CN108384867A - 一种实时荧光pcr检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒，本发明通过采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对对分枝杆菌16S、金黄色葡萄球菌femA、肺炎克雷伯菌phoE、肺炎链球菌ply、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S、枸橼酸菌cfa、阴沟肠杆菌ampC、流感嗜血杆菌ompP6基因，设计引物、探针、PCR检测混合液，选用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对多种下呼吸道特异性基因进行快速、准确检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒。
背景技术
下呼吸道感染是指终末气道，肺泡和肺间质的炎症，可由疾病微生物、理化因素，免疫损伤、过敏及药物所致。细菌性下呼吸道感染是最常见的下呼吸道感染，也是最常见的感染性疾病之一，其中临床常见的下呼吸道细菌有鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌、念珠菌、曲霉菌、表皮葡萄球菌、军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体。日常所讲的下呼吸道感染主要是指细菌性感染引起的下呼吸道感染，在抗生素应用以前，细菌性下呼吸道感染对儿童及老年人额健康威胁极大，抗生素的出现及发展曾一度使下呼吸道感染病死率明显下降，但近年来，尽管应用强有力的抗生素和有效的疫苗，下呼吸道感染总的病死率不再降低，甚至有所上升。
发明内容
本发明提供一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒，解决现有技术中无有效的烟曲霉特异性基因ITS检测方法的技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的引物和探针，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的方法，其特征在于，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对分枝杆菌16S、金黄色葡萄球菌femA、肺炎克雷伯菌phoE、肺炎链球菌ply、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S、枸橼酸菌cfa、阴沟肠杆菌ampC、流感嗜血杆菌ompP6基因设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示；
分别针对分枝杆菌16S、金黄色葡萄球菌femA、肺炎克雷伯菌phoE、肺炎链球菌ply、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S、枸橼酸菌cfa、阴沟肠杆菌ampC、流感嗜血杆菌ompP6基因，配置反应混合液；
分别取所述混合液36μL置于PCR管中，并将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品，盖好管盖，进行荧光PCR扩增反应，并进行结果判定。
一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、第四引物探针混合液、第五引物探针混合液、第六引物探针混合液、第七引物探针混合液、第八引物探针混合液、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液包括检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；第二引物探针混合液包括检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；第三引物探针混合液包括检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；第四引物探针混合液包括检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；第五引物探针混合液检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；第六引物探针混合液检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；第七引物探针混合液包括检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；第七引物探针混合液检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
本发明的有益效果：采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对对分枝杆菌16S、金黄色葡萄球菌femA、肺炎克雷伯菌phoE、肺炎链球菌ply、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S、枸橼酸菌cfa、阴沟肠杆菌ampC、流感嗜血杆菌ompP6基因，设计引物、探针、PCR检测混合液，选用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对多种下呼吸道特异性基因进行快速、准确检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例真菌感染样本的荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
本发明实施例提供了一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的引物和探针，其特征在于，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
其中，
(1)分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-16S-F：5’-TGGCGAACGGGTGAGTAAC-3’19bp
下游引物P-16S-R：5’-ACCCAGTTTCCCAGGCTTATC-3’21bp
针对16S rDNA的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-16S：5’-FAM-CGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTC-TAMRA-3’24bp
(2)金黄色葡萄球菌基因femA设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-femA-F：5’-TGCTGGTGGTACATCAAATGCT-3’22bp
下游引物P-femA-R：5’-TCCCATTGCACTGCATAACTTC-3’22bp
针对fernA的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-femA：5’-FAM-TCCGCCATTTTGC-MGB-3’13bp
(3)肺炎克雷伯菌基因phoE设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-phoE-F：5’-GCTGGATGTGTACGGCAAGAT-3’21bp
下游引物P-phoE-R：5’-CCGAAACGCACGTAAGTCTGA-3’21bp
针对phoE的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-phoE
5’-FAM-CCATGCACTACTTCAGCGATTATGACAGCA-TAMRA-3’30bp
(4)肺炎链球菌基因ply设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-ply-F：5’-GAAAGAAAGAAGCGGAGCTTGTC-3’23bp
下游引物P-ply-R：5’-CACTACGAGAAGTGCTCCAGGAT-3’23bp
针对ply的TaqMan荧光标记探针序列如下：
ply：5’-FAM-TTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCT-TAMRA-3’30bp
(5)嗜麦芽寡氧单胞菌基因Sm16S设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-Sm16S-F：5’-TGAGACACGGTCCAGACTCCTA-3’22bp
下游引物P-Sm16S-R：5’-TCTTCACCCACGCGGTATG-3’19bp
针对Sm16S的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-Sm16S：5’-FAM-ACAATGGGCGCAAGCCTGATCC-TAMRA-3’22bp
(6)枸橼酸杆菌基因cfa设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-cfa-F：5’-CGATGTFGCGGCGAACA-3’17bp
下游引物P-cfa-R：5’-CGCCGGTGAAGGTTTTACTTAT-3’22bp
针对cfa的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-cfa：5’-FAM-CCTGTCACCCCGCAAACCCTGTT-TAMRA-3’23bp
(7)阴沟肠杆菌基因ampC设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-ampC-F：5’-CGATGTTGCGGCGAACA-3’17bp
下游引物P-ampC-R：5’-CGCCGGTGAAGGTTTTACTTAT-3’22bp
针对ampC的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-ampC：5’-FAM-CCTGTCACCCCGCAAACCCTGTT-TAMRA-3’23bp
(8)流感嗜血杆菌基因ompP6设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-ompP6-F：5′-CGACATTACTGGTGAATATGTTCAAA-3′26bp
下游引物P-ompP6-R：5’-GATGTTGTATTCTGGTGTACCACGTT-3′26bp
针对ompP6的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-ompP6 5′-FAM-ATGCGCACGCAGCATATTTAAATGCA-TAMRA-3′26bp
16S、phoE、ply、Sm16S、cfa、ampC、ompP6基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA；femA基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB。
实施例二
实施例二提供了一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的方法，其特征在于，包括：
步骤201、样本核酸制备，以获得核酸模板；
步骤202、分别针对分枝杆菌16S、金黄色葡萄球菌femA、肺炎克雷伯菌phoE、肺炎链球菌ply、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S、枸橼酸菌cfa、阴沟肠杆菌ampC、流感嗜血杆菌ompP6基因设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示；
步骤203、分别针对分枝杆菌16S、金黄色葡萄球菌femA、肺炎克雷伯菌phoE、肺炎链球菌ply、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S、枸橼酸菌cfa、阴沟肠杆菌ampC、流感嗜血杆菌ompP6基因，配置反应混合液；
步骤204、分别取所述混合液36μL置于PCR管中，并将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品，盖好管盖，进行荧光PCR扩增反应，并进行结果判定。
其中，酶组成的确定，具体如下：
酶由Taq DNA聚合酶(简称Taq酶)和UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)组成，将5U/μLTaq酶和2U/μL UNG酶按体积比3：1比例混合。
阴、阳性对照品，具体如下：
阳性对照品为含有灭活的E-16S(含有分枝杆菌16S基因片段的工程菌)、E-femA(含有femA基因片段的工程菌)、E-phoE(含有phoE基因片段的工程菌)、E-ply(含有ply基因片段的工程菌)、E-Sm16S(含有嗜麦芽寡氧单胞菌16S基因片段的工程菌)、E-cfa(含有cfa基因片段的工程菌)、E-ampC(含有ampC基因片段的工程菌)、E-ompP6(含有ompP6基因片段的工程菌)菌混合液，菌浓度105CFU/mL。阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度105CFU/mL。
PCR反应程序为37℃2min，94℃2min，1循环；93℃15s，60℃60s，40循环。检测通道选择：16S、femA、phoE、ply、Sm16S、cfa、ampC、ompP6基因选用荧光PCR仪上的FAM通道，适用机型为ABI StepOnePlus荧光PCR仪、ABI 7500荧光PCR仪。
仪器FAM通道CT栏显示Undet.表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品在FAM通道，检测结果报告为阳性；待检样品FAM通道CT显示在35～40之间且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。
本发明使用的试剂、反应体系、反应程序经过一系列实验优化后，具有很强的PCR扩增能力、更高的扩增效率。本试剂盒具有准确率高、特异性强、灵敏度高、检测速度快的优点。本方法用于体外定性检测人痰液样本中分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、枸橼酸菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌，临床医生可以根据不同的检测结果分别用药，对临床医生合理用药具有一定的指导作用。
实施例三
本发明实施例三提供了一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、第四引物探针混合液、第五引物探针混合液、第六引物探针混合液、第七引物探针混合液、第八引物探针混合液、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液包括检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；第二引物探针混合液包括检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；第三引物探针混合液包括检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；第四引物探针混合液包括检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；第五引物探针混合液检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；第六引物探针混合液检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；第七引物探针混合液包括检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；第七引物探针混合液检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
其中，第一引物探针混合液由n×36μL分枝杆菌基因特异性基因16SrDNA PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第二引物探针混合液由n×36μL金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第三引物探针混合液由n×36μL检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第四引物探针混合液由n×36μL肺炎链球菌基因特异性基因ply PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第五引物探针混合液由n×36μL嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第六引物探针混合液由n×36μL枸橼酸菌基因特异性基因cfa PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第七引物探针混合液由n×36μL阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第八引物探针混合液由n×36μL流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6 PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成。
PCR反应酶系由Taq DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶组成，将5U/μL Taq酶和2U/μL UNG酶按体积比3∶1比例混合混合组成。
PCR扩增的条件为：37℃2min，94℃2min，1循环；93℃15s，60℃60秒，40循环。
所述阳性对照品为含有灭活的分枝杆菌16S基因片段的工程菌、femA基因片段的工程菌、phoE基因片段的工程菌、ply基因片段的工程菌、嗜麦芽寡氧单胞菌16S基因片段的工程菌、cfa基因片段的工程菌、ampC基因片段的工程菌、ompP6基因片段的工程菌的混合液，菌浓度105CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度105CFU/mL。
实施例四
本实施例结合具体检测案例说明本发明的具体应用方式，首先收集人痰液和咽拭子样本，采用发明实施例三中提供的试剂盒进行检测，统计结果符合率。
收集临床样本，经细菌培养鉴定法确定为多重耐药菌感染，采用本方法进行检测，统计结果符合率。
1、样本核酸制备
(1)痰液：取痰液加入2倍体积的4％NaOH(自备)，摇匀，室温下放置30min液化，12,000rpm 5min。沉淀加无菌生理盐水1mL打匀，12,000rpm 5min；去尽上清，沉淀中直接加入50μL核酸抽提液，充分混匀，98℃10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min，取上清2μL做PCR反应。
(2)对照品：取阳性对照品、阴性对照品各50μL分别置于1.5mL(或0.5mL)离心管中(冻存试剂融化后振荡混匀10sec)，分别加入核酸抽提液100μL充分混匀，98℃10min，然后12,000rpm 5min，取上清4μL做PCR反应。
2、试剂配制
取n×36μL分枝杆菌(16S)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL金黄色葡萄球菌(femA)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL肺炎克雷伯菌(phoE)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL肺炎链球菌(ply)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL嗜麦芽寡氧单胞菌(Sm16S)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL枸橼酸杆菌(cfa)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL阴沟肠杆菌(ampC)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×36μL流感嗜血杆菌(ompP6)基因PCR检测混合液与n×0.4μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒。
3、加样
分别取上述混合液36μL置于PCR管中，然后将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品，盖好管盖，立即进行荧光PCR扩增反应。
4、PCR扩增
反应管置于荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：
37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15sec，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为40μL。
荧光通道检测选择：16S、femA、phoE、ply、Sm16S、cfa、ampC、ompP6基因选用FAM通道。
5、结果判定
检测结果根据CT值进行判定，仪器FAM通道CT栏显示Undet，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品在FAM通道CT值均≤35，检测结果报告为阳性；待检样品FAM通道CT显示在35～40之间且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。
6、检测结果
本方法与细菌培养鉴定与药敏试验结果一致。
以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (8)
1.一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的引物和探针，其特征在于，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
2.根据权利要求1所述的实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的引物和探针，其特征在于，16S、phoE、ply、Sm16S、cfa、ampC、ompP6基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA；femA基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB。
3.一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的方法，其特征在于，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对分枝杆菌16S、金黄色葡萄球菌femA、肺炎克雷伯菌phoE、肺炎链球菌ply、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S、枸橼酸菌cfa、阴沟肠杆菌ampC、流感嗜血杆菌ompP6基因设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示；
分别针对分枝杆菌16S、金黄色葡萄球菌femA、肺炎克雷伯菌phoE、肺炎链球菌ply、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S、枸橼酸菌cfa、阴沟肠杆菌ampC、流感嗜血杆菌ompP6基因，配置反应混合液；
分别取所述混合液36μL置于PCR管中，并将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品，盖好管盖，进行荧光PCR扩增反应，并进行结果判定。
4.一种实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、第四引物探针混合液、第五引物探针混合液、第六引物探针混合液、第七引物探针混合液、第八引物探针混合液、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，第一引物探针混合液包括检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；第二引物探针混合液包括检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测检测金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；第三引物探针混合液包括检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO：10～11所示，检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；第四引物探针混合液包括检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的引物核苷酸序列如SEQIDNO：14～15所示，检测肺炎链球菌基因特异性基因ply的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；第五引物探针混合液检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的引物核苷酸序列如SEQIDNO：18～19所示，检测嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；第六引物探针混合液检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的引物核苷酸序列如SEQIDNO：22～23所示，检测枸橼酸菌基因特异性基因cfa的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；第七引物探针混合液包括检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的引物核苷酸序列如SEQIDNO：26～27所示，检测阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；第七引物探针混合液检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的引物核苷酸序列如SEQIDNO：30～31所示，检测流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：32所示。
5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，第一引物探针混合液由n×36μL分枝杆菌基因特异性基因16S rDNA PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第二引物探针混合液由n×36μL金黄色葡萄球菌基因特异性基因femA PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第三引物探针混合液由n×36μL检测肺炎克雷伯菌基因特异性基因phoE PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第四引物探针混合液由n×36μL肺炎链球菌基因特异性基因ply PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第五引物探针混合液由n×36μL嗜麦芽寡养单胞菌基因特异性基因Sm16S PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第六引物探针混合液由n×36μL枸橼酸菌基因特异性基因cfa PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第七引物探针混合液由n×36μL阴沟肠杆菌基因特异性基因ampC PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成；第八引物探针混合液由n×36μL流感嗜血杆菌基因特异性基因ompP6 PCR检测混合液与n×0.4μL酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒而成。
6.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，PCR反应酶系由Taq DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶组成，将5U/μL Taq酶和2U/μLUNG酶按体积比3∶1比例混合混合组成。
7.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的条件为：37℃2min，94℃2min，1循环；93℃15s，60℃60秒，40循环。
8.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测下呼吸道细菌特异性基因的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有灭活的分枝杆菌16S基因片段的工程菌、femA基因片段的工程菌、phoE基因片段的工程菌、ply基因片段的工程菌、嗜麦芽寡氧单胞菌16S基因片段的工程菌、cfa基因片段的工程菌、ampC基因片段的工程菌、ompP6基因片段的工程菌的混合液，菌浓度105CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度105CFU/mL。
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