CN107245527A - Mtrr基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Mtrr基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了MTRR基因多态性快速检测的试剂盒，包括PCR反应液；PCR反应液的原料及终浓度为，DNA聚合酶0.04‑0.09U/μL；dNTPs 0.1‑0.5mM；5X PCR缓冲液0.5‑1.5 X；MgCl2 1‑2.5mM；十二烷基硫酸钠0.0005‑0.015％（w/v）；聚乙二醇辛基苯基醚0.001‑0.03％（w/v）；上游引物0.2‑1.0μM；下游引物0.2‑1.0μM；突变型分子信标0.3‑0.5μM；野生型分子信标0.3‑0.7μM；且其用于检测细胞样品。本发明要解决的技术问题是提供一种可在无痛环境下取样，操作简单、成本低且检测快速、时间短、成功率高的MTRR基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法，从而为个体化用叶酸提供指导，减小胎儿畸形风险。

Description

MTRR基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种MTRR基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。
背景技术
叶酸(folic acid)属于B组维生素,是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，一旦发生叶酸缺陷或者叶酸代谢酶的缺陷，就会导致细胞周期不正常，DNA、蛋白质甲基化反应异常，DNA碱基无法合成等，从而直接或间接导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人心血管疾病发生。目前，研究表明和叶酸代谢密切相关的基因有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)。其中MTRR主要作用是通过还原性的甲基化作用将失活的甲硫氨酸合成酶还原成有活性状态，从而可以将5-甲基四氢叶酸和同型半胱氨酸(Hcy)代谢为甲硫氨酸，维持细胞内甲硫氨酸、叶酸和无毒Hcy的水平。MTRR常见的突变位点为66A>G(rs1801394),蛋白质水平表现为氨基酸第22位的异亮氨酸变为甲硫氨酸，在中国的发生率为25.7％，其中66AA基因型的发生率为6.6％。MTRR基因突变会导致酶的表达或功能的差异，进而影响血浆Hcy的水平。研究表明，MTRR基因发生改变时，在脑血管疾病(CVD)的风险中，66AA比66GG的Hcy水平高4％，因此对MTRR的基因检测不仅对补充叶酸可以起到指导作用，还可以对高同型半胱氨酸血症患者及时补充叶酸，降低脑卒中发生风险也有一定的指导意义。
目前，已报道的用于SNP(Single Nucleotide Polymorphism)检测的方法主要有RFLP、测序、Taqman探针法、HRM、SNP芯片法和质谱法等，它们之间各有优劣势，但大多都需要专业人士操作，操作复杂，耗费时间较长，花费昂贵。目前临床用于检测MTRR(66A>G)的方法主要为荧光探针法，都需要以提纯的DNA或血液作为扩增模板来确定基因分型。提取纯化DNA需要增加抽取血液和提取血液DNA的步骤，完成整个过程需要4个小时，不仅造成了伤痛，还浪费了大量时间。现有技术在PCR扩增后需要进行毛细管电泳分析，增加此操作步骤，需要花费至少1个小时。此外，目前市面上的试剂为多组分组成，使用时需要专业的操作者，并且需要根据试剂盒中的试剂组分和说明配制试剂然后才能使用，此过程容易造成试剂的污染，测试的成功率低,而且增加了检测操作步骤，延长了检测时间，得出检测结果的整个过程至少需要8小时。因此，难以满足临床疾病的快速诊断，增加了患者疾病治疗的风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可在无痛环境下取样，操作简单、成本低且检测快速、时间短、成功率高的MTRR基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法，从而为个体化用叶酸提供指导，减小胎儿畸形风险。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：MTRR基因多态性快速检测的试剂盒，
包包括PCR反应液；PCR反应液的原料及终浓度为，
DNA聚合酶 0.04-0.09U/μL；
dNTPs 0.1-0.5mM；
5X PCR缓冲液 0.5-1.5X；
MgCl2 1-2.5mM；
十二烷基硫酸钠 0.0005-0.015％(w/v)；
聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0.03％(w/v)；
上游引物 0.2-1.0μM；
下游引物 0.2-1.0μM；
突变型分子信标 0.3-0.5μM；
野生型分子信标 0.3-0.7μM；
且其用于检测细胞样品。
dNTP是deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写，dNTPs则是由四种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)以相同的比例混合而成，是DNA复制的原料；MgCl2的作用是提供Mg2+与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别；DNA聚合酶为GoTaq DNA Polymerase，以DNA为复制模板，从DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。上游引物、下游引物作为DNA复制的起始点，因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上，因此，在核酸合成反应时，引物作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用。
采用本发明技术方案的MTRR基因多态性快速检测的试剂盒，以细胞为样本，以荧光基团信标法为基础，结合细胞裂解液对MTRR进行检测分析。用细胞裂解液(由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成)在反应过程中直接裂解细胞并释放出细胞核中DNA。在现有的PCR反应中，以细胞直接作为模板的PCR反应，通常无法彻底裂解细胞，并且裂解后的细胞碎片及一些细胞内容物(如蛋白酶)对PCR反应有抑制，最终导致分型结果不稳定，甚至失败。因此，在未加裂解液的情况下，直接加入细胞作为模板，会造成细胞裂解不彻底，并且细胞裂解之后的细胞碎片以及一些蛋白酶会对PCR反应造成阻碍，造成实验失败。本发明的细胞裂解液可直接溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解一些蛋白酶，降低细胞裂解之后产生的杂质对PCR反应的影响。因此在最大释放DNA的同时还消除了细胞中其他成分对PCR反应的部分阻碍作用。
由实验可知，PCR反应液的原料、特异性引物及分子信标的终浓度范围为上述范围时检测结果均正确。其中，5X反应缓冲液1X的原料为5X反应缓冲液，指的是初始浓度为5倍的反应缓冲液，1X是指的应用的终浓度。
本发明具有无需采取血液样本，无痛操作，不需要抽取血液；无需提纯DNA；简化操作，缩短检测时间，无需专业人士操作；在为被测者减少痛苦的同时，也能为医生尽早精准用药争取时间。本发明与现有技术相比，本发明具有无痛采样、简单快速、即时检测，避免污染，成功率高等优点。
进一步，所述的PCR反应液的原料终浓度为：
DNA聚合酶 0.09U/μL；
dNTPs 0.2mM；
5X PCR缓冲液 1X；
MgCl2 2.5mM；
十二烷基硫酸钠 0.005％(w/v)；
聚乙二醇辛基苯基醚 0.01％(w/v)；
上游引物 0.5μM；
下游引物 0.5μM；
突变型分子信标 0.3μM；
野生型分子信标 0.5μM。
由实验可知，PCR反应液的原料、特异性引物及分子信标的终浓度范围为上述范围时检测结果最准确，成功率最高。
进一步，所述的细胞样品为口腔黏膜脱落细胞。本发明以直接刮取的口腔黏膜脱落细胞为样本，操作方便。
进一步，还包括有提纯的人类基因组DNA基因序列。试剂盒中包括质控品，为提纯的人类基因组DNA基因序列，是在测定时为了做平行试验，来测定试剂结果的有效性。
本申请还提出另一个技术方案，本发明试剂盒中的MTRR基因多态性快速检测的引物，
上游引物5’-3’的基因序列为：ATGCTACACAGCAGGGACAG；
下游引物5’-3’的基因序列为：CACTAATACAGTGAAGATCTGCAG。
本申请还提出另一个技术方案，试剂盒中引物检测的MTRR基因多态性快速检测的分子信标，
野生型分子信标的5’-3’的基因序列为：CGCGCTTTG+CTCAC+A+T+ATTTCTTCTAGCGCG；
突变型分子信标的5’-3’的基因序列为：CGCGCTTTG+CTCACA+C+ATTTCTTCTAGCGCG；
+为锁核酸修饰的碱基；
且野生型分子信标和突变型分子信标基因序列的5’端或3’端分别设有荧光基团和与荧光基团配合的淬灭基团。
本技术方案使用了分子信标分子信标，分子信标为一种在5’和3’末端可自身形成由5-8个碱基组成的发夹结构的双标记寡核苷酸分子信标。即为上述分子信标的基因序列和结构。自由状态时，发夹结构的两个末端使荧光基团与淬灭基团靠近(约为7-10nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭。当分子信标与细胞的基因序列完全互补的靶标序列结合形成双链杂交体时，茎结构互补区的碱基对被分开，荧光基团和淬灭基团之间距离增大，这时分子信标的荧光几乎100％恢复。这种设计能有效地增加分子信标的特异性，提高对MTRR检测的正确性。
检测的原理为：在MTRR(66A>G)基因突变位点两侧保守区域设计一对引物，并在突变位点序列处设计两个分子信标，突变型分子信标、野生型分子信标，野生型分子信标与未突变序列结合，突变型分子信标与突变位点序列结合。野生型分子信标、突变型分子信标5’端用荧光基团标记，野生型分子信标、突变型分子信标的3’端用与荧光基团配合的淬灭基团标记。在PCR退火阶段，野生型分子信标与未突变的序列结合，而突变型分子信标与有突变位点的序列结合，在结合后，荧光基团远离淬灭基团，此时发出的荧光被实时荧光定量检测仪记录下来，从而通过荧光的颜色来判断所检测基因的基因型。
进一步，所述的荧光基团为Alexa Fluor 488、FAM，淬灭基团为BHQ1标记基团；
或者所述的荧光基团为Alexa Fluor 594、Texas Red标记基团，淬灭基团为BHQ2标记基团。为本发明中所使用的荧光基团和淬灭基团，当然，也可用其他荧光基团和与其配合的淬灭基团代替，不影响检测结果。
本申请还提出另一个技术方案，利用上述的引物、分子信标及试剂盒进行的MTRR基因多态性快速检测方法，操作方法为，
(1)取样前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；
(2)取取样装置的取样部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次，上下为1次；
(3)取样后将取样装置的取样部插入PCR反应液中，混匀；
(4)取1μL提纯的DNA基因序列加入到另一支PCR反应液中，混匀；
(5)将完成加样的PCR反应液放入定量PCR仪中，运行反应程序。
进一步，定量PCR仪的反应程序为：
A、预变性：温度95℃，5min，1个循环；
B、变性：95℃，8s；
C、退火及延伸：58℃，35s；
D、B及C程序操作50个循环。
进一步，所述的定量PCR仪为双通道，激发波长分别为450-500nm和550-600nm。
附图说明
图1是本发明实施例一的第一个样品检测扩增曲线图；
图2是本发明实施例一的第一个样品检测扩增曲线图；
图3是本发明实施例一的第一个样品检测扩增曲线图；
图4是本发明实施例二的第二个样品检测扩增曲线图；
图5是本发明实施例二的第二个样品检测扩增曲线图；
图6是本发明实施例二的第二个样品检测扩增曲线图；
图7是本发明实施例三的第三个样品检测扩增曲线图；
图8是本发明实施例三的第三个样品检测扩增曲线图；
图9是本发明实施例三的第三个样品检测扩增曲线图；
图10是本发明实施例四的第一个样品检测扩增曲线图；
图11是本发明实施例四的第二个样品检测扩增曲线图；
图12是本发明实施例四的第三个样品检测扩增曲线图；
图13是本发明提纯的MTRR突变杂合型人类基因组DNA基因序列样品检测扩增曲线图。
具体实施方式
以下是本发明MTRR基因多态性快速检测试剂盒中的各实施例的原料终浓度，如表1所示：
表1
以下为本发明MTRR基因多态性快速检测的具体操作方式：
一、细胞裂解液的配制
表1中的细胞裂解液组分浓度为PCR反应体系中的最终浓度，此浓度太小，会造成加样的不准确性。因此在配置时，可将终浓度扩大，再稀释。
所有试剂配制均在灭菌后的超净工作台进行。
(1)实施例一中200X细胞裂解液的配制
裂解液的配置方法：使用1.5ml的离心管，加入10ul SDS和1.88ul Triton X-100，再加入988.12ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到0.1％，使TritonX-100的终浓度达到0.2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
(2)实施例二、实施例四中200X细胞裂解液的配制
裂解液的配置方法：使用1.5ml的离心管，加入100ulSDS和18.78ulTriton X-100，再加入881.22ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到1％，使TritonX-100的终浓度达到2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
(3)实施例三中200X细胞裂解液的配制
使用1.5ml的离心管，加入300ul SDS和56.34ulTriton X-100，再加入643.66ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到3％，使TritonX-100的终浓度达到6％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
上游引物5’-3’的基因序列为：ATGCTACACAGCAGGGACAG；
下游引物5’-3’的基因序列为：CACTAATACAGTGAAGATCTGCAG。
野生型分子信标5’-3’的基因序列为：
Alexa Fluor 488标记-CGCGCTTTG+CTCAC+A+T+ATTTCTTCTAGCGCG-BHQ1标记；
突变型分子信标5’-3’的基因序列为：
Alexa Fluor 594标记-CGCGCTTTG+CTCACA+C+ATTTCTTCTAGCGCG-BHQ2标记；
+为锁核酸修饰的碱基。
上述原料，除特异性引物、分子信标、细胞裂解液外，均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。特异性引物由上海占标生物科技有限公司合成；分子信标由上海英骏生物技术有限公司合成。
二.PCR反应液配制
各原料的加入量如表2所示。所有配制均在灭菌后的超净工作台进行。
表2
三、MTRR基因型检测；
MTRR基因型快速检测试剂盒由9支分装好的试剂管组成，每个被测者检测3次重复(一次一支反应液)，每测试9支试剂，同时测试一次质控品，质控品即为提纯的人类基因组DNA基因序列，作为平行测试。该质控品为MTRR突变杂合型，当结果如图13所示时，表明试剂能有效地进行分型，表示其他试剂测试结果同样可信。
每个实施例按照23.5ul的反应体系各配制36支试剂，以上所指的终浓度是指各组分在23.5ul体系中的浓度，ul/支是指各个组分在试剂管中的含量，-20℃避光保存；
(1)取样前用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，尽量避免口腔内壁残留唾液；
(2)取出一次性使用无菌拭子(专利授权公告号：CN205359515U)及反应液，拔掉反应液塞子及拭子端盖；
(3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁，实施例一、二、三、四均匀刮拭5次(上下为1次)，力度以腮部微突为宜；
(4)取样后立即将拭子插入反应液中，按压顶部使其与试剂管密封，避光暂存，而后轻弹试剂管使样本与反应液充分混匀；
步骤(1)～(4)在20s内完成操作，切勿中断；
(5)用移液器取1μL质控品加入到一支反应液中，轻弹试剂管并混匀；
(6)将完成加样的反应液放入OM-1000型荧光PCR仪器(专利授权公告号：CN103820306B)中，并运行表3中程序。
表3
(7)得到扩增曲线和荧光颜色，分析结果。
四、结果分析：
因为人类基因组为二倍体，每一基因座位上含有两个等位基因。结果共有三种，分别是“GG”、“GA”或“AA”，其中阴性结果是“AA”，阳性结果是“GA”和“GG”。如图1、图2和图3所示，图中A线表示MTRR(66A>G)未突变基因扩增情况，G线表示MTRR(66A>G)突变基因扩增情况。
实施例一的结果为：
由图1可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，因此检测结果是野生型AA，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；
由图2可知：A线和G线都有指数增长，表示检测结果是突变杂合型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；
由图3可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，表示检测结果是纯合突变型GG，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；
由此，可从图1、图2和图3中分析得出MTRR(66A>G)的基因型，从而可得出，患者对药物的代谢类型。
实施例二的结果为：
由图4可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，因此检测结果是野生型AA，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；
由图5可知：A线和G线都有指数增长，表示检测结果是突变杂合型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；
由图6可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，表示检测结果是纯合突变型GG，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；
由此，可从图4、图5和图6中分析得出MTRR(66A>G)的基因型，从而可得出，患者对药物的代谢类型。
实施例三的结果为：
由图7可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，因此检测结果是野生型AA，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；
由图8可知：A线和G线都有指数增长，表示检测结果是突变杂合型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；
由图9可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，表示检测结果是纯合突变型GG，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；
由此，可从图7、图8和图9中分析得出MTRR(66A>G)的基因型，从而可得出，患者对药物的代谢类型。
通过上述三个实施例结果可看出，三个实施例均能正确分析出MTRR(A66G，rs1801394)的基因型，但实施例二的杂合基因型GR-ratio明显优于实施例一和实施例三。故确定实施例二中的PCR反应系统为最优。
实施例四的结果为：
由图10可知：在三次重复测试中，均只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，三次检测结果一致，均为野生型；
由图11可知：在三次重复测试中，A线和G线都有指数增长，三次检测结果一致，均为杂合型；
由图12可知：在三次重复测试中，均只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，三次检测结果一致，均为突变型。
由此，可以从图10、图11和图12中分析得出MTRR三种基因型的分型正确率均为100％，表示实施例四分型结果稳定，能够准确报告出患者的代谢类型，指导患者精准用药。
核苷酸序列表如下：
<110>重庆京因生物科技有限责任公司
<120>MTRR基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<400>1
ATGCTACACAGCAGGGACAG
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<400>2
CACTAATACAGTGAAGATCTGCAG
<210>3
<211>35
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<400>3
CGCGCTTTG+CTCAC+A+T+ATTTCTTCTAGCGCG
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<400>4
CGCGCTTTG+CTCACA+C+ATTTCTTCTAGCGCG。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
<110> 重庆京因生物科技有限责任公司
<120>MTRR基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<400>1
ATGCTACACAGCAGGGACAG
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<400>2
CACTAATACAGTGAAGATCTGCAG
<210>3
<211>35
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<400>3
CGCGCTTTG+CTCAC+A+T+ATTTCTTCTAGCGCG
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<400>4
CGCGCTTTG+CTCACA+C+ATTTCTTCTAGCGCG。

Claims (10)

1.MTRR基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液；PCR反应液的原料及终浓度为，
DNA聚合酶 0.04-0.09U/μL；
dNTPs 0.1-0.5mM；
5X PCR缓冲液 0.5-1.5 X；
MgCl2 1-2.5mM；
十二烷基硫酸钠 0.0005-0.015％（w/v）；
聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0.03％（w/v）；
上游引物 0.2-1.0μM；
下游引物 0.2-1.0μM；
突变型分子信标 0.3-0.5μM；
野生型分子信标 0.3-0.7μM；
且其用于检测细胞样品。
2.根据权利要求2所述的MTRR基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应液的原料终浓度为：
DNA聚合酶 0.09 U/μL；
dNTPs 0.2mM；
5X PCR缓冲液 1X；
MgCl2 2.5mM；
十二烷基硫酸钠 0.005％（w/v）；
聚乙二醇辛基苯基醚 0.01％（w/v）；
上游引物 0.5μM；
下游引物 0.5μM；
突变型分子信标 0.3μM；
野生型分子信标 0.5μM。
3.根据权利要求3所述的MTRR基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：所述的细胞样品为口腔黏膜脱落细胞。
4.根据权利要求4所述的MTRR基因多态性快速检测的试剂盒，其特征在于：还包括有提纯的人类基因组DNA基因序列。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的试剂盒中的MTRR基因多态性快速检测的引物，其特征在于，
所述的上游引物5’-3’的基因序列为：ATGCTACACAGCAGGGACAG；
所述的下游引物5’-3’的基因序列为：CACTAATACAGTGAAGATCTGCAG。
6.利用与权利要求5所述的试剂盒中引物检测的MTRR基因多态性快速检测的分子信标，其特征在于：
野生型分子信标的5’-3’的基因序列为：CGCGCTTTG+CTCAC+A+T+ATTTCTTCTAGCGCG；
突变型分子信标的5’-3’的基因序列为：CGCGCTTTG+CTCACA+C+ATTTCTTCTAGCGCG；
+为锁核酸修饰的碱基；
且野生型分子信标和突变型分子信标基因序列的5’端和3’端分别设有荧光基团和与荧光基团配合的淬灭基团。
7.根据权利要求6所述的MTRR基因多态性快速检测的分子信标，其特征在于：所述的荧光基团为Alexa Fluor 488、FAM，淬灭基团为BHQ1标记基团；
或者所述的荧光基团为Alexa Fluor 594、Texas Red 标记基团，淬灭基团为BHQ2标记基团。
8.利用权利要求6或7所述的引物、分子信标和试剂盒进行的MTRR基因多态性快速检测方法，其特征在于：操作方法为，
（1）取样前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；
（2）取取样装置的取样部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次，上下为1次；
（3）取样后将取样装置的取样部插入PCR反应液中，混匀；
（4）取1μL提纯的人类基因组DNA基因序列加入到另一支PCR反应液中，混匀；
（5）将完成加样的PCR反应液放入定量PCR仪中，运行反应程序。
9.利用权利要求8所述的引物、分子信标和试剂盒进行的MTRR基因多态性快速检测方法，其特征在于：定量PCR仪的反应程序为：
A、预变性：温度95℃，5min，1个循环；
B、变性：95℃，8s；
C、退火及延伸：58℃，35s；
D、B及C程序操作50个循环。
10.如权利要求9所述的MTRR基因多态性快速检测方法，其特征在于：所述的定量PCR仪为双通道，激发波长分别为450-500nm和550-600nm。
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