KR100695147B1 - 다중좌 마커를 이용한 2형 당뇨병의 진단방법, 2형당뇨병과 연관된 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및마이크로어레이 - Google Patents
다중좌 마커를 이용한 2형 당뇨병의 진단방법, 2형당뇨병과 연관된 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및마이크로어레이 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 2형 당뇨병과 연관된 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 피검체에 있어서 하기 표 1에 표시된 1 이상 핵산의 다형성 부위의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는, 2형 당뇨병의 진단 방법을 제공한다.
폴리뉴클레오티드, 2형 당뇨병, 단일염기 다형, SNP
Description
1. Gusella, Ann. Rev. Biochem . 55, 831-854(1986)
2. PR Newswire, Sept 1, 1998
3. PR Newswire, Oct 28, 2003
본 발명은 다중좌 마커를 이용한 2형 당뇨병의 진단방법, 2형 당뇨병과 연관된 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 마이크로어레이에 관한 것이다.
모든 생물의 게놈은 진화의 과정에서 자손의 서열에 변이체를 생기게 하는 자발적 돌연변이를 겪는다 (Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831-854(1986)). 변이체는 자손 형태에 비하여 진화적으로 이익 또는 불이익을 주거나 중성적일 수 있다. 어떤 경우는 변이체가 치사적 불이익을 주어 자손에게 전달되지 않는 경우도 있다. 다른 경우에는, 종에게 진화학적인 이익을 주고, 결국에는 종의 대부분에 DNA가 삽입되어 효과적으로 선조 형태가 된다. 많은 경우 이 선조 형태 및 변이체는 살아남아 종집단 중에 공존하게 된다. 서열의 복수 형태의 공존에 의하여, 다형(polymorphism)이 발생한다.
이러한 다형에는 RFLP (restriction fragment length polymorphism: 제한 단편 길이 다형), STR (short tandem repeats), SNP(single nucleotide polymorphism : 단일염기 다형) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 단일염기 다형으로서, 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. 단일염기 다형은 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형 형태 중 어느 하나에 의하여 결함이 있거나 변이된 단백질이 발현될 수도 있다. 다른 경우에는 비코딩 영역 서열에 단일염기 다형이 발생할 수 있다. 이들 중 일부는 결함이 있거나 변이된 단백질의 발현을 초래할 수 있다 (예를 들면, 결함 있는 스플라이싱의 결과로서). 어떤 단일염기 다형은 표현형에 아무런 영향을 미치지 않을 수 있다.
단일염기 다형은 인간의 경우 약 1,000bp 마다 1회의 빈도로 발생하는 것으로 알려져 있다. 이들 단일염기 다형이 질병과 같은 표현형에 영향을 미치는 경우, 상기 단일 염기 다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 질병을 진단하는 데에 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 단일염기 다형에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또한, 질병의 진단에 사용될 수 있다. 현재 여러 연구 기관에서 단일염기 분석 및 그 기능 분석에 관한 연구를 수행하고 있다. 이렇게 찾아낸 단일염기 다형의 염기서열 및 기타 실험결과를 데이터베이스화하여 공개, 누구나 접근하여 연구에 이용할 수 있도록 하고 있다.
그러나 이러한 단일염기 다형은 단순히 인간의 게놈 또는 cDNA 상에 단일염기 다형이 존재한다는 것만을 발견하였을 뿐, 이들이 표현형에 미치는 영향을 밝힌 것은 아니었다. 이들 중 일부에 대하여는 그 기능이 알려진 것도 있으나, 대부분이 알려지지 않았다.
2형 당뇨병 (Type 2 Diabetes Mellitus)은 전체 당뇨병 환자의 90 ~ 95%가 해당하는 것으로 알려져 있다. 2형 당뇨병은 체내에서 인슐린은 생산되지만, 인슐린의 양이 비정상적이거나, 인슐린에 대한 민감도 (sensitivity)가 낮은 사람들에게서 발병하는데, 혈액 내 혈당 수준의 변이가 크게 나타나는 증세를 나타낸다. 이는 인슐린의 효용도 이상으로 인해 혈액 내의 포도당을 세포 내로 이동시킬 수 없기 때문에 음식물로부터 에너지를 얻는데 어려움이 생기는 것으로 알려져 있다. 2형 당뇨병의 발병에는 유전적 요인이 있는 것으로 알려져 있고, 그 외의 위험인자 (risk factor)로는 45세 이상의 나이, 당뇨병에 대한 가족력, 과체중, 고혈압 및 콜레스테롤 수준 등을 들 수 있다. 현재 당뇨병의 진단은 주로 공복시의 혈당치 (FSB : fasting blood glucose) 시험, 및 경구 포도당 부하시험(OGTT : oral glucose tolerance test) 등을 통해 질병에 의한 표현형의 변화, 즉 혈당량을 측정하는 방법으로 이루어지고 있다 (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health, http://www.niddk.nih.gov, 2003). 2형 당뇨병의 경우 진단이 되면 운동 및 식이생활습관의 변화, 체중조절, 및 각종 약물치료 등을 통해 치료 또는 당뇨병의 진행 속도를 늦출 수 있기 때문에 조기 진단의 필요성이 매우 높은 질병이라 할 수 있다. 밀레니움 파마슈니컬스(Millenium Pharmaceuticals) 사에서 HNF1 유전자에 있는 유전자형의 변이들을 탐지함으로써 2형 당뇨병의 진단과 예측이 가능하다고 발표하였고 (PR Newswire, Sept 1, 1998), 시쿼넘(Sequenom) 사에서는 FOXA2 (HNF3β) 유전자가 2형 당뇨병의 발병과 높은 연관이 있다고 발표하였다 (PR Newswire, Oct 28, 2003). 이와 같이 몇몇 유전자들이 2형 당뇨병의 발병과 연관이 있다고 보고되고 있지만, 일부 염색체 상의 소수의 특정 유전자에만 연구가 집중되어 있고 특정 인구집단을 대상으로 실험하였다. 이에 따라 대상으로 하는 인종에 따라 다른 결과가 나타날 가능성이 있고, 2형 당뇨병의 원인유전자가 모두 밝혀진 것은 아니며, 이러한 분자 생물학적 방법을 이용하여 2형 당뇨병을 진단하는 경우는 많지 않은 것이 현재의 진단 수준이다. 아울러 발병 전 조기 진단은 현재 이루어지지 못하고 있다. 이에 전체 인간 유전체를 대상으로 2형 당뇨병과 연관이 높은 새로운 SNP 및 관련 유전자를 찾아내어 조기 진단에 활용해야 할 필요성이 대두되었다.
본 발명의 목적은 다중좌 마커를 이용하여 2형 당뇨병을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 2형 당뇨병과 연관된 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 있는 기판을 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명은 피검체에 있어서 하기 표 1에 표시된 1 이상 핵산의 다형성 부위의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는, 2형 당뇨병의 진단 방법을 제공한다.
표 1.
| NCBI 젠 뱅크 허가번호 | 다형성 부위 |
| rs502612 | 서열번호 1의 101번 |
| rs1394720 | 서열번호 2의 101번 |
| rs488115 | 서열번호 3의 101번 |
| rs2051672 | 서열번호 4의 101번 |
| rs1038308 | 서열번호 5의 101번 |
| rs1943317 | 서열번호 6의 101번 |
| rs929476 | 서열번호 7의 101번 |
| rs1984388 | 서열번호 8의 101번 |
| rs752139 | 서열번호 9의 101번 |
| rs2058501 | 서열번호 10의 101번 |
| rs1059033 | 서열번호 11의 101번 |
| rs492220 | 서열번호 12의 101번 |
| rs1461986 | 서열번호 13의 101번 |
| rs607209 | 서열번호 14의 101번 |
| rs197367 | 서열번호 15의 101번 |
| rs1340266 | 서열번호 16의 101번 |
| rs1316909 | 서열번호 17의 101번 |
| rs1377188 | 서열번호 18의 101번 |
서열번호 1 내지 18은 상기 rs502612, rs1394720, rs488115, rs2051672, rs1038308, rs1943317, rs929476, rs1984388, rs752139, rs2058501, rs1059033, rs492220, rs1461986, rs607209, rs197367, rs1340266, rs1316909, 및 rs1377188의 단일염기 다형성 부위 (101번 위치)의 염기서열을 포함하는 201bp의 핵산 단편이다. 상기 핵산 및 상기 핵산에 존재하는 각 단일염기다형의 특성에 관하여는 하기 표 2 및 표 3에 나타낸 바와 같다.
상기 서열번호 1 내지 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기 다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기 다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 18의 다형성 서열 중 1 이상의 다형성 부위 (101 번 위치)가 2형 당뇨병과 연관성이 있는 다중좌 마커 (multilocus marker)를 이용하는 2형 당뇨병을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 다중좌 마커는 2형 당뇨병 환자와 정상인으로부터 유래한 혈액 시료로부터 얻어진 DNA를 서열 분석한 결과를 통하여 확인할 수 있었다. 표 2 및 3은 서열번호 1 내지 18의 다형성 서열의 특성을 나타낸 것이다.
표 2.
표 2 (계속)
표 3.
표 2 및 3에 있어서, 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.
ㆍAssay_ID는 마커의 명칭을 나타내는 것이다.
ㆍSNP는 단일염기 다형성 부위에서 관찰되는 염기를 나타낸 것으로, 여기서 A1과 A2는 시쿼넘 (Sequenom)사의 균질적 MassEXTEND (homogeneous MassEXTEND : 이하 hME라고도 한다) 기법에 의하여 서열분석을 하는 과정에서 질량이 작은 대립인자를 A1 및 질량이 큰 대립인자를 A2로 임의적으로 실험의 편의상 명명한 것이다.
ㆍSNP를 포함하는 서열은 각 SNP 부위를 포함하는 서열의 서열번호를 나타낸 것으로, 각각 101번째 위치에 A1 및 A2 대립인자를 포함하는 서열을 나타낸 것이다.
ㆍ대립인자 빈도 (allele frequency)란에서 cas_A2, con_A2 및 Delta는 각각 질병군 (case sample)에서의 A2 대립인자의 빈도, 정상군 (normal sample)에서의 A2 대립인자의 빈도 및 상기 cas_A2와 con_A2의 차이의 절대값을 나타내는 것이다. 여기서 cas_A2는 질병군에서 (A2A2 유전자형의 빈도x2 + A1A2 유전자형의 빈도)/(질병군의 샘플 수 x2)이고, con_A2는 정상군에서 (A2A2 유전자형의 빈도x2 + A1A2 유전자형의 빈도)/(정상군의 샘플 수 x2)이다.
ㆍ유전자형의 빈도 (genotype frequency)는 각 유전자형의 빈도를 나타내는 것으로, cas_A1A1, cas_A1A2 및 cas_A2A2 및 con_A1A1, con_A1A2 및 con_A2A2는 각각 질병군과 정상군에서 A1A1, A1A2 및 A2A2 유전자형을 갖는 사람의 수를 나타낸다.
ㆍ카이제곱 (df=2)은 자유도 (degree of freedom)가 2인 카이제곱 값을 나타낸 것으로, Chi-value는 카이제곱 결과 값으로 p-value 계산의 기준이 되는 값이다. chi-exact-p-value는 p-value of Fisher's exact test of chi-square test를 나타내는 것으로, 유전자형 수의 값이 5 보다 작은 값이 포함되는 경우 일반 카이제곱 검정 결과가 부정확할 수 있으므로, Fisher's exact test를 통해 보다 정확한 통계적 유의성 (p-value)을 검정하는데 사용되는 변수이다. 본 발명에서는 p-value≤ 0.05인 경우 질병군과 정상군의 유전자형이 같지 않다 즉, 유의하다고 판단하였다.
ㆍ오즈 비율 (odds ratio)은 정상군 중에서 대립인자 A1을 가질 확률에 대한 질병군 중에서 대립인자 A1을 가질 확률의 비율을 나타낸다. 본 발명에서는 Mantel-Haenszel odds ratio 방법을 사용하였다. CI (confidence Interval)는 오즈 비율의 95% 신뢰구간을 나타내는 것으로, (하한 신뢰구간, 상한 신뢰구간)을 나타낸다. 신뢰구간은 1을 포함하는 경우에는 질병과의 연관성을 유의하다고 판단할 수 없다.
ㆍHWE 상태는 하아디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium)의 상태를 나타내는 것으로, con_HWE 및 cas_HWE는 정상군 및 질병군에서 하아디-와인버그 평형 여부를 나타내는 것이다. 카이제곱 (df=1) 검정에서 chi-value = 6.63 (p-value =0.01, df=1)을 기준으로, 6.63 보다 큰 경우에는 하아디-와인버그 비평형 HWD (Hardy-Weinberg Disequilibrium)으로, 6.63 보다 작은 경우에는 하아디-와인버그 평형 HWE (Hardy-Weinberg Equilibrium)으로 판단하였다.
ㆍ콜 비율은 원래 실험에 투입한 전체 시료 수에 대한 유전자형이 성공적으로 실험된 시료의 수를 나타내는 것으로, cas_call_rate 및 con_call_rate는 각각 질병군 및 정상군 실험에 사용된 총 시료 (300 명) 중 유전자형이 성공적으로 분석된 비율을 나타내는 것이다.
표 2 및 3은 NCBI build 123을 기준으로 각 SNP 마커와 관련된 특성을 기재한 것이다.
본 발명의 방법의 일 구체예는, rs502612, rs1394720, rs488115, rs2051672, rs1038308, rs1943317, rs929476, rs1984388, rs752139, rs2058501, rs1059033, rs492220, rs1461986, rs607209, rs197367, rs1340266, rs1316909, 및 rs1377188의단일염기 다형성 부위의 염기서열이 하기 (1) 내지 (7) 중 하나 이상에 해당하는 경우는 피검체를 2형 당뇨병 환자 또는 2형 당뇨병에 걸린 위험성이 높은 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
(1) rs488115의 다형성 부위의 유전자형이 AA 또는 AG이고, rs1984388의 다형성 부위의 유전자형이 TT;
(2) rs2051672의 다형성 부위의 유전자형이 CC이고, rs1943317의 다형성 부위의 유전자형이 AA이고, rs752139의 다형성 부위의 유전자형이 AG 또는 GG;
(3) rs1943317의 다형성 부위의 유전자형이 TA 또는 AA이고, rs929476의 다형성 부위의 유전자형이 TT 또는 TC이고, rs1377188의 다형성 부위의 유전자형이 AT 또는 TT;
(4) rs502612의 다형성 부위의 유전자형이 TT이고, rs2051672의 다형성 부위의 유전자형이 CC이고, rs2058501의 다형성 부위의 유전자형이 CC 또는 CT이고, rs1461986의 다형성 부위의 유전자형이 TT 또는 TC;
(5) rs1394720의 다형성 부위의 유전자형이 TT 또는 TG이고, rs1316909의 다형성 부위의 유전자형이 AT 또는 TT이고, rs607209의 다형성 부위의 유전자형이 AG 또는 GG;
(6) rs2051672의 다형성 부위의 유전자형이 CC이고, rs1340266의 다형성 부위의 유전자형이 AA이고, rs492220의 다형성 부위의 유전자형이 TC 또는 CC; 및
(7) rs1038308의 다형성 부위의 유전자형이 CC이고, rs1059033의 다형성 부위의 유전자형이 TT이고, rs607209의 다형성 부위의 유전자형이 AA 또는 AC.
상기 (1) 내지 (7)에 해당하는 다중좌에서의 유전자형은 환자군과 정상인군에서 그의 출현 빈도를 비교함으로써, 유의하게 2형 당뇨병과 연관성이 있는 것으로 판명된 것이다. 상기 다중좌 마커의 출현 빈도에 대한 결과는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
표 4에서 마커 명칭에 대응되는 NCBI 젠뱅크 허가번호는 표 3에 나타낸 바와 같다. 표 4의 결과는 각각 300명의 2형 당뇨병 환자 및 정상인에서의 각 다중좌 유전자형 (genotype pattern)의 출현 빈도를 비교한 것으로, 상기 (1) 내지 (7)의 다중좌 유전자형 중 하나 이상을 만족하는 경우가, 300명의 환자 중 247명이었다 (82%). 또한, 표 4에서 오즈 비율 (Odds ratio)은 정상인 군에서의 상기 다중좌 유전자형의 출현확률에 대한 환자군에서의 상기 다중좌 유전자형의 출현확률의 비를 나타내는 것이다. Odds ratio 값은 모두 3.5 이상을 초과하는 것으로 상기 다중좌 유전자형의 출현 빈도와 2 형 당뇨병이 양성으로 아주 밀접하게 연관되어 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 구체예는, 피검체로부터 핵산을 얻는 단계; 및
서열번호 1 내지 18의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드 중의 1 이상의 다형성 부위 (101 번째)의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하는 2형 당뇨병의 진단방법일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 먼저 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다. 마지막 두 가지의 방법은 등온전사에 근거한 등온 반응과 관련되는 것으로서, 증폭산물로서 30 또는 100배의 단일가닥 RNA 및 이중 가닥 DNA를 생산한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하 는 단계는 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 디데옥시법과 같은 직접적으로 핵산의 염기서열을 분석하는 방법이 사용될 수 있다. 또한, 혼성화 방법과 같이 직접적으로 염기서열을 결정하지 않고, 간접적으로 다형성 부위의 염기서열을 결정하는 방법이 사용될 수 있다. 혼성화 방법을 이용하는 경우, 다양한 방법이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 핵산 마이크로어레이가 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 서열번호 1 내지 18로 구성된 군으로부터 유래한 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 101 번째 염기를 포함하는 2형 당뇨병 진단 또는 치료용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 2 개 이상 고정화되어 있는 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
마이크로어레이 및 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 2형 당뇨병과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 발명은 또한, 하기 표의 다형성 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 세트로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 다형성 부위 (101번째 뉴클레오티드)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 세트를 제공한다.
| NCBI 젠 뱅크 허가번호 | 다형성 부위 | 서열 |
| rs502612 | 서열번호 1의 101번 | C 또는 T |
| rs1394720 | 서열번호 2의 101번 | T 또는 G |
| rs488115 | 서열번호 3의 101번 | A 또는 G |
| rs2051672 | 서열번호 4의 101번 | C 또는 A |
| rs1038308 | 서열번호 5의 101번 | C 또는 T |
| rs1943317 | 서열번호 6의 101번 | T 또는 A |
| rs929476 | 서열번호 7의 101번 | T 또는 C |
| rs1984388 | 서열번호 8의 101번 | A 또는 T |
| rs752139 | 서열번호 9의 101번 | A 또는 G |
| rs2058501 | 서열번호 10의 101번 | C 또는 T |
| rs1059033 | 서열번호 11의 101번 | T 또는 C |
| rs492220 | 서열번호 12의 101번 | T 또는 C |
| rs1461986 | 서열번호 13의 101번 | T 또는 C |
| rs607209 | 서열번호 14의 101번 | A 또는 C |
| rs197367 | 서열번호 15의 101번 | A 또는 G |
| rs1340266 | 서열번호 16의 101번 | A 또는 G |
| rs1316909 | 서열번호 17의 101번 | A 또는 T |
| rs1377188 | 서열번호 18의 101번 | A 또는 T |
본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 세트는 하기 (1) 내지 (7)로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 세트로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 세트이다:
(1) rs488115 및 rs1984388;
(2) rs2051672, rs1943317 및 rs752139;
(3) rs1943317, rs929476 및 rs1377188;
(4) rs502612, rs2051672, rs2058501 및 rs1461986;
(5) rs1394720, rs1316909 및 rs197367;
(6) rs2051672, rs1340266 및 rs492220; 및
(7) rs1038308, rs1059033 및 rs607209.
본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 세트는 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 세트는 용액 중에서 뿐만 아니라 고체 기판 상에 고정화되어, 즉 마이크로어레이 상에 고정화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 세트는 1 이상의 폴리뉴클레오티드 세트로서 2형 당뇨병에 특이적인 서열이기 때문에, 2형 당뇨병을 진단 또는 치료하는 등의 2 형 당뇨병과 관련된 용도로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드 세트 및 마이크로어레이에 대하여는 상기한 바와 같다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
본 실시예에서는 한국인 중 2형 당뇨병 환자로 판명되어 치료 중인 환자군 (300 명)과 환자군과 동일 연령 대에 해당하면서 아직 2형 당뇨병의 증상이 없는 정상인 (300 명)의 혈액으로부터 DNA를 분리하고, 특정한 단일염기 다형의 출현 빈도를 분석하였다. 본 실시예에 선택된 단일염기 다형은 공개된 데이터베이스 (NCBI dbSNP:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) 또는 Sequenom 사의 realsnp.com (http:://www.realsnp.com/)으로부터 선택하였으며, 선택된 단일염기 다형 주변의 서열을 이용한 프라이머를 이용하여 시료 중의 단일염기 서열을 분석하였다.
1. DNA 시료의 준비
2형 당뇨병 환자 및 정상인으로부터 수집한 혈액으로부터 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 공지의 추출 방법 (Molecular cloning : A Laboratory Manual, p 392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)과 상업용 키트 (Gentra system, D-50K)의 설명서에 따라 이루어졌다. 추출된 DNA 중 순도가 UV 측정치 (260/280nm)가 최소 1.7 이상되는 것만을 선별하여 사용하였다.
2. 표적 DNA의 증폭
분석하고자 하는 단일염기 다형이 포함된 일정한 DNA 영역인 표적 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR 방법은 통상적인 방법으로 진행하였으며, 그 조건은 다음과 같았다. 먼저, 표적 게놈 DNA를 2.5 ng/ml로 준비하였다. 다음으로 다음의 PCR 반응액을 준비하였다.
물(HPLC 급) 2.24㎕
10x 버퍼 (15 mM MgCl2, 25 mM MgCl2 함유) 0.5㎕
dNTP 믹스(GIBCO)(25 mM/각) 0.04㎕
Taq pol(HotStar)(5U/㎕) 0.02㎕
전위/후위 프라이머 믹스 (1μM/각) 0.02㎕
DNA 1.00㎕
총 반응 부피 5.00㎕
여기서, 상기 전위(forward) 및 후위(reverse) 프라이머는 공지의 데이데이터 베이스의 단일염기 다형의 상류와 하류로부터, 적당한 위치에서 선택하였다. 상기 프라이머를 표 5에 정리하였다.
열 순환 반응은, 95 ℃에서 15분 동안 유지하고, 95 ℃에서 30초, 56 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 45회 반복하고, 72 ℃에서 3분 동안 유지한 후, 4 ℃에 보관하였다. 그 결과, 200 개 뉴클레오티드 이하의 길이를 가진 표적 DNA 단편을 얻었다.
3. 증폭된 표적 DNA 중의 단일염기 다형의 분석
표적 DNA 단편 중의 단일염기 다형의 분석은 시쿼넘 (Sequenom)사의 균질적 MassEXTEND (homogeneous MassEXTEND : 이하 hME라고도 한다) 기법을 이용하였다. 상기 MassEXTEND 기법의 원리는 다음과 같다. 먼저, 표적 DNA 단편 중의 단일염기 다형 바로 전까지의 염기에 상보적인 프라이머 (연장용 프라이머 (extension primer)라고도 한다.)를 제작한다. 다음으로, 상기 프라이머를 표적 DNA 단편에 혼성화시키고, DNA 중합 반응을 일으킨다. 이 때, 반응액 중에 대상 단일염기 다형 대립인자 중 제1 대립인자 염기 (예를 들면, A 대립인자)에 상보적인 염기가 첨가된 후 반응이 멈추도록 하는 시약 (예를 들면, ddTTP)을 포함시킨다. 그 결과, 표적 DNA 단편에 제1 대립인자 (예를 들면, A 대립인자)가 존재하는 경우에는, 상기 제1 대립인자에 상보적인 염기 (예를 들면, T) 하나만이 첨가된 산물이 얻어진다. 반면, 표적 DNA 단편에 제2 대립인자 (예를 들면, G 대립인자)가 존재하는 경우에는, 상기 제2 대립인자에 상보적인 염기 (예를 들면, C)가 첨가된 가장 근접한 제1 대립인자 염기 (예를 들면, A)까지 연장된 산물을 얻게 된다. 이렇게 얻어진 상기 프라이머로부터 연장된 산물의 길이를 질량 분석을 통하여 결정함으로써, 표적 DNA에 존재하는 대립인자의 종류를 결정할 수 있다. 구체적인 실험조건은 다음과 같았다.
먼저, 상기 PCR 산물로부터 결합되지 않는 dNTP를 제거하였다. 이를 위하여 순수 1.53㎕, hME 버퍼 0.17㎕, SAP (shrimp alkaline phosphatase) 0.30㎕를 1.5 ml 튜브에 넣고 혼합하여 SAP 효소 용액을 준비하였다. 상기 튜브를 5,000 rpm에서 10 초 동안 원심분리하였다. 그 후, PCR 산물을 상기 SAP 용액 튜브에 넣고, 밀봉한 다음 37 ℃에서 20분, 85 ℃에서 5분 동안 유지한 후, 4 ℃에 보관하였다.
다음으로, 상기 표적 DNA 산물을 주형으로 하여 균질적 연장 반응을 실시하였다. 반응액은 다음과 같았다.
물(나노급 순수) 1.728㎕
hME 연장 믹스 (2.25 mM d/ddNTPs를 포함하는 10x버퍼) 0.200㎕
연장 프라이머 (각 100μM) 0.054㎕
Thermosequenase(32U/㎕) 0.018㎕
총부피 2.00㎕
상기 반응액을 잘 혼합한 후, 스핀다운 원심분리하였다. 상기 반응액이 든 튜브 또는 플레이트를 잘 밀봉한 다음, 94 ℃에서 2분 동안 유지한 다음, 94 ℃에 서 5초, 52 ℃에서 5초, 72 ℃에서 5초를 40회 반복 한 다음, 4 ℃에 보관하였다. 이렇게 얻어진 균질적 연장 반응 산물을 레진 (SpectroCLEAN, Sequenom사 #10053)을 사용하여 세척하였다. 연장 반응에 사용된 연장 프라이머는 표 3에 나타내었다.
표 5. 표적 DNA 증폭에 사용된 프라이머 및 균질 연장 반응에 사용된 연장 프라이머
얻어진 연장 반응 산물을 질량 분석 방법 중 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization-Time of Flight)를 이용하여 다형성 부위의 서열을 분석하였다. 상기 MALDI-TOF는 분석하고자 하는 물질이 레이저 빔을 받으면, 이온화된 매트릭스 (3-Hydroxypicolinic acid)와 함께 비행하여 진공상태에서 반대편에 있는 검출기까지 날아가는 데 걸린 시간을 계산하여 질량을 분석해내는 원리에 의하여 작동한다. 질량이 작은 물질은 검출기에 빨리 도달하게 되는데, 이렇게 얻어지는 질량의 차이와 이미 알고 있는 단일염기 다형의 서열을 근거로 하여 표적 DNA의 단일염기 다형의 서열을 결정할 수 있는 것이다.
상기와 같은 MALDI-TOF를 사용한 표적 DNA의 다형성 부위의 서열을 결정한 결과는 표 2 및 3에 나타내었다. 이 때, 각 대립인자는 각 개체에 있어서 동형접합자 (homozygote) 또는 이형접합자 (heterozygote)의 형태로 존재할 수 있다. 멘델의 유전법칙과 하디-와인버그 (Hardy-Weinberg) 법칙에 의하면, 집단을 구성하는 대립인자의 조성은 일정한 빈도로 유지되며, 통계적으로 유의한 경우 생물학적 기능상의 의미를 부여할 수 있다. 본 발명의 단일염기 다형은 표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 2형 당뇨병 환자에게서 통계적으로 유의한 수준으로 출현되어, 2형 당뇨병의 진단 등에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 표 4에 나타낸 바와 같이, 표 2와 3으로부터 얻어지는 단일염기 다형성 부위의 염기서열을 조합한 유전자형 즉, 다중좌 유전자형과 2형 당뇨병과의 연관성을 분석한 결과 2형 당뇨병과의 연관성이 아주 높은 것으로 확인되었다.
본 발명의 2형 당뇨병의 진단방법에 의하면, 2형 당뇨병의 존재 또는 위험의 유무를 효과적으로 진단할 수 있다.
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- 하기 표의 다형성 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 각각 다형성 부위 (101번째 뉴클레오티드)를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드:
NCBI 젠 뱅크 허가번호 다형성 부위 서열 rs502612 서열번호 1의 101번 C 또는 T rs1394720 서열번호 2의 101번 T 또는 G rs488115 서열번호 3의 101번 A 또는 G rs2051672 서열번호 4의 101번 C 또는 A rs1038308 서열번호 5의 101번 C 또는 T rs1943317 서열번호 6의 101번 T 또는 A rs929476 서열번호 7의 101번 T 또는 C rs1984388 서열번호 8의 101번 A 또는 T rs752139 서열번호 9의 101번 A 또는 G rs2058501 서열번호 10의 101번 C 또는 T rs1059033 서열번호 11의 101번 T 또는 C rs492220 서열번호 12의 101번 T 또는 C rs1461986 서열번호 13의 101번 T 또는 C rs607209 서열번호 14의 101번 A 또는 C rs197367 서열번호 15의 101번 A 또는 G rs1340266 서열번호 16의 101번 A 또는 G rs1316909 서열번호 17의 101번 A 또는 T rs1377188 서열번호 18의 101번 A 또는 T - 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기 (1) 내지 (7)로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 세트로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:(1) rs488115 및 rs1984388;(2) rs2051672, rs1943317 및 rs752139;(3) rs1943317, rs929476 및 rs1377188;(4) rs502612, rs2051672, rs2058501 및 rs1461986;(5) rs1394720, rs1316909 및 rs197367;(6) rs2051672, rs1340266 및 rs492220; 및(7) rs1038308, rs1059033 및 rs607209.
- 제5항 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 있는 마이크로어레이.
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