CN104962621A

CN104962621A - 用于mthfr基因和mtrr基因位点多态性检测的引物组、其检测方法和应用

Info

Publication number: CN104962621A
Application number: CN201510323593.XA
Authority: CN
Inventors: 赵薇薇; 胡昌明; 燕启江; 郭周萍
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2015-10-07

Abstract

本发明提供用于MTHFR基因和MTRR基因位点多态性检测的引物组，MTHFR基因和MTRR基因的位点多态性检测方法，步骤如下：（1）采用PCR扩增MTHFR基因和MTRR基因检测位点所在基因片段并纯化；（2）采用SNaPshot法对扩增产物进行微测序，分析测序结果；并具体设计了相应的引物。本发明的MTHFR基因和MTRR基因的多态性检测方法能够将MTHFR基因C677T、A1298C及MTRR基因A66G三个位点一起检测，即一管体系就可以解决，既得到满意的结果又节省了试剂成本；结果直观且实验稳定性好。

Description

用于 MTHFR 基因和 MTRR 基因位点多态性检测的引物组、其检测方法和应用

技术领域

本发明属于核酸的测定与检验方法技术领域，具体涉及用于MTHFR基因和MTRR基因位点多态性检测的引物组、其检测方法和应用。

背景技术

中国是世界上出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20%。叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因：一是叶酸摄入量不足，二是由于遗传（基因）缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下（叶酸代谢通路障碍）。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）等基因变异引起的相应的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。

同型半胱氨酸（Hcy），是人体内一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物。在Hcy代谢过程中，叶酸和亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）起关键作用，叶酸和MTHFR共同为Hcy代谢提供甲基供体。当体内的叶酸含量不足，或MTHFR基因C677T发生突变时，Hcy就会在体内不断的累积，造成高Hcy血症。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) 是同型半胱氨酸代谢的关键酶之一，其677位点有三种基因分型，野生型CC，杂合突变型CT，纯合突变型TT。有研究发现，MTHFR C677T突变可使酶活性明显下降，使得甲基供体的生成不足，体内的Hcy代谢异常，从而导致Hcy浓度的升高。其中，CT型的活性是CC型的65%，而TT型的活性仅为CC型的30%。亚甲基四氢叶酸还原酶C677T突变是引起高Hcy的主要遗传因素。高血压伴有高同型半胱氨酸（即Hcy血浆浓度大于等于10μmol/L）的原发性高血压就是H型高血压。研究表明：中国有2亿高血压患者，其中1.5亿是H型高血压，H型高血压患者占75%，H型高血压是中国脑卒中高发的主要高危因素，H型高血压患者心脑血管事件是正常人的28倍。H型高血压患者又合并TT基因突变，心脑血管事件风险增加到40倍。早期发现高Hcy血症从而能够早期纠正高Hcy血症、及早防治心脑血管疾病是人们研究的方向，而对MTHFR C677T多态性检测可做到早期发现、早期纠正高Hcy血症，为及早防治心脑血管病提供了一条新的途径。

亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydorfolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢过程中的关键酶，可将还原型叶酸转变为5-甲基四氢叶酸（5-MTHF），前者是胸苷酸合成的重要原料之一，参与DNA的合成与修复；后者是体内主要的甲基供体，参与DNA甲基化。MTHFR对于DNA的合成、活化及修复有着极为重要的调控作用，其功能异常可导致DNA正常功能不能维持。MTHFR基因在677位点存在C>T改变，导致Ala222Val氨基酸替换，使酶活性显著降低，使体内5, 10-亚甲基四氢叶酸（5, 10- MTHF）水平升高、5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）水平随之下降，进而影响叶酸正常代谢，以及甲氨蝶呤、5-FU等药物的疗效和毒副作用。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是叶酸拮抗剂，能抑制亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydorfolate reductase，MTHFR），在急性淋巴细胞白血病（特别在侵犯中枢神经系统时）、颅内原发性中枢神经系统淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、盆腔肿瘤、头颈部肿瘤、肺癌及骨肉瘤等多种肿瘤的化疗中发挥重要作用。但在治疗过程中患者常出现不良反应，包括胃肠道反应、骨髓移植和肝功能损害等。研究发现MTHFR基因第677位碱基的C>T突变显著增加 MTX的毒副作用。 5-氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）为嘧啶类似物，属于抗代谢药的一种，进入体内后，在胸苷激酶的催化下转变成5-氟-2-脱氧尿苷-5-单磷酸盐，再与5, 10-MTHF及胸苷酸合成酶形成共价络合物，从而干扰DNA的合成和修复。MTHFR能将5, 10-MTHF转变成5-MTHF，从而参与蛋氨酸代谢循环和DNA甲基化。因此，MTHFR的活性将直接影响体内5, 10-MTHF的浓度，进而影响5-FU疗效。研究结果表明，MTHFR基因第677位碱基的C>T突变可以导致酶活性显著下降，从而增加对5-FU的敏感性。因此，MTHFR基因677C/T多态性可用于指导该类药物的个体化使用，以提高临床治疗的针对性和可预见性。

综上，检测MTHFR基因C677T的多态性能够用于临床指导5-FU类、甲氨蝶呤等个体化用药及育龄期妇女叶酸补充，具有重大意义。

发明内容

本发明提供了用于MTHFR基因和MTRR基因位点多态性检测的引物组，本发明还提供了MTHFR基因和MTRR基因的位点多态性检测方法，能够用于临床指导5-FU类、甲氨蝶呤等个体化用药及育龄期妇女叶酸补充，具有重大意义。

本发明提供的用于MTHFR基因和MTRR基因位点多态性检测的引物组由3对PCR扩增引物和3条SNaPshot扩增引物组成，所述PCR扩增引物为：

MTHFR-C677T-Fwd：CGAAGCAGGGAGCTTTGAG(SEQ ID NO.1)，

MTHFR-C677T-Rev：GGAAGAATGTGTCAGCCTCA(SEQ ID NO.2)；

MTHFR-A1298C-Fwd：CAAGGAGGAGCTGCTGAAG(SEQ ID NO.3)，

MTHFR-A1298C-Rev：CATCACTCACTTTGTGACCATT(SEQ ID NO.4)；

MTRR-A66G-Fwd：CTGTTACATGCCTTGAAGTGATG(SEQ ID NO.5)，

MTRR-A66G-Rev：CGGCTCTAACCTTATCGGATTC(SEQ ID NO.6)；

所述SNaPshot扩增引物为：

SNE-MTHFR-C677T：GCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQ ID NO.7)；

SNE-MTHFR-A1298C：GATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAG(SEQ ID NO.8)；

SNE-MTRR-A66GR:AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCATGTACCACAGCTTGCTCACA(SEQ ID NO.9)。

本发明还提供MTHFR基因和MTRR基因的位点多态性检测方法，步骤如下：

（1）采用PCR扩增MTHFR基因和MTRR基因检测位点所在基因片段并纯化；

（2）采用SNaPshot法对扩增产物进行微测序，分析测序结果；

其中，步骤（1）所述扩增时的引物序列为：MTHFR-C677T-Fwd：CGAAGCAGGGAGCTTTGAG(SEQ ID NO.1)，

MTHFR-C677T-Rev：GGAAGAATGTGTCAGCCTCA(SEQ ID NO.2)；

MTHFR-A1298C-Fwd：CAAGGAGGAGCTGCTGAAG(SEQ ID NO.3)，

MTHFR-A1298C-Rev：CATCACTCACTTTGTGACCATT(SEQ ID NO.4)；

MTRR-A66G-Fwd：CTGTTACATGCCTTGAAGTGATG(SEQ ID NO.5)，

MTRR-A66G-Rev：CGGCTCTAACCTTATCGGATTC(SEQ ID NO.6)；

步骤（2）所述SNaPshot法中使用的引物序列为：

SNE-MTHFR-C677T：GCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQ ID NO.7)；

SNE-MTHFR-A1298C：GATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAG(SEQ ID NO.8)；

优选地，步骤（1）中所述PCR扩增反应体系为：Q5^TM热启动超保真2×Master Mix 12.5μL；H₂O 5.5μL；引物混合物5.0μL，模板DNA2.0μL；反应条件为：98℃ 3min；98℃ 10s；58℃ 30s；72℃ 1min；29个循环；72℃ 5min； 25℃ 保温；其中，所述引物混合物由MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C和MTRR-A66G组成，MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C和MTRR-A66G的体积比为1:1:1。

优选地，步骤（2）中所述SNaPshot法微测序中，SNaPshot PCR扩增反应体系为：SNaPshot预反应混合液 1.25μL；5×sequencing buffer 1.50μL；ddH₂O 4.25μL；2.0μLSNaPshot引物混合物；1.0μL纯化产物；反应条件为：96℃，10s；55℃，5s；60℃，30s；25个循环；4℃保温；其中，所述SNaPshot引物混合物由引物SNE-MTHFR 677、SNE-MTHFR 1298和SNE-MTRR A66G组成，SNE-MTHFR 677、SNE-MTHFR 1298和SNE-MTRR A66G的体积比为1:1:1。

本发明采用上述引物和扩增条件能够同时高效扩增三条核苷酸序列：包含MTHFR-C677T的核苷酸片段、包含MTHFR-A1298C的核苷酸片段和包含MTRR-A66G的核苷酸片段。其中，核苷酸序列中加黑加大的字母为SNP位点。

本发明的第三个目的是提供上述引物组在制备检测用于MTHFR基因和MTRR基因位点多态性试剂中的引用。

本发明的第四个目的是提供上述引物组在检测MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G的多态性中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述引物组在分析甲氨蝶呤的毒副作用，分析5-FU的疗效，早期发现高Hcy血症，分析叶酸缺乏原因中的应用。

本发明的MTHFR基因和MTRR基因的多态性检测方法能够将MTHFR基因C677T、A1298C及MTRR基因A66G三个位点一起检测，即一管体系就可以解决，既得到满意的结果又节省了试剂成本；结果直观且实验稳定性好。应用本发明的检测方法能够有效指导临床5-FU类个性化用药，能够做到早期发现、早期纠正高Hcy血症；同时，为育龄期妇女补充叶酸提供基因依据。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明SNaPshot法检测MTHFR_C677T基因多态性的检测结果图；

图2为本发明SNaPshot法检测MTHFR_A1298C基因多态性的检测结果图；

图3为本发明SNaPshot法检测MTRR A66G基因多态性的检测结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

本申请所用仪器参见表1。

表1 本申请实验所用仪器

仪器名称	型号	备注
			生物安全柜	BioBase	其它型号仪器达到安全标准即可
离心机	Eppendorf 5424	无特殊要求，1.5ml离心机即可
			离心机	Eppendorf 5804R	>3000rpm即可
移液器	1000/200/100/20/10μL	满足计量要求即可，品牌无特别要求
			带滤芯tips	AxyGen 1000/200/10μL	满足无DNA/RNA酶即可，无特殊要求
震荡器	IKA®VorTex	用于混匀样本，无特殊要求
			离心管	ExtraGene 1.5ml	满足无DNA/RNA酶即可，无特殊要求
PCR仪	ABI 9700	满足计量要求即可，品牌无特别要求
			基因分析仪	ABI 3130XL,3530XL,3500XL DX,3730

本申请所用试剂如下：

Q5^TM 热启动超保真2×Master Mix，购自NEB公司，货号：M0494L，-20℃。

实施例 1

一 . 采用多重 PCR 法扩增检测位点所在基因片段

1 待测样本 DNA 提取

本检测采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取外周血DNA，提取步骤参考试剂盒说明书。

试剂准备

a、本申请中引物序列为本申请人自行设计，具体序列参见表2，Invitrogen公司生产，使用浓度为5.0pmol/μL；干粉于-20℃保存，有效期一年；工作液于4℃保存，有效期半年；基因参考序列号为

SNP位点参考NCBI和UCSC数据库。

表2 PCR扩增时所用引物序列

b、取出Q5^TM热启动超保真2×Master Mix，primers，ddH₂O，室温融化后，短暂离心；配制引物混合物，体积比例如下：MTHFR C677T:MTHFR A1298C:MTRR A66G=1:1:1，震荡混匀；短暂离心后备用；

反应体系配制：

Q5^TM热启动超保真2×Master Mix 12.5μL

H₂O 5.5μL

共计 18μL。

震荡混匀，短暂离心后，分装18.0μL至标记好的PCR反应管；在PCR反应管中加入引物混合物5.0μL后转移至标本制备区。本检测使用高保真热启动聚合酶，因此，在工作过程中可预先配制好18.0μL的反应体系并保存于-20℃，每次使用时取出，加入5.0μL引物混合物即可用于检测，也可将引物混合物直接与聚合酶混合，保存于-20℃备用。

加样扩增

向分装好的PCR反应管中加入2.0μL稀释后的模板；进行PCR扩增，扩增条件如下：98℃ 3min；98℃ 10s；58℃ 30s；72℃ 1min；29个循环；72℃ 5min； 25℃ 保温。得到三条核苷酸序列。采用上述引物和扩增条件能够同时高效扩增三条核苷酸序列：包含MTHFR-C677T的核苷酸片段、包含MTHFR-A1298C的核苷酸片段和包含MTRR-A66G的核苷酸片段。其中，核苷酸序列中加黑加大的字母为SNP位点。

对扩增产物进行微测序

DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在反应系统中分别按比例引入四种带有荧光标记的双脱氧碱基(ddNTP)，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，进行毛细管电泳，以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

荧光标记单碱基延伸技术(SNaPshot,SNE)是美国应用生物公司（ABI）开发，是一种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称微测序，是指在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧邻多态位点5'端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。通常用于10~30个SNP位点分析。具有分型准确、通量高、不受SNP位点多态性特性限制、不受样本个数限制等特点，通常采用SNaPshot® Multiplex Kit进行检测。

本发明在应用多重PCR扩增检测位点所在基因片段后，采用荧光标记单碱基延伸技术(SNaPshot,SNE)结合毛细管电泳技术进行检测。

微测序时引物及体积比例为：SNE-MTHFR 677: SNE-MTHFR 1298: SNE-MTRR A66G =1:1:1。本发明使用SNaPshot® Multiplex Kit试剂盒进行微测序，并按照SNaPshot® Multiplex Kit操作说明，准备好检测用试剂。

扩增产物纯化

取2.0μL ExoSAP-IT试剂和3.0μL ddH₂O配制酶混合物，加入PCR扩增产物2.0μL，混匀微离心；在PCR仪中进行酶切反应，程序：37℃,15 min；80℃,15min；4℃，保温。

扩增

纯化结束后按照表3所示体系配置，之后加入2.0μL的测序引物混合物至相应管，最后加入1.0μL的纯化产物，按以下程序进行PCR扩增：96℃，10s；55℃，5s；60℃，30s；25个循环；4℃保温。

表3 PCR反应扩增体系

组分	1×Reaction(μL)
		SNaPshot预反应混合液	1.25
5×sequencing buffer	1.50
		ddH₂O	4.25
总计	7.00

4.3 SNE 产物纯化

在SNaPshot PCR产物中加入1.0μL SAP酶，按照以下程序进行反应：37℃，60min；75℃，15min；4℃，保温。反应完毕后，取出产物保存于4℃。立即进行SNaPshot分析，如不能，则应该在不超过24小时内完成后续分析。

电泳

使用的分子量标准为GeneScan^TM-120LizTM Size Standards，采用基因分析仪进行电泳及分析（即毛细管电泳仪）型号为ABI 3500XL DX。

结果分析

使用GENEMAPPERID V4.1软件中SNaPshot法进行分析，图1为样本分析结果，具体为：MTHFR C677T：A/A（第1峰，两个峰重叠在一起）；MTHFR A1298C：A/A（第2峰，两个峰重叠在一起）；MTRR A66G：T/C（第4峰），因MTHFR C677T、MTRR A66G位点为反向设计，因此本检测临床报告为MTHFR C677T:T/T、MTHFR A1298C：A/A、MTRR A66G：A/G。（第3峰为UGT1A1*6（G71R））。

对报告结果进行分析，具体如下：

（1）叶酸利用能力遗传检测项目涉及的基因及位点如表4所示。

表4

基因	位点	基因型	基因型在中国人群中分别所占比例
				MTHFR	C677T	CC（正常）；CT（正常）；TT（风险）	22%；50%；28%
MTHFR	A1298C	AA（正常）；AC（正常）；CC（风险）	66%；31%； 3%
				MTRR	A66G	AA（正常）；AG（风险）；GG（风险）	58%；36%；6%

（2）MTHFR基因型与5-FU用药的关系参见表5。

表5

因此，应用本发明的检测方法能够有效指导临床5-FU类个性化用药，能够做到早期发现、早期纠正高Hcy血症；同时，为育龄期妇女补充叶酸提供基因依据。

本发明通过对多态性检测方法进行了优化：选择先用多重PCR法扩增检测位点所在基因片段再采用SNaPshot法进行微测序的方法，检测率高、灵敏度高、结果直观且实验稳定性好。然后对一系列具体条件进行了优化：PCR扩增时引物、扩增体系及反应条件、SNaPshot法中使用引物和扩增体系及反应条件均进行了优化，使得MTHFR基因C677T、A1298C及MTRR基因A66G三个位点能够一起检测，即一管体系就可以解决，既得到满意的结果又节省了试剂成本。

实施例 2 本发明的多态性检测方法验证试验

对本发明的多态性检测结果采用ARMS法或Sanger测序法进行验证。其中，Sanger测序法使用BigDye Terminator试剂盒进行测序。BigDye Terminator试剂盒简称BDT。BDT v3.1是DNA测序的标准试剂盒，适用于所有类型DNA模板的测序，对于长片段测序更具优势，是目前基因突变检测的金标准。

对本发明的多态性检测方法进行验证

1 主要试剂和仪器如下：

1.1 引物（ Primers ）

本检测所用引物均由本实验室自行设计（见表2），PCR引物序列参见表2，所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。

主要试剂

本检测DNA提取采用Qiagen公司产品TIANamp Blood DNA Kit，货号DP318；

PCR扩增采用NEB公司产品Q5^TM 热启动超保真2×Master Mix，货号：M0494L；

SNaPshot单碱基延伸测序采用ABI公司产品SNaPshot® Multiplex Kit，货号4223151；

操作步骤参考各自操作说明书。

主要仪器参见表 6 。

表6 主要仪器

2 检测特异性（Analytical Specificity）

2.1 引物特异性（ Specificity Of Primers ）

1）各引物于UCSC中进行Blasting，扩增片段分别覆盖了检测位点MTHFR C677T及MTHFR A1298C，无其它同源基因。

2）使用表2中PCR扩增引物分别对检测样本进行扩增及Sanger测序，测序结果显示，各引物扩增片段与MTHFR基因参考序列吻合。

3）使用表2中SNaPshot PCR引物，结果显示，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符。

检测特异性（ Analytical Specificity ）

本检测的检测特异性定义为阴性符合率。

本检测共对21例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果均采用ARMS法或Sanger测序法进行验证。其中，MTHFR C677T位点SNaPshot测序法检测无突变的样本（阴性）共10例（如表7所示），与ARMS法显示的结果相符；MTHFR A4298C位点SNaPshot测序法检测无突变的样本（阳性）共12例（如表7所示），与Sanger测序法显示的结果相符。本检测的检测灵敏度为100%。

表7 检测特异性实验数据

敏度（ Analytical Sensitivity ）

1）本检测的检测灵敏度定义为阳性符合率。

本检测共对21例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果均采用ARMS法或Sanger测序法进行验证。其中，MTHFR C677T位点SNaPshot测序法检测到突变的样本（阳性）共11例（如表7所示），与ARMS法显示的结果相符；MTHFR A1298C位点SNaPshot测序法检测到突变的样本（阳性）共9例（如表8所示），与Sanger测序法显示的的结果相符。本检测的检测灵敏度为100%。

表8 检测灵敏度实验数据

2）本检测以MTHFR C677T位点为例验证本检测的检测下限。

使用MTHFR 677T/T基因样本（纯合突变型）与C/C基因样本（野生型）按1:9，2:8，3:7；4:6，5:5比例混合后进行检测，结果显示，突变型与野生型比例1:9（突变型比例为10%）时本检测方法也能检测到突变型。MTHFR C677T多态为胚系突变，在杂合基因型C/T中突变等位基因为50%，因此，本检测的检测灵敏度100%。具体结果参见表9。

表9 SNaPshot法检测下限

4 准确度（ Accuracy ）

本检测准确度定义为不同方法检测结果的一致性。

21例样本经SNaPshot法和Sanger测序或ARMS法检测，不同方法检测结果一致，如表10所示。本检测的准确度为100%。

表10 准确度实验数据

5 精密度（ Precision ）

本检测的精密度定义为对标本进行重复检测得到同一结果的能力。

本检测进行了人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比试验（表11），所有结果均显示一致，本检测精密度为100%。其中，位点1:MTHFR C677T；位点2:MTHFR A1298C。

表11a 批间精密度实验数据

表11b 批内精密度实验数据

6 临床特异性（ Clinical Specificity ）

MTHFR是叶酸代谢中的关键酶，在维持DNA正常甲基化和核苷酸从头合成以及DNA修复等过程发挥着重要作用。MTHFR基因常见的多态性位点为C677T（rs1801133）和A1298C（rs1801131)。在中国人群中，MTHFR基因677位点C/C、C/T、T/T基因型频率分别为22%、50%、28%；1298位点A/A、A/C、C/C基因型频率分别66%、31%、3%。

临床灵敏度（ Clinical Sensitivity ）

MTHFR 677位点和1298位点的多态性是影响MTHFR酶活性和热稳定性的一个重要因素，进而影响个体对5-氟尿嘧啶的敏感性。研究结果表明，677位TT基因型携带者5-Fu化疗有效率显著高于TC和CC基因型携带者，1298位AA基因型携带者化疗有效率也明显优于AC和CC基因型携带者，另一方面，MTHFR677位点多态性还与甲氨蝶呤的毒副作用有关，677位TT纯合子对甲氨蝶呤治疗的毒性反应比677C的基因型严重的多。

本次验证的结果可接受的标准及最终结果总结如表12所示。

表12本次验证的结果可接受的标准及最终结果对照表

8 临床用途（ Clinical Usage ）

为需使用5-氟尿嘧啶或甲氨蝶呤等药物治疗的患者提供使用药敏感性及毒性评估。

结论（ Conclusions ）

本发明的验证参数能够接受，验证结果显示，本发明的方法可用于检测MTHFR基因C677T及A1298C基因多态性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 广州金域医学检验中心有限公司

<120> 用于MTHFR基因和MTRR基因位点多态性检测的引物组、其检测方法和应用

<130> 9

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaagcaggg agctttgag 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaagaatgt gtcagcctca 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caaggaggag ctgctgaag 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catcactcac tttgtgacca tt 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgttacatg ccttgaagtg atg 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggctctaac cttatcggat tc 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctgcgtgat gatgaaatcg 20

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgtggggg gaggagctga ccagtgaag 29

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatccatg taccacagct tgctcaca 58

Claims

1.用于MTHFR基因和MTRR基因位点多态性检测的引物组，其特征在于：由3对PCR扩增引物和3条SNaPshot扩增引物组成，所述PCR扩增引物为：

MTHFR-C677T-Fwd：CGAAGCAGGGAGCTTTGAG，

MTHFR-C677T-Rev：GGAAGAATGTGTCAGCCTCA；

MTHFR-A1298C-Fwd：CAAGGAGGAGCTGCTGAAG)，

MTHFR-A1298C-Rev：CATCACTCACTTTGTGACCATT；

MTRR-A66G-Fwd：CTGTTACATGCCTTGAAGTGATG，

MTRR-A66G-Rev：CGGCTCTAACCTTATCGGATTC；

所述SNaPshot扩增引物为：

SNE-MTHFR-C677T：GCTGCGTGATGATGAAATCG；

SNE-MTHFR-A1298C：GATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAG；

SNE-MTRR-A66GR:AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCATGTACCACAGCTTGCTCACA。

2.MTHFR基因和MTRR基因的位点多态性检测方法，其特征在于：步骤如下：

（2）采用SNaPshot法对扩增产物进行微测序，分析测序结果；

其中，步骤（1）所述扩增时的引物序列为：MTHFR-C677T-Fwd：CGAAGCAGGGAGCTTTGAG，

MTHFR-C677T-Rev：GGAAGAATGTGTCAGCCTCA；

MTHFR-A1298C-Fwd：CAAGGAGGAGCTGCTGAAG，

MTHFR-A1298C-Rev：CATCACTCACTTTGTGACCATT；

MTRR-A66G-Fwd：CTGTTACATGCCTTGAAGTGATG，

MTRR-A66G-Rev：CGGCTCTAACCTTATCGGATTC；

步骤（2）所述SNaPshot法中使用的引物序列为：

SNE-MTHFR-C677T：GCTGCGTGATGATGAAATCG；

SNE-MTHFR-A1298C：GATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAG；

SNE-MTRR-A66GR:AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCATGTACCACAGCTTGCTCACA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述PCR扩增反应体系为：Q5^TM热启动超保真2×Master Mix 12.5μL；H₂O 5.5μL；引物混合物5.0μL，模板DNA2.0μL；反应条件为：98℃ 3min；98℃ 10s；58℃ 30s；72℃ 1min；29个循环；72℃ 5min； 25℃ 保温；其中，所述引物混合物由MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C和MTRR-A66G组成，MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C和MTRR-A66G的体积比为1:1:1。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述SNaPshot法微测序中，SNaPshot PCR扩增反应体系为：SNaPshot预反应混合液 1.25μL；5×sequencing buffer 1.50μL；ddH₂O 4.25μL；2.0μLSNaPshot引物混合物；1.0μL纯化产物；反应条件为：96℃，10s；55℃，5s；60℃，30s；25个循环；4℃保温；其中，所述SNaPshot引物混合物由引物SNE-MTHFR 677、SNE-MTHFR 1298和SNE-MTRR A66G组成，SNE-MTHFR 677、SNE-MTHFR 1298和SNE-MTRR A66G的体积比为1:1:1。

5.权利要求1所述的引物组在制备检测用于MTHFR基因和MTRR基因位点多态性试剂中的应用。

6.权利要求1所述的引物组在检测MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G的多态性中的应用。

7.权利要求1所述的引物组在分析甲氨蝶呤的毒副作用，分析5-FU的疗效，早期发现高Hcy血症，分析叶酸缺乏原因中的应用。