CN113736892B

CN113736892B - 一组高原鼢鼠多态性微卫星分子标记

Info

Publication number: CN113736892B
Application number: CN202111243537.7A
Authority: CN
Inventors: 蔡振媛; 张同作; 李文君; 宋鹏飞; 高红梅; 刘道鑫; 汪海静; 张婧捷; 江峰
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2041-10-25
Also published as: CN113736892A

Abstract

本发明提供了一组高原鼢鼠多态性微卫星分子标记，属于DNA分子标记技术领域。所述微卫星分子标记是SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10中任意一种或多种所示的核苷酸序列。本发明通过高通量测序技术，使用生物信息学方法，筛选含有微卫星的DNA序列，设计特异性引物，并对这些微卫星位点进行了多态性检测，开发了一组(10个)具有丰富多态性的高原鼢鼠微卫星分子标记，并提供了一组高原鼢鼠微卫星引物。本发明提供的高原鼢鼠微卫星引物对能够对微卫星位点进行特异性扩增，并且具有高度多态性，可以应用于高原鼢鼠及其近缘种遗传多样性、种群遗传结构、谱系地理、进化与亲缘关系等研究领域，具有优异的应用前景。

Description

一组高原鼢鼠多态性微卫星分子标记

技术领域

本发明属于DNA分子标记技术领域，具体涉及一种高原鼢鼠多态性微卫星分子标记。

背景技术

高原鼢鼠(Eospalax baileyi)是典型的地下掘土类啮齿动物，主要分布在甘肃河西走廊以南的祁连山地、甘南高原、青海高原以及四川北部、西部高地的农田、山坡及草甸草原，高原鼢鼠对于高原自然条件有很好的适应能力，是青藏高原特有种。高原鼢鼠觅食、繁殖等绝大部分行为都在地下进行，常常伴随高耗能的挖掘活动，过高的挖掘能量代价严重限制其长距离的迁移活动，从而扩散率明显低于地上活动动物，开展高原鼢鼠遗传多样性和谱系地理学研究对于理解青藏高原物种多样化过程具有重要意义。

微卫星即简单重复序列((Single Sequence Repeats,SSR)，于1990年被报道并定名，是以1-6个核苷酸为重复单位，多次重复从而形成的串联重复序列，几乎存在于整个基因组，且不同等位基因间重复单元和重复次数的差异使其具有多态性。微卫星重复序列两侧序列相对保守，在物种间具有较高的同源性，因此可用于设计引物，然后通过PCR扩增和电泳检测来分析其长度多态性。微卫星相对其他的分子标记而言，分布广，多态性高，呈共显性遗传，只需少量DNA就可进行扩增，对DNA质量要求也不高，对DNA降解容忍度高，在种属间也具有比较好的通用性，因此，它是最常用的DNA分子标记之一。

传统的微卫星分子标记开发主要采用磁珠富集法，该方法费时费力费用高。随着高通量测序技术的普及和生物信息分析方法的日新月异，通过简化基因组测序技术开发微卫星分子标记成为可能。开发高原鼢鼠微卫星分子标记，不仅有助于开展其多样性分布格局研究，也可为近缘种遗传多样性分析提供帮助。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：采用高通量测序技术，分离和鉴定具有较高多态性的高原鼢鼠微卫星分子标记，提供一组高原鼢鼠多态性微卫星引物，该组微卫星引物扩增特异性好，多态信息含量丰富，能够用于高原鼢鼠及其近缘种遗传多样性和进化等研究。

本发明提供了一组高原鼢鼠多态性微卫星分子标记，所述微卫星分子标记是SEQID NO:1～SEQ ID NO:10中任意一种或多种所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一组前述的高原鼢鼠多态性微卫星分子标记的引物，它是SEQ IDNO:11和12所示的引物对、SEQ ID NO:13和14所示的引物对、SEQ ID NO:15和16所示的引物对、SEQ ID NO:17和18所示的引物对、SEQ ID NO:19和20所示的引物对、SEQ ID NO:21和22所示的引物对、SEQ ID NO:23和24所示的引物对、SEQ ID NO:25和26所示的引物对、SEQ IDNO:27和28所示的引物对、SEQ ID NO:29和30所示的引物对中的一对或多对。

本发明还提供了一种用于高原鼢鼠及其近缘种种群遗传结构和遗传多样性分析的试剂盒，它包括检测待检测物种前述的微卫星分子标记中任意一种或多种的试剂。

进一步地，所述试剂是同时检测待检测物种前述的10种微卫星分子标记的试剂。

进一步地，所述试剂为PCR产物克隆测序、毛细管电泳检测、聚丙烯酰氨凝胶电泳检测试剂。

进一步地，前述的试剂盒还包括扩增前述的微卫星分子标记的试剂。

进一步地，所述扩增前述的微卫星分子标记的试剂包括SEQ ID NO:11和12所示的引物对、SEQ ID NO:13和14所示的引物对、SEQ ID NO:15和16所示的引物对、SEQ ID NO:17和18所示的引物对、SEQ ID NO:19和20所示的引物对、SEQ ID NO:21和22所示的引物对、SEQ ID NO:23和24所示的引物对、SEQ ID NO:25和26所示的引物对、SEQ ID NO:27和28所示的引物对、SEQ ID NO:29和30所示的引物对中的一对或多对。

本发明还提供了一种用于高原鼢鼠及其近缘种种群遗传结构和遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检鼢鼠样本的基因组总DNA；

(2)检测SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10中任意一种或多种所示的核苷酸序列变异，分析，即可；

优选的，步骤(1)所述的样本为肝脏、肌肉组织样本。

进一步地，步骤(2)所述检测的步骤如下：

1)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用扩增试剂进行PCR扩增得到扩增产物；

2)对步骤1)所得PCR扩增产物进行克隆测序、毛细管荧光电泳或聚丙烯酰氨凝胶电泳检测；

3)对步骤2)的检测结果进行微卫星位点多态性评估。

进一步地，步骤1)的扩增试剂包括SEQ ID NO:11和12所示的引物对、SEQ ID NO:13和14所示的引物对、SEQ ID NO:15和16所示的引物对、SEQ ID NO:17和18所示的引物对、SEQ ID NO:19和20所示的引物对、SEQ ID NO:21和22所示的引物对、SEQ ID NO:23和24所示的引物对、SEQ ID NO:25和26所示的引物对、SEQ ID NO:27和28所示的引物对、SEQ IDNO:29和30所示的引物对中的一对或多对；

和/或，步骤1)的扩增条件为95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；第二轮PCR扩增条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最终72℃修复延伸8min。

本发明解决技术问题的技术方案：采用RAD-seq(restriction-site associatedDNAsequencing)技术进行简化基因组测序，通过SR Search软件进行微卫星搜索，获得微卫星序列，应用primer 3在线软件针对微卫星序列侧翼保守区设计扩增引物，通过高原鼢鼠基因组总DNA混合池进行PCR筛选稳定扩增的微卫星位点，然后选取不同地理种群的高原鼢鼠个体，对初筛位点进行多态性检测，最终确定了一组(10个)多态性丰富的微卫星分子标记。同时提供了一组(10个)高原鼢鼠多态性微卫星分子标记引物对，所述引物对来自EB-0028、EB-0077、EB-0116、EB-0234、EB-0262、EB-0331、EB-0409、EB-0447、EB-0525和EB-0798。

综上，本发明通过高通量测序技术，使用生物信息学方法，筛选含有微卫星的DNA序列，设计特异性引物，并对这些微卫星位点进行了多态性检测，开发了一组(10个)具有丰富多态性的高原鼢鼠微卫星分子标记，并提供了一组高原鼢鼠微卫星引物。本发明提供的高原鼢鼠微卫星引物对能够对微卫星位点进行特异性扩增，并且具有高度多态性，可以应用于高原鼢鼠及其近缘种遗传多样性、种群遗传结构、谱系地理、进化与亲缘关系等研究领域，具有优异的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：高原鼢鼠HX-4样本EB-0028位点毛细管电泳分型图。

图2：高原鼢鼠HX-4样本EB-0077位点毛细管电泳分型图。

图3：高原鼢鼠HX-4样本EB-0116位点毛细管电泳分型图。

图4：高原鼢鼠HX-4样本EB-0234位点毛细管电泳分型图。

图5：高原鼢鼠HX-4样本EB-0262位点毛细管电泳分型图。

图6：高原鼢鼠HX-4样本EB-0331位点毛细管电泳分型图。

图7：高原鼢鼠HX-4样本EB-0409位点毛细管电泳分型图。

图8：高原鼢鼠HX-4样本EB-0447位点毛细管电泳分型图。

图9：高原鼢鼠HX-4样本EB-0525位点毛细管电泳分型图。

图10：高原鼢鼠HX-4样本EB-0798位点毛细管电泳分型图。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商建议的条件；实施例中所用到的各种化学试剂均可以商购获得，所用引物委托合成。

实施例1、用于高原鼢鼠及其近缘种种群遗传结构和遗传多样性分析的试剂盒

本发明试剂盒的组分包括：

(1)PCR扩增试剂：包含SEQ NO:11～12的引物对、SEQ NO:13～14的引物对、SEQNO:15～16的引物对、SEQ NO:17～18的引物对、SEQ NO:19～20的引物对、SEQ NO:21～22的引物对、SEQ NO:23～24的引物对、SEQ NO:25～26的引物对、SEQ NO:27～28的引物对、SEQNO:29～30的引物对；(2)多态性检测试剂。

实施例2、高原鼢鼠多态性微卫星分子标记的制备

(1)基因组总DNA提取与检测

利用凯杰DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒，提取高原鼢鼠(编号为GY14)的基因组总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop 2000C分光光度计对提取的基因组总DNA进行定量、定性检测。提取的基因组总DNA体积为50μL，电泳结果有明亮的主带，拖尾不明显，分光光度计检测结果显示浓度67.3ng/μL，OD260/280为2.12，DNA质量满足简化基因组测序要求。

(2)测序、聚类、组装

将合格的高原鼢鼠基因组总DNA样品，采用RAD-seq技术进行简化基因组测序。制备300-700bp文库，利用Illumina-HiSeqTM 2500测序平台进行PE125测序。

对测序原始数据进行处理，得到2.92Gb的Raw Base，过滤后得到2.88Gb的CleanBase，Effective Rate为98.83％，碱基错误率为0.01％，Q20为97.03％，Q30为93.72％，GC含量为41.53％，RAD-Tag捕获率为96.28％，样本的数据量足够，测序质量合格，GC分布正常，建库测序成功。

聚类组装后，得到2187222类和94080cotigs，组装cotigs的平均长度为298bp，组装结果的GC含量为42.77％，和reads的GC含量一致性较高，说明组装结果能够代表部分基因组。而Het rate为87.06％，说明杂合SNP在基因组中比较多，说明组装结果可靠。

(3)微卫星位点的提取及引物设计

通过SR search检测出组装的contigs中的微卫星位点，并过滤除去其中距离过近的位点，最终样本GY14中双端能够各自留出150bp作为引物设计的SSR数目为1329，其中能够成功设计引物的SSR数目为1161。得到的SSR位点类型以二核苷酸重复单元为主，在设计的微卫星引物中选择100对用于引物筛选。

(4)多态性微卫星引物的筛选

对随机选取100对SSR引物进行合成并添加荧光接头，选取5个鼢鼠样本提取基因组总DNA，构建DNA pool，用于引物扩增特异性检测和多态性初筛。

PCR反应体系25μL：50ng/μL的模板DNA 1μL，10μM的正反引物和引物各1μL，10μM的dNTP(mix)1μL，10×的Taq Buffer(with MgCl2)2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，ddH₂O 18μL。

PCR扩增在ABI Veriti温度梯度PCR仪上进行，第一轮PCR扩增条件：95℃预变性3min，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，10个cycles；第二轮PCR扩增条件：94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环，最终72℃修复延伸8min。扩增产物纯化变性后在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳检测，根据荧光电泳图谱初筛，获得具有多态性的特异性扩增引物10对，该10对引物对应的微卫星及侧翼序列如SEQ ID No：1-10所示。这10对特异性扩增引物如表1所示。

微卫星及侧翼序列如下：

EB-0028

TAAAACATGTCCAGTTCTACCGGTCACTTAGGGAACAAAGATGGCACACCAGTTACAAATCTCTTATGGAATTTTCACCTATATGAAATGGACCTTATGGAAACAAACAAACAAACAAACAAACAAACAAACGAAAAGACCAATACTAGCCTGAAAATGATCTCTGGGCTCTGAGTAAATACTAATTTCTTTTATATATTTCCCCTATGTCTAACTTTCTGCACTAAGTTTA(SEQ ID No:1)

EB-0077

TGCACGGCAACGAAGGAAGCTTAGGGGTACAGAAGTCAAAGATAAATCCTATCTGTGTGACAAGCAACCAGGCAAGGCTAGAACCCAGGAAGCAGTTATAAACAACAACAACAACAACAACAACAAAACAAACCTATAGAAACACAGAAGGACAAGTGGGGTGATGGGCCTAAGCAGACAGTATAAAAGAGTCTCAGTGAAGTAGGTCTGAGGGATAACACAAA(SEQ ID No:2)

EB-0116

AGGGTCTGGGCTCAGTGAGACCCTGTATCAAAAAAGTAAGGTGAAGAGGGACAGAGGGAGACACCGGCATCAATGTCTGGCCTTGGCACACACCATGTCTACACACACACACACACACACACACACACACAGAATGAACCAGGCCTGGGATGTGGCTTTAGGGAACGCACTAGTTCAGCCTCAAGGTCCTGGGAAGAGGATGGAGACAAACAACCACAGCTTGCCACAGC(SEQ ID No:3)

EB-0234

CAAAAAGGAAAAGAAAAATACTCATATTTGGGCCAAGAAGATGGCTCAGTAAAAGTACCTGCTGCCAAGCCTGACAACCTTAAATAAATGCAAGTTAGAAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGAATTTCCAAGGACTCAAAGAGATGGCCTAGGGGTTAAGAGCATGTACTGCTCTCCCAGAAGACCCAAGTCTTCAGTTTCCAACAACTAGTCAGGTGGC(SEQ ID No:4)

EB-0262

AGGGTGAGAATAGAGCCAGGTAACAGGACCGAAAGCGGTGAGCACACAGTTGTTAAAACCAGGATTCACAGCTGGAATCCAAAACCACTCTGGATATTAAAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAACAACAACAACAACATCAACAACAAGTTTTCTTTCAGCATTTTGGTATTTCTGAAGTTCTTGGAAGGACTTGAGGAGTGGAAAGCTGTATAATGTT(SEQ ID No:5)

EB-0331

GACAGATATATCTGTGAGTTTGTTATAAGCTGGATGAAAACTCCAAAGAAATAGGATTACATGAAGAGCAACTGAGACTCATGTTTTGGGAACTAGATTCATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCATCTATCTATCTATTCATCCATCCATCCATCTAATTGTACGTGTGTGTTGTTAGGGATCAAACCCAGGACCTGGTACATGCTAAACAAGTGCTCTAC(SEQ ID No:6)

EB-0409

AATCCTGGTACTGGAGAGGCAAAGGTAGGAGGATTTTTGAGAAGTTTTGAGAGAATCTCAGGTCAGTCTGTATTATGTTAGCAAGATCCTGTCTCTCATGCACACACACACACACACACACACATTGAAAACAATACTACTTGAGAAAGTAGTCGATATTGACTGAAAGTGGGGATTGCTGAGTATCCCCTGATCCTTAACCTAAAAGGTCTAGCTGCCTACAA(SEQ ID No:7)

EB-0447

TACGTAGCACATTGGAATAATAAAAAATATTAAGATGCTCACAGAATGTTTGATGGAGTGCCTCCATTCTCCCCCACCATTGTTTTATGATATAACCACTCACACACACACACACACACACACACACCCCGTAGCAACTGTTAGCAATTTTGTCTTCATTTTTTTGATTTGCTAGGTAAATTCAAACATGTGTGTACACAGTTATTTTTACACAAATTGTAGTATA(SEQ ID No:8)

EB-0525

TTGACAGGCACCATCTCAACTAAGTGGTCAGCATTAACATCACTAGTAATATTAAGACTGTTGACATCATGTGCCTTTTGATAGAATGTACTGAGATGAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTCCTGAGATTGGGGTCTCCTGTTGCAGATTGGCCTTGAACTTACTTTCTAACCAAGATGGCCATGAACAACTTTTAAAAAATACTTATTTTT(SEQ ID No:9)

EB-0798

ATTAAATTAGAGGGAATATATGTCTTTCACTTAATACTGATGTGCTATTTCATTATAATAAAAATGTTTTAAAACCACTCAATTTAATCTGACTGTATTCTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGCAGTAGTAGTAGTTACTTTTTTATTTCTGAGACAGAGATTCCCTTTAGCCTCAGCTGGCCTGGAACACAGTGTAGACCAGGTTGGCCTTGATCTCACAGA(SEQ ID No:10)

表1一组高原鼢鼠多态性微卫星引物对具体序列

实施例3、用所述10对引物进行高原鼢鼠遗传多样性分析

从7个不同地理种群的29个高原鼢鼠的肝脏组织中提取基因组总DNA，并进行检测，样本信息见表2。对筛选获得的10对引物进行荧光引物合成，基因组DNA检测合格稀释至50ng/μL，用于PCR扩增，扩增体系和反应条件同实施例2，扩增产物在ABI 3730XL测序仪上进行毛细管荧光电泳检测，并根据电泳结果统计等位基因等数据。

对电泳结果进行微卫星位点多态性评估，使用Popgene软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)，使用PIC-CALC计算多态性信息含量(PIC)，以此来描述29个高原鼢鼠微卫星遗传多态性特征。多态性检测结果(表3)显示本发明的10对引物在29个高原鼢鼠中都有多态性，各位点等位基因数Na在4-17，有效等位基因数(Ne)为2.4919-7.0970，观测杂合度(Ho)为0.1379-0.8276，期望杂合度(He)为0.6092-0.8742，多态信息含量(PIC)为0.5574-0.8458。由此可见，本发明的10个微卫星分子标记可用于遗传多样性、种群遗传结构、谱系地理、进化与亲缘关系研究等，具有良好的应用前景。

表2 7个种群29个高原鼢鼠样本信息表

表3特异性扩增的10个微卫星位点多态性特征

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院西北高原生物研究所

<120> 一组高原鼢鼠多态性微卫星分子标记

<130> GY417-2021P0113906CC

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taaaacatgt ccagttctac cggtcactta gggaacaaag atggcacacc agttacaaat 60

ctcttatgga attttcacct atatgaaatg gaccttatgg aaacaaacaa acaaacaaac 120

aaacaaacaa acgaaaagac caatactagc ctgaaaatga tctctgggct ctgagtaaat 180

actaatttct tttatatatt tcccctatgt ctaactttct gcactaagtt ta 232

<210> 2

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcacggcaa cgaaggaagc ttaggggtac agaagtcaaa gataaatcct atctgtgtga 60

caagcaacca ggcaaggcta gaacccagga agcagttata aacaacaaca acaacaacaa 120

caacaaaaca aacctataga aacacagaag gacaagtggg gtgatgggcc taagcagaca 180

gtataaaaga gtctcagtga agtaggtctg agggataaca caaa 224

<210> 3

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggtctggg ctcagtgaga ccctgtatca aaaaagtaag gtgaagaggg acagagggag 60

acaccggcat caatgtctgg ccttggcaca caccatgtct acacacacac acacacacac 120

acacacacac agaatgaacc aggcctggga tgtggcttta gggaacgcac tagttcagcc 180

tcaaggtcct gggaagagga tggagacaaa caaccacagc ttgccacagc 230

<210> 4

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caaaaaggaa aagaaaaata ctcatatttg ggccaagaag atggctcagt aaaagtacct 60

gctgccaagc ctgacaacct taaataaatg caagttagaa agagagagag agagagagag 120

agagagagag ggaatttcca aggactcaaa gagatggcct aggggttaag agcatgtact 180

gctctcccag aagacccaag tcttcagttt ccaacaacta gtcaggtggc 230

<210> 5

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agggtgagaa tagagccagg taacaggacc gaaagcggtg agcacacagt tgttaaaacc 60

aggattcaca gctggaatcc aaaaccactc tggatattaa agcagcagca gcagcagcag 120

cagcaacaac aacaacaaca acatcaacaa caagttttct ttcagcattt tggtatttct 180

gaagttcttg gaaggacttg aggagtggaa agctgtataa tgtt 224

<210> 6

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacagatata tctgtgagtt tgttataagc tggatgaaaa ctccaaagaa ataggattac 60

atgaagagca actgagactc atgttttggg aactagattc atctatctat ctatctatct 120

atctatctat catctatcta tctattcatc catccatcca tctaattgta cgtgtgtgtt 180

gttagggatc aaacccagga cctggtacat gctaaacaag tgctctac 228

<210> 7

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatcctggta ctggagaggc aaaggtagga ggatttttga gaagttttga gagaatctca 60

ggtcagtctg tattatgtta gcaagatcct gtctctcatg cacacacaca cacacacaca 120

cacattgaaa acaatactac ttgagaaagt agtcgatatt gactgaaagt ggggattgct 180

gagtatcccc tgatccttaa cctaaaaggt ctagctgcct acaa 224

<210> 8

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tacgtagcac attggaataa taaaaaatat taagatgctc acagaatgtt tgatggagtg 60

cctccattct cccccaccat tgttttatga tataaccact cacacacaca cacacacaca 120

cacacacccc gtagcaactg ttagcaattt tgtcttcatt tttttgattt gctaggtaaa 180

ttcaaacatg tgtgtacaca gttattttta cacaaattgt agtata 226

<210> 9

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgacaggca ccatctcaac taagtggtca gcattaacat cactagtaat attaagactg 60

ttgacatcat gtgccttttg atagaatgta ctgagatgag ctctctctct ctctctctct 120

ctctctctct tttttttttc ctgagattgg ggtctcctgt tgcagattgg ccttgaactt 180

actttctaac caagatggcc atgaacaact tttaaaaaat acttattttt 230

<210> 10

<211> 233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

attaaattag agggaatata tgtctttcac ttaatactga tgtgctattt cattataata 60

aaaatgtttt aaaaccactc aatttaatct gactgtattc tagtagtagt agtagtagta 120

gtagtagtag tagcagtagt agtagttact tttttatttc tgagacagag attcccttta 180

gcctcagctg gcctggaaca cagtgtagac caggttggcc ttgatctcac aga 233

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agggaacaaa gatggcacac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcccagagat cattttcagg 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gctagaaccc aggaagcagt tat 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tatactgtct gcttaggccc atc 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtaaggtga agagggacag agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctgaactagt gcgttcccta aag 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagtaaaagt acctgctgcc aag 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctaggccatc tctttgagtc ctt 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttgttaaaac caggattcac agc 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccaaaatgct gaaagaaaac ttg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

taagctggat gaaaactcca aag 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

acaattagat ggatggatgg atg 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tagcaagatc ctgtctctca tgc 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttaaggatca ggggatactc agc 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctcacagaat gtttgatgga gtg 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

caaaattgct aacagttgct acg 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tgacatcatg tgccttttga tag 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tggccatctt ggttagaaag taa 23

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgtctttcac ttaatactga tgtgct 26

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gggaatctct gtctcagaaa taaaa 25

Claims

1.一种高原鼢鼠多态性微卫星分子标记，其特征在于：所述微卫星分子标记是SEQ IDNO:1~ SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

2. 一种权利要求1所述的高原鼢鼠多态性微卫星分子标记的扩增引物，其特征在于：所述扩增引物是SEQ ID NO:11和12所示的引物对、SEQ ID NO:13和14所示的引物对、SEQID NO:15和16所示的引物对、SEQ ID NO:17和18所示的引物对、SEQ ID NO:19和20所示的引物对、SEQ ID NO:21和22所示的引物对、SEQ ID NO:23和24所示的引物对、SEQ ID NO:25和26所示的引物对、SEQ ID NO:27和28所示的引物对和SEQ ID NO:29和30所示的引物对。

3.一种用于高原鼢鼠及其近缘种种群遗传结构和遗传多样性分析的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2所述的扩增引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR产物克隆测序、毛细管电泳检测、聚丙烯酰氨凝胶电泳检测试剂。

5.一种用于高原鼢鼠及其近缘种种群遗传结构和遗传多样性分析的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1) 提取待检鼢鼠样本的基因组总DNA；

(2) 检测SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列变异，分析，即可；

步骤(2)所述检测的步骤如下：

1）以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的扩增引物或权利要求3或4所述的试剂盒进行PCR扩增得到扩增产物；

2）对步骤1）所得PCR扩增产物进行克隆测序、毛细管荧光电泳或聚丙烯酰氨凝胶电泳检测；

3）对步骤2）的检测结果进行微卫星位点多态性评估。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的样本为肝脏、肌肉组织样本。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤1）的扩增条件为95℃预变性3min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10个循环；第二轮PCR扩增条件：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最终72℃修复延伸8 min。