CN109097459B - 一种基于snp位点的成人常用抗感染药物用药分析的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于SNP位点的成人常用抗感染药物用药检测方法,针对成人常见抗感染药风险评估的SNP位点组合,包含了用于检测药物毒性、药物代谢和药物反应的67个SNP位点组合及其特异性引物。通过位点特异性引物对样品DNA进行PCR扩增,并分析其熔解曲线与标准熔解曲线的差异,对比PCR扩增产物的Tm值,获得相应的基因分型结果。本检测方法可应用于成人对常见抗感染药物适用性的快速筛查,为成人用药的合理选择提供指导,检测方法具有操作简单、效率高、特异性高和经济实惠等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体为一种基于SNP位点的成人抗感染药物用药分析系统及其应用。
背景技术
药物基因检测是通过提取患者口腔黏膜中的DNA,针对与药物反应相关基因进行解读,根据不同基因型对特定药物的临床反应的统计结果,预测患者对特定药物的不良反应程度,对临床用药起到一定的指导作用。
1999年至2017年,全国药品不良反应监测网络累计收到《药品不良反应/事件报告表》1218.2万份,2017年共收到143万份《药品不良反应/事件报告表》,其中严重药品不良反应/事件报告12.6万份,占同期报告总数的8.8%。2017年药品不良反应/事件报告涉及的怀疑药品中,化学药品例次数排名前5位的类别为抗感染药(占化学药品总例次数的42.3%),心血管系统用药(10.0%),肿瘤用药(7.3%),电解质、酸碱平衡及营养药(6.2%),神经系统用药(5.7%)。其中抗感染药物在2017年化学药品严重药品不良反应/事件报告中也占据首位,达到32.9%。对成人常见抗感染药物进行基因检测,可以根据其独特的基因型,个性化用药,最大程度的降低用药风险。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,是人类可遗传变异中最常见的一种。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万。数量庞大的SNP位点与生命的多种进程都密切相关,尤其是在疾病的鉴定方面SNP起着重大的作用。
针对当前成人常用抗感染药物,包括β-内酰胺类抗生素(青霉素类抗生素):青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、克拉维酸、头孢拉定、头孢克洛、头孢氨苄;氨基糖苷类抗生素:链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素;大环内酯类抗生素:红霉素;磺胺类抗菌剂:磺胺甲噁唑、复方磺胺甲噁唑、磺胺甲基异恶唑、柳氮磺吡啶;抗结核病药:吡嗪酰胺、利福平、链霉素、异烟肼;抗真菌药:伏立康唑;抗病毒药:聚乙二醇化干扰素-α-2a、聚乙二醇化干扰素-α-2b、利巴韦林、利托那韦;抗疟药:伯氨喹、乙胺嘧啶等,结合药物基因数据库以及最新的临床科研进展,我们构建了三类抗感染药物基因SNP检测组合。
药物毒性分析:不同基因型的人群对某些药物有着不同的解毒能力,如rs8330位点,其中CC基因型的人群比CG和GG基因型的人群在使用对乙酰氨基酚类药物时更容易造成肝功能衰竭,因此CC基因型的患者可考虑采用其它替换药物。常见抗感染药物进行药物毒性分析的SNP位点包括rs1050828,rs761142,rs1544410,rs6051702,rs11854484,rs1127354,rs1800795,rs7270101,rs267606617,rs267606618,rs267606619,rs9274407,rs1805128,rs11125,rs1041983,rs1799931,rs1800629,rs1799930,rs4646244,rs1042640,rs10929303,rs17863778,rs17868323,rs2853826,rs2854116,rs2854117,rs3806596,rs5128,rs7586110,rs8175347,rs8330。
药物代谢分析:不同基因型的人群对某些药物有着不同的代谢能力,如rs4646437位点,其中AG基因型的人群比GG基因型的人群对伏立康唑等抗真菌感染类药物有着更低的代谢能力,提示AG基因型的患者可以在医生指导下酌情减少用药。对常见抗感染药物进行药物代谢分析的SNP位点包括rs1045642,rs368234815,rs35599367,rs717620,rs2231142,rs72552713,rs2032582,rs4646437。
药物反应分析:不同基因型的人群对某些药物有着不同的反应能力,如rs4803217位点,其中CC基因型的患者比AA和AC基因型的患者对聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b和利巴韦林等抗病毒类药物有着更强的反应能力。对常见抗感染药物进行药物反应分析的SNP位点包括rs11506105,rs117648444,rs11881222,rs12979860,rs12980275,rs14158,rs28416813,rs3828913,rs4273729,rs4803217,rs4803219,rs7248668,rs760370,rs8103142,rs8105790,rs9939609,rs8099917,rs10846744,rs10741657,rs10853728,rs10877012,rs12819210,rs2228570,rs8113007,rs1800477,rs187238,rs1946518,rs212091。
目前针对这些基因位点多态性的研究主要是Sanger测序法,该方法只能针对某一个样本的某一段区域进行检测,检测效率低,成本高。
基于此,本发明提供了一种基于SNP位点的成人常用抗感染药物用药分析系统及其应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状,提供一种检测便捷、准确率高、经济实惠的成人抗感染常用药物相关基因位点的检测方法;通过多组基因引物对样品DNA进行实时定量PCR扩增,并通过各位点的熔解曲线与标准熔解曲线相比较获取其基因型,最终判断出个体对特定药物的生理反应情况。
为实现上述发明的目的,本发明采用的技术方案是:
一种基于SNP位点的成人常用抗感染药物用药检测方法,针对成人常见抗感染药风险评估的SNP位点组合,包含了用于检测药物毒性、药物代谢和药物反应的67个SNP位点组合及其特异性引物。
对常见抗感染药物进行药物毒性分析的SNP位点(rs1050828,rs761142,rs1544410,rs6051702,rs11854484,rs1127354,rs1800795,rs7270101,rs267606617,rs267606618,rs267606619,rs9274407,rs1805128,rs11125,rs1041983,rs1799931,rs1800629,rs1799930,rs4646244,rs1042640,rs10929303,rs17863778,rs17868323,rs2853826,rs2854116,rs2854117,rs3806596,rs5128,rs7586110,rs8175347,rs8330);
对常见抗感染药物进行药物代谢分析的SNP位点(rs1045642,rs368234815,rs35599367,rs717620,rs2231142,rs72552713,rs2032582,rs4646437);
对常见抗感染药物进行药物反应分析的SNP位点(rs11506105,rs117648444,rs11881222,rs12979860,rs12980275,rs14158,rs28416813,rs3828913,rs4273729,rs4803217,rs4803219,rs7248668,rs760370,rs8103142,rs8105790,rs9939609,rs8099917,rs10846744,rs10741657,rs10853728,rs10877012,rs12819210,rs2228570,rs8113007,rs1800477,rs187238,rs1946518,rs212091)。
一种基于SNP位点的成人常用抗感染药物用药分析的检测系统,包括所述的组合SNP位点、一组包含饱和染料的PCR反应mix,还包含了检测SNP位点的组合引物,所述的组合引物序列如T ID NO:1-62、M ID NO:1-16和R NO:1-56所示。
一种基于SNP位点的成人常用抗感染药物用药分析的检测系统的检测方法,包括以下步骤:
1)样品采集、DNA提取和PCR扩增引物的设计:所述扩增引物设计为所述的组合引物;
2)高分辨率溶解荧光定量PCR扩增所述的组合引物:将步骤1)中不同的组合引物按照等比例混合,混合后作为一个的引物池,使用96孔板或者384孔板,按照试剂盒要求配置反应体系,贴封板膜,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底;
(注意:贴膜时,使用Roche LightCycler 480Ⅱ专配刮板,使膜贴紧PCR板。)
体系如下:
用此引物按照荧光定量PCR的方法进行扩增,扩增条件如下:95℃预变性10min;然后按95℃变性10s,65-55℃退火(每个循环下降0.5℃)10s,72℃延伸30s的程序进行45个循环;扩增出的DNA片段即为扩增文库;
3)步骤2)中的DNA片段按照高分辨率熔解曲线条件进行高分辨率溶解曲线过程,扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行,程序为:升温至95℃1min,然后降温至40℃1min,再升温至65℃1s。从65℃连续升温到95℃的过程中进行荧光收集(25次/℃)。最后,降温至40℃。
本发明提出了一种基于SNP位点的成人常用抗感染药物用药分析系统及其应用,其基于高分辨率溶解曲线法(荧光定量PCR技术),可同时检测成人用药相关基因的67个基因位点,具有通量高、成本低、检测时间短的特点。
上述的组合引物、PCR反应mix、测序方法中,所述组合引物为67对组合引物,所述上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度度内,且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。
所述上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度在3℃内,且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。
上述的组合引物、检测方法在制备用于基于SNP位点的成人用药基因检测试剂方面的应用。
有益效果:
1)高通量。通过一代测序获得的结果只是单个碱基的结果,而进行一次本发明的方法,至少可以检测30份样品,从而使其可以被广泛地用于成人用药基因检测服务的提供。
2)低成本。采用自主研发的检测试剂,其价格要远远低于进口仪器和试剂,使得检测成本大大降低。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
为了更好的理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的术语“高分辨率熔解曲线法”,主要是指基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的,因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。高分辨率熔解曲线技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
设计主要遵循:用软件进行比对,保证引物对之间的退火温度相差不大,最好在3度内。引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。组合引物的长度在20-40bp,所以在合成引物时,要选用较高纯化标准。
一个优选实施方案中,本发明的“组合引物”可用于制备试剂盒,所述试剂盒可用于成人用药相关基因位点检测。
本发明的另一个方面提供了用于对一个或多个样本进行成人用药相关基因位点检测的方法。所述方法包括使用上文描述的“组合引物”对多个样本的DNA进行扩增,然后进行测序以获得样本的序列的步骤。
本发明提供了基于多重PCR技术的高分辨率溶解曲线法,可同时检测常见的成人用药相关基因的67个突变位点的方法。
注意:为了保证样本不被食物或者饮料污染,取样前30min内请勿进食和饮水。
1)从检测者口腔拭子样本中提取基因组DNA;
2)将不同的组合引物按照等比例混合,混合后作为一个的引物池。使用96孔板或者384孔板,按照试剂盒要求配置反应体系,贴封板膜,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底;(注意:贴膜时,使用Roche LightCycler 480Ⅱ专配刮板,使膜贴紧PCR板。)
体系如下:
Roche Light Cycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR系统,开机;
用此引物按照荧光定量PCR的方法进行扩增,扩增条件如下:95℃预变性10min;然后按95℃变性10s,65-55℃退火(每个循环下降0.5℃)10s,72℃延伸30s的程序进行45个循环;扩增出的DNA片段即为扩增文库;
3)步骤2)中的DNA片段按照高分辨率熔解曲线条件进行高分辨率溶解曲线过程,扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行,程序为:升温至95℃1min,然后降温至40℃1min,再升温至65℃1s。从65℃连续升温到95℃的过程中进行荧光收集(25次/℃)。最后,降温至40℃。
表1:药物毒性相关SNP位点引物设计序列:
表2:药物代谢相关SNP位点引物设计序列:
表3:药物反应相关SNP位点引物设计序列:
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (2)
1.一种基于SNP位点的成人常用抗感染药物用药分析方法,其特征在于:包括针对成人常见抗感染药风险评估的SNP位点组合、一组包含饱和染料的PCR反应mix,还包含了检测SNP位点的组合引物,所述的组合引物序列如T ID NO:1-62、M ID NO:1-16和R NO:1-56所示;
针对成人常见抗感染药风险评估的SNP位点组合,包含了用于检测药物毒性、药物代谢和药物反应的67个SNP位点组合及其特异性引物;
对常见抗感染药物进行药物毒性分析的SNP位点:rs1050828,rs761142,rs1544410,rs6051702,rs11854484,rs1127354,rs1800795,rs7270101,rs267606617,rs267606618,rs267606619,rs9274407,rs1805128,rs11125,rs1041983,rs1799931,rs1800629,rs1799930,rs4646244,rs1042640,rs10929303,rs17863778,rs17868323,rs2853826,rs2854116,rs2854117,rs3806596,rs5128,rs7586110,rs8175347,rs8330;
对常见抗感染药物进行药物代谢分析的SNP位点:rs1045642,rs368234815,rs35599367,rs717620,rs2231142,rs72552713,rs2032582,rs4646437;
对常见抗感染药物进行药物反应分析的SNP位点:rs11506105,rs117648444,rs11881222,rs12979860,rs12980275,rs14158,rs28416813,rs3828913,rs4273729,rs4803217,rs4803219,rs7248668,rs760370,rs8103142,rs8105790,rs9939609,rs8099917,rs10846744,rs10741657,rs10853728,rs10877012,rs12819210,rs2228570,rs8113007,rs1800477,rs187238,rs1946518,rs212091;
包括以下步骤:
1)样品采集、DNA提取和PCR扩增引物的设计:所述扩增引物设计为所述的组合引物;
2)高分辨率溶解荧光定量 PCR扩增所述的组合引物:将步骤1)中不同的组合引物按照等比例混合,混合后作为一个引物池,按照试剂盒要求配置反应体系,体系如下:
用此引物按照荧光定量 PCR的方法进行扩增,扩增条件如下:95℃预变性10min;然后按95℃变性10s,65-55℃退火,每个循环下降0.5℃,10s,72℃延伸30s的程序进行45个循环;扩增出的 DNA片段即为扩增文库;
3)步骤2)中的DNA片段按照高分辨率熔解曲线条件进行高分辨率溶解曲线过程,扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行,程序为:升温至95℃ 1 min,然后降温至40℃1min,再升温至65℃ 1s;从65℃连续升温到95℃的过程中进行荧光收集;最后,降温至40℃;
所述的组合引物为67对组合引物,上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度3℃内,且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。
2.应用权利要求1所述的分析方法制备一种成人用药相关基因位点检测试剂的用途。
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