CN111455035A - 皮肤抗衰能力基因检测引物组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因分型技术领域，具体涉及一种皮肤抗衰能力基因检测引物组合、试剂盒及其应用。每个SNP位点分别设计一对多重PCR扩增引物和一个单碱基延伸引物，全部位点被设计到一个反应中，可同时检测。该多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组用于MassARRAY核酸质谱分析系统检测，该系统可用于高灵敏度和高精确度地快速分析核酸样本，检测准确率≥99.9％。本发明建立了一种高效检测皮肤抗衰能力基因的SNP分型方法，可以在同一时间完成多个SNP位点的分子生物学基因分型，检测灵敏度好、准确率高、成本低、实用性强，可用于检测影响皮肤抗衰能力的遗传因素，进行皮肤抗衰能力的综合评价，有助于推动美容行业个体化服务的发展。
Description
技术领域
本发明涉及基因分型技术领域，具体涉及一种皮肤抗衰能力基因检测引物组合、试剂盒及其应用。
背景技术
现阶段人们对皮肤护理的需求已经达到了一个前所未有的高度，皮肤护理上的花费也越来越多，其中抗衰占护肤需求的比重也逐渐增长。全面的抗衰护理已经成为了皮肤护理的重要组成部分。根据调查研究，中国人群抗衰护肤品的份额已经达到了23％，已成为护肤第一大品类。美白、祛斑、保湿、抗衰等需求中，抗衰的提及率已高达83％，而调研结果显示女性最关心、最热门的美容护肤服务和产品中，抗衰被提及率高达72.2％，位居第一位，抗衰已经成为消费者最关心的护肤目的之一。抗衰产品品类也逐步扩展到消费者关心的脸部、眼部、颈部及全身各处。
抗胶原蛋白流失、抗氧化和抗糖化作为抗衰护理的组成部分，也逐渐引起人们的重视。胶原蛋白是真皮层中高含量的蛋白质，可在皮肤形成细密的弹力网，从而牢牢锁住水分。随着年龄增长，开始表现皱纹、下垂，衰老加速。而抗氧化就是对抗自由基，减缓皮肤的衰老进程。自由基有强氧化性，当人体中的自由基过多时，就会过度氧化，加速衰老进程，表现为胶原蛋白流失加速、皱纹加重。糖化是当人体摄入过多的糖类时，多余的糖分会依附于皮肤层的胶原蛋白，使胶原蛋白纤维脆弱易断，对皮肤造成不可逆的伤害，导致胶原纤维损坏加快，皮肤过早衰老，泛黄松弛、毛孔粗大，痤疮严重。
由于人类遗传信息存在差异从而造成了皮肤表型状态的差异，而不同环境对皮肤的影响也起到了关键作用，内在遗传因素和外在环境因素共同决定皮肤状态，影响衰老进程。通过检测皮肤抗衰能力基因有助于提早获知自身遗传信息，有助于选择合适的护肤方案和护肤品进行针对性干预，可更好的减缓衰老进程，延缓皱纹、色斑的出现和进展。然而正是由于人类遗传信息的差异所造成的皮肤表型差异，相同护肤方案或护肤品使用效果在不同人身上有巨大差异，使用不当也可能造成不良效果。如某人抗胶原蛋白分解能力强，那么使用含过量胶原蛋白功效成分护肤品对于这个人，非但不能较好的补充胶原蛋白，还可能堵塞毛孔。另外一个方面，如果某人抗胶原蛋白分解能力较弱，那么这个人必须比同龄人更早或更多的补充胶原蛋白，否则皱纹、暗沉、松弛等问题会比同龄人更早出现。所以，使用同一种护肤品，不同人的使用效果具有很大的不同，错误使用不适合自己皮肤的护肤品就会增加皮肤的伤害，严重的可能会导致皮肤疾病。
人类遗传学、分子生物学、基因组学和生物信息学的研究进展已充分说明皮肤抗衰能力由单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)影响，专利(201611163909.4)公开了一种检测皮肤抗衰老能力的引物组合物，胶原蛋白增生能力基因COL1A1、肌肤锁水保湿能力基因AQP3、辐射保护能力基因ASIP、紫外线损伤修复能力基因ERCC2和LOC105374069、皮肤排毒能力基因GSTP1、肌肤敏感性基因IL6R和雌激素水平基因DIAPH2，共8个基因8个位点。该专利选择的检测方面不完全符合抗衰基因检测目的，包含其他检测方面，且检测位点无法覆盖检测需求。专利(201811630156.2)公开了一种检测抗衰老能力的方法和试剂盒，通过检测3个与抗衰相关的位点，检测皮肤抗衰老能力，采用荧光定量PCR测定，该方法虽然操作简单，但无法实现较大量SNP位点同时检测的实际需要，时间花费较长，检测范围小。
因此，提供高灵敏度和高精确度的皮肤抗衰能力基因检测引物组合、试剂盒及其应用具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种皮肤抗衰能力基因检测引物组合及其应用。本发明利用MassARRAY核酸质谱分析系统对皮肤抗衰能力基因的SNP位点进行分子生物学基因分型，根据基因分型结果对个体的皮肤抗衰能力进行综合评价，以期用于精准护肤管理。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测皮肤抗衰能力的引物组合，包括检测抗胶原蛋白分解能力的引物组、检测抗氧化能力的引物组和/或检测抗糖化能力的引物组；
(1)、所述检测抗胶原蛋白分解能力的引物组包括检测抗胶原蛋白分解能力的多重PCR扩增引物组和检测抗胶原蛋白分解能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗胶原蛋白分解能力的多重PCR扩增引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(I)、具有SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12、13～14、15～16、17～18任一组所示的核苷酸序列；
(II)、具有SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12、13～14、15～16、17～18所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(III)、与SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12、13～14、15～16、17～18所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(IV)、如(I)、(II)或(III)所示序列的互补序列；
所述检测抗胶原蛋白分解能力的单碱基延伸引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(V)、具有SEQ ID No.43～51任一项所示的核苷酸序列；
(VI)、具有SEQ ID No.43～51所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(VII)、与SEQ ID No.43～51所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(VIII)、如(V)、(VI)或(VII)所示序列的互补序列；
(2)、所述检测抗氧化能力的引物组包括检测抗氧化能力的多重PCR扩增引物组和检测抗氧化能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗氧化能力的多重PCR扩增引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(IX)、具有SEQ ID No.19～20、21～22、23～24、25～26、27～28、29～30、31～32任一组所示的核苷酸序列；
(X)、具有SEQ ID No.19～20、21～22、23～24、25～26、27～28、29～30、31～32任一组所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XI)、与SEQ ID No.19～20、21～22、23～24、25～26、27～28、29～30、31～32任一组所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XII)、如(IX)、(X)或(XI)所示序列的互补序列；
所述检测抗氧化能力的单碱基延伸引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(XIII)、具有SEQ ID No.52～58任一项所示的核苷酸序列；
(XIV)、具有SEQ ID No.52～58任一项所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XV)、与SEQ ID No.52～58任一项所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XVI)、如(XIII)、(XIV)或(XV)所示序列的互补序列；
(3)、所述检测抗糖化能力的引物组包括检测抗糖化能力的多重PCR扩增引物组和检测抗糖化能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗糖化能力的多重PCR扩增引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(XVII)、具有SEQ ID No.33～34、35～36、37～38、39～40、41～42任一组所示的核苷酸序列；
(XVIII)、具有SEQ ID No.33～34、35～36、37～38、39～40、41～42任一组所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XIX)、与SEQ ID No.33～34、35～36、37～38、39～40、41～42任一组所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XX)、如(XVII)、(XVIII)或(XIX)所示序列的互补序列；
所述检测抗糖化能力的单碱基延伸引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(XXI)、具有SEQ ID No.59～63任一项所示的核苷酸序列；
(XXII)、具有SEQ ID No.59～63任一项所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XXIII)、与SEQ ID No.59～63任一项所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XXIV)、如(XXI)、(XXII)或(XXIII)所示序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合中所述检测抗胶原蛋白分解能力的多重PCR扩增引物组、所述检测抗胶原蛋白分解能力的单碱基延伸引物组、所述检测抗氧化能力的多重PCR扩增引物组、所述检测抗氧化能力的单碱基延伸引物组、所述检测抗糖化能力的多重PCR扩增引物组与所述检测抗糖化能力的单碱基延伸引物组的摩尔比为(6.5～7.4)：(17～29.9)：(6.6～7.1)：(18.5～32)：(6.5～6.7)：(18.5～38.6)。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物组合在制备检测皮肤抗胶原蛋白分解能力、抗氧化能力和/或抗糖化能力的试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明还提供了所述的引物组合在制备检测皮肤抗衰能力的试剂和/或试剂盒中的应用。
此外，本发明还提供了检测试剂，包括所述的引物组合。
本发明还提供了试剂盒，包括所述的引物组合或所述的检测试剂。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物组合、所述的检测试剂或所述的试剂盒在检测皮肤抗衰基因或皮肤抗衰能力中的应用。
本发明还提供了皮肤抗衰基因的检测方法，包括如下步骤：
步骤1、获得待测样品的核酸；
步骤2、以步骤1提取的核酸为模板，分别采用所述的引物组合中的引物进行多重PCR扩增和单碱基延伸，对SNP位点进行基因分型；
步骤3、根据所述基因分型的结果获得检测结果。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述根据所述基因分型的结果获得检测结果为：
在本发明的一些具体实施方案中，所述根据所述基因分型的结果获得检测结果的标准为：SNP位点基因型对表型的影响为“强”的计1分，“一般”的计0分，“弱”的计-1分，各SNP位点得分相加得到最终得分；并根据最终得分判断抗胶原蛋白分解能力、抗氧化能力和/或抗糖化能力：
最终得分≥1：“强”；
最终得分＝0：“一般”；
最终得分≤-1：“弱”。
本发明运用MassARRAY核酸质谱分析系统进行皮肤抗衰能力基因的SNP分型检测，该检测结合多重PCR技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)进行分型检测。通过对包含SNP位点的DNA片段进行PCR扩增，再利用特异性延伸引物进行单碱基延伸反应进行。由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现。该检测具有灵敏度高、时间灵活、出错概率低、成本低、避免交叉污染的优势。通过检测分子量来分辨碱基差异，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，准确率高。可同时检测17个基因的21个SNP位点，且位点涵盖与皮肤抗衰能力直接相关的抗胶原蛋白分解能力、抗氧化能力、抗糖化能力，检测内容为目前最全面。通过皮肤抗衰能力基因检测，用以综合评价皮肤先天的抗衰能力，从而为外部护肤方案提供科学依据，可以更加有效的减缓皮肤衰老，保持年轻活力。由此，更具针对性的皮肤抗衰能力基因检测能够帮助人们更好的了解自身遗传因素，更深层次了解皮肤问题的根源，为实现皮肤抗衰提供科学的指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)实验流程图；
图2示MassARRAY核酸质谱分析系统21个位点结果峰图；
图3示rs2070600位点UCSC Genome Bioinformatics验证图；
图4示rs1799750位点MassARRAY核酸质谱分析系统结果峰图；
图5示rs1799750位点MassARRAY核酸质谱分析系统结果散点图；
图6示实施例4中样本1受检者脸部照片；
图7示实施例4中样本2受检者脸部照片；
图8示实施例3中已进行检测的30个口腔拭子样本17个皮肤抗衰基因的21个SNP位点的检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种皮肤抗衰能力基因检测引物组合、试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供一种皮肤抗衰能力基因检测引物组合及其应用，包括人基因组DNA的17个皮肤抗衰能力基因的21个SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组。
进一步的，所述的人基因组DNA的17个皮肤抗衰能力基因为基质金属蛋白酶1(Matrix Metallopeptidase 1,MMP1)基因、载脂蛋白A5(Apolipoprotein A5,APOA5)基因、合成素结合蛋白5类似物(Syntaxin Binding Protein 5like,STXBP5L)基因、白细胞介素6(Interleukin 6,IL6)基因、载脂蛋白B-mRNA编辑酶复合物1(Apolipoprotein B mRNAediting Enzyme,Catalytic Polypeptide 1,APOBEC1)基因、WD重复域88(WD RepeatDomain 88,WDR88)基因、角蛋白40(Recombinant Keratin 40,KRT40)基因、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38(Serine/threonine Kinase 38,STK38)基因、肽基脯氨酰异构酶E(Peptidylprolyl Isomerase E,PPIE)基因；抗氧化能力基因包括过氧化氢酶(Catalase,CAT)基因、谷胱甘肽过氧化物酶1(Glutathione Peroxidase 1,GPX1)基因、醌氧化还原酶1(NAD(P)H Dehydrogenase Quinone 1,NQO1)基因、核因子红细胞2相关因子2(NuclearFactor Erythroid 2-related Factor 2,NFE2L2)基因、超氧化物歧化酶2(SuperoxideDismutase 2,SOD2)基因、超氧化物歧化酶1(Superoxide Dismutase 1,SOD1)基因；抗糖化能力基因包括晚期糖化终末产物受体(Receptor for Advanced Glycation EndProducts,AGER)基因、乙二醛酶1(Glyoxalase 1,GLO1)基因(表1)。
进一步的，所述的17个皮肤抗衰能力基因的21个SNP位点为rs1799750、rs662799、rs322458、rs1800795、rs73064632、rs10422125、rs75202326、rs659726、rs12094291、rs1001179、rs1050450、rs1800566、rs2917666、rs35652124、rs4880、rs2234694、rs184003、rs1800625、rs2070600、rs1049346、rs1130534(表1)。
进一步的，所述多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组检测皮肤抗衰能力包括检测抗胶原蛋白分解能力、抗氧化能力和抗糖化能力。
表1基因SNP位点
进一步的，所述检测抗胶原蛋白分解能力包括检测抗胶原蛋白分解能力基因SNP位点的多重PCR扩增引物组包含引物Y1～Y18，所述多重PCR扩增引物组的序列如SEQ IDNo.1～18所示，包括MMP1基因rs1799750位点上游引物Y1和下游引物Y2，序列信息如SEQ IDNo.1～2所示；包括APOA5基因rs662799位点上游引物Y3和下游引物Y4，序列信息如SEQ IDNo.3～4所示；包括STXBP5L基因rs322458位点上游引物Y5和下游引物Y6，序列信息如SEQID No.5～6所示；包括IL6基因rs1800795位点上游引物Y7和下游引物Y8，序列信息如SEQID No.7～8所示；包括APOBEC1基因rs73064632位点上游引物Y9和下游引物Y10，序列信息如SEQ ID No.9～10所示；包括WDR88基因rs10422125位点上游引物Y11和下游引物Y12，序列信息如SEQ ID No.11～12所示；包括KRT40基因rs75202326位点上游引物Y13和下游引物Y14，序列信息如SEQ ID No.13～14所示；包括STK38基因rs659726位点上游引物Y15和下游引物Y16，序列信息如SEQ ID No.15～16所示；包括PPIE基因rs12094291位点上游引物Y17和下游引物Y18，序列信息如SEQ ID No.17～18所示。
所述单碱基延伸引物组T1～T9，所述单碱基延伸引物组的序列如SEQ ID No.43～51所示，包括MMP1基因rs1799750位点单碱基延伸引物T1，序列信息如SEQ ID No.43所示；包括APOA5基因rs662799位点单碱基延伸引物T2，序列信息如SEQ ID No.44所示；包括STXBP5L基因rs322458位点单碱基延伸引物T3，序列信息如SEQ ID No.45所示；包括IL6基因rs1800795位点单碱基延伸引物T4，序列信息如SEQ ID No.46所示；包括APOBEC1基因rs73064632位点单碱基延伸引物T5，序列信息如SEQ ID No.47所示；包括WDR88基因rs10422125位点单碱基延伸引物T6，序列信息如SEQ ID No.48所示；包括KRT40基因rs75202326位点单碱基延伸引物T7，序列信息如SEQ ID No.49所示；包括STK38基因rs659726位点单碱基延伸引物T8，序列信息如SEQ ID No.50所示；包括PPIE基因rs12094291位点单碱基延伸引物T9，序列信息如SEQ ID No.51所示。
所述检测抗氧化能力包括检测抗氧化能力基因SNP位点的多重PCR扩增引物组Y19～Y32，所述多重PCR扩增引物组的序列如SEQ ID No.19～32所示，包括CAT基因rs1001179位点上游引物Y19和下游引物Y20，序列信息如SEQ ID No.19～20所示；包括GPX1基因rs1050450位点上游引物Y21和下游引物Y22，序列信息如SEQ ID No.21～22所示；包括NQO1基因rs1800566位点上游引物Y23和下游引物Y24，序列信息如SEQ ID No.23～24所示；包括NQO1基因rs2917666位点上游引物Y25和下游引物Y26，序列信息如SEQ ID No.25～26所示；包括NFE2L2基因rs35652124位点上游引物Y27和下游引物Y28，序列信息如SEQ ID No.27～28所示；包括SOD2基因rs4880位点上游引物Y29和下游引物Y30，序列信息如SEQ ID No.29～30所示；包括SOD1基因rs2234694位点上游引物Y31和下游引物Y32，序列信息如SEQ IDNo.31～32所示。
所述单碱基延伸引物组T10～T16，所述单碱基延伸引物组的序列如SEQ ID No.52～58所示，包括CAT基因rs1001179位点T10，序列信息如SEQ ID No.52所示；包括GPX1基因rs1050450位点T11，序列信息如SEQ ID No.53所示；包括NQO1基因rs1800566位点T12，序列信息如SEQ ID No.54所示；包括NQO1基因rs2917666位点T13，序列信息如SEQ ID No.55所示；包括NFE2L2基因rs35652124位点T14，序列信息如SEQ ID No.56所示；包括SOD2基因rs4880位点T15，序列信息如SEQ ID No.57所示；包括SOD1基因rs2234694位点T16，序列信息如SEQ ID No.58所示。
所述检测抗糖化能力包括检测抗糖化能力基因SNP位点的多重PCR扩增引物组Y33～Y42，所述多重PCR扩增引物组的序列如SEQ ID No.33～42所示，包括AGER基因rs184003位点上游引物Y33和下游引物Y34，序列信息如SEQ ID No.33～34所示；包括AGER基因rs1800625位点上游引物Y35和下游引物Y36，序列信息如SEQ ID No.35～36所示；包括AGER基因rs2070600位点上游引物Y37和下游引物Y38，序列信息如SEQ ID No.37～38所示；包括GLO1基因rs1049346位点上游引物Y39和下游引物Y40，序列信息如SEQ ID No.39～40所示；包括GLO1基因rs1130534位点上游引物Y41和下游引物42，序列信息如SEQ ID No.41～42所示。
所述单碱基延伸引物组T17～T21，所述单碱基延伸引物组的序列如SEQ ID No.59～63所示，包括AGER基因rs184003位点单碱基延伸引物T17，序列信息如SEQ ID No.59所示；包括AGER基因rs1800625位点单碱基延伸引物T18，序列信息如SEQ ID No.60所示；包括AGER基因rs2070600位点单碱基延伸引物T19，序列信息如SEQ ID No.61所示；包括GLO1基因rs1049346位点单碱基延伸引物T20，序列信息如SEQ ID No.62所示；包括GLO1基因rs1130534位点单碱基延伸引物T21，序列信息如SEQ ID No.63所示。
本发明运用MassARRAY核酸质谱分析系统进行皮肤抗衰能力基因的SNP分型检测，具有灵敏度高、时间灵活、出错概率低、成本低、避免交叉污染的优势，能够在同一时间内检测多个SNP位点，可迅速读取遗传信息，更适合批量化和低成本的检测服务。近年来基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)也逐渐成为业内研究的热点，成为技术的发展趋势。相关技术人员可通过此种技术的使用方法设计本发明所述多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组用于皮肤抗衰能力基因的检测服务。
本发明通过对皮肤抗衰能力基因的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组进行特异性设计，同时对17个基因的21个SNP位点进行检测，成本低、准确度高、时间短，可检测与皮肤抗衰能力直接相关的抗胶原蛋白分解能力、抗氧化能力和抗糖化能力的遗传信息，根据分子生物学基因分型结果对个体的皮肤抗衰能力进行综合评价，以期用于精准护肤管理。本发明公布的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组组合是目前为止检测效果最好、检测项目最全的皮肤抗衰能力基因检测多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组组合。
本发明提供的皮肤抗衰能力基因检测引物组合及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
步骤1：合成所需SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组。
步骤2：提取人口腔拭子样本DNA，进行PCR扩增。
步骤3：采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)进行样本DNA检测，确定样本SNP位点基因型。
步骤4：依据SNP位点基因型检测结果，综合评价皮肤抗衰能力的遗传信息，给出结果解读。
表2多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物序列
实施例2
为验证本发明的用于检测皮肤抗衰能力基因SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组设计的准确性和实用性，本实施例采集了30个口腔拭子样本进行检测，具体内容如下：
1、引物设计：
根据SNP位点序列信息，利用Agena公司设计软件Assay Design Suite V2.0设计待测SNP位点的多重PCR扩增引物及单碱基延伸引物，将17个基因的21个SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组设计到一个反应(WELL)中，并用UCSC GenomeBioinformatics进行验证。
设计软件引物组合质量值结果显示本发明公布的引物组合质量良好(表3)。
经在线软件及UCSC Genome Bioinformatics进行验证，本发明公布的引物组合扩增片段满足唯一或者每条扩增序列包含检测位点的要求，特异性良好(图3)。
多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表3引物组合质量值
2、样本采集：
选取30个口腔拭子样本进行DNA提取，并记录受检者年龄、性别、皮肤状态等信息(表5)，其中皮肤状态评价方法为：对30个口腔拭子样本对应的受试者进行脸部拍照，由10名皮肤检测技术人员对照片皮肤衰老状态按项目进行打分，分值1～9分。项目得分相加取平均值，然后取10名技术人员分数的分均值，结果取整数，最终确定该受检者皮肤状态评分，分数越高皮肤状态越好。
表4皮肤状态评分标准
表5样本采集信息
3、口腔拭子DNA提取：
利用美基基因的核酸提取纯化试剂盒进行口腔拭子DNA提取，按说明书在BufferBW1中加入一定量的无水乙醇。把口腔拭子采集头剪下放入2mL的EP管中，加入400mLBuffer ATL和20μL的Proteinase K，转移拭子至2mL离心管中，去除一部分拭子柄。55℃振荡温育15～30分钟。加入25μL Magpure和600μL Buffer GXP2至离心管中。转移250～300μL上清液至装有磁珠/GXP2的离心管中，颠倒混匀15～30次，室温放置5～8分钟，其间颠倒混匀数次。转移至磁力架上吸附2分钟，吸弃或倒弃溶液。加入500μL Buffer BW1，涡旋混匀15秒打散磁珠。转移至磁力架上吸附1分钟，吸弃或倒弃溶液。加入700μL 75％乙醇，涡旋混匀15秒打散磁珠。转移至磁力架上吸附1分钟，吸弃或倒弃溶液。加入700μL 75％乙醇，涡旋混匀15秒打散磁珠。转移至磁力架上吸附1分钟，吸弃或倒弃溶液。短暂离心，吸尽残液，空气干燥10～15分钟去除乙醇。加入30～100μL Elution Buffer至离心管中，55℃振荡温育5～10分钟。转移至磁力架上吸附3～5分钟，把DNA转移至新的离心管中，用超微量分光光度计对DNA溶液进行质检，质检合格的DNA取体积30μL，转移至上样用384孔板中于-20℃储存备用。
基因组DNA质检标准为DNA总量≥0.5μg，浓度≥15ng/μL，纯度OD260/280 1.7～2.1，无蛋白、RNA污染，完整性达到条带清晰，分子量大于10Kb，无明显降解。
表6样本DNA质检结果
4、PCR扩增反应：
采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积5μL。
A.在一个新的1.5ml EP管中配制PCR反应体系溶液，反应体系采用384孔板，设置38％的试剂损耗。
表7 PCR反应体系溶液
A.使用多通道加样器，调节加样体积为4μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCR反应体系溶液。该384孔板即为PCR反应板。
B.取出已经制备好的DNA样本384孔板，使用多通道加样器，调节加样体积为1μL，这样每个5μL的PCR反应体系中包含模板DNA20～50ng，Hotstar Taq 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs。
C.在PCR仪上设定如下反应条件进行PCR扩增。
表8 PCR扩增反应循环参数
5、PCR扩增产物碱性磷酸酶处理
B.在PCR反应结束后，将PCR扩增产物使用SAP(shrimpalkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
C.配制碱性磷酸酶处理反应SAP Mix体系溶液，反应体系采用384孔板，设置38％的试剂损耗。
表9 SAP Mix体系溶液
D.使用多通道加样器，调节加样体积为2μL，将SAP Mix加入384孔板。
对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μL，其中PCR产物5μL，SAP混合液2μL。
E.将384孔板放置在PCR仪上，设定如下反应条件进行碱性磷酸酶处理。
表10碱性磷酸酶处理循环参数
6、单碱基延伸反应
A.在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μL。
B.配制单碱基延伸反应液EXTEND Mix体系溶液，反应体系采用384孔板，设置38％的试剂损耗。
表11 EXTEND Mix体系溶液
C.使用多通道加样器，调节加样体积为2μL，将EXTEND Mix对应加入384孔板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μL及EXTEND Mix液2μL(其中各延伸反应引物混合物0.94μL，iPLEX enzyme 0.041μL，延伸混合物0.2μL)。
D.将384孔板放置在PCR仪上，设定如下PCR反应条件进行单碱基延伸反应。
表12单碱基延伸反应循环参数
7、树脂纯化
将反应产物(共9μl)稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
A.将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中。
B.加16μL水到延伸产物的对应孔内。
C.将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触。
D.离心使树脂沉入孔底部。
8、芯片点样：
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
9、质谱检测：
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MassARRAY Analyzer System分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
实施例3
运用本发明设计的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组与普通多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组(表13)分别检测口腔拭子DNA样本，样本提取和检测的具体实施方法和步骤如上述实施例1和实施例2，结果数据如表14。
表13普通多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物序列
本对比实验检测结果数据显示本发明设计的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组比普通多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组更适用于皮肤抗衰能力基因SNP位点检测(表14)。本发明设计的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组的阳性检出率为≥97％，远超过普通多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组，实现了实验目的。
表14本发明与普通引物组合检测结果数据对比
实施例4
针对实施例3中已进行检测的30个口腔拭子样本17个皮肤抗衰基因的21个SNP位点的检测结果进行统计(表15、图8)，并依据检测结果解读标准(表16)进行SNP位点分子生物学基因分型结果解读(表17，18)，综合评价受检者皮肤抗衰能力的遗传信息，用于指导精准护肤管理。
表15 SNP位点检测结果
表15、图8显示，本发明用于检测皮肤抗衰能力的17个基因的21个SNP位点分子生物学基因分型结果均能通过本发明公布的检测方法获得。检测结果纯合基因型为相同字母重复，如“AA”；两个不同字母，如“AG”，表示杂合基因型“AG”或“GA”，“D”表示该单个碱基为“del”(删除)，“--”表示未检出。
表16检测结果解读标准
综合评价结果确定方法为：SNP位点基因型对表型的影响为“强”的计1分，“一般”的计0分，“弱”的计-1分，各SNP位点得分相加得到最终得分。并根据最终得分判断各项目能力“强”(最终得分≥1)、“一般”(最终得分＝0)、“弱”(最终得分≤-1)。
最终结论总体抗衰能力评定方法为：根据各项目能力“强”、“一般”和“弱”评级，通过“强+强＝强，强+一般＝强，强+弱＝一般，一般+一般＝一般，一般+弱＝弱，弱+弱＝弱”确定，其中“强+一般＝强”与“一般+强＝强”结果一致。
通过本发明公布的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组检测皮肤抗衰能力，最终得到样本1的皮肤抗衰能力综合评价结果(表17)。结果表明，该样本皮肤抗胶原蛋白分解能力一般，胶原蛋白易流失，皮肤易松弛、产生皱纹，需要及时补充胶原蛋白；抗氧化能力强，皮肤细胞不易受到氧化损伤，不易出现粗糙、暗沉等现象，衰老减缓；抗糖化能力一般，较高风险出现皮肤失去光泽、肌理不匀等问题。通过观察，样本1实际面部状态与检测结果相符，呈现少量皱纹和皮肤暗黄等衰老现象。最终结论为样本1的皮肤总体抗衰能力强，但也应注意进行日常护肤保养，做好防晒，缓解胶原蛋白流失带来的皮肤状态失衡问题，进行必要的辅助护肤方法来达到延缓皮肤衰老的目的。
表17样本1检测结果统计和解读
通过本发明公布的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组检测皮肤抗衰能力，最终得到样本2的皮肤抗衰能力综合评价结果(表18)。结果表明，该样本皮肤抗胶原蛋白分解能力强，胶原蛋白含量充足，皮肤紧致、有弹性，较少出现皱纹、松弛；抗氧化能力弱，皮肤细胞极易受到氧化损伤，出现粗糙、暗沉等现象，衰老加速；抗糖化能力弱，极高风险皮肤出现暗沉发黄、变薄粗糙、纹理不匀等衰老问题。通过观察，样本2实际面部状态与检测结果相符，现已出现皮肤暗黄、色斑、粉刺、皱纹等衰老现象。最终结论为样本2的皮肤总体抗衰能力弱，应减少糖分摄入，重点注意做好皮肤抗氧化、抗糖化养护，提高皮肤屏障功能。
表18样本2检测结果统计和解读
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州市普森生物科技有限公司
<120> 皮肤抗衰能力基因检测引物组合、试剂盒及其应用
<130> MP1911908
<160> 126
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
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<400> 62
ccccttctgc catggctgc 19
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
acaggcaaac ttaccgaa 18
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
acgttggatg gttatgccac ttagatgagg 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg ctgcgtcaag actgatatct 30
<210> 66
<211> 26
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tggattgatt tgagataagt catatc 26
<210> 67
<211> 30
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acgttggatg gttcagcttt tcctcatggg 30
<210> 68
<211> 30
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acgttggatg aagatgagat ggcaagaggc 30
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acgttggatg gctgtgtgac cttagataaa 30
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<211> 31
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acgttggatg cctcacagta aaaggtatgt c 31
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tttgtagata aaaaagaggt aact 24
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<211> 30
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acgttggatg agcctcaatg acgacctaag 30
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<211> 30
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acgttggatg gattgtgcaa tgtgacgtcc 30
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<211> 21
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ccaggtgacg tcctttagca t 21
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acgttggatg aatgcagtga gtccagaacc 30
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acgttggatg ccacaaacat ttaaaaatgt c 31
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agttaaaaat gtcagttgga aga 23
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<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg ctttttgtgc cttgacagcc 30
<210> 80
<211> 30
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acgttggatg aaccagcggt cacaaaacag 30
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cctcacatcc atacaaagga atgtc 25
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg gccagagtgc ctactttcaa 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg aaactgagac tcacagaagc 30
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gttaaataat ttgccagtgg tcaca 25
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg tagaacagaa ctctgggcac 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg agaaggcctg aaacatggac 30
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ccccatgaaa catggaccac acatcag 27
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg ttgagggttt cctgcttctg 30
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<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 89
acgttggatg aacatggtgg tcaaggcctg 30
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cacccttctc atctggat 18
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<211> 29
<212> DNA
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acgttggatg cagcaattgg agagcctcg 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg ctgaaggatg ctgataaccg 30
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ccgccctggg ttcggctat 19
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<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg tcatagatga aaaccccccc 30
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<212> DNA
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acgttggatg ttgacatcga gcctgacatc 30
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<212> DNA
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cctacctgct gtctcaaggg c 21
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg tgtgcccaat gctatatgtc 30
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg ttctgtatcc tcagagtggc 30
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<211> 19
<212> DNA
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tggcttccaa gtcttagaa 19
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg gcccttattt aatcccccac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg gaaagggctt attggcagag 30
<210> 102
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggtccagaga ctcaagttcc taa 23
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 103
acgttggatg agctcgtgtt cgcagtcacc 30
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg cttaggagaa tggagacacg 30
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ccacgtggga gttcagagg 19
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<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<210> 107
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg ttctgcctgg agcccagata 30
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tccttgagcc cagatacccc aaa 23
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg cctctatcca gaaaacacgg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gtctaccata tgaactccag aaagcta 27
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg tttccctcgt tagccctctg 30
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg gatgaaggat gtgagtgacc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggggcggtag ggtgaaccat aacta 25
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 115
acgttggatg gcctgcatca tgaaggcaag 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 116
acgttggatg aaaaacatga gaaaccccag 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 117
caaaaaatga ttttctttca cgaag 25
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg acagtgtggc tcgtgtcctt 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg ttgcctggca ccggaaaatc 30
<210> 120
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gccggaagga agagggagc 19
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg ggtcccgtcg tctgtgata 29
<210> 122
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 122
acgttggatg cgtcggagca gcaactgag 29
<210> 123
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 123
tgtgggctgc ggttctgcca tggctgc 27
<210> 124
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 124
acgttggatg atgagaccca gagttaccac 30
<210> 125
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 125
acgttggatg cacataaaaa caggcaaac 29
<210> 126
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 126
acaggcaaac ttaccgaa 18
Claims (10)
1.检测皮肤抗衰能力的引物组合，其特征在于，包括检测抗胶原蛋白分解能力的引物组、检测抗氧化能力的引物组和/或检测抗糖化能力的引物组；
(1)、所述检测抗胶原蛋白分解能力的引物组包括检测抗胶原蛋白分解能力的多重PCR扩增引物组和检测抗胶原蛋白分解能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗胶原蛋白分解能力的多重PCR扩增引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(I)、具有SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12、13～14、15～16、17～18任一组所示的核苷酸序列；
(II)、具有SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12、13～14、15～16、17～18所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(III)、与SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12、13～14、15～16、17～18所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(IV)、如(I)、(II)或(III)所示序列的互补序列；
所述检测抗胶原蛋白分解能力的单碱基延伸引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(V)、具有SEQ ID No.43～51任一项所示的核苷酸序列；
(VI)、具有SEQ ID No.43～51所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(VII)、与SEQ ID No.43～51所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(VIII)、如(V)、(VI)或(VII)所示序列的互补序列；
(2)、所述检测抗氧化能力的引物组包括检测抗氧化能力的多重PCR扩增引物组和检测抗氧化能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗氧化能力的多重PCR扩增引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(IX)、具有SEQ ID No.19～20、21～22、23～24、25～26、27～28、29～30、31～32任一组所示的核苷酸序列；
(X)、具有SEQ ID No.19～20、21～22、23～24、25～26、27～28、29～30、31～32任一组所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XI)、与SEQ ID No.19～20、21～22、23～24、25～26、27～28、29～30、31～32任一组所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XII)、如(IX)、(X)或(XI)所示序列的互补序列；
所述检测抗氧化能力的单碱基延伸引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(XIII)、具有SEQ ID No.52～58任一项所示的核苷酸序列；
(XIV)、具有SEQ ID No.52～58任一项所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XV)、与SEQ ID No.4、SEQ ID No.52～58任一项所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XVI)、如(XIII)、(XIV)或(XV)所示序列的互补序列；
(3)、所述检测抗糖化能力的引物组包括检测抗糖化能力的多重PCR扩增引物组和检测抗糖化能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗糖化能力的多重PCR扩增引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(XVII)、具有SEQ ID No.33～34、35～36、37～38、39～40、41～42任一组所示的核苷酸序列；
(XVIII)、具有SEQ ID No.33～34、35～36、37～38、39～40、41～42任一组所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XIX)、与SEQ ID No.33～34、35～36、37～38、39～40、41～42任一组所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XX)、如(XVII)、(XVIII)或(XIX)所示序列的互补序列；
所述检测抗糖化能力的单碱基延伸引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(XXI)、具有SEQ ID No.59～63任一项所示的核苷酸序列；
(XXII)、具有SEQ ID No.59～63任一项所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XXIII)、与SEQ ID No.59～63任一项所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XXIV)、如(XXI)、(XXII)或(XXIII)所示序列的互补序列。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合中所述检测抗胶原蛋白分解能力的多重PCR扩增引物组、所述检测抗胶原蛋白分解能力的单碱基延伸引物组、所述检测抗氧化能力的多重PCR扩增引物组、所述检测抗氧化能力的单碱基延伸引物组、所述检测抗糖化能力的多重PCR扩增引物组与所述检测抗糖化能力的单碱基延伸引物组的摩尔比为(6.5～7.4)：(17～29.9)：(6.6～7.1)：(18.5～32)：(6.5～6.7)：(18.5～38.6)。
3.如权利要求1或2所述的引物组合在制备检测皮肤抗胶原蛋白分解能力、抗氧化能力和/或抗糖化能力的试剂和/或试剂盒中的应用。
4.如权利要求1或2所述的引物组合在制备检测皮肤抗衰能力的试剂和/或试剂盒中的应用。
5.检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合。
6.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合或如权利要求5所述的检测试剂。
7.如权利要求1或2所述的引物组合、如权利要求5所述的检测试剂或如权利要求6所述的试剂盒在检测皮肤抗衰基因或皮肤抗衰能力中的应用。
8.皮肤抗衰基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、获得待测样品的核酸；
步骤2、以步骤1提取的核酸为模板，分别采用如权利要求1或2所述的引物组合中的引物进行多重PCR扩增和单碱基延伸，对SNP位点进行基因分型；
步骤3、根据所述基因分型的结果获得检测结果。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤3中所述根据所述基因分型的结果获得检测结果为：
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述根据所述基因分型的结果获得检测结果的标准为：SNP位点基因型对表型的影响为“强”的计1分，“一般”的计0分，“弱”的计-1分，各SNP位点得分相加得到最终得分；并根据最终得分判断抗胶原蛋白分解能力、抗氧化能力和/或抗糖化能力：
最终得分≥1：“强”；
最终得分＝0：“一般”；
最终得分≤-1：“弱”。
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