CN107385063B

CN107385063B - 一种用于检测mthfr和mtrr基因多态性的组合物及其应用

Info

Publication number: CN107385063B
Application number: CN201710698006.4A
Authority: CN
Inventors: 刘沛; 王林海
Original assignee: Beijing Sino Mdgene Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Sino Mdgene Technology Co ltd
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-08-15
Also published as: CN107385063A

Abstract

本发明公开了一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物及其应用，通过FAM、HEX、ROX(修饰)三通道多重PCR反应对MTHFR和MTRR基因中的单核苷酸多态性位点进行检测。为了提高检测的简便性和特异性，通过探针分型的技术手段实现一管分型检测，使得整个操作以及反应过程简单化，并在此基础上，对探针进行锁核酸修饰和二级结构修饰，增加探针的Tm值，进一步提高探针结合的特异性的，最后通过调整引物对的配比、Taq酶的用量、镁离子的用量等，提高整个试剂盒的最低检测限、准确性和特异性，试剂盒最低检测浓度能够达到1ng/μL，准确性和特异性均能够达到100％。

Description

一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的技术。

背景技术

叶酸是一种水溶性B族维生素，因最初从菠菜叶中提取得到，故称为叶酸。叶酸是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。

机体缺乏叶酸有两个方面的原因：一是叶酸摄入量不足，二是由于遗传(基因)突变导致机体对叶酸的利用能力低下。前者通过多食用富含叶酸食物，或适量补充叶酸制剂即可满足机体需求；而携带相关基因突变的人群，即使按常量补充叶酸，也不能满足机体代谢所需。叶酸代谢基因的差异，决定了叶酸利用能力的不同，因此，叶酸补充剂量应因人而异。

参与叶酸代谢最重要的两个基因是亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)。研究发现，MTHFR的活性与C677T和A1298C基因位点有关；MTRR的活性与A66G基因位点有关。当基因位点发生突变时就会导致MTHFR和MTRR活性下降，进而引起叶酸利用能力不足，宝宝出生缺陷风险增加。

中国人群中存在一定比例的风险型基因----78％的国人存在叶酸利用能力相关基因突变，导致不同人对叶酸的利用能力不同，所以叶酸补充需要个性化。

因此，MTHFR和MTRR基因多态性检测对于叶酸补充剂量有重要意义。而目前检测MTHFR和MTRR基因多态性的核苷酸引物及方法准确性和特异性较低，难以在临床广泛应用。所以探索一种检测MTHFR和MTRR基因多态性快速可靠的核苷酸引物组及方法已经成为临床实验研究的热点问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物及其应用，通过调整引物的配比、Taq酶的用量和镁离子的用量等，通过FAM、HEX、ROX(修饰)三通道多重PCR反应，并且将引物放置到一管内分型检测，提高检测的简便性和特异性，使得整个操作以及反应过程简单化。并在此基础上，对探针进行锁核酸修饰和二级结构修饰，增加探针的Tm值，进一步提高探针结合的特异性的，最后通过上述体系的调整，使得准确性和特异性均能够达到100％，最低检测浓度能够达到1ng/μL，解决了以往检测MTHFR和MTRR基因多态性时准确性和特异性较低的问题。

为了实现上述目的，本发明提供的一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物，包括分别针对用于检测待检样品中与MTHFR和MTRR基因相关的特异性目的基因的引物对，包括：

MTHFR677引物：

MTHFR677基因正向引物(MTHFR677-F):AACAGGTGGAGGCCAGCCT(SEQ ID NO.1)；

MTHFR677基因反向引物(MTHFR677-R):GTGCGGTGAGAGTGGGGTG(SEQ ID NO.2)；

MTHFR677-CFP：FAM-TGAAAGCGGGAGCCGATTTCA-BHQ1(SEQ ID NO.3)；

MTHFR677-TFP：

ROX-GCGTGGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGC-BHQ2(SEQ ID NO.4)；

MTHFR1298引物对：

MTHFR1298基因正向引物(MTHFR1298-F):

GACTACTACCTCTTCTACCTG(SEQ ID NO.5)；

MTHFR1298基因反向引物(MTHFR1298-R):

AGGGGATGAACCAGGGTCCC(SEQ ID NO.6)；

MTHFR1298-AF：FAM-CTTCCAGTGAAGAAAGTGTCTTTGAAG-BHQ1(SEQ ID NO.7)；

MTHFR1298-CFP：ROX-CAAAGAGTGAAGCAAGTGTCTTTG-BHQ2(SEQ ID NO.8；

MTRR66引物对：

MTRR66基因正向引物(MTRR66-F)：TTTCACTGTTACATGCCTTGAAG(SEQ ID NO.9)；

MTRR66基因反向引物(MTRR66-R)：ACTGTAACGGCTCTAACCTTAT(SEQ ID NO.10)；

MTRR66-AFP:FAM-GCTTCAGAAGAAATATGTGAGCAAGC-BHQ1(SEQ ID NO.11)；

MTRR66-GFP:ROX-TTGCAGAAGAAATGTGTGAGCAA-BHQ2(SEQ ID NO.12)；

内标引物对：

HER2-F:TGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCA(SEQ ID NO.13)；

HER2-R:CCAAACACTGCCTCCAGCTCTTGCC(SEQ ID NO.14)；

HER2-FP:HEX-AGGGCCAGGTCCTGGGGTGGGC-BHQ1(SEQ ID NO.15)；

其中对MTHFR677-CFP、MTHFR1298-AF和MTRR66-AFP的5，端进行FAM修饰，3，端进行BHQ1修饰；对MTHFR677-TFP、MTHFR1298-CFP和MTRR66-GFP的5，端进行ROX修饰，3，端进行BHQ2修饰；对HER2-FP的5，端进行HEX修饰，3，端进行BHQ1修饰；

在MTHFR677-CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTHFR677-TFP序列的第13位碱基T上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTHFR1298-AF序列的第13位碱基A上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTHFR1298-CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTRR66-AFP序列的第15位碱基A上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTRR66-GFP序列的第14位碱基G上增加锁核酸(LNA)的修饰。

优选地，一人份加入量为：MTHFR677-F加入量0.1-0.3μL，MTHFR1298-F加入量0.1-0.3μL，MTRR66-F加入量0.1-0.3μL，MTHFR677-R加入量0.1-0.3μL，MTHFR1298-R加入量0.1-0.3μL，MTRR66-R加入量0.1-0.3μL，MTHFR677-CFP加入量0.01-0.2μL，MTHFR1298-AFP加入量0.01-0.2μL，MTRR66-AFP加入量0.01-0.2μL，MTHFR677-TFP加入量0.01-0.2μL，MTHFR1298-CFP加入量0.01-0.2μL，MTRR66-GFP加入量0.01-0.2μL，HER2-F加入量0.01-0.2μL，HER2-R加入量0.01-0.2μL，HER2-FP加入量0.01-0.2μL。

本发明提供的一种用于检测检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物。

优选地，所述试剂盒包括DNA聚合酶(Taq酶)、dNTPs、10×DNA聚合酶buffer、UDG酶和Mg²⁺，一人份加入量为：DNA聚合酶加入量0.1-0.4μL，dNTPs加入量1-3μL，10×DNA聚合酶buffer加入量1-4μL，UDG酶加入量0.01-0.2μL，Mg²⁺加入量2-5μL。

本发明提供的一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒的样本处理方法，包括：

(1)提取样本中的基因组DNA，其中样本可以选用全血样本；

(2)将提取之后的基因组DNA进行浓度测定，并将浓度稀释至10-20ng/μL后，进行荧光定量PCR反应；

(3)根据PCR反应之后的结果分析：根据PCR扩增的结果进行判读，得出MTHFR和MTRR各个位点的具体型别。

优选地，步骤(3)中的位点包括MTHFR677(C＞T)、MTHFR1298(A＞C)和MTRR66(G＞A)。

优选地，PCR反应过程为：37℃下UDG酶反应2min，95℃预变性3min，94℃变性15s，60℃退火延伸35s，40个循环。

本发明提供的一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物及其应用，具有如下有益效果：

本发明采用这种技术进行相关基因检测，操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，并且整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。

本发明通过探针分型的技术手段实现在一管内对SNP(单核苷酸多态性)位点进行同时检测，提高检测的简便性，进而达到将目的位点精准有效的检测。

本发明通过设计锁核酸和含有二级结构的特异性探针和引物，能够将每个位点的三个基因型别准确区分，并且检测最低浓度能够达到1ng/μL。

本发明通过调整引物的配比、Taq酶的用量和镁离子的用量等，提高整个试剂盒的准确性和特异性，准确性和特异性均能够达到100％。

本发明主要包括采用特异性的多重PCR-荧光探针法检测MTHFR和MTRR基因的单核苷酸多态性C677T、A1298C和A66G，用于判断MTHFR和MTRR基因中多态性位点的分布，进一步用于辅助叶酸补充剂量的临床诊断。

附图说明

图1为本实施例1中各检测位点基因型的基因峰。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供的一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物，包括分别针对用于检测待检样品中与MTHFR和MTRR基因相关的特异性目的基因的引物对，包括：

MTHFR677引物：

MTHFR677基因正向引物(MTHFR677-F):AACAGGTGGAGGCCAGCCT；

MTHFR677基因反向引物(MTHFR677-R):GTGCGGTGAGAGTGGGGTG；

MTHFR677-CFP：FAM-TGAAAGCGGGAGCCGATTTCA-BHQ1；

MTHFR677-TFP：

ROX-GCGTGGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGC-BHQ2；

MTHFR1298引物对：

MTHFR1298基因正向引物(MTHFR1298-F):

GACTACTACCTCTTCTACCTG；

MTHFR1298基因反向引物(MTHFR1298-R):

AGGGGATGAACCAGGGTCCC；

MTHFR1298-AF：FAM-CTTCCAGTGAAGAAAGTGTCTTTGAAG-BHQ1；

MTHFR1298-CFP：ROX-CAAAGAGTGAAGCAAGTGTCTTTG-BHQ2；

MTRR66引物对：

MTRR66基因正向引物(MTRR66-F)：TTTCACTGTTACATGCCTTGAAG；

MTRR66基因反向引物(MTRR66-R)：ACTGTAACGGCTCTAACCTTAT；

MTRR66-AFP:FAM-GCTTCAGAAGAAATATGTGAGCAAGC-BHQ1；

MTRR66-GFP:ROX-TTGCAGAAGAAATGTGTGAGCAA-BHQ2；

内标引物对：

HER2-F:TGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCA；

HER2-R:CCAAACACTGCCTCCAGCTCTTGCC；

HER2-FP:HEX-AGGGCCAGGTCCTGGGGTGGGC-BHQ1；

在MTHFR677-CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTHFR677-TFP序列的第13位碱基T上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTHFR1298-AF序列的第13位碱基A上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTHFR1298-CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTRR66-AFP序列的第15位碱基A上增加锁核酸(LNA)的修饰；

在MTRR66-GFP序列的第14位碱基G上增加锁核酸(LNA)的修饰。

在引物合成的时候，按照合成单位的规定标记待修饰碱基即可，合成单位就会知道采用LNA的方式修饰此位点。

实施例1：本发明在多重荧光PCR的基础上，配制成已经预混好的检测位点的引物组合物。直接可对提取完成的样本进行检测，这样使检测步骤更为简便。

具体步骤如下：

1)提取全血样本中的基因组DNA(采用商业化的外周血基因组DNA提取试剂盒)。

2)将提取之后的基因组DNA进行浓度测定，并将浓度稀释至10-20ng/μL进行后续的PCR反应过程。

3)反应体系的成分组成：dNTPs、Mg²⁺、DNA聚合酶buffer、反转录buffer、基因的引物对、DNA聚合酶等。

4)PCR反应条件：37℃下UDG酶反应2min；95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃下退火延伸35s，40个循环。

5)PCR反应体系的配制：

PCR扩增MIX(12.5μL，其余用纯化水补齐)

PCR引物混合液体系(6.5μl，其余用纯化水补齐)

PCR扩增体系

PCR扩增程序如下：

第一扩增阶段：37℃UDG酶反应2min；

第二扩增阶段：95℃预变性3min；

第三扩增阶段：94℃变性15s，60℃退火延伸35s，40个循环。

6)结果分析

①每个样本内标通道(HEX)Ct值应≤35，且靶基因通道两个扩增反应中至少其中一个Ct＜38，(靶基因通道无扩增曲线，Ct值按40计算)满足此条件后按表1判读：

②若样本内标通道(HEX)Ct值＞35，建议重新提取标本，再做检测；

③若样品内标通道Ct值≤35，且靶基因通道Ct值均Ct≥38，则检测无效。

表1结果判读

检测名称	Ct值	结果	判断
				MTHFR677(C)	Ct＝A	B-A≥5	CC基因型
MTHFR677(T)	Ct＝B	\|B-A\|＜5	CT基因型
						A-B≥5	TT基因型
MTHFR1298(A)	Ct＝C	D-C≥5	AA基因型
				MTHFR1298(C)	Ct＝D	\|D-C\|＜5	AC混合型
		C-D≥5	CC基因型
				MTRR66(A)	Ct＝E	F-E≥5	AA基因型
MTRR66(G)	Ct＝F	\|F-E\|＜5	AG基因型
						E-F≥5	GG基因型

7)成品试剂盒的性能验证

利用配置完成的成品试剂盒进行产品特异性、最低检测限检测，产品试剂盒的特异性能够达到100％，最低检测浓度能到达到1ng/μL。

收集全血样本40例，利用上述成品试剂盒进行特异性检测，对照结果采用一代测序作比较，结果如下：

从上述结果可以得出，本试剂盒的检测准确性达到100％，特异性也达到100％。

利用本试剂盒对50ng/μL，25ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL的不同浓度样本进行检测，本试剂盒最低检测浓度能达到1ng/μL，因此，本试剂盒的检测最低检测浓度为1ng/μL。

具体实施方式2：

收集来自武汉同济医院的200例外周血对照样本，利用上述的成品试剂盒进行检测。具体操作步骤如实施案例1所述。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司

<120> 一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物及其应用

<130> P20170150

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacaggtgga ggccagcct 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgcggtgag agtggggtg 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaaagcggg agccgatttc a 21

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgtggcggg agtcgatttc atcatcacgc 30

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactactacc tcttctacct g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggggatgaa ccagggtccc 20

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cttccagtga agaaagtgtc tttgaag 27

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caaagagtga agcaagtgtc tttg 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttcactgtt acatgccttg aag 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

actgtaacgg ctctaacctt at 22

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcttcagaag aaatatgtga gcaagc 26

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgcagaaga aatgtgtgag caa 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgcttggatc tggcgctttt ggca 24

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccaaacactg cctccagctc ttgcc 25

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agggccaggt cctggggtgg gc 22

Claims

1.一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物，其特征在于，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与MTHFR和MTRR基因相关的特异性目的基因的引物对和探针，包括：

MTHFR677引物：

MTHFR677基因正向引物（MTHFR677-F）:SEQ ID NO.1；

MTHFR677基因反向引物（MTHFR677-R）:SEQ ID NO.2；

探针MTHFR677-CFP：SEQ ID NO.3；

探针MTHFR677-TFP：SEQ ID NO.4；

MTHFR1298引物对：

MTHFR1298基因正向引物（MTHFR1298-F）:SEQ ID NO.5；

MTHFR1298基因反向引物（MTHFR1298-R）: SEQ ID NO.6；

探针MTHFR1298-AF：SEQ ID NO.7；

探针MTHFR1298-CFP：SEQ ID NO.8；

MTRR66引物对：

MTRR66基因正向引物（MTRR66-F）：SEQ ID NO.9；

MTRR66基因反向引物（MTRR66-R）：SEQ ID NO.10；

探针MTRR66-AFP: SEQ ID NO.11；

探针MTRR66-GFP: SEQ ID NO.12；

内标引物对：

HER2-F: SEQ ID NO.13；

HER2-R: SEQ ID NO.14；

探针HER2-FP: SEQ ID NO.15；

在MTHFR677-CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸（LNA）的修饰；

在MTHFR677-TFP序列的第13位碱基T上增加锁核酸（LNA）的修饰；

在MTHFR1298-AF序列的第13位碱基A上增加锁核酸（LNA）的修饰；

在MTHFR1298-CFP序列的第13位碱基C上增加锁核酸（LNA）的修饰；

在MTRR66-AFP序列的第15位碱基A上增加锁核酸（LNA）的修饰；

在MTRR66-GFP序列的第14位碱基G上增加锁核酸（LNA）的修饰；

一人份加入量为：MTHFR677-F加入量0.1-0.3μL，MTHFR1298-F加入量0.1-0.3μL，MTRR66-F加入量0.1-0.3μL，MTHFR677-R加入量0.1-0.3μL，MTHFR1298-R加入量0.1-0.3μL，MTRR66-R加入量0.1-0.3μL，MTHFR677-CFP加入量0.01-0.2μL，MTHFR1298-AFP加入量0.01-0.2μL，MTRR66-AFP加入量0.01-0.2μL，MTHFR677-TFP加入量0.01-0.2μL，MTHFR1298-CFP加入量0.01-0.2μL，MTRR66-GFP加入量0.01-0.2μL，HER2-F加入量0.01-0.2μL，HER2-R加入量0.01-0.2μL，HER2-FP加入量0.01-0.2μL。

2.根据权利要求1所述的用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物在制备用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂中的应用。

3.一种用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的组合物。

4.根据权利要求3所述的用于检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DNA聚合酶、dNTPs、10×DNA聚合酶buffer、UDG酶和Mg2+，一人份加入量为：DNA聚合酶加入量0.1-0.4μL，dNTPs加入量1-3μL，10×DNA聚合酶buffer 加入量1-4μL，UDG酶加入量0.01-0.2μL，Mg2+加入量2-5μL。