser Gly Ala Ser Ser Ile Asn Met Asn 145 150 155 160 Glu Asp Asn Ser Thr Met His Asn Ile Arg Ile Tyr Lys Asn Thr Asn 165 170 175 Asn Ile Asn Asp Thr Tyr Glu Lys Lys Ile Ile Glu Thr Glu Leu Ser 180 185 190 Asp Ser Ser Asp Phe Glu Asn Met Val Gly Asp Leu Arg Ile Thr Phe 195 200 205 Ile Asn Trp Leu Lys Lys Thr Gln Met Asn Phe Ile Arg Glu Lys Asp 210 215 220 Lys Leu Phe Lys Asp Lys Lys Glu Leu Glu Met Glu Arg Ile Arg Leu 225 230 235 240 Tyr Lys Glu Ile Glu Asn Arg Lys Ala Ile Glu Glu Gln Lys Leu Gln 245 250 255 Asp Glu Arg Lys Lys Leu Asp Ile Asp Ile Ser Asn Gly Tyr Lys Gln 260 265 270 Ile Lys Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Lys Arg Phe Asp Asp Glu Arg 275 280 285 Leu Arg Phe Leu Gln Glu Ile Asp Lys Ile Lys Leu Val Leu Tyr Leu 290 295 300 Glu Lys Glu Lys Tyr Phe Gln Glu Tyr Lys Asn Phe Glu Asn Asp Lys 305 310 315 320 Lys Lys Ile Val Asp Ala Asn Ile Ala Thr Glu Thr Met Ile Asp Ile 325 330 335 Asn Val Gly Gly Ala Leu Phe Glu Thr Ser Arg His Thr Leu Thr Gln 340 345 350 Gln Lys Asp Ser Phe Ile Glu Lys Leu Leu Ser Gly Arg Tyr His Ile 355 360 365 Thr Arg Asp Lys Gln Gly Arg Ile Phe Leu Asp Arg Asp Ser Glu Leu 370 375 380 Phe Arg Ile Ile Leu Asn Phe Leu Arg Asn Pro Leu Thr Ile Pro Ile 385 390 395 400 Pro Lys Asp Leu Gly Glu Ser Glu Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Phe 405 410 415 Tyr Gly Ile Lys Phe Leu Pro Phe Pro Leu Val Phe Ser Ile Gly Gly 420 425 430 Phe Asp Gly Val Glu Tyr Leu Asn Ser Met Glu Leu Leu Asp Ile Ser 435 440 445 Gln Gln Cys Trp Arg Met Cys Thr Pro Met Ser Thr Lys Lys Ala Tyr 450 455 460 Phe Gly Ser Ala Val Leu Asn Asn Phe Leu Tyr Val Phe Gly Gly Asn 465 470 475 480 Asn Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Phe Glu Thr Glu Val Tyr Asp Arg Leu 485 490 495 Arg Asp Thr Trp Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asn Ile Pro Arg Arg Asn 500 505 510 Asn Cys Gly Ile Thr Ser Asn Gly Arg Ile Tyr Cys Ile Gly Gly Tyr 515 520 525 Asp Gly Ser Ser Ile Ile Pro Asn Val Glu Ala Tyr Asp His Arg Met 530 535 540 Lys Ala Trp Ile Glu Val Ala Pro Leu Asn Thr Pro Arg Ser Ser Ala 545 550 555 560 Met Cys Val Ala Phe Asp Asn Lys Ile Tyr Val Val Gly Gly Ala Asn 565 570 575 Gly Glu Arg Leu Asn Ser Ile Glu Val Tyr Asp Glu Lys Met Asn Lys 580 585 590 Trp Glu Asn Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Glu Ala Arg Ser Ser Gly Ala 595 600 605 Ala Phe Asn Tyr Leu Asn Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ile Asp Asn 610 615 620 Glu His Asn Ile Leu Glu Ser Val Glu Gln Tyr Gln Pro Phe Asn Lys 625 630 635 640 Arg Trp Gln Phe Leu Asn Gly Ile Pro Glu Lys Lys Met Asn Phe Gly 645 650 655 Ala Thr Thr Leu Ser Asp Ser Tyr Ile Ile Thr Gly Gly Glu Asn Gly 660 665 670 Asp Val Leu Asn Ser Cys His Phe Phe Ser Pro Asp Thr Asn Glu Trp 675 680 685 Gln Ile Gly Pro Pro Leu Leu Val Pro Arg Phe Gly His Ser Val Leu 690 695 700 Val Ala Asn Ile 705 <210> 7 <211> 708 <212> PRT <213> Plasmodium yoelii <400> 7 Met Glu Asp Asp Lys Ile Lys Ser Asn Ser Ile Ser Asn Phe Ser Val 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Arg Glu Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ser Glu Glu Arg Asp 20 25 30 Met Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Asn Leu Phe Met Asn Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Lys Asn Glu Lys Ile Glu Asp Asn Ser Ser Phe Val Asn Met Lys 50 55 60 Asp Ser Leu Leu Glu Ser Ile Asp Leu Ser Val Leu Asp Ser Asn Phe 65 70 75 80 Asp Ser Lys Asn Asp Phe Leu Pro Asn Asn Phe Ser Lys Asn Leu Asn 85 90 95 Asn Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ser Asn Lys Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu 100 105 110 Asn Lys Asn Asp Ser Ala Phe Met Thr Met Ser Lys Asp Leu Asn Val 115 120 125 Ser Asn Asn Asn Leu Asn Gly Asn Asn Ile Val Gly Ala Pro Thr Asn 130 135 140 Lys Lys Glu Ile Phe Met Asp Ser Gly Ala Ser Ser Ile Asn Met Asn 145 150 155 160 Glu Asp Asn Ser Thr Met His Asn Ile Arg Ile Tyr Lys Asn Thr Asn 165 170 175 Asn Ile Asn Asp Thr Tyr Glu Lys Lys Ile Ile Glu Thr Glu Leu Ser 180 185 190 Asp Ser Ser Asp Phe Glu Asn Met Val Gly Asp Leu Arg Ile Thr Phe 195 200 205 Ile Asn Trp Leu Lys Lys Thr Gln Met Asn Phe Ile Arg Glu Lys Asp 210 215 220 Lys Leu Phe Lys Asp Lys Lys Glu Leu Glu Met Glu Arg Ile Arg Leu 225 230 235 240 Tyr Lys Glu Ile Glu Asn Arg Lys Ala Ile Glu Glu Gln Lys Leu Gln 245 250 255 Asp Glu Arg Lys Lys Leu Asp Ile Asp Ile Ser Asn Gly Tyr Lys Gln 260 265 270 Ile Lys Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Lys Arg Phe Asp Asp Glu Arg 275 280 285 Leu Arg Phe Leu Gln Glu Ile Asp Lys Ile Lys Leu Val Leu Tyr Leu 290 295 300 Glu Lys Glu Lys Tyr Phe Gln Glu Tyr Lys Asn Phe Glu Asn Asp Lys 305 310 315 320 Lys Lys Ile Val Asp Ala Asn Ile Ala Thr Glu Thr Met Ile Asp Ile 325 330 335 Asn Val Gly Gly Ala Leu Phe Glu Thr Ser Arg His Thr Leu Thr Gln 340 345 350 Gln Lys Asp Ser Phe Ile Glu Lys Leu Leu Ser Gly Arg Tyr His Ile 355 360 365 Thr Arg Asp Lys Gln Gly Arg Ile Phe Leu Asp Arg Asp Ser Glu Leu 370 375 380 Phe Arg Ile Ile Leu Asn Phe Leu Arg Asn Pro Leu Thr Ile Pro Ile 385 390 395 400 Pro Lys Asp Leu Gly Glu Ser Glu Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Phe 405 410 415 Tyr Gly Ile Lys Phe Leu Pro Phe Pro Leu Val Phe Ser Ile Gly Gly 420 425 430 Phe Asp Gly Val Glu Tyr Leu Asn Ser Met Glu Leu Leu Asp Ile Ser 435 440 445 Gln Gln Cys Trp Arg Met Cys Thr Pro Met Ser Thr Lys Lys Ala Tyr 450 455 460 Phe Gly Ser Ala Val Leu Asn Asn Phe Leu Tyr Val Phe Gly Gly Asn 465 470 475 480 Asn Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Phe Glu Thr Glu Val Tyr Asp Arg Leu 485 490 495 Arg Asp Thr Trp Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asn Ile Pro Arg Arg Asn 500 505 510 Asn Cys Gly Ile Thr Ser Asn Gly Arg Ile Tyr Cys Ile Gly Gly Tyr 515 520 525 Asp Gly Ser Ser Ile Ile Pro Asn Val Glu Ala Tyr Asp His Arg Met 530 535 540 Lys Ala Trp Ile Glu Val Ala Pro Leu Asn Thr Pro Arg Ser Ser Ala 545 550 555 560 Met Cys Val Ala Phe Asp Asn Lys Ile Tyr Val Val Gly Gly Ala Asn 565 570 575 Gly Glu Arg Leu Asn Ser Ile Glu Val Tyr Asp Glu Lys Met Asn Lys 580 585 590 Trp Glu Asn Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Glu Ala Arg Ser Ser Gly Ala 595 600 605 Ala Phe Asn Tyr Leu Asn Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ile Asp Asn 610 615 620 Glu His Asn Ile Leu Glu Ser Val Glu Gln Tyr Gln Pro Phe Asn Lys 625 630 635 640 Arg Trp Gln Phe Leu Asn Gly Ile Pro Glu Lys Lys Met Asn Phe Gly 645 650 655 Ala Thr Thr Leu Ser Asp Ser Tyr Ile Ile Thr Gly Gly Glu Asn Gly 660 665 670 Asp Val Leu Asn Ser Cys His Phe Phe Ser Pro Asp Thr Asn Glu Trp 675 680 685 Gln Ile Gly Pro Ser Leu Leu Val Pro Arg Phe Gly His Ser Val Leu 690 695 700 Val Ala Asn Ile 705 <210> 8 <211> 708 <212> PRT <213> Plasmodium chabaudi <400> 8 Met Glu Asp Asp Lys Ile Lys Ser Asn Ser Ile Ser Asn Phe Ser Val 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Arg Glu Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ser Glu Glu Arg Asp 20 25 30 Ile Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Asn Leu Phe Met Asn Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Lys Asn Glu Lys Ile Glu Asp Asn Ser Ser Phe Val Asn Met Lys 50 55 60 Asp Ser Leu Leu Glu Ser Ile Asp Leu Ser Val Leu Asp Ser Asn Phe 65 70 75 80 Asp Ser Lys Asn Asp Phe Leu Pro Asn Asn Phe Ser Lys Asn Leu Asn 85 90 95 Asn Leu Thr Lys Asp Thr Ile Gly Asn Lys Tyr Leu Ser Lys Tyr Leu 100 105 110 Asn Lys Asn Asp Pro Ala Phe Met Ala Met Ala Lys Asp Leu Asn Val 115 120 125 Ser Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Asn Ile Val Gly Ala Pro Ala Asn 130 135 140 Lys Lys Glu Met Phe Met Asp Ser Gly Ala Ser Ser Ile Asn Met Asn 145 150 155 160 Asp Asp Asn Thr Thr Met His Asn Val Arg Lys Tyr Lys Ser Thr Asn 165 170 175 Asn Val Asn Asp Thr Tyr Glu Lys Lys Ile Ile Glu Thr Glu Leu Ser 180 185 190 Asp Ser Ser Asp Phe Glu Asn Met Val Gly Asp Leu Arg Ile Thr Phe 195 200 205 Ile Asn Trp Leu Lys Lys Thr Gln Met Asn Phe Ile Arg Glu Lys Glu 210 215 220 Lys Leu Phe Lys Asp Lys Lys Glu Leu Glu Met Glu Arg Ile Arg Leu 225 230 235 240 Tyr Lys Glu Ile Glu Asn Arg Lys Asn Ile Glu Glu Gln Lys Leu Gln 245 250 255 Asp Glu Arg Lys Lys Leu Asp Ile Asp Ile Ser Asn Gly Tyr Lys Gln 260 265 270 Ile Lys Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Lys Arg Phe Asp Asp Glu Arg 275 280 285 Leu Arg Phe Leu Gln Glu Ile Asp Lys Ile Lys Leu Val Leu Tyr Leu 290 295 300 Glu Lys Glu Lys Tyr Phe Gln Glu Tyr Lys Asn Phe Glu Asn Asp Lys 305 310 315 320 Lys Lys Ile Val Asp Ala Asn Ile Ala Thr Glu Thr Met Ile Asp Ile 325 330 335 Asn Val Gly Gly Ala Leu Phe Glu Thr Ser Arg His Thr Leu Thr Gln 340 345 350 Gln Lys Asp Ser Phe Ile Glu Gln Leu Leu Ser Gly Arg Tyr His Ile 355 360 365 Thr Arg Asp Lys Gln Gly Arg Ile Phe Leu Asp Arg Asp Ser Glu Leu 370 375 380 Phe Arg Ile Ile Leu Asn Phe Leu Arg Asn Pro Leu Thr Ile Pro Ile 385 390 395 400 Pro Lys Asp Leu Gly Glu Ser Glu Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Tyr 405 410 415 Tyr Gly Ile Lys Phe Leu Pro Phe Pro Leu Val Phe Cys Ile Gly Gly 420 425 430 Phe Asp Gly Val Glu Tyr Leu Asn Ser Met Glu Leu Leu Asp Ile Ser 435 440 445 Gln Gln Cys Trp Arg Met Cys Thr Pro Met Ser Thr Lys Lys Ala Tyr 450 455 460 Phe Gly Ser Ala Val Leu Asn Asn Phe Leu Tyr Val Phe Gly Gly Asn 465 470 475 480 Asn Tyr Asp Tyr Lys Ala Leu Phe Glu Thr Glu Val Tyr Asp Arg Leu 485 490 495 Arg Asp Thr Trp Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asn Ile Pro Arg Arg Asn 500 505 510 Asn Cys Gly Ile Thr Ser Asn Gly Arg Ile Tyr Cys Ile Gly Gly Tyr 515 520 525 Asp Gly Ser Ser Ile Ile Pro Asn Val Glu Ala Tyr Asp His Arg Met 530 535 540 Lys Ala Trp Ile Glu Val Ala Pro Leu Asn Thr Pro Arg Ser Ser Ala 545 550 555 560 Met Cys Val Ala Phe Asp Asn Lys Ile Tyr Val Ile Gly Gly Ala Asn 565 570 575 Gly Glu Arg Leu Asn Ser Ile Glu Val Tyr Asp Glu Lys Met Asn Lys 580 585 590 Trp Glu Lys Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Glu Ala Arg Ser Ser Gly Ala 595 600 605 Ala Phe Asn Tyr Leu Asn Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ile Asp Asn 610 615 620 Glu His Asn Ile Leu Glu Ser Val Glu Gln Tyr Gln Pro Phe Asn Lys 625 630 635 640 Arg Trp Gln Phe Leu Asn Gly Ile Pro Glu Lys Lys Met Asn Phe Gly 645 650 655 Ala Thr Thr Leu Ser Asp Ser Tyr Ile Ile Thr Gly Gly Glu Asn Gly 660 665 670 Asp Val Leu Asn Ser Cys His Phe Phe Ser Pro Asp Thr Asn Glu Trp 675 680 685 Gln Ile Gly Pro Ser Leu Leu Val Pro Arg Phe Gly His Ser Val Leu 690 695 700 Ile Ala Asn Ile 705 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 cggagtgacc aaatctggga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gggaatctgg tggtaacagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 cgccagcatt gttgactaat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gcggaagtag tagcgagaat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gccaagctgc cattcatttg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gccttgttga aagaagcaga 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 aggtggattt gatggtgtag aat 23 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 catacacctc agtttcaaat aaagc 25 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 aatttcttat acgtttttgg tggtaa 26 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ctctacccat gctttcatac gat 23 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 ggatatgatg gctcttctat tataccg 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 acttcaatag aatttaatct ctcacca 27 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 atgtcattgg tggaactaat ggt 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ttaaatggtt gatattgttc aacg 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ttcaggagca gcttttaatt acc 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ctggtgaaaa gaaatgacat gaa 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ccttgttgaa agaagcagaa ttt 23 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 attcaataca gcacttccaa aataa 25 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 aggtggattt gatggtgtag aat 23 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 catacacctc agtttcaaat aaagc 25 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 aatttcttat acgtttttgg tggtaa 26 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 ctctacccat gctttcatac gat 23 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 ggatatgatg gctcttctat tataccg 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 acttcaatag aatttaatct ctcacca 27 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 atgtcattgg tggaactaat ggt 23 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 ttaaatggtt gatattgttc aacg 24 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 ttcaggagca gcttttaatt acc 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 ctggtgaaaa gaaatgacat gaa 23 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 ccttgttgaa agaagcagaa tttt 24 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 attcaataca gcagttccaa aataa 25 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 ttgagcttct ttttcccaat aatggc 26 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 gtgaaaagga taataaattc tatgcc 26 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 agcaagaacg ttttgtgtaa a 21 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 taatatgtaa agtgattatg tatatcgc 28 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 agaagagcca tcatatcccc c 21 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 atatgagtaa aatgtcaggt tttgg 25 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 aaatagttgg gcgtagctca g 21 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 tgatatatgt ttgtaggagc tgtgag 26 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 tatctaccat atattctgat tctcc 25 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 gaattcttta atggttttga agat 24 <210> 49 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 atgctagaga agttaaagag aagaagcg 28 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 agtggaagac atcatgtaac cag 23 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 tgcttgttgt gattcatggg g 21 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 tatcacaatt aagtgtatca caacg 25 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 53 tttgtatagg tggattt 17 <210> 54 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 54 ccattcccat tagtat 16 <210> 55 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 55 ccattcccat tagtaa 16 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 56 tggatttgat ggtgtagaa 19 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 57 cattagtatt ttgtatagg 19 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 58 cattagtatt ttgtatagc 19 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 59 attcgatgga attattagat attagtcaac aa 32 <210> 60 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 60 gstggatttg atggtgtaga atatttaa 28 <210> 61 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 61 gstggatttg atggtgtaga atatttat 28 <210> 62 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 62 ctggcgtatg tgtacac 17 <210> 63 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 63 atattagtca acaatg 16 <210> 64 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 64 atattagtca acaata 16 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 65 cgtatgtgta cacctatg 18 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 66 attagtcaac aatgctgg 18 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 67 attagtcaac aatgctga 18 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 68 ttattttgga agtgctgta 19 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 69 tatgtctacc aaaaaagc 18 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 70 tatgtctacc aaaaaagt 18 <210> 71 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 71 acgtttttgg tggtaataac tatgatt 27 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 72 tggaagtgct gtattgaata atttcttat 29 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 73 tggaagtgct gtattgaata atttcttac 29 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 74 gtaatttaaa tatacctaga 20 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 75 gatgtatggt atgtttcaa 19 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 76 gatgtatggt atgtttcat 19 <210> 77 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 77 tacgtcaaat ggtagaat 18 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 78 gaagaaataa ttgtggtgt 19 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 79 gaagaaataa ttgtggtgc 19 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 80 aatttattgt aytgggggat atgatg 26 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 81 tgtggtgtta cgtcaawtgg tag 23 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 82 tgtggtgtta cgtcaawtgg tac 23 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 83 tgggggatat gatggctct 19 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 84 tgttacgtca awtggtasaa tttattgtat 30 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 85 tgttacgtca awtggtasaa tttattgtac 30 <210> 86 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 86 ctcttctatt ataccga 17 <210> 87 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 87 attgggggat atgatgg 17 <210> 88 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 88 attgggggat atgatga 17 <210> 89 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 89 gaatgtagaa gcatatgatc atcrtatg 28 <210> 90 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 90 gggatatgat ggctcttcta ttatacc 27 <210> 91 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 91 gggatatgat ggctcttcta ttatact 27 <210> 92 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 92 agaagcatat gatcatcg 18 <210> 93 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 93 cttctattat accgaatgt 19 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 94 cttctattat accgaatgc 19 <210> 95 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 95 catatgatca tcgtatga 18 <210> 96 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 96 ttataccgaa tgtagaag 18 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 97 ttataccgaa tgtagaat 18 <210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 98 tatgaaagca tgggtaga 18 <210> 99 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 99 gaagcatatg atcatcg 17 <210> 100 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 100 gaagcatatg atcatca 17 <210> 101 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 101 agcatgggta gaggtgg 17 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 102 catatgatca tcgtatgaa 19 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 103 catatgatca tcgtatgag 19 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 104 ggcacctttg aatacccyta gat 23 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 105 crtatgaaag catgggtaga ggt 23 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 106 crtatgaaag catgggtaga ggg 23 <210> 107 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 107 tagatcatca gctatgtg 18 <210> 108 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 108 gcacctttga atacccc 17 <210> 109 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 109 gcacctttga ataccct 17 <210> 110 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 110 ctatgtgtgt tgctttt 17 <210> 111 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 111 gacccctaga tcatcag 17 <210> 112 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 112 gacccctaga tcatcat 17 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 113 tgttgctttt gwtaataaaa tttatgtc 28 <210> 114 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 114 aatacccyta gatcatcagc tatgtg 26 <210> 115 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 115 aatacccyta gatcatcagc tatgta 26 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 116 tgataataaa atttatgtca ttg 23 <210> 117 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 117 ctatgtgtgt tgcttt 16 <210> 118 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 118 ctatgtgtgt tgcttc 16 <210> 119 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 119 ctatgtgtgt tgctta 16 <210> 120 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 120 htgataataa aatttatgtc attg 24 <210> 121 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 121 ctatgtgtgt tgctt 15 <210> 122 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 122 ctatgtgtgt tgctc 15 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 123 taataaaatt tatgtcattg g 21 <210> 124 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 124 atgtgtgttg cttttga 17 <210> 125 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 125 atgtgtgttg cttttgt 17 <210> 126 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 126 tcattggtgg aactaatgg 19 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 127 gcttttgata ataaaattta tg 22 <210> 128 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 128 gcttttgata ataaaattta ta 22 <210> 129 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 129 aatttccata tgccttat 18 <210> 130 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 130 aaaatgaata aatgggaac 19 <210> 131 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 131 aaaatgaata aatgggaag 19 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 132 taatgaacat aacatattag 20 <210> 133 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 133 gttgttggag gtattga 17 <210> 134 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 134 gttgttggag gtattgg 17

Claims (28)

  1. 플라스모듐(Plasmodium)을 유전형분석하는 방법으로서,
    (a) 플라스모듐을 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 샘플에서 서열 번호 1의 서열을 갖는 야생형 K-13 프로펠러 핵산과 비교하여 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재를 검출하거나, 또는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 K-13 프로펠러 단백질과 비교하여 돌연변이된 K-13 프로펠러 단백질의 존재를 검출하는 단계로서,
    상기 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산이 코딩하는 단백질 또는 상기 돌연변이된 K-13 프로펠러 단백질은 F446I, G449A, N458Y, C469Y, W470stop, A481V, Y493H, K503N, S522C, V534A, R539T, I543T, G548D, P553L, V555A, A557S, R561H, K563R, V568G, P574L, A578S, C580Y, F583L, D584V, V589I, Q613E 및 D641G로 이루어진 군에서 선택된 돌연변이를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 유전형분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 플라스모듐이 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재를 서열결정으로 검출하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산의 존재를 PCR로 검출하는 것인 방법.
  5. 환자에서 플라스모듐 감염을 검출하는 방법으로서,
    (a) 환자로부터 사전에 얻은 혈액 샘플을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 혈액 샘플에서 야생형 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 야생형 K-13 프로펠러 핵산 서열은 서열 번호 1의 서열을 갖고, 야생형 K-13 프로펠러 단백질은 서열 번호 2의 서열을 갖고, 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 서열이 코딩하는 단백질 또는 돌연변이된 K-13 프로펠러 단백질은 F446I, G449A, N458Y, C469Y, W470stop, A481V, Y493H, K503N, S522C, V534A, R539T, I543T, G548D, P553L, V555A, A557S, R561H, K563R, V568G, P574L, A578S, C580Y, F583L, D584V, V589I, Q613E 및 D641G로 이루어진 군에서 선택된 돌연변이를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 플라스모듐이 플라스모듐 팔시파룸인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 야생형 K-13 프로펠러 핵산의 존재를 서열결정으로 검출하는 것인 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 샘플에서 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 야생형 K-13 프로펠러 핵산의 존재를 PCR로 검출하는 것인 방법.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 플라스모듐이 야생형 또는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질 서열을 갖는지를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제1항 또는 제5항에 따른 방법에 사용되는 키트로서, K-13 프로펠러 핵산의 증폭을 위한 프라이머 및 증폭된 생성물의 검출을 위한 시약을 포함하는, 플라스모듐 감염을 검출하는 키트.
  11. 제10항에 있어서, 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 검출하기 위한 프로브를 함유하는 키트.
  12. 제11항에 있어서, 프로브가 형광, 방사성 또는 효소 표지로 표지되는 것인 키트.
  13. 제10항에 있어서, Y493H, R539T, I543T 및 C580Y 대립형질(allele)을 코딩하는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 검출하는 키트.
  14. 제10항에 있어서, 하기 프라이머들 중 하나 이상을 포함하는 키트:
    Figure 112020139820874-pct00040
  15. 제10항에 있어서, F446I, N458Y, C469Y, Y493H, K503N, R539T, I543T, P553L, P574L, A578S, C580Y 및 D584V 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 검출하는 키트.
  16. 제10항에 있어서, F446I, G449A, N458Y, C469Y, W470stop, A481V, Y493H, K503N, S522C, V534A, R539T, I543T, G548D, P553L, V555A, A557S, R561H, K563R, V568G, P574L, A578S, C580Y, F583L, D584V, V589I, Q613E 및 D641G 대립형질을 코딩하는 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 검출하는 키트.
  17. 제10항에 있어서, 하기 프라이머 쌍들 중 하나 이상을 포함하는 키트:
    Figure 112020139820874-pct00041
  18. 제10항에 있어서, 하기 SNP 중 하나와 혼성화하는 하나 이상의 프로브를 포함하는 키트:
    Figure 112020139820874-pct00042
  19. 환자로부터 사전에 얻은, 플라스모듐을 함유하는 생물학적 샘플에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 야생형 K-13 프로펠러 핵산 또는 F446I, G449A, N458Y, C469Y, W470stop, A481V, Y493H, K503N, S522C, V534A, R539T, I543T, G548D, P553L, V555A, A557S, R561H, K563R, V568G, P574L, A578S, C580Y, F583L, D584V, V589I, Q613E 및 D641G 중 하나 이상의 대립형질을 코딩하는 그의 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서,
    a) 환자로부터 사전에 얻은 플라스모듐의 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    b) 샘플의 DNA를 100 내지 300 bp 범위의 거리에서 K-13 프로펠러 핵산과 특이적으로 혼성화하는 한 쌍 이상의 프라이머와 접촉시키고 인터칼레이팅(intercalating) 염료의 존재 하에서 PCR 반응을 수행하는 단계;
    c) 증폭 생성물을 용융 단계로 처리하는 단계; 및
    d) 증폭 생성물의 용융 프로파일을 분석함으로써 돌연변이체 대립형질 또는 야생형 대립형질의 존재를 확인하는 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  20. 제19항에 있어서, 한 쌍 이상의 프라이머와 샘플의 DNA를 접촉시키는 단계 이전에 생물학적 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 환자로부터 사전에 얻은, 플라스모듐을 함유하는 생물학적 샘플에서 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서, 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산을 PCR 반응으로 증폭하는 단계, 및 증폭된 핵산을 돌연변이체 K-13 프로펠러에 대해 특이적인 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하는 검출 방법으로서, 야생형 K-13 프로펠러 핵산 서열은 서열 번호 1의 서열을 갖고, 돌연변이체 K-13 프로펠러 핵산은 F446I, G449A, N458Y, C469Y, W470stop, A481V, Y493H, K503N, S522C, V534A, R539T, I543T, G548D, P553L, V555A, A557S, R561H, K563R, V568G, P574L, A578S, C580Y, F583L, D584V, V589I, Q613E 및 D641G 대립형질 중 하나 이상을 코딩하는 것인 방법.
  22. 제5항, 제19항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 존재가, 환자가 아르테미시닌(artemisinin) 유도체에 대해 내성인 플라스모듐으로 감염되어 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 아르테미시닌 유도체에 대해 내성인 플라스모듐으로 감염된 상기 환자를 일반 프로토콜보다 더 긴 아르테미시닌 유도체에 기초한 치료 대상으로서 분류하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 아르테미시닌 유도체에 대해 내성인 플라스모듐으로 감염된 상기 환자를 또 다른 항-말라리아 약물을 이용한 치료 대상으로서 분류하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 또 다른 항-말라리아 약물은 퀴닌(quinine), 클로로퀸(chloroquine) 또는 메플로퀸(mefloquine)인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 아르테미시닌 유도체에 대해 내성인 플라스모듐으로 감염된 상기 환자를 신규 항-말라리아 약물에 기초한 치료의 대상으로서 분류하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 치료 후 상기 환자로부터 사전에 얻은 혈액 샘플 내의 돌연변이된 K-13 프로펠러 핵산 또는 단백질의 부재는, 상기 환자가 아르테미시닌 유도체에 대해 내성인 플라스모듐으로 더 이상 감염되어 있지 않고 상기 치료가 아르테미시닌 유도체에 대해 내성인 플라스모듐에 효율적이라는 것을 나타내는 것인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 프로브가 형광 비드에 결합되는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 프로브를 돌연변이체 K-13 프로펠러 도메인 핵산에 결합시키는 단계, 및 결합된 K-13 프로펠러 도메인 핵산에 결합하는 제2 프로브로 상기 결합된 K-13 프로펠러 도메인 핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
KR1020167015777A 2013-11-15 2014-11-14 플라스모듐 팔시파룸 아르테미시닌 내성의 분자 마커 KR102283408B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361904651P 2013-11-15 2013-11-15
US61/904,651 2013-11-15
US201462062439P 2014-10-10 2014-10-10
US62/062,439 2014-10-10
PCT/IB2014/002910 WO2015071759A1 (en) 2013-11-15 2014-11-14 A molecular marker of plasmodium falciparum artemisinin resistance

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160119753A KR20160119753A (ko) 2016-10-14
KR102283408B1 true KR102283408B1 (ko) 2021-07-29

Family

ID=52440720

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167015777A KR102283408B1 (ko) 2013-11-15 2014-11-14 플라스모듐 팔시파룸 아르테미시닌 내성의 분자 마커

Country Status (12)

Country Link
US (2) US10900093B2 (ko)
EP (1) EP3068903B1 (ko)
JP (2) JP6667445B2 (ko)
KR (1) KR102283408B1 (ko)
CN (1) CN105940115B (ko)
AU (1) AU2014349828B2 (ko)
BR (1) BR112016011046A2 (ko)
CA (1) CA2928014A1 (ko)
ES (1) ES2720728T3 (ko)
HK (1) HK1225757A1 (ko)
WO (1) WO2015071759A1 (ko)
ZA (1) ZA201602703B (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA45934A (fr) 2016-08-10 2019-06-19 Centre Nat Rech Scient Procédés et réactifs utilisés pour la détection du paludisme à plasmodium falciparum résistant à la pipéraquine
CN109504791A (zh) * 2018-12-29 2019-03-22 潮州市人民医院 用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关k13基因突变的试剂盒
CN109797207A (zh) * 2019-02-27 2019-05-24 四川国际旅行卫生保健中心 一种检测恶性疟原虫k13基因四个抗性突变位点的方法
CN109897901A (zh) * 2019-02-27 2019-06-18 四川国际旅行卫生保健中心 检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组及其应用
CN112592395A (zh) * 2020-12-11 2021-04-02 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 一种恶性疟原虫RIFIN重组蛋白PfRIFIN-54的构建、制备及用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008146938A1 (en) 2007-05-28 2008-12-04 Ehime University Primers for detecting plasmodium

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
USRE32011E (en) 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US5242794A (en) 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5333675C1 (en) 1986-02-25 2001-05-01 Perkin Elmer Corp Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
JPS63501765A (ja) 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
WO1989001050A1 (en) 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
JP2650159B2 (ja) 1988-02-24 1997-09-03 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 核酸増幅方法
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1990002809A1 (en) 1988-09-02 1990-03-22 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
WO1990006995A1 (en) 1988-12-16 1990-06-28 Siska Diagnostics, Inc. Self-sustained sequence replication system
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
JP4146512B2 (ja) 1991-03-01 2008-09-10 ダイアックス コープ． 小型タンパク質
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US6582938B1 (en) 2001-05-11 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
CN100535125C (zh) * 2007-06-28 2009-09-02 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 用于扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因的多重pcr引物及方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008146938A1 (en) 2007-05-28 2008-12-04 Ehime University Primers for detecting plasmodium

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PNAS, 2012, Vol.110, NO.1, pp240-245

Also Published As

Publication number Publication date
CA2928014A1 (en) 2015-05-21
EP3068903B1 (en) 2019-02-13
JP6667445B2 (ja) 2020-03-18
US11732312B2 (en) 2023-08-22
BR112016011046A2 (pt) 2019-01-29
HK1225757A1 (zh) 2017-09-15
ZA201602703B (en) 2019-12-18
CN105940115A (zh) 2016-09-14
ES2720728T3 (es) 2019-07-24
JP2016537030A (ja) 2016-12-01
US10900093B2 (en) 2021-01-26
AU2014349828A1 (en) 2016-05-26
US20160289774A1 (en) 2016-10-06
CN105940115B (zh) 2021-07-06
JP2020043873A (ja) 2020-03-26
WO2015071759A9 (en) 2016-06-23
WO2015071759A1 (en) 2015-05-21
KR20160119753A (ko) 2016-10-14
EP3068903A1 (en) 2016-09-21
AU2014349828B2 (en) 2021-01-28
US20210198755A1 (en) 2021-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11732312B2 (en) Molecular marker of plasmodium falciparum artemisinin resistance
Nicolete et al. Naturally acquired binding-inhibitory antibodies to Plasmodium vivax Duffy binding protein and clinical immunity to malaria in rural Amazonians
Ariey et al. A molecular marker of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria
Amambua-Ngwa et al. Population genomic scan for candidate signatures of balancing selection to guide antigen characterization in malaria parasites
Xainli et al. Age-dependent cellular immune responses to Plasmodium vivax Duffy binding protein in humans
Soulama et al. Genetic diversity of polymorphic vaccine candidate antigens (apical membrane antigen-1, merozoite surface protein-3, and erythrocyte binding antigen-175) in Plasmodium falciparum isolates from western and central Africa
Perez-Llaneza et al. Development of a tandem repeat-based multilocus typing system distinguishing Babesia bovis geographic isolates
Minassian et al. Controlled human malaria infection with a clone of Plasmodium vivax with high-quality genome assembly
Pirahmadi et al. Analysis of genetic diversity and population structure of gene encoding cell-traversal protein for ookinetes and sporozoites (CelTOS) vaccine candidate antigen in global Plasmodium falciparum populations
Hanron et al. Multiplex, DNase-free one-step reverse transcription PCR for Plasmodium 18S rRNA and spliced gametocyte-specific mRNAs
Lima et al. Antibody response to a new member of the DBL family (EBP2) after a brief Plasmodium vivax exposure
Noranate et al. Population diversity and antibody selective pressure to Plasmodium falciparum MSP1 block2 locus in an African malaria-endemic setting
Atuhaire et al. Molecular characterization and population genetics of Theileria parva in Burundi’s unvaccinated cattle: Towards the introduction of East Coast fever vaccine
EP3497237B1 (en) Methods and reagents for detecting piperaquine-resistant plasmodium falciparum malaria
Brashear et al. Population genomics in neglected malaria parasites
Bradley The Duffy antigen system and Plasmodium vivax: Immunological and epidemiological approaches to unconventional malaria in Sub-Saharan Africa
US20230287390A1 (en) Compositions and methods for identifying epitopes
Carey-Ewend et al. Population genomics of Plasmodium ovale species in sub-Saharan Africa
Little et al. Prevalence and characteristics of Plasmodium vivax Gametocytes in Duffy-positive and Duffy-negative populations across Ethiopia
Assisi Screening and characterization of antimalarial resistance related genetic structural variations in P. falciparum
Imitola Molecular epidemiology of malaria in Papua-Indonesia
Pringle Understanding Mechanisms of Sustained Malaria Transmission in Zambia Through Plasmodium falciparum Genetics
Wamae Genetic Epidemiology of Plasmodium falciparum Asymptomatic Infections and Antimalarial Drug-resistance Markers in Kilifi, Kenya.
OA19184A (en) Methods and reagents for detecting piperaquine-resistant plasmodium falciparum malaria.
Tessema et al. Protective Immunity Against Severe Malaria is Associated with a Repertoire of Antibodies to Conserved PfEMP1 Variants

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant