CN111944912B - 一种肤质基因检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肤质基因检测方法，通过将35对肤质基因位点的引物对预混包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，降低成本的同时大大提高了检测通量和效率。通过二代测序解决了现有技术中存在的检测肤质基因位点时灵敏度低、操作复杂、成本高等问题。
Description
技术领域
本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种肤质基因检测方法。
背景技术
随着经济的发展和生活水平的提高，现代女性越来越注重皮肤的保养，不惜花费大量金钱在护肤保养方面，包括抗氧化产品、防晒产品等等。但是不同个体的自身肤质情况不同，盲目的使用护肤品可能达不到理想的效果。根据研究表明，不同个体的肤质差异高达60％的原因归咎于自身的遗传因素，即体内参与抗氧化、抗糖化、抵御紫外线等作用的酶的基因多态性不同。例如rs1050450这个位点的基因型为GG的个体的抗氧化能力高于基因型为AA的个体，这是因为基因型为GG的个体具有高GPx1活性，而GPx1是机体最主要的抗氧化系统之一的谷胱甘肽过氧化物酶家族(GSH-Px)中的成员，其广泛存在于机体内的各个组织，可以清除可溶性自由基和一些有机过氧化物，从而达到抗氧化、减缓皮肤衰老速度的作用。于是就可以据此检测结果针对基因型为AA的个体订制抗氧化能力高的护肤产品。因此，利用基因检测手段，明确个体的肤质基因位点的多态性，可以针对个体的基因特性，实现产品的私人订制，这不仅能够有效的改善肤质问题还能避免盲目的高消费。
目前针对基因多态性检测的技术很多，普遍使用的技术包括基于Tm值和溶解曲线的荧光定量PCR法和一代测序等等，这些技术有的操作繁琐，有的无法实现多位点的同时检测，使得目前在临床上对于多态性检测技术应用仍不理想，一直无法满足临床检测需求。随着高通量测序技术的发展，二代测序(NGS)越来越多的被应用基因检测项目，第二代测序技术以其可高效率地完成大量序列的检测，同时精度可以达到99.99％。二代测序技术在保证检测精度的同时还可以一次对成千上万个样本进行处理。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的检测肤质基因位点时灵敏度低、操作复杂、成本高等问题，提供一种肤质基因检测方法。本发明基于二代测序技术，具有高灵敏度、低成本、操作简单、通量高等特点，可以同时一次性检测35个相关基因位点。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
一种肤质基因检测方法，包括人类皮肤抗氧化相关基因位点：GPX1基因上的rs1050450位点、SOD2基因上的rs4880位点、NQO1基因上的rs1800566位点、NFE2L2基因上的rs35652124位点，美白祛斑相关基因位点：基因间区上的rs1015362位点、HERC2基因上的rs12913832位点、基因间区上的rs4911414位点、SLC45A2基因上的rs16891982位点，抗糖化相关基因位点：AGER基因上的rs1800624、rs1800625位点，皮肤保湿相关基因位点：基因间区上的rs11103631位点、AQP3基因上的rs17553719位点、ZNF100基因上的rs10412066位点、OR10K2基因上的rs12239443位点，抗痤疮相关基因位点：DDB2基因上的rs1060573、rs747650位点、SELL基因上的rs7531806位点、TGFB2基因上的rs1159268位点，紫外线抵御相关基因位点：MC1R基因上的rs11648785位点、SLC45A2基因上的rs35391位点，抵御妊娠纹相关基因位点：基因间区上的rs7787362位点、SRPX基因上的rs35318931位点，皮肤抗衰老相关基因位点：WTAPP1基因上的rs1799750位点、基因间区上的rs322458位点，皮肤抗疤痕相关基因位点：NEDD4基因上的rs8032158位点、基因间区上的rs873549位点、基因间区上的rs1511412位点，清除污染相关基因位点：GSTP1基因上的rs1695位点、EPHX1基因上的rs1051740位点，抗皱纹相关基因位点：APOBEC1基因上的rs73064632位点、MTMR2基因上的rs566204位点、KRT40基因上的rs75202326位点、DLGAP1基因上的rs11876749位点，抗敏抗炎相关基因位点：RTEL1基因上的rs6010620位点、TMEM232基因上的rs7701890位点中一个或多个样本肤质相关基因位点的检测。
进一步的，所述基因位点的扩增引物对序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.70所示。
进一步的，所述基因位点的扩增引物对中包含用于高通量测序的芯片接头序列，正向引物用于高通量测序的芯片接头序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAAGGCGA，反向引物用于高通量测序的芯片接头序列为CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACCGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC。
进一步的，所述扩增引物中同时包含用于序列分析时的index序列，一次拆分序列和二次拆分序列分别为TACCGAAT和TAAGGCGA。
进一步的，一种肤质基因检测方法，包括以下步骤：
1)取含有EDTA抗凝剂血液样本进行核酸提取；
2)预混35个所述基因位点对应的35对扩增引物；
3)将步骤1)得到的DNA和步骤2)预混好的引物混合液一起加入到多重PCR反应液里面，进行多重PCR扩增反应；
4)扩增产物利用产物纯化试剂盒进行纯化，完成测序文库制备；
5)将步骤4)制备完成的测序文库定量后进行高通量测序(NGS)；
6)测序结束后,利用生物信息统计法，根据每个位点的引物进行拆分，得到每个位点对应的片段的扩增序列总条数，再统计出野生型纯合/杂合/突变纯合序列条数占对应位点扩增序列总条数的百分比，通过计算出的百分比进行基因分型判读。
进一步的，所述步骤2)中35个基因位点扩增引物的摩尔比依次为：0.2～0.3:0.1～0.3:0.3～0.5:0.3～0.5:0.3～0.5:0.1～0.3:0.3～0.5:0.2～0.3:0.1～0.2:0.3～0.4:0.3～0.4:0.3～0.5:0.1～0.3:0.55～0.65:0.25～0.3:0.25～0.3:0.25～0.3:0.3～0.4:0.25～0.3:0.4～0.5:0.55～0.65:0.3～0.4:0.9～1.0:0.1～0.3:0.2～0.3:0.1～0.3:0.1～0.3:0.1～0.3:0.1～0.3:0.2～0.3:0.05～0.2:0.1～0.3:0.2～0.3:0.4～0.6:0.1～0.3。
进一步的，所述35个基因位点扩增引物的摩尔比依次为0.23：0.2：0.4：0.43：0.4：0.2：0.4：0.23：0.18：0.33：0.33：0.4：0.2：0.6：0.3：0.3：0.3：0.33：0.3：0.43：0.58：0.35：0.98：0.2：0.3：0.2：0.2：0.2：0.2：0.3：0.1：0.2：0.25：0.5：0.25。
进一步的，所述步骤3)中多重PCR扩增反应条件为：
预变性：94℃，1分钟；
35个扩增循环：变性：94℃，30秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，30秒；
延伸：72℃，5分钟。
进一步的，所述步骤3)中PCR反应液的配置为：Multiplex PCR Buffer，25μL；Multiplex PCR Enzyme Mix，0.35μL；Primer Mix，25μL；基因组DNA(模板)，150ng；灭菌去离子水。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明实现了对27种肤质相关基因的35个多态性位点进行检测，将35对肤质基因位点的引物对预混包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，降低成本的同时大大提高了检测通量和效率；
(2)本发明具有高灵敏度、低成本、操作简便、检测通量高等特点，可以快速精准的对个体的肤质基因多态性进行检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。
实施例1：检测试剂的制备
1、药物和检测基因靶点的选择
发明人通过分析NCBI数据库和医疗美容机构客户的肤质检测结果的个体差异，筛选出抗氧化等12种肤质相关的35个多态性位点，并制备出检测该35个多态性位点的引物组合物和使用该组合物的检测试剂，建立准确的检测方法用以精准测定个体的皮肤情况。12种肤质能力分别为抗氧化、美白祛斑、抗糖化、皮肤保湿、抗痤疮、紫外线抵御、抵御妊娠纹、皮肤抗衰老、皮肤抗疤痕、清除污染、抗皱纹、抗敏抗炎。35个多态性位点扩增引物对可用于特异性的检测样本中的rs1050450、rs4880、rs1800566、rs35652124、rs1015362、rs12913832、rs4911414、rs16891982、rs1800624、rs1800625、rs11103631、rs17553719、rs10412066、rs12239443、rs1060573、rs747650、rs7531806、rs1159268、rs11648785、rs35391、rs7787362、rs35318931、rs1799750、rs322458、rs8032158、rs873549、rs1511412、rs1695、rs1051740、rs73064632、rs566204、rs75202326、rs11876749、rs6010620、rs7701890等35个位点的基因多态性，肤质和基因关联分析及检测位点如表1：
表1药物和基因关联分析
2、检测靶点扩增引物设计
本发明利用NCBI公布的rs1050450、rs4880、rs1800566、rs35652124、rs1015362、rs12913832、rs4911414、rs16891982、rs1800624、rs1800625、rs11103631、rs17553719、rs10412066、rs12239443、rs1060573、rs747650、rs7531806、rs1159268、rs11648785、rs35391、rs7787362、rs35318931、rs1799750、rs322458、rs8032158、rs873549、rs1511412、rs1695、rs1051740、rs73064632、rs566204、rs75202326、rs11876749、rs6010620、rs7701890等35个基因位点序列信息，设计多重PCR扩增引物，本发明经过大量实验筛选，优选的扩增引物如表2：
表2 PCR扩增引物序列
上述扩增引物中包含用于高通量测序的芯片接头序列，分别为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAAGGCGA和CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACCGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC。
上述扩增引物中同时包含用于序列分析时的index序列，优选的一次拆分序列和二次拆分序列分别为TACCGAAT和TAAGGCGA。
3、测序文库构建
(1)本发明采用多重PCR一步法进行测序文库的制备。引物混合体系中的各引物对的用量如表3：
表3引物混合体系
(2)将待测样本的DNA和按表3预混好的引物混合液一起加入到多重PCR反应液里面，进行多重PCR扩增反应。本发明中多重PCR扩增反应采用TaKaRa生产的Multiplex PCRAssay Kit Ver.2试剂盒进行扩增。多重PCR反应液的配制如表4：
(3)本发明中PCR扩增条件为：
表4 PCR反应液
| 反应液组分 | 含量 |
| Multiplex PCR Buffer | 25μL |
| Multiplex PCR Enzyme Mix | 0.35μL |
| Primer Mix | 25μL |
| 基因组DNA(模板) | 150ng |
| 灭菌去离子水 | 加至55μL |
(4)扩增产物利用产物纯化试剂盒(本发明中使用MECKMAN COULTER的AgencourtAMPure XP 60mL kit试剂盒)进行纯化，完成测序文库制备。
4、高通量测序及结果分析
本发明专利中使用的检测平台为Iillumina公司生产CN500高通量测序仪，制备完成的测序文库定量后进行二代测序(NGS)；测序结束后,利用生物信息统计法，根据每个位点的引物进行拆分，得到每个位点对应的片段的扩增序列总条数，再统计出野生型纯合/杂合/突变纯合序列条数占对应位点扩增序列总条数的百分比，通过计算出的百分比进行基因分型判读。
实施例2：肤质基因检测
本实施例收集了2例患者外周血，分别编号为样本1和样本2，并采用一代测序进行对照验证结果的准确性。2例外周样本来自重庆市第九人民医院，均使用含有EDTA抗凝剂的釆血管采集血液标本5ml。样本室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。
1、样本处理
将样本利用商业化试剂盒进行核酸提取，本发明采用美基生物生产的HiPureBlood DNA Mini Kit(货号：D3111)，实验步骤参考说明书进行。在1.5ml离心管中，加入25μl Proteinase K，转移10-250μl抗凝血液至装有蛋白酶的离心管中。轻轻振荡混匀，加入250μl Buffer AL至样品中，颠倒3-5次混匀，最高速度涡旋30秒混匀，70℃水浴10分钟，其间涡旋混匀一次。加入250μl无水乙醇至样品中，涡旋30秒混匀，短暂离心收集管壁的液滴。把DNA柱装在新的收集管中，转移混合液至柱子中。10000×g离心1分钟，丢弃收集管和流出液。把DNA柱装在新的收集管中，加入500μl Buffer DW1至柱子上，颠倒混匀几次，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入650μl Buffer DW2(已用乙醇稀释)至柱子中，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。10000×g离心2分钟，可彻底去除柱子中残留的乙醇。将柱子转移至新的1.5ml离心管中。加入30-100μl预热至70℃ Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央，放置3分钟后，10000×g离心1分钟。再加入30-100μl预热至70℃ Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央，放置3分钟，10000×g离心1分钟，丢弃DNA结合柱，检测DNA液体的浓度，把DNA保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
2、PCR反应
反应体系配制按照实施例1中表4的PCR反应液配制反应体系，将2个样本提取的DNA加入配制好的反应体系中，加入的模板量约150ng，并按照实施例1中PCR扩增条件进行多重PCR扩增反应。
3、产物测序前纯化
本实验采用贝克曼的商业化试剂盒进行PCR产物测序前纯化，步骤如下：
1)将存放于4℃冰箱的磁珠置于室温回温5-10min；
2)将第二轮PCR产物瞬离(若壁上无残留则不需要此步骤)；
3)将瞬离后的PCR产物加入56uL磁珠，吹吸混匀15次，室温放置5min；
4)将PCR管放置于磁力架，2min后弃上清；
5)每管加250uL 80％乙醇，30s后弃上清；反复两次；
6)吸除管内剩余乙醇；室温静置10min，待磁珠晾干；
7)每管加50uL洗脱液，吹吸混匀15次，室温放置5min；
8)放置磁力架5min；收集30uL洗脱下来的液体于新的离心管中，检测浓度，并用洗脱液稀释至1-5ng/uL再上机测序。
4、测序结果
反应结束后下机数据用生物信息法统计结果并进行基因分型的结果判读。样本1和样本2采用本发明的检测方法与一代测序结构完全一致，检测结果见表5。
表5检测结果
表6样本1测序结果
表7样本2测序结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司
<120> 一种肤质基因检测方法
<160> 70
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 16
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttcct taagtgtact gtgtgtctg 89
<210> 17
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaagca gcaactgcca agca 84
<210> 18
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcacatc gaagctgctg tct 83
<210> 19
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaatct tactggcgga atga 84
<210> 20
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatccaaac atactcaatc ttagtcttg 89
<210> 21
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgacaga aggactattt actcagtga 89
<210> 22
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatccagac acagtgcctt gtt 83
<210> 23
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgagtga ccaagaaaat tgtaat 86
<210> 24
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctggct ccctggtttt tgt 83
<210> 25
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaagtt cttcccaaga ggct 84
<210> 26
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctttcc cacttttcaa ctgc 84
<210> 27
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgacaac aatacttcag tatatcttgg a 91
<210> 28
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatccatgt tatacttaga tgagga 86
<210> 29
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatgtg tgcccaatgc tatat 85
<210> 30
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgcat ttggcttcca a 81
<210> 31
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaagga gactgttgtc tgca 84
<210> 32
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcagcct tgtcatgatg ca 82
<210> 33
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaaggg aacaggagag a 81
<210> 34
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcaaaca tgagacccca gaaa 84
<210> 35
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatctc tttgtttgta agtctttgc 89
<210> 36
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcaaagg caactagaga aaagcatcat 90
<210> 37
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatttc ttgagacctg g 81
<210> 38
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcaac atccaaccag atca 84
<210> 39
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaacta atctctgagc ttcagtttct 90
<210> 40
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgaca tctgttacat tcctcat 87
<210> 41
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatgat tatctccata gtagttataa g 91
<210> 42
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctccta gaacaaaacc taccaagt 88
<210> 43
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgacgtg tgtgaacatg actgtaa 87
<210> 44
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcctgag acccaggctt gaa 83
<210> 45
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatatt ggaaaaaact agctt 85
<210> 46
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcctgcc tcctacattg tttatga 87
<210> 47
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatagg cctaggagca gaaga 85
<210> 48
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcctctc gctgtccgga gct 83
<210> 49
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatacc ctgaacatcc ccag 84
<210> 50
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcaggag gaagatttta gtgtgga 87
<210> 51
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaactg cccacagttc acagct 86
<210> 52
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcaggtt gggaagggct tg 82
<210> 53
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaacga gtaacgattt gggt 84
<210> 54
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcaatcc acccctggtg tc 82
<210> 55
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaagcc actagtccca taca 84
<210> 56
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcatagc cagtaaccca ctgc 84
<210> 57
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatgct gatccaagag gcga 84
<210> 58
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgatg atgagcgtgc agaa 84
<210> 59
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaataa gaggaaaaca cggagt 86
<210> 60
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcgagga gtcgattgga tgtt 84
<210> 61
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatgtc gcaggggt 78
<210> 62
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcgctgg aggcctgctc gct 83
<210> 63
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgatgtc atgccatgct tatcc 85
<210> 64
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgttg ctgaatccca ct 82
<210> 65
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgactct tcgcagtcac cct 83
<210> 66
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcagctt aggaatggag acacgt 86
<210> 67
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgacaca aatttaaaaa tgtcagtt 88
<210> 68
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcatgca gtgaccagaa ccaga 85
<210> 69
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60
aggcgaactt tcaaattcct gcttaccct 89
<210> 70
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
caagcagaag acggcatacg agattaccga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcaca gaagctaaat aatttgcca 89
Claims (8)
1.一种肤质基因检测方法，其特征在于，包括人类皮肤抗氧化相关基因位点：GPX1基因上的rs1050450位点、SOD2基因上的rs4880位点、NQO1基因上的rs1800566位点、NFE2L2基因上的rs35652124位点，美白祛斑相关基因位点：基因间区上的rs1015362位点、HERC2基因上的rs12913832位点、基因间区上的rs4911414位点、SLC45A2基因上的rs16891982位点，抗糖化相关基因位点：AGER基因上的rs1800624、rs1800625位点，皮肤保湿相关基因位点：基因间区上的rs11103631位点、AQP3基因上的rs17553719位点、ZNF100基因上的rs10412066位点、OR10K2基因上的rs12239443位点，抗痤疮相关基因位点：DDB2基因上的rs1060573、rs747650位点、SELL基因上的rs7531806位点、TGFB2基因上的rs1159268位点，紫外线抵御相关基因位点：MC1R基因上的rs11648785位点、SLC45A2基因上的rs35391位点，抵御妊娠纹相关基因位点：基因间区上的rs7787362位点、SRPX基因上的rs35318931位点，皮肤抗衰老相关基因位点：WTAPP1基因上的rs1799750位点、基因间区上的rs322458位点，皮肤抗疤痕相关基因位点：NEDD4基因上的rs8032158位点、基因间区上的rs873549位点、基因间区上的rs1511412位点，清除污染相关基因位点：GSTP1基因上的rs1695位点、EPHX1基因上的rs1051740位点，抗皱纹相关基因位点：APOBEC1基因上的rs73064632位点、MTMR2基因上的rs566204位点、KRT40基因上的rs75202326位点、DLGAP1基因上的rs11876749位点，抗敏抗炎相关基因位点：RTEL1基因上的rs6010620位点、TMEM232基因上的rs7701890位点所有基因位点的检测；
所述基因位点的扩增引物对序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.70所示。
2.如权利要求1所述一种肤质基因检测方法，其特征在于：所述基因位点的扩增引物对中包含用于高通量测序的芯片接头序列，正向引物用于高通量测序的芯片接头序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAAGGCGA，反向引物用于高通量测序的芯片接头序列为CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACCGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC。
3.如权利要求2所述一种肤质基因检测方法，其特征在于：所述扩增引物中同时包含用于序列分析时的index序列，一次拆分序列和二次拆分序列分别为TACCGAAT和TAAGGCGA。
4.如权利要求1所述一种肤质基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取含有EDTA抗凝剂血液样本进行核酸提取；
2)预混35个所述基因位点对应的35对扩增引物；
3)将步骤1)得到的DNA和步骤2)预混好的引物混合液一起加入到多重PCR反应液里面，进行多重PCR扩增反应；
4)扩增产物利用产物纯化试剂盒进行纯化，完成测序文库制备；
5)将步骤4)制备完成的测序文库定量后进行高通量测序(NGS)；
6)测序结束后,利用生物信息统计法，根据每个位点的引物进行拆分，得到每个位点对应的片段的扩增序列总条数，再统计出野生型纯合/杂合/突变纯合序列条数占对应位点扩增序列总条数的百分比，通过计算出的百分比进行基因分型判读。
5.如权利要求4所述一种肤质基因检测方法，其特征在于：所述步骤2)中35个基因位点扩增引物的摩尔比依次为：0.2～0.3:0.1～0.3:0.3～0.5:0.3～0.5:0.3～0.5:0.1～0.3:0.3～0.5:0.2～0.3:0.1～0.2:0.3～0.4:0.3～0.4:0.3～0.5:0.1～0.3:0.55～0.65:0.25～0.3:0.25～0.3:0.25～0.3:0.3～0.4:0.25～0.3:0.4～0.5:0.55～0.65:0.3～0.4:0.9～1.0:0.1～0.3:0.2～0.3:0.1～0.3:0.1～0.3:0.1～0.3:0.1～0.3:0.2～0.3:0.05～0.2:0.1～0.3:0.2～0.3:0.4～0.6:0.1～0.3。
6.如权利要求5所述一种肤质基因检测方法，其特征在于：所述35个基因位点扩增引物的摩尔比依次为0.23：0.2：0.4：0.43：0.4：0.2：0.4：0.23：0.18：0.33：0.33：0.4：0.2：0.6：0.3：0.3：0.3：0.33：0.3：0.43：0.58：0.35：0.98：0.2：0.3：0.2：0.2：0.2：0.2：0.3：0.1：0.2：0.25：0.5：0.25。
7.如权利要求6所述一种肤质基因检测方法，其特征在于：所述步骤3)中多重PCR扩增反应条件为：
预变性：94℃，1分钟；
35个扩增循环：变性：94℃，30秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，30秒；
延伸：72℃，5分钟。
8.如权利要求7所述一种肤质基因检测方法，其特征在于：所述步骤3)中PCR反应液的配置为：Multiplex PCR Buffer，25μL；Multiplex PCR Enzyme Mix，0.35μL；Primer Mix，25μL；基因组DNA模板，150ng；灭菌去离子水。
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| CN108251521A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-07-06 | 北京天平永达科技发展有限公司 | 用于检测与皮肤衰老相关易感基因snp的成套引物及其应用 |
| CN110904207A (zh) * | 2019-06-14 | 2020-03-24 | 陕西九州医学检验有限公司 | 一种与皮肤老化表征相关的易感基因检测panel及其应用 |
| CN111455035A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-07-28 | 广州市普森生物科技有限公司 | 皮肤抗衰能力基因检测引物组合、试剂盒及其应用 |
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2020
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