CN100535125C - 用于扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因的多重pcr引物及方法 - Google Patents

用于扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因的多重pcr引物及方法 Download PDF

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CN100535125C CNB2007100430014A CN200710043001A CN100535125C CN 100535125 C CN100535125 C CN 100535125C CN B2007100430014 A CNB2007100430014 A CN B2007100430014A CN 200710043001 A CN200710043001 A CN 200710043001A CN 100535125 C CN100535125 C CN 100535125C
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Abstract

本发明涉及恶性疟原虫药物抗性相关基因多重PCR扩增方法，以恶性疟原虫基因组DNA为模板，采用本发明设计的多重PCR引物集，进行一次单管PCR反应，扩增特定的5个基因(恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因Pfcrt、恶性疟原虫多药抗性基因Pfmdr1、恶性疟原虫二氢喋酸合成酶基因Pfahps、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因Pfdhfr和恶性疟原虫三磷酸腺苷酶第6亚基基因PfATPase6)靶序列，扩增产物涵盖21个目前已知恶性疟原虫药物抗性相关SNP位点。本发明操作步骤少，快捷方便，节约费用；尤其适用于高通量基因型分析，将有力促进恶性疟原虫抗性相关SNP在现场监测中的广泛应用。

Description

用于扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因的多重PCR引物及方法
技术领域
本发明涉及一种恶性疟原虫药物抗性相关基因的扩增技术，属于关于核苷酸的测定或检验方法技术领域。
背景技术
疟疾在世界范围内流行形势严峻，尤其是恶性疟的危害更加突出，据世界卫生组织报告全球每年约有100万人死于恶性疟，尚不包括间接引起的死亡。我国云南和海南两省存在恶性疟流行，每年均有死亡病例报告。20世纪50年代后，恶性疟原虫开始对抗疟药产生抗性，近年抗性形势日趋严峻，由低度抗性发展为高度抗性，由单一抗性发展为多重抗性，且抗性产生速度逐步加快。准确快速地监测抗性株的分布和流行已成为当前亟待解决的问题。
新近研究表明抗疟药抗性的产生与恶性疟原虫某些关键基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)有关，目前发现多个基因的SNP可反映恶性疟原虫对相应药物的抗性情况，并在不同地区的多项研究中得到验证。如：恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)的391 T/A、392 G/C、399G/T、400 A/G、402 T/A和404 A/C多态性(对应72～76位氨基酸编码序列)与氯喹抗性相关联(Anderson TJ，Nair S，Qin H，等Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6)：2180-2188.；Tagelsir N，Ibrahim Z，Medani A，等Acta Trop，2006，97(1)：19-25.；Dittrich S，Alifrangis M，Stohrer JM，等Trop Med Int Health，2005，10(12)：1267-1270.)；恶性疟原虫多药抗性基因(Pfmdr1)的256 A/T和257 A/T多态性(对应86位氨基酸编码序列)与甲氟喹、氯喹等多种药物的抗性有关(Anderson TJ，Nair S，Qin H，等Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6)：2180-2188.；Tagelsir N，Ibrahim Z，Medani A，等Acta Trop，2006，97(1)：19-25.；Duraisingh MT，Refour P.Mol Microbiol，2005，57(4)：874-877.)；恶性疟原虫二氢喋酸合成酶基因(Pfdhps)的1482 T/G、1483 C/T/G、1486 G/C、1794 A/G、1918C/G和2013 G/T/A多态性(对应436、437、540、581和613位氨基酸编码序列)与磺胺类药物抗性有关；恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因(Pfdhfr)的148 T/C、152 A/T、153 T/C、175 T/C、323 G/A/C和490 A/T多态性(对应50、51、59、108和164位氨基酸编码序列)与乙胺嘧啶抗性有关(官亚宜，汤林华.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23(2)：117-120.；Happi CT，Gbotosho GO，Folarin OA，等Acta Trop，2005，95(3)：183-193.；Ndiaye D，Daily JP，Sarr O，等Trop Med IntHealth，2005，10(11)：1176-1179.)；恶性疟原虫三磷酸腺苷酶第6亚基基因(PfATPase6)的2306 G/A多态性(对应769位氨基酸编码序列)与青蒿素类药物IC50升高有关(Jambou R，Legrand E，Niang M，等Lancet，2005，366(9501)：1960-1963.；Eckstein-Ludwig U，Webb RJ，Van Goethem ID，等Nature，2003，424(6951)： 957-961.)。在非洲和东南亚等恶性疟严重流行地区，上述SNP已被作为分子标志用于现场恶性疟原虫的药物抗性评价(官亚宜，汤林华.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23(2)：117-120.；Congpuong K，Na Bangchang K，Mungthin M，等Trop Med Int Health，2005，10(8)：717-722.；Syafruddin D，Asih PB，Casey GJ，等Am J Trop Med Hyg，2005；72(2)：174-181.；Nsimba B，Jafari-Guemouri S，Malonga DA，等Trop Med Int Health.2005；10(10)：1030-1037.)。
检测上述SNP首先需对相应基因进行扩增，疟疾患者血样通常以滤纸干血滴形式从现场带回，所含疟原虫DNA量较少，且混有人类DNA，传统单轮PCR的灵敏度和特异性均达不到要求。经检索中国生物医学文献数据库(CBM)、万方数据库、中国知网(CNKI)中国期刊全文数据库和PubMed数据库发现，目前文献报道均采用巢式PCR方法对上述基因逐一进行扩增，具体方法以文献Djimde A，Doumbo OK，Cortese JF，等N Engl J Med.2001；344(4)：257-263.和文献Pearce RJ，Drakeley C，Chandramohan D，等Antimicrob Agents Chemother，2003；47(4)：1347-1354.为例简述如下。
1、Pfcrt巢式PCR扩增方法
1)第一轮反应
上游引物：5’-CCGTTAATAATAAATACACGCAG-3’
下游引物：5’-CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC-3’
反应体系：
①10×PCR缓冲液          5μl
②25mmol/L MgCl2         5μl
③100μmol/L上游引物     0.5μl
④100μmol/L下游引物     0.5μl
⑤10mmol/L dNTPs         1μl
⑥H2O                    32.5μl
⑦模板DNA                5μl
⑧5U/μl Taq DNA聚合酶   0.5μl
总体积                   50μl
反应条件：
Figure C20071004300100041
Figure C20071004300100051
2)第二轮反应
上游引物：5’-TGTGCTCATGTGTTTAAACTT-3’
下游引物：5’-CAAAACTATAGTTACCAATTTTG-3’
反应体系：
①10×PCR缓冲液            5μl
②25mmol/L MgCl2           5μl
③100μmol/L上游引物       0.5μl
④100μmol/L下游引物       0.5μl
⑤10mmol/L dNTPs           1μl
⑥H2O                      35.5μl
⑦模板DNA                  2μl
⑧5U/μl Taq DNA聚合酶     0.5μl
总体积                     50μl
反应条件：
Figure C20071004300100052
2、Pfmdr1巢式PCR扩增方法
1)第一轮反应
上游引物：5’-ATGGGTAAAGAGCAGAAAGA-3’
下游引物：5’-AACGCAAGTAATACATAAAGTCA-3’
反应体系：
①10×PCR缓冲液             5μl
②25mmol/L MgCl2            5μl
③100μmol/L上游引物        0.5μl
④100μmol/L下游引物        0.5μl
⑤10mmol/L dNTPs            1μl
⑥H2O                       32.5μl
⑦模板DNA                 5μl
⑧5U/μl Taq DNA聚合酶    0.5μl
总体积                    50μl
反应条件：
Figure C20071004300100061
2)第二轮反应
上游引物：5’-TGGTAACCTCAGTATCAAAGAA-3’
下游引物：5’-ATAAACCTAAAAAGGAACTGG-3’
反应体系：
①10×PCR缓冲液            5μl
②25mmol/L MgCl2           5μl
③100μmol/L上游引物       0.5μl
④100μmol/L下游引物       0.5μl
⑤10mmol/L dNTPs           1μl
⑥H2O                      35.5μl
⑦模板DNA                  2μl
⑧5U/μl Taq DNA聚合酶     0.5μl
总体积                     50μl
反应条件：
Figure C20071004300100062
3、Pfdhps巢式PCR扩增方法
1)第一轮反应
上游引物：5’-GATTCTTTTTCAGATGGAGG-3’
下游引物：5’-TTCCTCATGTAATTCATCTGA-3’
反应体系：
①10×PCR缓冲液           2.5μl
②20mmol/L MgCl2          2.5μl
③12.5μmol/L上游引物     0.5μl
④12.5μmol/L下游引物     0.5μl
⑤10mmol/L dNTPs          0.6μl
⑥H2O                     17.2μl
⑦模板DNA                 1.0μl
⑧5U/μl Taq DNA聚合酶    0.2μl
总体积                    25μl
反应条件：
Figure C20071004300100071
2)第二轮反应
上游引物：5’-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3’
下游引物：5’-AATTGTGTGATTTGTCCACAA-3’
反应体系：
①10×PCR缓冲液            2.5μl
②20mmol/L MgCl2           2.5μl
③12.5μmol/L上游引物      0.5μl
④12.5μmol/L下游引物      0.5μl
⑤10mmol/L dNTPs           0.6μl
⑥H2O                      17.2μl
⑦模板DNA                  1.0μl
⑧5U/μl Taq DNA聚合酶     0.2μl
总体积                     25μl
反应条件：
Figure C20071004300100072
4、Pfdhfr巢式PCR扩增方法
1)第一轮反应
上游引物：5’-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3’
下游引物：5’-CTAGTATATACATCGCTAACA-3’
反应体系：
①10×PCR缓冲液            2.5μl
②20mmol/L MgCl2           2.5μl
③12.5μmol/L上游引物      0.5μl
④12.5μmol/L下游引物      0.5μl
⑤10mmol/L dNTPs           0.6μl
⑥H2O                      17.2μl
⑦模板DNA                  1.0μl
⑧5U/μl Taq DNA聚合酶     0.2μl
总体积                     25μl
反应条件：
Figure C20071004300100081
2)第二轮反应
上游引物：5’-TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3’
下游引物：5’-CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG-3’
反应体系：
①10×PCR缓冲液              2.5μl
②20mmol/L MgCl2             2.5μl
③12.5μmol/L上游引物        0.5μl
④12.5μmol/L下游引物        0.5μl
⑤10mmol/L dNTPs             0.6μl
⑥H2O                        17.2μl
⑦模板DNA                    1.0μl
⑧5U/μl Taq DNA聚合酶       0.2μl
总体积                       25μl
反应条件：
Figure C20071004300100091
Figure C20071004300100092
5、PfATPase6的PCR扩增方法
未见文献报道。
巢式PCR方法的原理和技术均已成熟，在恶性疟原虫抗性相关基因研究中广泛应用，但完成上述5个药物抗性相关基因的扩增至少需要进行10次PCR反应，约5个工作日方能完成，消耗较多人力，操作步骤复杂，所需费用高，且时效性较差，制约了恶性疟原虫抗性相关分子标志在现场监测中的广泛应用。寻找一个高效、便捷的手段来扩增这些基因显得十分必要。
发明内容
本发明针对恶性疟原虫药物抗性相关基因传统扩增方法操作繁琐、耗时耗力的不足，提供一种高效、便捷的恶性疟原虫药物抗性相关基因多重PCR扩增引物及方法，实现一次反应完成5个主要抗性相关基因(分别反映恶性疟原虫对氯喹、甲氟喹、乙胺嘧啶、磺胺类和青蒿素类等药物的抗性情况)的扩增，扩增产物涵盖21个抗性相关SNP，为后继的SNP分析，如DNA测序、RFLP、PCR-ELISA和SNP芯片等检测方法提供重要技术支撑，从而显著提高恶性疟原虫药物抗性相关SNP的检测效率，为恶性疟原虫抗性分子标志监测的广泛开展奠定技术基础。
聚合酶链反应(PCR)原理：在PCR反应管中，加入适当缓冲液，微量模板DNA，4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)溶液，DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)，和一对特异性引物，将上述溶液加热，使模板DNA在高温下(如94℃)变性，双链解为单链；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下(如50℃)与模板DNA互补结合，形成部分双链；溶液温度再升至中温(如72℃)，在DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，以结合在单链模板DNA上的引物为起点，按模板DNA碱基的配对要求，合成互补链。如此反复按顺序改变反应温度，即高温变性，低温退火和中温延伸，这样一个循环使特定区段的DNA数量增加1倍。一般经过20～40次循环扩增，最终使模板DNA数量增加数百万倍，可在短时间内生成大量特定DNA分子。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理与一般PCR相同。多重PCR的特点有：①高效性，在同一PCR反应管内同时扩增多个目的基因片段；②系统性，多重PCR很适宜于一组相关基因的扩增；③经济简便性，多个基因在同一反应管内同时扩增，节省时间、试剂，节约经费开支。
Hot start Taq DNA聚合酶的氨基酸残基上结合了热依赖的封闭基团，常温下没有活性，避免了非特异性引物退火和引物二聚体。只有经94℃加热变性超过4分钟才能激活。相对普通Taq DNA聚合酶，其扩增的特异性、灵敏度和产量均有所提高。
本发明根据多重PCR扩增原理，采用Hot start Taq DNA聚合酶，依据Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhps、Pfdhfr和PfATPase6等5个恶性疟原虫药物抗性相关基因序列，运用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件，设计3对特异性引物，参考文献(PearceRJ，Drakeley C，Chandramohan D，等Antimicrob Agents Chemother，2003，47：1347-1354.)2对引物，摸索和优化多重PCR引物组合、反应体系和反应条件，设置递增延伸温度，建立了5个恶性疟原虫抗性相关基因的单管多重PCR扩增方法。
本发明所述的恶性疟原虫药物抗性相关基因是指包括Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhps、Pfdhfr和PfATPase6在内的恶性疟原虫基因。
一种用于扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因靶序列的引物集，其包括以下引物：
(a)引物P1F：5’-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAAT-3’
 引物P1R：5’-ATATTGGTAGGTGGAATAGATTCT-3’；
(b)引物P2F：5’-TGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA-3’
引物P2R：5’-TCGTACCAATTCCTGAACTCACTT-3’；
(c)引物P5F：5’-AAAATAAATACCACATCAACACAT-3’
 引物P5R：5’-TCAATAATACCTAATCCACCTAAA-3’；
(d)引物P3F：5’-GATTCTTTTTCAGATGGAGG-3’
引物P3R：5’-TTCCTCATGTAATTCATCTGA-3’；
(e)引物P4F：5’-TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3’
引物P4R：5’-CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG-3’；
一种扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因的方法，采用上述引物集对恶性疟原虫药物抗性相关基因进行多重PCR反应。
如上所述的方法，其包括将引物混合液与100-500ng模板DNA混合；其中引物混合液中每条引物含量在0.02-0.1pmol之间。
如上所述的方法，其中多重PCR的反应条件是：94℃预变性13-17min，进入循环：94℃变性35-45s，50℃退火1.5-2.5min，由50℃按0.1℃/s递增至70-74℃，共35-45个循环，然后70-74℃延伸3min。
本发明进行多重PCR扩增时，反应条件为：94℃预变性15min，进入循环：94℃变性40s、50℃退火2min、由50℃按0.1℃/秒递增至72℃，共40循环，然后72℃延伸3min。扩增产物-20℃保存备用。
本发明进行多重PCR扩增时，反应体系包括：10×PCR缓冲液(含1.5-2.5mmol/L Mg2+)5.0μl，10mmol/L dNTPs 1.0-1.5μl，引物混合物液(组成：2.5-4.0μl 12.5μmol/L P1F、2.5-4.0μl 12.5μmol/L P1R、1.5-2.5μl 12.5μmol/L P2F、1.5-2.5μl 12.5μmol/L P2R、1.5-2.5μl 12.5μmol/L P3F、1.5-2.5μl 12.5μmol/L P3R、1.5-2.5μl 12.5μmol/L P4F、1.5-2.5μl 12.5μmol/L P4R、1.5-2.5μl 12.5μmol/L P5F、1.5-2.5μl 12.5μmol/L P5R)0.8-1.2μl，模板DNA 2.0-3.0μl，5U/μl Hot start Taq DNA聚合酶0.3-0.5μl，加灭菌双蒸水至50.0μl。
本发明进行多重PCR扩增时，反应体系优选条件包括：10×PCR缓冲液(含2.0mmol/L Mg2+)5.0μl，10mmol/L dNTPs 1.2μl，引物混合物液(组成：3.2μl12.5μmol/L P1F、3.2μl 12.5μmol/L P1R、2.0μl 12.5μmol/L P2F、2.0μl 12.5μmol/L P2R、2.0μl 12.5μmol/L P3F、2.0μl 12.5μmol/L P3R、2.0μl 12.5μmol/LP4F、2.0μl 12.5μmol/L P4R、2.0μl 12.5μmol/L P5F、2.0μl 12.5μmol/L P5R)1.0μl，模板DNA 2.5μl，5U/μl Hot start Taq DNA聚合酶0.4μl，加灭菌双蒸水至50.0μl。
如上所述引物集在恶性疟原虫药物抗性相关基因扩增方面的应用。
传统巢式PCR扩增方法每扩增一个恶性疟原虫药物抗性相关基因需进行两次PCR反应，若欲扩增目前明确的5个主要抗性相关基因，则需10次PCR反应，约5个工作日方能完成，本发明单管一次反应即可完成5基因扩增，只需5小时。
本发明所需耗材和试剂用量显著少于传统巢式PCR扩增方法，节省费用。
传统巢式PCR扩增5基因需完成10次PCR操作，本发明工作量与一次普通PCR相当，操作步骤少，快捷方便，减少各种操作失误发生的可能，可提高实验成功几率。
本发明单管一次反应完成5个主要抗性相关基因扩增，扩增产物涵盖21个已知药物抗性相关SNP位点，尤其适用于PCR-ELISA和SNP芯片等高通量基因型分析方法。
传统方法耗时耗力，限制了抗性分子标志在现场监测中的应用，本发明将促进恶性疟原虫抗性分子标志在现场监测中的广泛应用。
附图说明
图1为实施例中本发明多重PCR扩增产物电泳检测结果。
具体实施方式
(一)引物
根据Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhps、Pfdhfr和PfATPase6 5个恶性疟原虫基因的保守序列及21个药物抗性相关SNP位点的位置，设计5对特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。5个基因预期扩增产物长度分别为Pfcrt：315bp；Pfmdr1：514bp；Pfdhps：770bp；Pfdhfr：594bp；PfATPase6：437bp。
Pfcrt
上游引物(P1F)：5’-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAAT-3’
下游引物(P1R)：5’-ATATTGGTAGGTGGAATAGATTCT-3’
Pfmdr1
上游引物(P2F)：5’-TGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA-3’
下游引物(P2R)：5’-TCGTACCAATTCCTGAACTCACTT-3’
Pfdhps
上游引物(P3F)：5’-GATTCTTTTTCAGATGGAGG-3’
下游引物(P3R)：5’-TTCCTCATGTAATTCATCTGA-3’
Pfdhfr
上游引物(P4F)：5’-TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3’
下游引物(P4R)：5’-CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG-3’
PfATPase6
上游引物(P5F)：5’-AAAATAAATACCACATCAACACAT-3’
下游引物(P5R)：5’-TCAATAATACCTAATCCACCTAAA-3’
(二)多重PCR
1、模板DNA的制备
(1)现场收集5份恶性疟原虫滤纸血样，1份间日疟原虫滤纸血样(作为阴性对照)；
(2)将疟原虫滤纸干血滴剪碎，置于1.5ml EP管；
(3)加200μl 100℃预热的5％(w/v)chelex-100，振荡20s；
(4)100℃水浴10min，振荡20s；
(5)10 000rpm离心5min，吸取上清150μl，-20℃保存备用。
2、多重PCR扩增
反应体系：
(1)10×PCR缓冲液(含2.0mmol/L Mg2+)    5.0μl
(2)10mmol/L dNTPs                     1.2μl
(3)引物混合物液                       1.0μl
(4)模板DNA                            2.5μl
(5)5U/μl Hot start Taq DNA聚合酶     0.4μl
(6)H2O                                39.9μl
总体积                                50μl
注：引物混合液的组成：3.2μl 12.5μmol/L P1F、3.2μl 12.5μmol/L P1R、2.0μl 12.5μmol/L P2F、2.0μl 12.5μmol/L P2R、2.0μl 12.5μmol/L P3F、2.0μl 12.5μmol/L P3R、2.0μl 12.5μmol/L P4F、2.0μl 12.5μmol/L P4R、2.0μl 12.5μmol/LP5F、2.0μl 12.5μmol/L P5R。
扩增条件：
Figure C20071004300100131
所用PCR仪型号为PTC-200，购自MJ Research公司
(三)PCR扩增产物的电泳鉴定
取PCR扩增产物5μl，加1μl溴酚蓝上样缓冲液，混匀，点样于20g/L琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)，以100bp DNA分子量Marker作为标准分子参照，在5V/cm的电场强度下于1倍的TAE电泳缓冲液中电泳50分钟，凝胶成像系统(MULTI GENIUS Bio Imaging System，Syngene)紫外线下观察结果并拍照(见图1)。图1中M：100bp DNA分子量Marker，1-5：现场恶性疟原虫DNA多重PCR扩增产物，6：现场间日疟原虫DNA多重PCR扩增产物，7：空白对照多重PCR扩增产物。
(四)PCR产物的序列测定
利用DNA回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)从琼脂糖凝胶中回收PCR产物片段进行DNA序列测定。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
(五)总结
本实验利用5对特异引物，采用优化的多重PCR反应体系和反应条件，成功地扩增出恶性疟原虫5个主要药物抗性相关基因靶序列，PCR产物大小分别为Pfcrt：315 bp；Pfmdr1：514bp；Pfdhps：770bp；Pfdhfr：594bp；PfATPase6：437bp。经序列比对，现场恶性疟原虫标本的5基因靶序列除多态性位点外均与恶性疟原虫国际标准株3D7株一致。阴性对照和空白对照未见扩增产物。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
<120>用于扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因的多重PCR引物及方法
<130>P3-071048C
<140>200710043001.4
<141>2007-06-28
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>1
ggaggttctt gtcttggtaa at                            22
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>2
atattggtag gtggaataga ttct                          24
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>3
tgttgaaaga tgggtaaaga gcaga                          25
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>4
tcgtaccaat tcctgaactc actt                           24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>5
aaaataaata ccacatcaac acat                           24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>6
tcaataatac ctaatccacc taaa                         24
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>7
gattcttttt cagatggagg                              20
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>8
ttcctcatgt aattcatctg a                            21
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>9
tgatggaaca agtctgcgac gtt                          23
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>10
ctggaaaaaa tacatcacat tcatatg                      27

Claims (6)

1.一种用于扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因靶序列的引物集，其特征在于包括以下引物：
(a)引物P1F：5’-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAAT-3’
   引物P1R：5’-ATATTGGTAGGTGGAATAGATTCT-3’；
(b)引物P2F：5’-TGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA-3’
   引物P2R：5’-TCGTACCAATTCCTGAACTCACTT-3’；
(c)引物P5F：5’-AAAATAAATACCACATCAACACAT-3’
   引物P5R：5’-TCAATAATACCTAATCCACCTAAA-3’；
(d)引物P3F：5’-GATTCTTTTTCAGATGGAGG-3’
   引物P3R：5’-TTCCTCATGTAATTCATCTGA-3’；
(e)引物P4F：5’-TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3’
   引物P4R：5’-CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG-3’。
2.一种扩增恶性疟原虫药物抗性相关基因的方法，其特征在于采用权利要求1中所述引物集对恶性疟原虫药物抗性相关基因进行多重PCR反应。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于将引物混合液与100-500ng模板DNA混合；其中引物混合液中每条引物含量在0.02-0.1pmol之间。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述多重PCR的条件是：94℃预变性13-17min，进入循环：94℃变性35-45s，50℃退火1.5-2.5min，由50℃按0.1℃/s递增至70-74℃，共35-45个循环，然后70-74℃延伸3min。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述多重PCR条件是：94℃预变性15min，进入循环：94℃变性40s，50℃退火2min，由50℃按0.1℃/s递增至72℃，共40个循环，然后72℃延伸3min。
6.权利要求1所述引物集在恶性疟原虫药物抗性相关基因扩增方面的应用。
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恶性疟原虫药物抗性相关基因的分子标记及其在药物抗性监测中的应用. 官亚宜.中国寄生虫病学与寄生虫病杂志，第23卷第2期. 2005
恶性疟原虫药物抗性相关基因的分子标记及其在药物抗性监测中的应用. 官亚宜.中国寄生虫病学与寄生虫病杂志，第23卷第2期. 2005 *
抗疟药物敏感性检测方法的研究进展. 黄，芳.国际医学寄生虫病杂志，第33卷第2期. 2006
抗疟药物敏感性检测方法的研究进展. 黄，芳.国际医学寄生虫病杂志，第33卷第2期. 2006 *

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