CN108165615A - 一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法和试剂盒 - Google Patents

一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法和试剂盒 Download PDF

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杨连兴
朱峰
王赫群
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Abstract

本发明公开一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法和试剂盒。该方法包括：扩增：使用PCR引物扩增样本DNA从而得到PCR产物，并对PCR产物进行纯化；所述PCR引物包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6核苷酸序列；延伸：使用MTHFR的1298位点延伸引物SEQ ID NO：9、MTHFR的677位点延伸引物SEQ ID NO：10和MTRR的66位点延伸引物SEQ ID NO：11对上述纯化后的PCR产物进行单碱基延伸，并对延伸产物进行纯化；飞行质谱检测：将纯化后的延伸产物转移到质谱芯片上进行质谱检测。本发明技术方案实现了一个反应的多重检测，大大降低试剂成本和其他成本如人力、一次性耗材、实验室运营等，大大提高检测样本通量。

Description

一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法和试剂盒。
背景技术
叶酸是一种B族维生素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。人体本身不能合成叶酸，从食物中摄取的叶酸只有在叶酸还原酶的作用下还原为四氢叶酸，才能参与人体许多重要的生化代谢反应。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。
我国是出生缺陷高发国家，根据2012年原卫生部发布的数据显示，我国出生缺陷发生率在5.6％左右，每年新增出生缺陷数约90万例。这其中，开放性脊柱裂、脑脊膜膨出、唇裂和腭裂等，是我国常见的出生缺陷。而大量的研究已经证实：叶酸缺乏是导致此类新生儿出生缺陷的主要原因。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因：一是叶酸的摄入量不足，二是由于基因遗传缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下。
孕妇一般采用每天服用一粒叶酸片(400微克)的形式补充叶酸，对于叶酸利用能力正常的孕妇这个用量是充足的，但对于叶酸利用能力不足的孕妇却远远不够。那些叶酸利用能力不足的孕妇，其叶酸代谢途径相关酶的基因基因功能异常导致酶活性偏低，此类人群需要补充跟多量的叶酸。因此，叶酸增补应因人而异，要根据其对于叶酸利用能力来进行。卫生部于2009年6月发出了关于《增补叶酸预防神经管缺陷项目管理方案》的通知，加大了对叶酸增补用量的宣传和管理力度。
科学研究已证实了与叶酸代谢密切相关的两个基因：亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylene tetrahydrofolate reductase，即MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(Methyltetrahydrofolate-Homocysteine Methyltransferase Reductase或MethionineSynthase Reductase，即MTRR)。两个基因的3个多态性位点直接影响着叶酸的代谢：MTHFR的677位点和1298位点及MTRR的66位点。以MTHFR的677位点为例，其三种基因型CC/CT/TT在中国人群中的所占比例分别为22％、50％、28％。如果认为携带野生基因型MTHFR677CC的个体的MTHFR活性为100％，那么，携带MTHFR677CT的MTHFR活性为71％，而携带MTHFR677TT的MTHFR活性仅为34％。由此可见多态性位点的基因型对叶酸代谢的重要影响。
目前，常用的基因突变检测方法包括：单链构象多态性分析、PCR-限制性片段长度多态性、荧光定量PCR、变性高效液相色谱、直接测序等。这些方法或者检测能力有限，或者耗时费力，更重要的是，这些方法不能针对不同基因的多个突变位点同时进行高通量检测。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法，旨在对与叶酸代谢相关的3个位点同时进行检测，最终同时给出3个位点的基因分型结果。
为实现上述目的，本发明提出一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法，包括以下步骤：
扩增：使用PCR引物扩增样本DNA从而得到PCR产物，并对PCR产物进行纯化；所述PCR引物包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6核苷酸序列，其中，
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2核苷酸序列配对使用，
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4核苷酸序列配对使用，
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6核苷酸序列配对使用；
延伸：使用MTHFR的1298位点延伸引物SEQ ID NO：9、MTHFR的677位点延伸引物SEQID NO：10和MTRR的66位点延伸引物SEQ ID NO：11对上述纯化后的PCR产物进行单碱基延伸，并对延伸产物进行纯化；
飞行质谱检测：将纯化后的延伸产物转移到质谱芯片上进行质谱检测。
优选地，所述PCR引物还包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12；其中，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8核苷酸序列配对使用。
优选地，所述PCR扩增条件为：
93～95℃预变性2min；延伸42～45个循环，每个循环的条件为：93～95℃预变性30s，54～58℃退火20s～35s，70～75℃延伸55s～65s；再于70～75℃继续延伸4min～6min；随后4℃保藏。
优选地，所述延伸反应条件为：93～95℃预变性30Sec；38～42个循环，每个循环的条件为：93～95℃预变性5Sec，接下来进行五个循环(50℃～54℃退火4s至6s，78℃至82℃延伸4s至6s)；再于70～75℃继续延伸4min～6min；随后4℃保藏。
优选地，所述样本来自唾液或者口腔拭子。
优选地，对延伸产物进行纯化的步骤包括：
步骤一，树脂纯化：在每个反应孔中加入树脂，翻转摇匀；
步骤二，离心：将步骤一中的产品进行离心，以获得纯化后的产品。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物对。
优选地，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的引物。
优选地，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物对、及SEQ ID NO：12的引物。
优选地，所述试剂盒还包括用于DNA纯化或单碱基延伸的试剂。
本发明技术方案通过对每一个与叶酸代谢相关的位点设计两条PCR引物(正向和反向)，并在一个反应管中进行多重PCR扩增目的区域后，对其突变位点进行特异性的寡核苷酸引物单碱基延伸，含有突变位点信息的延伸产物经时间飞行质谱检测后直接报告出突变信息。整个过程只需普通PCR反应程序，所以简单易行；此实验是直接对核酸片断进行检测，无需同位素或荧光等信号扩增，所以灵敏精准。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一个反应中的三个叶酸位点与一个质控位点的峰图：
其中，横坐标为分子量道尔顿，纵坐标为信号强度。位点rs1801131的基因分型为纯合的AA，位点rs1801133的基因分型为杂合的CT，位点rs1801394的基因分型为杂合的AG，质控位点Control的基因分型为纯合的GG。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
与叶酸代谢密切相关的两个基因：MTHFR和MTRR。两个基因的3个多态性位点直接影响着叶酸的代谢：MTHFR的677位点和1298位点及MTRR的66位点。MTHFR的677位点有三种基因型：CC/CT/TT；MTHFR的1298位点有三种基因型：AA/AC/CC；MTRR的66位点有三种基因型：AA/AG/GG。
本发明可在一个反应管中对中国疾控中心妇幼保健中心提出的3个位点同时进行检测，最终给出3个位点的基因分型结果。这是一种高通量、高效能、低成本的叶酸代谢相关基因位点突变筛查方法，可实现临床快速检测和规模化筛查。
本发明的基因分型的方法，包括以下步骤：
PCR扩增：使用PCR引物扩增样本DNA从而得到PCR产物，并对PCR产物进行纯化；所述PCR引物包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6核苷酸序列，其中，
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2核苷酸序列配对使用，
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4核苷酸序列配对使用，
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6核苷酸序列配对使用；
延伸：使用MTHFR的1298位点延伸引物SEQ ID NO：9、MTHFR的677位点延伸引物SEQID NO：10和MTRR的66位点延伸引物SEQ ID NO：11对上述纯化后的PCR产物进行延伸，并对延伸产物进行纯化；
飞行质谱检测：将纯化后的延伸产物转移到质谱芯片上进行质谱检测。
首先，本发明需要采集用户的DNA，将采集的DNA提纯后，需要进行PCR扩增。
具体的，本发明提供的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6核苷酸序列如下表所示：
表1
PCR反应体系如表2所示：
表2
试剂名称 试剂浓度 体积(微升)
HPLC级纯水 1.2
PCR缓冲液 10x 0.5
MgCl2 25mM 0.4
dNTP混合物 25mM 0.1
PCR引物混合物 0.5uM 1.0
PCR酶 5U/ul 0.2
模板DNA 10ng/ul 1.0
PCR的反应最佳条件如下：
在上述扩增完成后，需要对PCR产物进行纯化。具体而言，通过SAP酶除去PCR扩增产物中的dNTP，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。SAP酶反应体系见表3，配好后，分别加2微升SAP反应液于上述PCR反应的孔板中。
表3
试剂名称 试剂浓度 体积(微升)
HPLC级纯水 1.53
SAP缓冲液 10x 0.17
SAP酶 1.7U/ul 0.30
在一较佳实施例中，为了证实本发明测定的准确性，在PCR引物中引入质控。对于质控的选定，需要选定没有多态性和拷贝变异的的位点。经仔细筛选，确定了一批常用的管家基因，又通过对序列数据库信息分析，排除多态性、重复性和拷贝数变异等因素，在每个管家基因上拟定了数十个备用的质控位点，在如此众多的指控位点中经过不断地进行设计尝试，选出最稳定而且对上述三个目标位点影响最小的指控位点加入已有的设计中，也即ATP5B。
参照表1，质控引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，对ATP5B的延伸引物为SEQ IDNO：12。
通过对MTHFR的677位点片段、MTRR的66位点片段、MTHFR的1298位点片段扩增完，并纯化后，需要通过基因位点特异性的延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基(ddNTP)，得到延伸产物。
具体操作如下：将4条延伸引物配成混合物后，按表4延伸反应体系。配好后，分别加2微升延伸反应液于上述表3反应的孔板中。
表4
试剂名称 试剂浓度 体积(微升)
HPLC级纯水 0.619
iPLEX缓冲液 10x 0.200
iPLEXddNTP混合物 5x 0.200
延伸引物混合物 5.5-10.0uM# 0.940
iPLEX延伸酶 220x 0.041
上述延伸反应最佳条件为：95℃预变性30Sec；40个循环，每个循环的条件为：94℃预变性5Sec，接下来进行五个循环(52℃退火4s至6s，80℃延伸4s至6s)；再于72℃继续延伸5min；随后4℃保藏。
对于样本的来源，可以是用户的血液，也可以是用户的唾液，还可以是来自通过棉签采集用户的口腔拭子。虽然血液中的核酸提取相对较弱容易，但是其采集过程较麻烦，而且还会给用户带来疼痛感。由于本发明的检测精准度极高，所以，即便样本来自用户的唾液(DNA含量较少)，最终对检测结果也不会产生影响。
上述延伸反应结束后，每个反应孔内加入16微升水和6mg树脂，翻转摇匀15分钟，以利于反应体系中的阳离子充分结合，达到脱盐纯化的目的。之后以4000rpm速度离心5分钟，可直接用于质谱检测。
参照图1，一个反应中的三个叶酸位点与一个质控位点的峰图：
其中，横坐标为分子量道尔顿，纵坐标为信号强度。位点rs1801131的基因分型为纯合的AA，位点rs1801133的基因分型为杂合的CT，位点rs1801394的基因分型为杂合的AG，质控位点Control的基因分型为纯合的GG。
为了验证本方法的准确性，以120个已知样本进行检测。下表所示为120个样本的基因分型结果。
表5
其中样本s017由于样本本身的问题没有任何结果，其余样本均成功。从整个数据来分析，如果包含失败样本的话，基因分型的成功率为99.17％；如果排除失败样本的话，基因分型的成功率为100％。由此可见，本方法的准确性极高。
除此之外，本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物对。利用该试剂盒可以有效地检测用户的叶酸代谢通路是否有障碍。另外，本发明的试剂盒中的上述6中核酸，可以是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5设置在相同的容器中，也可以是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别设置在相同容器中，还可以是上述六种引物都设置在同一容器中，还可以是每种引物单独置放于容器中，还可以是上述引物以任意组合的方式置放于容器中。
因为对MTHFR的1298位点、MTHFR的677位点和MTHFR的66位点的延伸引物可以有多种，但是考虑到引物的特异性，在此，上述试剂盒还可以包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的引物。
在测试过程中，为了避免测定误差，通常要增加质控样。在本发明中，上述试剂盒中还可以包括质控引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物对、及用于延伸质控样ATP5B位点的SEQ ID NO：12引物。
该试剂盒还包括用于DNA纯化或单碱基延伸的试剂。例如HPLC级纯水、iPLEX缓冲液、iPLEXddNTP混合物、iPLEX延伸酶、SAP缓冲液、SAP酶中的一种或其组合。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳中南医学检验实验室
<120> 一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法和试剂盒
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg tctacctgaa gagcaagtcc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg ccgagaggta aagaacgaag 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgttggatg gaaaagctgc gtgatgatg 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgttggatg acctgaagca cttgaaggag 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgttggatg ctatatgcta cacagcaggg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgttggatg gaaaatccat gtaccacagc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgttggatg caacaccagc aaacacagag 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgttggatg gctttttggt ggtgctggag 30
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gagctgacca gtgaag 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcgtgatgat gaaatcg 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgccatcgca gaagaaat 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acctccatga tcagtacagt 20

Claims (10)

1.一种与叶酸代谢相关的基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
扩增：使用PCR引物扩增样本DNA从而得到PCR产物，并对PCR产物进行纯化；所述PCR引物包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6核苷酸序列，其中，
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2核苷酸序列配对使用，
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4核苷酸序列配对使用，
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6核苷酸序列配对使用；
延伸：使用MTHFR的1298位点延伸引物SEQ ID NO：9、MTHFR的677位点延伸引物SEQ IDNO：10和MTRR的66位点延伸引物SEQ ID NO：11对上述纯化后的PCR产物进行延伸，并对延伸产物进行纯化；
飞行质谱检测：将纯化后的延伸产物转移到质谱芯片上进行质谱检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR引物还包括SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：12；其中，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8核苷酸序列配对使用。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述延伸反应条件为：
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本来自唾液或者口腔拭子。
6.如权利要求1的方法，其特征在于，对延伸产物进行纯化的步骤包括：
步骤一，树脂纯化：在每个反应孔中加入树脂，翻转摇匀；
步骤二，离心：将步骤一中的产品进行离心，以获得纯化后的产品。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物对。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQID NO：11的引物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物对、及SEQ ID NO：12的引物。
10.如权利要求7、8或9所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于DNA纯化或单碱基延伸的试剂。
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