CN105296621B - 用于检测mthfr基因多态性的引物对、荧光探针及试剂盒 - Google Patents

用于检测mthfr基因多态性的引物对、荧光探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于MTHFR基因C677T位点核苷酸多态性检测的引物对、特异性寡核苷酸荧光探针及试剂盒。设计出一种新的特异性的引物对及相应的荧光探针，采用“不对称PCR技术”进行PCR扩增，扩增结束后进行熔解曲线分析，通过特定温度的熔解峰来判断基因型。本发明的试剂盒能够高特异性的扩增MTHFR基因，在单管PCR体系中即可完成C677T位点3种基因型的检测，检测特异性高，结果易于判读，且操作步骤简单，检测成本低、周期短、效率高。

Description

用于检测MTHFR基因多态性的引物对、荧光探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及单核苷酸多态性检测领域，特别涉及用于MTHFR基因C677T位点核苷酸多态性检测的引物对组、探针、荧光PCR试剂盒。
背景技术
人类基因组DNA中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate-reductase，MTHFR)是叶酸和甲硫氨酸在人体内代谢途径中的关键酶之一，可将5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。一方面作为甲基的传递体参与体内嘌呤和嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化；另一方面在甲硫氨酸合成酶的催化下，以维生素B12为辅酶，使血液中的同型半胱氨酸再甲基化生成甲硫氨酸，从而维持体内正常的同型半胱氨酸水平。
研究发现，MTHFR基因C677T位多态性可导致MTHFR的耐热性和活性下降，从而引起同型半胱氨酸甲基化受阻，出现高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸可损伤血管内皮细胞，并引起低密度脂蛋白氧化和血小板凝集，从而破坏血管平滑肌细胞的正常功能及机体的凝血和纤溶系统，从而加速动脉粥样硬化和血栓形成，引发多种疾病，如脑卒中、H型高血压、冠心病等。同时发现，高同型半胱氨酸血症可引起细胞死亡、诱导DNA链断裂、氧化应激和细胞凋亡，干扰胚胎细胞的正常周期和诱发胚胎细胞凋亡，从而引发出生缺陷的发生。
此外，MTHFR C677T基因多态性影响叶酸的正常代谢，从而增加叶酸拮抗剂的毒副作用。甲氨蝶呤是抗叶酸代谢药物，是目前很多肿瘤(急性细胞性白血病)和风湿病的一线用药，临床用药过程发现相同剂量的甲氨蝶呤用在不同的患者身上时其毒副反应不一。研究结果表明677位TT纯合子对氨甲喋呤治疗的毒性反应比677C的基因型严重得多。
另外，C677T基因多态性还影响到5-氟尿嘧啶的化疗效果。5-氟尿嘧啶为嘧啶类似物，属于抗代谢药的一种，对消化道癌及其他实体癌有良好疗效。5-氟尿嘧啶对胃肠道肿瘤化疗效果的研究发现，677位TT基因型携带者化疗有效率显著高于TC和CC基因型携带者。
由此可见，通过对个体MTHFR基因C677T位点基因型进行检测可以提示个体发生脑卒中等心脑血管疾病及新生儿缺陷的风险，并预测甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶等化疗药物的治疗疗效和毒副作用。
对于该突变位点的检测，目前主要有Sanger测序法、PCR-RFLP法(CN01105305.5)、芯片法、荧光定量PCR法(CN201410767859.5)等方法，然而上述检测方法存在检测过程繁琐，周期过长，成本较高，判读复杂或者易引起交叉污染而出现假阳性以及灵敏度低等缺点。现有技术中也公开了采用PCR-FRET法对突变位点进行检测，例如CN 201210356878.X公开了一种判断MTHFR基因多态性(C677T)的方法，设计一对用来扩增目标序列特异引物和一对作为目标序列的检测信号FRET探针，两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号，FRET探针再进行熔解曲线分析，通过熔解曲线来判断MTHFR基因多态性(C677T)。该方法无需开管操作，且易于判读，然而，上述方法需设计两条不同的FRET探针才能进行检测，检测程序复杂，且增加了成本。
针对这些问题，本发明设计了一种采用新的引物对和双标荧光探针的MTHFR基因多态性检测方法，该方法简单、快速、价格低廉且易于判读，可用于临床检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的简单、快速而准确的用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的产品。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供了一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的引物对，所述引物对是用于扩增MTHFR基因的特异性引物对，含有以下寡核苷酸序列组(A)和(B)之一：
(A)正向引物具有序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：1：5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3'，
反向引物具有序列表中的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：2：5'-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3'；
或者，
(B)正向引物具有序列表中的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：3：5'-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3'，
反向引物具有序列表中的SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：4：5'-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3'。
本发明引物对也可为本发明上述寡核苷酸序列组(A)或(B)的互补序列。
本发明还提供了一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针，所述荧光探针含有以下寡核苷酸序列之一：
荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：5：5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3'，
荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：6：5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3'；
荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：7：5'-TGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者，
荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：8：5'-TGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATC-3'。
本发明所述探针序列也可为上述寡核苷酸序列(SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8)的互补序列之一。
所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记探针。
优选的，所述5'末端区域具有以下荧光基团之一：FAM，TET，VIC，HEX，ROX，JOE，CY3或CY5等；所述3'末端区域具有以下猝灭基团之一：BHQ，DABCYL或TAMRA等。
本发明还一方面提供一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的试剂盒，所述试剂盒包括本发明上述任意引物对和荧光探针。
进一步的，本发明所述试剂盒还包括PCR缓冲液。
其中，在本发明具体实施方式中，本发明试剂盒中PCR缓冲液含有Mg2+。
优选的，本发明所述试剂盒还可包括阴性对照品和/或阳性对照品。
在本发明具体实施方式中，所述阴性对照为水。
本发明所述试剂盒还可包括核酸DNA提取试剂。所述提取试剂按W:V比包含5～10％Chelex-100，其中，本发明所述的Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子。
本发明所述试剂盒还可包括PCR反应所需的Taq聚合酶、dNTP等，此外，还可包括说明书。
本发明还一方面提供了一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的PCR试剂，所述PCR试剂包括本发明所述的引物对、荧光探针和PCR缓冲液。
在本发明具体的实施方式中，所述引物对中各引物和探针在PCR试剂中的浓度为：正向引物的终浓度为0.08-0.25μM，反向引物的终浓度为0.82-1.55μM，和/或，荧光探针的终浓度为0.05-0.09μM。
在本发明具体实施方式中，所述PCR试剂还可包括Taq酶、dNTP等。本发明PCR试剂中Taq酶、dNTP的浓度的确定对于本领域技术人员来说可以根据所掌握的普通技术知识确认，本发明对此不作限定。
此外，本发明还提供一种本发明所述引物对、荧光探针、试剂盒或PCR试剂在制备用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的试剂盒中的应用。
本发明还一方面提供一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，包括以下步骤：
步骤(1)、提供一种用于扩增MTHFR基因的特异性引物对，含有以下寡核苷酸序列组(A)和(B)之一：
(A)正向引物具有序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：1：5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3'，
反向引物具有序列表中的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：2：5'-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3'；
或者，
(B)正向引物具有序列表中的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：3：5'-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3'，
反向引物具有序列表中的SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：4：5'-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3'；
步骤(2)、提供一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针，所述荧光探针含有以下寡核苷酸序列之一：
荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：5：5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3'，
荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：6：5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3'；
荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：7：5'-TGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者，
荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：8：5'-TGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATC-3'；
所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记探针；
步骤(3)、加入待测样品和步骤(1)所述的引物对及步骤(2)所述的荧光探针进行荧光PCR扩增反应，对PCR产物进行熔解曲线分析，通过有无特定的熔解峰来判断样本的基因型。
本发明的荧光PCR扩增反应的条件为：37℃1～10min，90～95℃3～5min；然后95℃10～20s，62～68℃40～60s，30～40个循环；本发明熔解曲线分析的条件为：95℃10s，45℃1min，80℃10s。
本发明结果判定的具体方法为：比较待测样品与阳性对照品Tm值的差异，若样品只出现一个熔解峰，且Tm值在52.5-63.5℃(优选为55.5-63.5℃，更优选为56.5±1℃或62.5±1℃)之间则判定为677TT纯合突变基因型；若Tm值在64.8-72.8℃(优选为65.8±1℃或69.8±1℃)之间则判定为677CC纯合野生基因型；若样品出现两个熔解峰，且Tm值分别在52.5-63.5℃和64.8-72.8℃之间则判定为677CT杂合突变基因型。
在本发明具体实施方式中，在进行PCR扩增反应前还包括基因组DNA的提取，所述基因组DNA的提取样品选择全血、体液、组织样品或脱落细胞中的一种，优选为全血。
本发明的有益效果包括以下内容：
1.本发明技术方案中设计出一种新的检测人MTHFR C677T基因多态性的检测引物和相应的荧光探针，PCR检测特异性非常高，能够实现高度特异性扩增，采用“不对称PCR技术”进行PCR扩增，结合实时荧光PCR技术，分析熔解曲线产生的熔解峰，通过特定熔解峰的有无方便的判读不同的基因型。
2.本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，在不影响特异性的前提下，仅需单条荧光探针即可实现基因多态性检测。
3.本发明技术方案在实验过程中只需单管就可完成不同基因型的检测，操作简单；且无需进行PCR产物的后续分析，检测成本低、周期短、效率高，同时还降低了PCR产物污染引起的假阳性风险。
附图说明
图1本发明实施例1中677TT纯合突变基因型模板检测结果，只出现C677T突变峰型。
图2本发明实施例1中677CC纯合野生基因型模板检测结果，只出现C677T野生峰型。
图3本发明实施例1中677CT杂合突变基因型模板检测结果，同时出现C677T突变和野生峰型。
图4本发明实施例1中阳性对照品检测结果，出现C677T突变和野生峰型。
图5本发明实施例1中未包含基因组模板的荧光PCR熔解曲线，未加任何基因组模板，未出现任何熔解峰。
图6本发明实施例2中677TT纯合突变基因型模板检测结果，只出现C677T突变峰型。
图7本发明实施例2中677CC纯合野生基因型模板检测结果，只出现C677T野生峰型。
图8本发明实施例2中677CT杂合突变基因型模板检测结果，同时出现C677T突变和野生峰型。
图9本发明实施例2中阳性对照品检测结果，出现C677T突变和野生峰型。
图10本发明实施例2中未包含基因组模板的荧光PCR熔解曲线，未加任何基因组模板，未出现任何熔解峰。
具体实施方式
为进一步说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合如下具体实施例(但非限制)并配合附图进行说明，所述实施例阐述本发明几个优选的实施方案，本发明的其它实施例在不背离本发明的核心的前提下为本领域技术人员所预见。
实施例1.亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性检测
1.DNA提取
人全血样本采用Chelex-100法提取DNA，具体步骤如下：
A.取10μL全血加入2.0mL离心管中，向其中加入500μL灭菌双蒸水，剧烈振荡后室温下静置15min，13000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀(必要时可用双蒸水反复洗沉淀物，直至无色或血色素很少)；
B.沉淀中加入100μL核酸提取液(内含颗粒物，每次吸取前应充分摇匀，确保将颗粒一起吸出)，在振荡器上反复振荡，56℃保温30min以上；
C.取出后充分振荡，100℃保温8min，取出后充分振荡，13,000rpm离心3min，上清液可直接用于PCR扩增，在4℃下可保存一周，也可存放在-20℃冰箱待用。
本发明所适用的样本还可包括体液、组织样品或脱落细胞中的一种，例如血滤纸片、带毛囊的毛发、口腔黏膜刮片或唾液样本等，血液样本于-20℃以下保存不超过一年。根据取样方式以及被测样本的不同，对样本进行相应的预处理。
2.引物和荧光探针的设计
根据美国国立生物技术信息中心NCBI的dbSNP数据库公开的MTHFR C677T位点多态性(rs1801133)信息，采用Primer 5软件设计引物和探针，引物在多态性位点的上下游进行设计，且目的片段的长度控制在100bp左右，保证探针序列包含多态性位点，且与野生型基因完全互补，具体如下：
正向引物SEQ ID NO：1：5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3'，
反向引物SEQ ID NO：2：5'-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3'，
荧光探针SEQ ID NO：5：5'-FAM-TCTGCGGGAGCCGATTTC ATC-BHQ-3'。
引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。探针定量后-20℃避光保存。本实施例中，荧光探针也可选择如序列表SEQ ID NO：6所示的探针。
3.PCR扩增试验
PCR扩增所用的模板为携带MTHFR基因677TT纯合突变基因型、677CC纯合突变野生基因型、677CT杂合突变基因型的人基因组DNA。
反应体系如下：PCR缓冲液(2x buffer)10μL，正向引物(5μM)0.5μL，反向引物(5μM)4μL，荧光探针(5μM)0.25μL，模板2μL，Taq酶0.3μL，dNTP(10mM)0.4μL，H2O 2.55μL。
反应体系包括五个PCR反应管，第一个PCR反应管中，放置有C677T位点纯合突变基因型的模板(MTHFR-677TT)，第二个PCR反应管中，放置有C677T位点纯合野生基因型的模板(MTHFR-677CC)，第三个PCR反应管中，放置有C677T位点杂合突变基因型的模板(MTHFR-677CT)，第五个PCR反应管为阳性对照，以杂合突变阳性对照品为模板，第五个PCR反应管为NTC，以双蒸水为模板作为对照。其中，各个PCR反应管中模板浓度相同。
反应程序如下：
用AB ViiA 7荧光定量PCR仪按如下程序进行扩增反应：
扩增过程：37℃5min，95℃4min；然后95℃15s，64℃40s(收集荧光)，40个循环；
熔解曲线过程：95℃10s，45℃1min，45-80℃(收集荧光)，荧光通道选择FAM。
4.检测结果分析
本实施例五个PCR反应管的熔解曲线分别参见附图1-5，结果表明，含有模板的各反应管均出现特异性扩增，各PCR产物的Tm值之间均能够很好的进行区分，参见附图1，第一个管中仅出现57℃的677T突变熔解峰，样本基因型判断为677TT纯合突变基因型；参见附图2，第二管中仅出现65.92℃的677C野生熔解峰，样本基因型判断为677CC纯合野生基因型；参见附图3，第三管中同时出现56.89℃和65.89℃的熔解峰，分别为677T和677C峰，样本基因型判断为677CT杂合突变基因型；参见附图4，阳性对照管中出现56.93℃和65.53℃的熔解峰，分别为677T和677C峰，说明为677CT杂合突变基因型；参见附图5，NTC管则无任何熔解峰出现。
所有检测结果均与所测标本的DNA测序结果相一致，从而验证了本方法是准确有效的。
实施例2.亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性检测
1.DNA提取
DNA提取同本发明实施例1。
2.引物和荧光探针的设计
根据美国国立生物技术信息中心NCBI的dbSNP数据库公开的MTHFR C677T位点多态性(rs1801133)信息，采用Primer 5软件设计引物和探针，具体如下：
正向引物SEQ ID NO：3：5'-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3'，
反向引物SEQ ID NO：4：5'-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3'。
荧光探针SEQ ID NO：7：
5'-FAM-TGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATC-BHQ-3'；
引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。探针定量后-20℃避光保存。本实施例中，荧光探针也可选择如序列表SEQ ID NO：8所示的探针。
3.PCR扩增试验
PCR扩增试验的反应体系及反应程序同本发明实施例1，反应仪器采用SLAN全自动医用PCR分析系统。
4.检测结果分析
本发明五个PCR反应管的熔解曲线分别参见附图6-10，结果表明，含有模板的各反应管均出现特异性扩增，各PCR产物的Tm值之间均能够很好的进行区分，参见附图6，第一个管中仅出现62.7℃的677T突变熔解峰，样本基因型判断为677TT纯合突变基因型；参见附图7，第二管中仅出现69.6℃的677C野生熔解峰，样本基因型判断为677CC纯合野生基因型；参见附图8，第三管中同时出现62.2℃和69.4℃的熔解峰，分别为677T和677C峰，样本基因型判断为677CT杂合突变基因型；参见附图9，阳性对照管中出现62.3℃和69.5℃的熔解峰，分别为677T和677C峰，说明为677CT杂合突变基因型；参见附图10，NTC管则无任何熔解峰出现。
所有检测结果均与所测标本的DNA测序结果相一致，从而验证了本方法是准确有效的。
实施例3亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性检测验证
利用本发明实施例1引物对及荧光探针检测477例基因样本进行验证试验，所有样本均采用金标准测序法进行测序验证。检测到677TT纯合突变基因型148例，677CC纯合野生基因型92例，677CT杂合突变基因型237例，本发明试剂盒检测477例基因样本和金标准测序结果对比，检测结果一致，漏检0例，准确性为100％；对非本试剂盒检测范围的其他基因型阳性和阴性样本，本试剂盒检测结果均为阴性，灵敏度为100％，特异性为100％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效实施方式，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的引物对，所述引物对是用于扩增MTHFR基因的特异性引物对，为以下寡核苷酸序列组(A)和(B)之一：
(A)正向引物为序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：1：5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3'，
反向引物为序列表中的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：2：5'-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3'；
或者，
(B)正向引物为序列表中的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：3：5'-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3'，
反向引物为序列表中的SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：4：5'-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3'。
2.一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增MTHFR基因的特异性引物对及用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针；
所述引物对为以下寡核苷酸序列组(A)和(B)之一：
(A)正向引物为序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：1：5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3'，
反向引物为序列表中的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：2：5'-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3'；
或者，
(B)正向引物为序列表中的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：3：5'-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3'，
反向引物为序列表中的SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：4：5'-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3'；
所述荧光探针为以下寡核苷酸序列之一：
荧光探针为序列表中的SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：5：5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3'，
荧光探针为序列表中的SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：6：5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3'；
荧光探针为序列表中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：7：5'-TGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者，
荧光探针为序列表中的SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：8：5'-TGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATC-3'；
所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照品和/或阳性对照品。
4.一种用于检测MTHFR基因多态性的PCR试剂，所述PCR试剂包括用于扩增MTHFR基因的特异性引物对、用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针和PCR缓冲液；
所述引物对为以下寡核苷酸序列组(A)和(B)之一：
(A)正向引物为序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：1：5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3'，
反向引物为序列表中的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：2：5'-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3'；
或者，
(B)正向引物为序列表中的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：3：5'-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3'，
反向引物为序列表中的SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：4：5'-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3'；
所述荧光探针为以下寡核苷酸序列之一：
荧光探针为序列表中的SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：5：5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3'，
荧光探针为序列表中的SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：6：5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3'；
荧光探针为序列表中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：7：5'-TGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者，
荧光探针为序列表中的SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：8：5'-TGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATC-3'；
所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记探针；
所述引物对中各引物及所述探针在PCR试剂中的浓度为：正向引物的终浓度为0.08-0.25μM，反向引物的终浓度为0.82-1.55μM，和/或，荧光探针的终浓度为0.05-0.09μM。
5.如权利要求1所述引物对、如权利要求2-3所述的试剂盒或如权利要求4所述的PCR试剂在制备用于检测MTHFR基因多态性的试剂盒中的应用。
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