CN106119363A - 用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的snp组合、检测方法和试剂盒 - Google Patents

用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的snp组合、检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP组合、检测方法和试剂盒，属于医学分子生物学诊断技术领域，该SNP组合含有7个SNP位点，所述7个SNP位点的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～7所示；本发明还涉及一种SNP的检测方法，所述方法包含一个PCR扩增反应及双标记探针熔解曲线分析反应，7个SNP位点检测的引物对及双标记探针序列如SEQ ID NO.8～20所示。本发明所提供的SNP位点组合、检测方法和试剂盒能够快速、准确、简便和高通量的检测患者基因型，并预测患者使用抗结核药物发生肝损伤的风险。

Description

用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP组合、检测方法 和试剂盒
技术领域
本发明涉及单核苷酸多态性(SNP)检测，特别涉及用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP组合、检测方法和试剂盒，属于医学分子生物学诊断技术领域。
背景技术
结核病仍然是严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。据WHO统计，世界人口的1/3有结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第二大杀手。我国是全世界22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到结核菌感染。
目前结核病的治疗主要是应用异烟肼、利福平和吡嗪酰胺等药物，这些药物具有较明显的肝损伤，特别是联合应用时，更应考虑此类药物的肝损伤问题。药物性肝损伤是由药物或其代谢产物引起的肝功能异常，属于药物引起的肝脏毒性，是抗结核治疗中的常见问题。也是常见的上市后药品退出市场应用的原因之一。随着全球范围内结核疫情的反弹，抗结核药物引起的肝损伤也成为药物性肝炎最常见的原因之一。
不同国家抗结核药物肝损伤的发生率，从2.5％至34.9％不等，这种差异可能与种族、社会经济状况及地理位置等因素有关，也可能受营养不良、病毒性肝炎流行及遗传因素等的影响，此外，不能排除对抗结核药物所致肝损伤诊断缺乏统一标准、抗结核治疗方案、用药剂量和样本大小等原因对调查结果的影响。
近年来，药物代谢酶基因多态性与抗结核药物肝损伤个体差异的关系的研究越来越深入。药物代谢酶相关基因多态性影响许多药物的代谢率，从而影响治疗效果，而某些药物代谢率的降低会增加不良反应的危险性。由基因多态性造成的代谢率差异可达100倍。
如果得出某些SNP(单核苷酸的多态性)或SNP组合与某类药物的损伤、不良反应有明显相关性，就可以将这些SNP作为分子遗传标记，进行分子标记辅助选择和用药预测，实现个体化用药，减少药物不良反应。已有研究表明，N-乙酰基转移酶2基因NAT2的基因多态性影响利福平、异烟肼等抗结核药物的代谢率，从而影响此类药物的肝损伤等不良反应。
目前检测基因多态性(SNP)的方法主要有直接测序法、芯片法、质谱法、Taqman法、高分辨率熔解曲线法等。直接测序法是“金标准”，但操作复杂、成本高、周期长；芯片法通量高，适合大样本量检测，但准确性较差；质谱法准确性高，但需要专业的仪器，成本较高；Taqman法和高分辨率熔解曲线法均是基于荧光定量PCR技术，操作简单，但通量低，一般一个反应只能检测一个SNP位点。
因此，提供一种简单、快速、准确、成本低廉的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP组合、检测方法及试剂盒就成为该技术领域急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种简单、快速、准确、成本低廉的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP组合。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
一种用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP组合，所述SNP组合为N-乙酰基转移酶2基因的7个SNP位点，包括：rs1801279(191G>A)、rs1041983(282C>T)、rs1801280(341T>C)、rs1799929(481C>T)、rs1799930(590G>A)、rs1208(803G>A)和rs1799931(857G>A)；所述7个SNP位点的核苷酸序列依次如序列表1中的SEQ ID NO.1～7所示。
本发明的另一目的是提供一种快速、简单、灵敏、高效、廉价的SNP组合的检测方法用于抗结核药物肝损伤易感基因型的检测。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP检测方法，其步骤如下：
(1)提供特异性扩增7个SNP位点核苷酸序列的引物及相应的探针；所述探针为双标记探针，包括一个荧光报告标记和一个荧光淬灭标记，并且能与扩增的SNP区域杂交，在熔解曲线分析中产生一个熔解谱；
(2)样本处理及模板DNA提取：所述样本包括新鲜血液、抗凝血、组织和病理切片；
(3)PCR扩增反应：反应体系包含引物、探针、dNTPs、PCR反应缓冲液及DNA聚合酶；
(4)利用双标记探针与扩增产物杂交，进行熔解曲线分析，检测熔解过程中荧光值的变化并计算荧光强度变化的负一次导数(-dF/dT)，产生熔解峰，根据熔解峰进行SNP分型，高Tm值熔解峰的样本为野生型，低Tm值熔解峰的样本为突变型，同时出现两个峰的样本为杂合型。
优选地，所述步骤(1)中所述探针与相应位点的一种基因型序列完全互补，与另一种基因型存在一个错配碱基；探针的长度不超过35个核苷酸；探针的5’末端标记荧光报告标记，3’末端标记荧光猝灭标记。
优选地，所述荧光报告标记和荧光猝灭标记之间间隔小于20个核苷酸，或者小于18个核苷酸，或者小于15个核苷酸，或者小于14个核苷酸，大于8个核苷酸。
优选地，所述荧光报告标记是FAM、TET、JOE、ViC、HEX、ROX、TAMPA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red640、Texas Red中的一种或两种以上；所述荧光猝灭标记是DABCYL(4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸)，羧基二芳基罗丹明琥珀酰亚胺酯(QSY-7)，羧基-4'，5'-二硝基荧光素琥珀酰亚胺酯(QSY-33)，“黑洞淬灭基团”(BHQ-1，BHQ-2和BHQ-3)，Iowa Black FQ，Deep Dark Quencher，Eclipse Dark Quencher，核苷酸类似物，核苷酸G残基，纳米粒子或金微粒。
优选地，所述步骤(1)中所述引物和探针的序列如下：
1)检测NAT2(rs1801279、rs1041983、rs1801280)的引物和探针序列
2)检测NAT2(rs1799929、rs1799930)的引物和探针序列
3)检测NAT2(rs1208、rs1799931)的引物和探针序列
优选地，所述步骤(3)中所述PCR扩增反应为多重不对称PCR反应，采用多个荧光通道同时检测多种荧光标记的探针杂交信号。
优选地，所述步骤(1)中所述引物的Tm值控制在60±0.5℃；特异性探针要包含SNP位点，且SNP位点上的碱基不是“T”；其中引物采用PAGE纯化，探针采用HPLC纯化。
优选地，所述步骤(2)中，采集样本后，使用商品化的基因组DNA提取试剂盒提取样本的基因组DNA，然后用紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，并稀释至10ng/μl，直接用于检测，或-20℃储存备用。
采用基因合成的方法制备包含所检测SNP位点的质粒，每个基因型制备一个质粒，将质粒转化大肠杆菌；提取质粒，检测质粒DNA纯度及浓度，所提取质粒DNA的纯度应符合OD260/OD280＝1.8～2.0；将同一个SNP位点的2种基因型的质粒按1:1混合，作为杂合型标准品。
优选地，所述步骤(3)中，所述PCR反应体系中包含步骤(2)中至少一对引物和相应探针；所加各引物对的上游引物和下游引物浓度不同；扩增同探针互补链的引物浓度要高于与之配对的另一条引物浓度，二者的浓度比例为3:1～50:1；另外，需要加入一种热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，以便探针在反应全过程中能够保持完整。
优选地，所述步骤(3)中，所述PCR扩增程序为：95℃预变性1min；40～50个循环：95℃变性6sec，56℃退火30sec，72℃延伸10sec，56℃退火15sec，72℃延伸5sec；在每个循环的第一个56℃退火后检测荧光。
PCR反应开始后，在最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA；探针与单链PCR产物退火形成双链，产生可以检测到的荧光信号，可以实时监测PCR反应。
优选地，所述步骤(4)中，所述熔解曲线分析程序：95℃变性30sec；40℃保温20sec；40～85℃做熔解曲线分析，每步升温1℃，保温5～20sec，每个温度均检测荧光；程序运行结束后，使用PCR仪配套软件对结果进行分析；探针与完全互补的PCR产物杂交产生的Tm值高于与存在一个错配碱基的PCR产物杂交产生的Tm值，通过PCR产物与探针杂交产生的Tm值的不同，对样本进行SNP分型，只出现一个峰时为纯合型，同时出现2个峰时为杂合型。
优选地，所述步骤(1)中所述探针与相应位点的一种基因型序列完全互补，与另一种基因型存在一个错配碱基；探针的长度不超过35个核苷酸；探针的5’末端标记荧光报告标记，3’末端标记荧光猝灭标记。
优选地，所述荧光报告标记和荧光猝灭标记之间间隔小于20个核苷酸，或者小于18个核苷酸，或者小于15个核苷酸，或者小于14个核苷酸，大于8个核苷酸。
优选地，所述荧光报告标记是FAM、TET、JOE、ViC、HEX、ROX、TAMPA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red640、Texas Red中的一种或两种以上，也不仅限于此。
优选地，所述荧光猝灭标记可以是DABCYL(4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸)，羧基二芳基罗丹明琥珀酰亚胺酯(QSY-7)，羧基-4'，5'-二硝基荧光素琥珀酰亚胺酯(QSY-33)，或“黑洞淬灭基团”(BHQ-1，BHQ-2和BHQ-3)，Iowa Black FQ，Deep Dark Quencher，Eclipse Dark Quencher，核苷酸类似物，核苷酸G残基，纳米粒子或金微粒，也不仅限于此。
优选地，所述步骤(1)中所述引物和探针的序列如下：
1)检测NAT2(rs1801279、rs1041983、rs1801280)的引物和探针序列
2)检测NAT2(rs1799929、rs1799930)的引物和探针序列
3)检测NAT2(rs1208、rs1799931)的引物和探针序列
优选地，所述步骤(3)中的反应体系为：
1×PCR反应缓冲液
优选地，所述PCR反应缓冲液为Tris·Cl、氯化钾和硫酸铵，25℃下pH值在8.0～9.0之间；所述dNTP混合液为包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述的引物对可以是1～10对，每对引物均包含一条限制性引物；所述探针可以是1～10条，同一反应中使用不同的荧光标记，每种荧光标记的探针不超过2条；所述的aTaq酶为缺失5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。
优选地，所述步骤(3)中所述反应体系如下。
反应液1
各组分名称 终浓度
PCR缓冲液 1×
MgCl2 1.5mM
甜菜碱 1M
dNTPs 0.4mM
引物NatF1 0.4μM
引物NatR1 0.05μM
探针Nat191P 0.2μM
探针Nat282P 0.2μM
探针Nat341P 0.2μM
aTaq酶 0.5U
无菌超纯水 适量
DNA模板 2μl
总体积 20μl
反应液2
本发明的再一目的是提供一种快速、简单、灵敏、高效、廉价的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的试剂盒，包括：下述1)-3)中至少一对引物及相应探针；
引物和探针的序列如下：
1)检测NAT2(rs1801279、rs1041983、rs1801280)的引物和探针序列
2)检测NAT2(rs1799929、rs1799930)的引物和探针序列
3)检测NAT2(rs1208、rs1799931)的引物和探针序列
优选地，所述用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP试剂盒，还包括：PCR反应缓冲液：Tris·Cl、氯化钾和硫酸铵，25℃下pH值在8.0～9.0之间；dNTP混合液为包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；缺失5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。
本发明的有益效果是：
(1)提供了经过筛选，确认能够预测抗结核药物造成肝损伤的SNP位点组合，通过检测此SNP组合，可以帮助临床医生合理用药，降低患者用药风险；
(2)提供了一种检测SNP组合基因型的方法，此方法：准确性高，检测结果与测序法吻合率达100％，检测时间远低于测序法，符合临床使用要求；特异性强，通过引物和探针对检测特异性进行双重保证；操作简单，使用多重PCR及多个荧光通道同时检测，7个SNP位点只需要2个PCR反应，同时整个检测过程中实现闭管操作，有效避免了交叉污染。
下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1-1为本发明双标记探针熔解曲线检测SNP基因型的原理示意图之一。
图1-2为本发明双标记探针熔解曲线检测SNP基因型的原理示意图之二。
图1-3为本发明双标记探针熔解曲线检测SNP基因型的原理示意图之三。
图2为本发明NAT2(rs1801279)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值。
图3为本发明NAT2(rs1801280)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值。
图4为本发明NAT2(rs1799929)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值。
图5为本发明NAT2(rs1799930)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值。
图6为本发明NAT2(rs1208)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值。
图7为本发明NAT2(rs1799931)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值。
图8为本发明NAT2(rs1041983)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
1、SNP位点序列的筛选和确认
对591例未发生肝损伤(即正常对照组)和324例肝损伤(即病例组)DNA样本的SNP位点序列(如序列表1所示)进行PCR扩增，将扩增获得的PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳分离，回收并纯化目的条带进行测序。
使用在线Shesis软件(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm)对测序所见SNP位点进行等位基因频率和基因型频率的统计、针对等位基因和基因型分别进行病例组和正常对照组的卡方检测和odds ratio(优势比)的计算、位点间连锁分析、单倍体分析等遗传学统计分析，共获得7个与抗结核药物肝损伤显著相关的SNP位点包括：rs1801279(191G>A)、rs1041983(282C>T)、rs1801280(341T>C)、rs1799929(481C>T)、rs1799930(590G>A)、rs1208(803G>A)和rs1799931(857G>A)。
上述7个SNP位点对应于序列表1的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7。
2、引物和探针的设计与合成
使用Premier 5软件在SNP位点的上游和下游分别设计特异性引物，所有引物的Tm值控制在60±0.5℃；特异性探针要包含SNP位点，且SNP位点上的碱基不是“T”；引物和探针均委托专业公司进行合成，其中引物采用PAGE纯化，探针采用HPLC纯化。引物和探针的序列如下所示：
(1)检测NAT2(rs1801279、rs1041983、rs1801280)的引物和探针序列
(2)检测NAT2(rs1799929、rs1799930)的引物和探针序列
(3)检测NAT2(rs1208、rs1799931)的引物和探针序列
所述探针与相应位点的一种基因型序列完全互补，与另一种基因型存在一个错配碱基；通常探针的长度不超过35个核苷酸；探针的5’末端标记荧光报告基团，3’末端标记荧光猝灭基团；荧光报告基团和荧光猝灭基团之间间隔小于20个核苷酸，或者小于18个核苷酸，或者小于15个核苷酸，或者小于14个核苷酸，但是最好大于8个核苷酸；用于标记探针的荧光报告基团可以是FAM、TET、JOE、ViC、HEX、ROX、TAMPA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red640、Texas Red中的一种或两种以上，也不仅限于此；用于标记探针的荧光猝灭基团可以是DABCYL(4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸)，羧基二芳基罗丹明琥珀酰亚胺酯(QSY-7)，羧基-4'，5'-二硝基荧光素琥珀酰亚胺酯(QSY-33)，或“黑洞淬灭基团”(BHQ-1，BHQ-2和BHQ-3)，Iowa Black FQ，Deep Dark Quencher，Eclipse DarkQuencher，核苷酸类似物，核苷酸G残基，纳米粒子或金微粒，也不仅限于此。
3、样本DNA的提取
本发明方法适用的检测样本包括新鲜血液、抗凝血、组织和/或组织切片，采集样本后，使用商品化的基因组DNA提取试剂盒提取样本的基因组DNA，然后用紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，并稀释至10ng/μl，直接用于检测，或-20℃储存备用。
4、基因分型对照标准品制备
采用基因合成的方法制备包含所检测SNP位点的质粒，每个基因型制备一个质粒，将质粒转化大肠杆菌，所有合成的基因序列为序列表中的SEQ ID NO.1～7；利用商品化的质粒DNA提取试剂盒提取质粒，用紫外分光光度计检测质粒DNA纯度及浓度，所提取质粒DNA的纯度应符合OD260/OD280＝1.8～2.0；质粒浓度稀释至103copies/μl，将同一个SNP位点的2种基因型的质粒按1:1混合，作为杂合型标准品。
5、PCR反应组成
采用2个PCR反应检测7个SNP位点的基因型，按下表配制PCR反应液，加入样本DNA模板(每次实验必须包括阴性对照和杂合型标准品阳性对照)，配制完成后旋涡振荡混匀，离心后上机。
反应液1 PCR体系各成分组成(master Mix Ⅰ)
各组分名称 终浓度
PCR缓冲液 1×
MgCl2 1.5mM
甜菜碱 1M
dNTPs 0.4mM
引物NatF1 0.4μM
引物NatR1 0.05μM
探针Nat191P 0.2μM
探针Nat282P 0.2μM
探针Nat341P 0.2μM
aTaq酶 0.5U
无菌超纯水 适量
DNA模板 2μl
总体积 20μl
反应液2 PCR体系各成分组成(master MixⅡ)
6、PCR反应程序设定
将PCR反应管放入荧光定量PCR仪开始扩增，反应程序如下(以Rotor Gene Q为例)：所述PCR反应为多重不对称PCR反应，采用多个荧光通道同时检测多种荧光标记的探针杂交信号；
PCR程序设定
7、结果判定
利用双标记探针与扩增产物杂交，进行熔解曲线分析，检测熔解过程中荧光值的变化并计算荧光强度变化的负一次导数(-dF/dT)，产生熔解峰，根据熔解峰进行SNP分型。如图1-8所示，分别是：
图1-1为本发明双标记探针熔解曲线检测SNP基因型的原理示意图之一,显示双标记探针与不同基因型的等位基因的杂交状态。其中纯合子1中，探针与两条等位基因的序列均完全配对；杂合子中，探针与一条等位基因序列完全配对，与另一条等位基因有一个碱基错配；纯合子2中，探针与两条等位基因均有一个碱基错配。图1-2为本发明双标记探针熔解曲线检测SNP基因型的原理示意图之二，显示对应图1-1中三种基因型在熔解曲线分析中荧光值的变化；图1-3为本发明双标记探针熔解曲线检测SNP基因型的原理示意图之三，显示对应三种基因型在熔解曲线分析后，数据处理后获得的熔解曲线峰图。
图2为本发明NAT2(rs1801279)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值；其中,2-1为rs1801279-A的熔解曲线，2-2为rs1801279-G的熔解曲线，2-3为rs1801279-A/G的熔解曲线，2-4为空白对照的熔解曲线。
图3为本发明NAT2(rs1801280)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值；其中,3-1为rs1801280-C的熔解曲线，3-2为rs1801280-T的熔解曲线，3-3为rs1801280-C/T的熔解曲线，3-4为空白对照的熔解曲线。
图4为本发明NAT2(rs1799929)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值；其中,4-1为rs1799929-T的熔解曲线，4-2为rs1799929-C的熔解曲线，4-3为rs1799929-C/T的熔解曲线，4-4为空白对照的熔解曲线。
图5为本发明NAT2(rs1799930)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值；其中,5-1为rs1799930-A的熔解曲线，5-2为rs1799930-G的熔解曲线，5-3为rs1799930-A/G的熔解曲线，5-4为空白对照的熔解曲线。
图6为本发明NAT2(rs1208)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值；其中,6-1为rs1208-A的熔解曲线，6-2为rs1208-G的熔解曲线，6-3为rs1208-A/G的熔解曲线，6-4为水的熔解曲线。
图7为本发明NAT2(rs1799931)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值；其中,7-1为rs1799931-A的熔解曲线，7-2为rs1799931-G的熔解曲线，7-3为rs1799931-A/G的熔解曲线，7-4为空白对照的熔解曲线。
图8为本发明NAT2(rs1041983)三种基因型熔解曲线分析标准图谱及对应Tm值；其中,8-1为rs1041983-T的熔解曲线，8-2为rs1041983-C的熔解曲线，8-3为rs1041983-C/T的熔解曲线，8-4为空白对照的熔解曲线。
当荧光定量PCR仪运行结束后，用其配套软件对本次试验的结果进行熔解曲线分析，以杂合型标准品阳性对照反应管为参照，同时出现2个熔解峰的样本为杂合型，只出现一个高Tm值熔解峰的样本为野生纯合型，只出现一个低Tm值熔解峰的样本为突变纯合型。
本发明所述方法的基本原理为：基于荧光定量PCR技术平台，结合多重不对称PCR技术和熔解曲线技术，并运用多个荧光检测通道在一个PCR反应中检测6～10个SNP位点。
一般的PCR仅采用一对相同浓度的引物，通过PCR扩增产生一个双链的核酸片段。本发明则采用多重不对称PCR法(Multiplex Asymmetric PCR)，在同一个PCR反应体系中加入两对或两对以上的引物，每对引物的上游引物和下游引物浓度不同，各对引物针对各自特异的靶序列进行扩增。在PCR反应体系中，还包括至少一条双标记的寡核苷酸探针和一个热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。通过分析比较特异的荧光标记寡核苷酸探针同与其完全互补的单链PCR产物(野生型)以及存在突变的单链PCR产物(突变型)结合所产生溶解曲线Tm值的变化，来检测样本DNA的基因型。
本发明所提供的SNP位点组合、检测方法和试剂盒能够快速、准确、简便和高通量的检测患者基因型，并预测患者使用抗结核药物发生肝损伤的风险。
序列表1 12个SNP位点序列
序列表2 检测12个SNP位点基因型的引物和双标记探针寡核苷酸序列表
序列编号 序列名称 寡核苷酸序列(5’-3’)
SEQ ID NO.8 引物NatF1 GGGCTTAGAGGCTATTTTTGATCACA
SEQ ID NO.9 引物NatR1 CTAGAGGCTGCCACATCTGGGAG
SEQ ID NO.10 引物NatF2 GATCAGCCTCAGGTGCCTTGCA
SEQ ID NO.11 引物NatR2 GATGTGGTTATAAATGAAGATGTTGGAGAC
SEQ ID NO.12 引物NatF3 GATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCAC
SEQ ID NO.13 引物NatR3 GAGTTGGGTGATACATACACAAGGGT
SEQ ID NO.14 探针Nat191P FAM-5’CCACCCCGGTTTCTTC 3’-BHQ1
SEQ ID NO.15 探针Nat282P ROX-5’CTGGAGGGATATAAAAATACCCT 3’-BHQ2
SEQ ID NO.16 探针Nat341P Cy5-5’TCCTGCCGTCAATGGTCACCT 3’-BHQ2
SEQ ID NO.17 探针Nat481P FAM-5’CTGGTACCTGGACCAAATC 3’-BHQ1
SEQ ID NO.18 探针Nat590P HEX-5’ACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGA 3’-BHQ1
SEQ ID NO.19 探针Nat803P ROX-5’TATTTCTCAGCACTTCTTC 3’-BHQ2
SEQ ID NO.20 探针Nat857P Cy5-5’AAATAGTAAGGGATCCATCACCAGG 3’-BHQ2

Claims (10)

1.一种用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP组合，其特征在于：所述SNP组合为N-乙酰转移酶2基因的7个SNP位点，包括：rs1801279、rs1041983、rs1801280、rs1799929、rs1799930、rs1208和rs1799931；所述7个SNP位点的核苷酸序列依次如序列表1中的SEQ IDNO.1～7所示。
2.一种用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP检测方法，其步骤如下：
(1)提供特异性扩增7个SNP位点核苷酸序列的引物及相应的探针；所述探针为双标记探针，包括一个荧光报告标记和一个荧光淬灭标记，并且能与扩增的SNP区域杂交，在熔解曲线分析中产生一个熔解谱；
(2)样本处理及模板DNA提取：所述样本包括新鲜血液、抗凝血、组织和病理切片；
(3)PCR扩增反应：反应体系包含引物、探针、dNTPs、PCR反应缓冲液及DNA聚合酶；
(4)利用双标记探针与扩增产物杂交，进行熔解曲线分析，检测熔解过程中荧光值的变化并计算荧光强度变化的负一次导数，产生熔解峰，根据熔解峰进行SNP分型，高Tm值熔解峰的样本为野生型，低Tm值熔解峰的样本为突变型，同时出现两个峰的样本为杂合型。
3.根据权利要求2所述的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述探针与相应位点的一种基因型序列完全互补，与另一种基因型存在一个错配碱基；探针的长度不超过35个核苷酸；探针的5’末端标记荧光报告标记，3’末端标记荧光猝灭标记。
4.根据权利要求2所述的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP检测方法，其特征在于：所述荧光报告标记和荧光猝灭标记之间间隔小于20个核苷酸，或者小于18个核苷酸，或者小于15个核苷酸，或者小于14个核苷酸，大于8个核苷酸。
5.根据权利要求2所述的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP检测方法，其特征在于：所述荧光报告标记是FAM、TET、JOE、ViC、HEX、ROX、TAMPA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red640、Texas Red中的一种或两种以上；所述荧光猝灭标记是4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸，羧基二芳基罗丹明琥珀酰亚胺酯，羧基-4'，5'-二硝基荧光素琥珀酰亚胺酯，或“黑洞淬灭基团”BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3，Iowa Black FQ，DeepDark Quencher，Eclipse Dark Quencher，核苷酸类似物，核苷酸G残基，纳米粒子或金微粒。
6.根据权利要求2所述的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述引物和探针的序列如下：
1)检测NAT2(rs1801279、rs1041983、rs1801280)的引物和探针序列
2)检测NAT2(rs1799929、rs1799930)的引物和探针序列
3)检测NAT2(rs1208、rs1799931)的引物和探针序列
7.根据权利要求2所述的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述PCR扩增反应为多重不对称PCR反应，采用多个荧光通道同时检测多种荧光标记的探针杂交信号。
8.一种用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP试剂盒，包括：下述1)-3)中至少一对引物及相应探针：
1)检测NAT2(rs1801279、rs1041983、rs1801280)的引物和探针序列
2)检测NAT2(rs1799929、rs1799930)的引物和探针序列
3)检测NAT2(rs1208、rs1799931)的引物和探针序列
9.根据权利要求8所述的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP试剂盒，其特征在于：所述SNP试剂盒还包括PCR扩增反应缓冲液、Mg2+、dNTPs和DNA聚合酶。
10.根据权利要求9所述的用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测的SNP试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增反应缓冲液为：Tris·Cl、氯化钾和硫酸铵，25℃下pH值在8.0～9.0之间；所述dNTPs包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述DNA聚合酶为缺失5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。
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