CN116064893A - 指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点及其引物组和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体公开了一种指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点，包括ZH3008、ZH7380、ZH13016、ZH17408、ZH18659、ZH18997、ZH19490、ZH19729和ZH21570中的至少一个位点。本发明提供了用于扩增指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点的引物组，以及指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点在群体遗传结构分析、亲权鉴定和/或分子标记辅助育种中的应用。本发明提供的指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点及用于扩增微卫星标记位点的引物组，可应用于指状蔷薇珊瑚的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域的研究，重复性佳，是可靠有效的分子标记，是研究指状蔷薇珊瑚遗传多样性和连通性提供重要的工具。

Description

指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点及其引物组和应用
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，尤其涉及一种指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点及其引物组和应用。
背景技术
微卫星标记位点又称短串联重复序列(short tandem repeats,STR)或简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)，指由1-6个核苷酸为重复单元串联重复构成。微卫星标记位点指的是在基因组上含有微卫星标记位点的座位，微卫星标记位点在基因组上数量丰富且均匀分布。不同样本中，同一个微卫星标记位点内的重复单元的重复次数可能不同，在样本间存在长度变异，微卫星标记位点具有分布广泛、多态性信息容量高、共显性、易于PCR扩增、再现性佳等优点，是研究样本连通性和遗传多样性的主要工具。
西沙群岛珊瑚礁生态系统是我国现存珊瑚礁群落中最古老最原始的群落，是我国沿海区域珊瑚礁生态系统的发源地，也是我国近海海域保存相当完好和珍贵的珊瑚礁区域。西沙群岛的珊瑚礁生态系统为海洋生物提供了优越栖息环境，是海洋生物物种基因库、海洋自然药物资源库。但是，珊瑚礁生态系统是一个非常脆弱的生态系统，容易受到外界环境变化的影响，目前西沙群岛礁造礁石珊瑚出现白化死亡现象，部分区域珊瑚白化率达到30％以上。
造礁石珊瑚是珊瑚礁生态系统的重要组成部分，造礁石珊瑚的连通性和遗传多样性是制定珊瑚礁生态系统恢复和修复策略的重要依据。指状蔷薇珊瑚(Montiporadigitata)是西沙造礁石珊瑚优势种，具有代表性意义。研究指状蔷薇珊瑚的连通性和遗传多样性能为保护西沙群岛造礁石珊瑚提供重要的数据支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点及其引物组和应用，以解决上述技术问题。
本发明目的之一在于提供指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点，包括ZH3008、ZH7380、ZH13016、ZH17408、ZH18659、ZH18997、ZH19490、ZH19729和ZH21570中的至少一个位点，ZH3008的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；ZH7380的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；ZH13016的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；ZH17408的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；ZH18659的核苷酸序列为SEQ ID NO.15；ZH18997的核苷酸序列为SEQ ID NO.18；ZH19490的核苷酸序列为SEQ IDNO.21；ZH19729的核苷酸序列为SEQ ID NO.24；ZH21570的核苷酸序列为SEQ ID NO.27。
本发明目的之二在于提供上述用于检测指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点的引物组，包括引物对SEQ ID NO.1-2、引物对SEQ ID NO.4-5、引物对SEQ ID NO.7-8、引物对SEQ IDNO.10-11、引物对SEQ ID NO.13-14、引物对SEQ ID NO.16-17、引物对SEQ ID NO.19-20、引物对SEQ ID NO.22-23和引物对SEQ ID NO.25-26中的至少一组；
具体地，用于扩增ZH3008的引物对为SEQ ID NO.1-2；用于扩增ZH7380的引物对为SEQ ID NO.4-5；用于扩增ZH13016的引物对为SEQ ID NO.7-8；用于扩增ZH17408的引物对为SEQ ID NO.10-11；用于扩增ZH18659的引物对为SEQ ID NO.13-14；用于扩增ZH18997的引物对为SEQ ID NO.16-17；用于扩增ZH19490的引物对为SEQ ID NO.19-20；用于扩增ZH19729的引物对为SEQ ID NO.22-23；用于扩增ZH21570的引物对为SEQ ID NO.25-26。
本发明目的之三在于提供上述指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点在群体遗传结构分析、亲权鉴定和/或分子标记辅助育种中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供九个指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点，分别命名为ZH3008、ZH7380、ZH13016、ZH17408、ZH18659、ZH18997、ZH19490、ZH19729和ZH21570，核苷酸序列分别为SEQID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.27。
本发明提供了九个指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点及用于扩增微卫星标记位点的引物组，可应用于指状蔷薇珊瑚的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域的研究，重复性佳，是可靠有效的分子标记，是研究指状蔷薇珊瑚遗传多样性和连通性提供重要的工具。
附图说明
图1为ZH3008的毛细管电泳信号图；
图2为ZH7380的毛细管电泳信号图；
图3为ZH13016的毛细管电泳信号图；
图4为ZH17408的毛细管电泳信号图；
图5为ZH18659的毛细管电泳信号图；
图6为ZH18997的毛细管电泳信号图；
图7为ZH19490的毛细管电泳信号图；
图8为ZH19729的毛细管电泳信号图；
图9为ZH21570的毛细管电泳信号图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：
S1、采用加热棒将水温升到33℃，活体指状蔷薇珊瑚经33℃高温诱导白化后(用于除去珊瑚体内的虫黄藻)，送到广州基迪奥生物科技有限公司提取基因组DNA、酶切、末端修复、加A加接头、片段选择、PCR扩增和上机测序。
具体步骤如下，(1)DNA提取：使用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取基因组DNA。使用Qubit(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)和Nanodrop(ThermoFisherScientific,Waltham,MA)检测DNA质量。
(2)质检合格的基因组DNA被限制性内切酶消化，使用物理方法打断成300-700bp的序列，然后进行末端修复，加A尾，并使用
Figure BDA0003793795460000031
ΜLtraTMDNA Library Prep Kit库(NEB,USA)添加Illumina测序接头。
300-400bp的DNA片段进行PCR扩增富集。
最后，使用AMPure XP系统(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)对PCR产物进行纯化，使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent,Santa Clara,CA)对测序文库进行检测，并使用实时PCR进行文库定量。测序在Novaseq 6000测序仪上进行，采用PE 150测序策略。
(3)用FASTP(版本0.18.0)对Illumina平台的原始数据进行过滤，过滤标准如下：
①去除含有未知核苷酸(N)≥10％的reads；
②去除phred质量评分≤20的碱基≥50％的reads；
③删除含接头的reads。过滤后的clean reads用于组装分析。
(4)使用stack(版本1.46)首先对所有个体的read1数据进行单独聚类，获得个体的stack，随后对个体间的stacks进行聚类，获得群体的stacks集合。根据read1聚类结果对read2进行归类，然后对read2进行拼接。read1拼接得到的stacks序列和read2拼接得到的contig后，将序列比对虫黄藻基因组并过滤虫黄藻数据。过滤后再将stacks序列和contig序列进行拼接，构建RAD-tags。RAD-tags将作为后续变异检测和高级分析的参考序列。
珊瑚的细胞内含有大量的虫黄藻，提取的DNA是珊瑚和虫黄藻的混合DNA，所以S1要先升温诱导除去珊瑚体内的虫黄藻，然后在生信分析时，再过滤一遍虫黄藻，把虫黄藻数据分离掉，从而获得珊瑚的DNA。
(5)使用软件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对所有RAD-tags进行搜索，寻找RAD-tags中的SSR，获得指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点。
配置参数信息：
definition(unit_size,min_repeats):1-10 2-6 3-5 4-4 5-4 6-4；
interruptions(max_difference_between_2_SSRs):100。
S2、采集西沙银屿、羚羊礁、晋卿岛的指状蔷薇珊瑚，各两个，提取DNA，然后进行RCR扩增。将各位点的正向引物5’端加M13正向引物作为PCR的正向引物，扩增反应体系为25μL，
PCR体系为：PCR Master Mix(2×)12.5μL，正向引物10μmol/L 0.2μL，反向引物10μmol/L 0.6μL，FAM标记的M13引物10μmol/L 0.4μL，模板DNA＜100ng，最后用ddH2O补足至25μL。
反应程序为：95℃2min；30个循环：变性95℃20s，退火55℃20s，延伸72℃20s；8个循环：变性95℃20s，退火53℃20s，延伸72℃30s；总延伸72℃5min。
指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点、正向引物序列、反向引物序列和对应毛细管电泳信号图如下表所示。
Figure BDA0003793795460000041
由图1-图9可知，本实施例获得的指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点的长度在供试的指状蔷薇珊瑚中都出现了多态性，具有扩增稳定性高、特异性强、重复性佳的优点。由此可见，这九个微卫星标记位点是可靠有效的分子标记，开发指状蔷薇珊瑚的微卫星标记位点能为研究其遗传多样性和连通性提供重要的工具，今后能用于指状蔷薇珊瑚的种质资源评价和遗传连锁图谱构建等工作。
使用ABI 3730XL基因分析仪和SoftGenetics GeneMarker 3.0.0软件进行等位基因分型，获得PCR产物片段大小。
(1)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH3008(SEQ ID NO.3)：
TTCGAAGAAGACGTCAGCCTTTCGGCAGAGGAAATAACATAAAGATAGCTTACGTGCGTTAGAAAATTTAAGACGAGATCTTATTTATTATGGGGGGTGGATCATCAAGAAAGTGTTGGTCATTGCTTTTGACAAACGTGTTGGCTCCTAAAGGAGCCGTTGTTGTTGTTGTTTTTTCAGTTCACGAGACTCGTTCACTTGCTGCTGGTGTACTTGGTCACGGCCTTCGTACCCTCGCTGACGGCGTGTTTTGCAAGTTCACCGGGAAGCAAAACTCTTATCGCTGTTTGGATCTCTCTTGAACTAATGGTGGCCTTCTTGTTGTAAAGTGAAAGACGTGAGGACTCCACGGCTATGCGTTCGAAAATATCGTTCACGAAAGAATTAGAGTCAAAGATCGGAAGAGCGTCG；
正向引物(SEQ ID NO.1)：CGAAGAAGACGTCAGCCTTT；反向引物(SEQ ID NO.2)：AAGGCCGTGACCAAGTACAC。
(2)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH7380(SEQ ID NO.6)：
TAAATTTCAGTAGCTCTCACCGTATGCACGGTTGATACGCTATTTCAGACCTATTGAATAATTTGAAAAGGGCTTTGGTTGATGGTCTTATCTCTTAATGATGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCTTCTAAGAAAAACACCCAATTCAAACTTGAGTGCACAAACCACATTCAGATCAAAACGGCTAAAAAAAACCCTACCCTTTAGGGCCGCACATACCTATATTGCGCATATAGGGGCTTATATTTTTCAAAGGTCCTTTTGGAGGGGCTTATTTTTGAAGGGGCTTATATTCAAAGGGGTTTATCTACGGAGGGAAATTTGCGTTTCCAAATAAATTAGGCTAGCC；
正向引物(SEQ ID NO.4)：TAGCTCTCACCGTATGCACG；反向引物(SEQ ID NO.5)：AATAAGCCCCTCCAAAAGGA。
(3)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH13016(SEQ ID NO.9)：
CACATTACTATGTTTTCAACATAGCAATTCTGGGAACCTTTTCAGACAGAAAAAAAAAAGTAAATTTTTTTTTAGCTTCTTTTTGTAATACGCTGTTTGTAAAACAATAGGAACTTCAAGAAAGCGTAATAGTTTATAATATAGTGACAGTACTCACACACACTCAGGCTGCACACTGTTATCTATTGTAGCTAAATAAGGGTGTCGAGTTCCTTTTTGTTATTTTAGTATGTTCCTTTTTCACTACTTTTCTGTAATATTTTAAAAAATACAACCACACTTTTGAATTTTCGGAACATGTTTCGATGTTTCAAACATCATCTTCAGCCATAGTGAGTGAAACATTAAAATTTTTACAAGATAATTCGTATATATATATAAGTTAACTATCAGTACAATGATTCTTTGTAGATTAAATGTTCGTTACAA；
正向引物(SEQ ID NO.7)：CACTCAGGCTGCACACTGTT；反向引物(SEQ ID NO.8)：AACGAACATTTAATCTACAAAGAATCA。
(4)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH17408(SEQ ID NO.12)：
CTATTTTTTGTTAATAGCCAAACTACATCTGTGGGATTGCAGAAGATCACAAATACGTCCAACTATTGCTGGTTTTAAGACTAAGATAAAATTAAAATTTGAGACGAAAAAGTATATCTGTAAAAGATATATATATATGAAATACATATTTTGCACTGCGGGTATGAAATCAAATGAAACCATGTTGTCTCGCAGTGATGAGCGCAAATTTCTATTGCGTCGAGAAGTCTGAAAATTTTTCAGGACTTCAACGGGATTTAAACCCGCGACCTCGCGATACCGGTGCGATGGTCTAACCAACTGAGCTATGAAGCGACTGACGTTGGGAGCTGGTCACTTCTGAGTTCAC；
正向引物(SEQ ID NO.10)：TGTGGGATTGCAGAAGATCA；反向引物(SEQ ID NO.11)：CCCGTTGAAGTCCTGAAAAA。
(5)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH18659(SEQ ID NO.15)：
GCAGTTGCAGTGGGCAAAACAAGACTACCAAAGGTGAAGTTTATCAGCTCCTGTAACAAGCAAATTTCAGTTGTTTTTGAGGAAATTTTTTGTTTTTGAAAATTAAATTAAATTAAATTGAATATTCCTATTTGAAACTCAAGTATTAGCCGACAGCAATTTTTTGGGCTGATTTTAAGGTCATAAAAGGTCAACTTATACCCATGTAAATTTGGTATTTTATTATATAAACACCAATGAAATACCAAGTGAGCTTTAGCGCAAAGACATGTTATTTTCACACATGAAAAGATCACTGTTGCTATTGTTACAT；
正向引物(SEQ ID NO.13)：GCAGTGGGCAAAACAAGACT；反向引物(SEQ ID NO.14)：TTTGCGCTAAAGCTCACTTG。
(6)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH18997(SEQ ID NO.18)：
CTGCAGACTGGGTACAAATGCAGACCAAGTCTAAATAAATAAATAAATACGTGATGGAATGTCATCTTATAACTTACCTGCTGTCACGCAATCGTCATTTTTCACGAATATTAGCATTTATTGGGTTTCCTTGCCCGTTTCTTAATGTATTATGTCTTAAACAGAGTGGCCAGGCTACAGTGGTTCTTAAATAAAATTCTGAGCTACTTACTGATCTCCTAGCAGACTAGCTGATCTCCGGAAAGGTGATCTGCC；
正向引物(SEQ ID NO.16)：TGGGTACAAATGCAGACCAA；反向引物(SEQ ID NO.17)：GATCACCTTTCCGGAGATCA。
(7)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH19490(SEQ ID NO.21)：
GAGCTGGAATACGTTGCATTCGATCGAGGAATACGTTCCCGGGTTTTTTGTCCCTCTGGGTTTTTACCCCGGGTTTTCGTATCGGGCAACGTATCATCGATGTTTTTTCTGTAGATTTTTCCTAGTTTCCTGTTATGTGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTACACTTATGTAACTGCACTTAAATTTTTTGACTACGGTTATCTATATAATACATTTCCTGTAGATAGATACATTTCTATATACATTTTCAGGCTATTGTCAACAATATTCGCACTTTCACATTGATGTTCATGTA；
正向引物(SEQ ID NO.19)：GAATACGTTCCCGGGTTTTT；反向引物(SEQ ID NO.20)：CATCAATGTGAAAGTGCGAA。
(8)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH19729(SEQ ID NO.24)：
GCGTATTCGGATAGAAAAATTGCGGTTTCAAAAATATCCGGATACGTGTGGACGGGGCCTTAGCAAACAGGAAATGTCTGGATGAAACTTGGTGGTAGAGCAATTGCAGCGTAATCGCAGGGCCATGGATTCGAATCACGTTCAAACTTTCGATTTTTTTTTTTTTTTTCAGGTTTGCTGCAACTATTTTAGTTGTTTGGTTTTATCAACGGAGTTGATAATGTAAATTGGCCACCGTACAGAGATTTTAAAAGCTGGTTTCGAGGGTTAGCCCTTCGTTCGCTTTATTT；
正向引物(SEQ ID NO.22)：TTCGGATAGAAAAATTGCGG；反向引物(SEQ ID NO.23)：GAAGGGCTAACCCTCGAAAC。
(9)指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点ZH21570(SEQ ID NO.27)：
TATTGTTTTTTTGTCCTCACTGCCTGGCTATCAAGCTGAATATTTGATATTTCGAAAATGTCATAGTGACTTTTACGCGAAACTCACATTTCCATACCAGAGATATTTGGCAGTGTTCATAATGGTGAGAAGACCAGCTCTTGGACTCCAGCTGAGGAAAACAACAACAACAACAATCATCGTTCACGTTTAGACAAGGTATAGCAACAGCTCCAACACAAGGCCAAGTTGTTCGGCAATTCTATCGATTACTAGAAACTCAAAT；
正向引物(SEQ ID NO.25)：GTCCTCACTGCCTGGCTATC；反向引物(SEQ ID NO.26)：AGAATTGCCGAACAACTTGG。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (3)

1.指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点，其特征在于，包括ZH3008、ZH7380、ZH13016、ZH17408、ZH18659、ZH18997、ZH19490、ZH19729和ZH21570中的至少一个位点，ZH3008的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；ZH7380的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；ZH13016的核苷酸序列为SEQID NO.9；ZH17408的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；ZH18659的核苷酸序列为SEQ ID NO.15；ZH18997的核苷酸序列为SEQ ID NO.18；ZH19490的核苷酸序列为SEQ ID NO.21；ZH19729的核苷酸序列为SEQ ID NO.24；ZH21570的核苷酸序列为SEQ ID NO.27。
2.用于扩增权利要求1所述的指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点的引物组，其特征在于，包括引物对SEQ ID NO.1-2、引物对SEQ ID NO.4-5、引物对SEQ ID NO.7-8、引物对SEQ IDNO.10-11、引物对SEQ ID NO.13-14、引物对SEQ ID NO.16-17、引物对SEQ ID NO.19-20、引物对SEQ ID NO.22-23和引物对SEQ ID NO.25-26中的至少一组。
3.根据权利要求1所述的指状蔷薇珊瑚微卫星标记位点在群体遗传结构分析、亲权鉴定和/或分子标记辅助育种中的应用。
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