CN114438223B - 一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用。本发明提供21个戴氏山鳅的微卫星标记，以及相应扩增引物对，并将其应用于戴氏山鳅遗传多样性的研究中，不仅解决了目前没有戴氏山鳅鱼类核基因标记的现状，并能辅助形态学方法鉴定戴氏山鳅鱼类，为山鳅属鱼类遗传结构分析、遗传资源保护提供数据、奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用。
背景技术
微卫星标记(microsatellite)，又称短串联重复序列(simple tandemrepeats,STRs)或简单序列重复(simple sequence repeats,SSR)。它是以短核苷酸(1-6个碱基)为基本单位首尾相连组成串联重复序列，碱基数量和拷贝数的差异造成了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计一对特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。
戴氏山鳅(Claea dabryi(Sauvage))隶属于鲤形目(Cypriniformes)鳅超科(Cobitoidea)条鳅科(Nemacheilidae)山鳅属(Claea)鱼类，为中国特有种，长江上游特有鱼类，也是山鳅属唯一一种鱼类。近年来对戴氏山鳅的研究主要集中在与条鳅科其他属种的形态学比较及其分类地位上，对其遗传多样性和遗传结构的研究很少，基于核基因开发的标记进行的研究几乎没有。因此，开发出戴氏山鳅鱼类的微卫星标记，并将其应用于戴氏山鳅遗传多样性的研究中具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种戴氏山鳅鱼类多态性微卫星标记及其扩增引物和应用，即提供21个戴氏山鳅的微卫星标记，以及相应扩增引物对，并将其应用于戴氏山鳅遗传多样性的研究中，不仅解决了目前没有戴氏山鳅鱼类核基因标记的现状，并能辅助形态学方法鉴定戴氏山鳅鱼类，为山鳅属鱼类遗传结构分析、遗传资源保护提供数据、奠定基础。
为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
提供一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记，所述微卫星标记的核苷酸序列分别如SEQ IDNO：1-21所示。
本发明还提供了用于扩增戴氏山鳅鱼类多态性微卫星标记的引物对，所述引物对为：
上下游序列分别为SEQ ID NO：22(Cda005-F)、SEQ ID NO：23(Cda005-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的微卫星标记(Cda005)；
上下游序列分别为SEQ ID NO：24(Cda017-F)、SEQ ID NO：25(Cda017-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：2(Cda017)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：26(Cda019-F)、SEQ ID NO：27(Cda019-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：3(Cda019)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：28(Cda022-F)、SEQ ID NO：29(Cda022-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：4(Cda022)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：30(Cda028-F)、SEQ ID NO：31(Cda028-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：5(Cda028)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：32(Cda030-F)、SEQ ID NO：33(Cda030-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：6(Cda030)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：34(Cda035-F)、SEQ ID NO：35(Cda035-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：7(Cda035)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：36(Cda036-F)、SEQ ID NO：37(Cda036-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：8(Cda036)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：38(Cda041-F)、SEQ ID NO：39(Cda041-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：9(Cda041)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：40(Cda049-F)、SEQ ID NO：41(Cda049-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：10(Cda049)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：42(Cda053-F)、SEQ ID NO：43(Cda053-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：11(Cda053)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：44(Cda058-F)、SEQ ID NO：45(Cda058-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：12(Cda058)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：46(Cda059-F)、SEQ ID NO：47(Cda059-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：13(Cda059)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：48(Cda061-F)、SEQ ID NO：49(Cda061-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：14(Cda061)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：50(Cda072-F)、SEQ ID NO：51(Cda072-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：15(Cda072)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：52(Cda073-F)、SEQ ID NO：53(Cda073-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：16(Cda073)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：54(Cda077-F)、SEQ ID NO：55(Cda077-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：17(Cda077)的微卫星标记。
上下游序列分别为SEQ ID NO：56(Cda082-F)、SEQ ID NO：57(Cda082-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：18(Cda082)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：58(Cda083-F)、SEQ ID NO：59(Cda083-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：19(Cda083)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：60(Cda086-F)、SEQ ID NO：61(Cda086-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：20(Cda086)的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：62(Cda088-F)、SEQ ID NO：63(Cda088-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：21(Cda088)的微卫星标记。
本发明提供了一种上述戴氏山鳅鱼类微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在检测戴氏山鳅鱼类种群遗传多样性中的应用。
按上述方案，所述应用包括如下步骤：
(1)提取戴氏山鳅鱼类基因组DNA；
(2)微卫星PCR扩增：将序列为SEQ ID NO：22-63的引物对分别进行荧光标记后，以步骤(1)所得戴氏山鳅鱼类基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；
(3)测序仪检测扩增产物：将步骤(2)所得扩增产物避光保存，进行毛细管电泳和STR分析；
(4)遗传多样性分析：根据每个戴氏山鳅鱼类个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，计算遗传多样性参数。
优选地，步骤(1)采用磁珠法基因组DNA提取试剂盒提取戴氏山鳅鱼类鳍条组织的基因组DNA。
优选地，步骤(2)中所述荧光标记为FAM标记。
优选地，步骤(3)中用ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析。
优选地，步骤(4)中采用Cervus 3.0计算遗传多样性参数。
本发明提供了一种所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在辅助鉴定戴氏山鳅种类、保护戴氏山鳅鱼类物种资源方面的应用。
本发明的有益效果为：
1.本发明从戴氏山鳅鱼类基因组DNA中筛选21个微卫星标记，并得到相应扩增引物对，将其应用于戴氏山鳅遗传多样性的研究中，不仅解决了目前没有戴氏山鳅鱼类核基因标记的现状，并能辅助形态学方法鉴定戴氏山鳅鱼类，为山鳅属鱼类遗传多样性检测、遗传结构分析、辅助鉴定该种类、保护物种资源等领域提供数据、奠定基础。
2.本发明根据微卫星重复序列两端的侧翼区设计适用性引物并进行扩增，获得的扩增产物具有较高的多态性和较好的稳定性。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
对于实施例中未注明具体条件的实施方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实施指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
实施例1
1、含有微卫星重复单元的序列的查找
从构建的戴氏山鳅鱼类基因文库的序列中用软件SSRHunter1.3进行微卫星重复单元序列的查找；参数设置为查找含有二碱基、三碱基和四碱基重复数5次以上的序列。共筛选出96个含有微卫星重复单元的序列，并从中设计引物进行多态性的检测。
2、微卫星引物的设计：
从含有微卫星重复单元的基因序列中，选取符合引物设计的序列使用PrimerPremier 5.0进行引物设计。主要参数设置为：引物长度17-25bp，20bp为最适长度，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65℃。GC含量一般在40％-60％之间，尽量避免二级结构出现。
3、对设计的引物的扩增产物进行多态性检测：
(1)基因组DNA的提取：
采用磁珠法基因组DNA提取试剂盒(生产厂家，NanoMagBio)提取38尾戴氏山鳅鱼体鳍条组织的基因组DNA；
(2)微卫星PCR扩增：
采用FAM荧光接头引物，两步法扩增，其中M13序列5'-3'：TGTAAAACGACGGCCAGT，扩增体系和程序如下：
第一步：接头引物扩增
①扩增体系为：
②扩增程序为：
第二步：荧光引物扩增
①扩增体系为：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 2×Taq PCR Master Mix(生产厂家，GeneTech) | 5.0 |
| 第一步PCR产物 | 1.0 |
| M13荧光引物(浓度10pmol/μl) | 0.3 |
| 下游引物(浓度10pmol/μl) | 0.3 |
| ddH2O | 3.4 |
| 总体积 | 10.0 |
②扩增程序为：
(3)测序仪检测扩增产物：
将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析以确定戴氏山鳅鱼类微卫星标记在不同个体上的等位基因大小。
(4)遗传多样性分析：
根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，采用Cervus 3.0计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的微卫星标记。
经过多样性检测，本发明共筛选出21个具有遗传多态性的微卫星标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-21所示，其所对应的扩增引物的信息如表1所示。
表1.戴氏山鳅鱼类微卫星标记及其对应的引物
在戴氏山鳅鱼类38个样本中对上述21个微卫星标记进行遗传多样性分析，结果如表2所示。表2结果表明：每个微卫星标记的等位基因数目(N)从3到12不等，平均等位基因数目为7个，观测杂合度(HO)的范围从0.237到0.842，平均值为0.644，期望杂合度(HE)的范围从0.287到0.847，平均值为0.676，多态信息含量PIC的范围从0.272到0.816，平均值为0.624。从而证明本发明筛选的微卫星标记和设计的引物具有较高的遗传多态性。
表2. 21个戴氏山鳅微卫星标记的片段长度和多态性等相关信息
本发明的微卫星标记及其扩增引物还可用于戴氏山鳅鱼类的遗传结构分析、辅助形态学方法鉴定戴氏山鳅种类、物种资源保护等领域研究。
序列表
<110> 水利部中国科学院水工程生态研究所
<120> 一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda005
<400> 1
TGACACGCTGACAATAAAACAACTGCACAACCTGCAGCCAACACACTACAGCTTCAACACCACTACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTACTGCAAAGTACTGGCTGAACTCCACAGACTTTACAGTTTCTTTTTTGTGACACACACAAGCACACAGAGACAAACAGCGCTGAGCTGTCATCTACACAAAAACGCATGCAGTGGCAGCAGAGTCAGTCCACGGAGACGCAAATAGCATCCGCCGCGTCTCACACAAACATCGC
<210> 2
<211> 270
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda017
<400> 2
TGTGCTAATAGACGGACAAGCCAAAGGGACCTGGTGCGCGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTCTCCATCTGTACAGTACATGAGCTCTTTTCCCCTCTTCTGGGAACAGTGCCATCAACAGAATTAACCAAATCAGTTCAGCACACGTCAGGTTAATACAGCAGTGACTAACATTAATGGCAGGGCTGCTTGTTTCAGTGCCAGAGTTAGTCTCATTTGAATGTGAATAGTGTTTACCACTGAGAGCAGCTTGTAAGGA
<210> 3
<211> 269
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda019
<400> 3
AGAAATCTTATAGAACTGTACATCAGTCACCGTCTTGTATGCCTGTTAAACGGAAAAATAAATCATGTCCTGCTGCCTCCCTGATAACCTTTGTGTATGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAATCGATTACCCTCTATGGCATTGAAGTGTGGGGTCTACTGACAAATCCAAATCAAGATTTTACTAAATGGGAAAAACATCCAATTGAGAGCCTGCATACAAACCTCTGTAAAAATATCTTACAAATGCA
<210> 4
<211> 265
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda022
<400> 4
ATTTAGTATGTTTTTTTAAGAGATTTAGTTTACGAGGACACAGGAAGTGTCCCCGTTAACCATGTTTACGCACTGTCTCTCTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACATTTGTGCAGGAATGTGTGCCGTGTTAGAGACAAACACAGTCTAATTCTTCATGTCTACGGAGAAACTCACGCCTCTCATTTCCCGTTTGTGTTGGGGCAGTCGTGGCCTAATGGTTAGAGAGTCGGACTCGTGACCAGAAGGTTG
<210> 5
<211> 263
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda028
<400> 5
ACGTGTTTTGCGGGACTTGTGAGACGTACAGGGAGAGTAAAATTGCCTTTTGGTGCCATTTTTCAGCACAATTATCTTGATAACGCTTTTATTCAGTATGTAACCCGCCTCTTATTGGGAGATGTAACAGACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGATTGTTGTTAAAGAATAATAACGTTCAGGGCTGAACTCTAGGAATTCTGGGTACTGGCTGTGAATAGCATCAGGTTTTATGTTTCCTGAACTTGTATGT
<210> 6
<211> 262
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda030
<400> 6
TGAGCCCTTCCATCTGACCATTTGTTCTGTCATACATGTCTATTGTTCCCTCGTGAATCAGTCGGCTGCTTGTATGGAATGAGTCACCACATTCATGCACACACACACACACACACACACACACACACACACAAACAAAAAAGCAGGTAGAAAAAGAGCAGATTATGTTAACCCAAACATTTTTATTCTAATGTCCATGTTCATTGTGTGTGCATGGTGACTCATAAAGTCACCTACATTTAGCTACCCAAAAATGAAAATT
<210> 7
<211> 259
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda035
<400> 7
AGGGTCTTCAGTTCGCACAGATGCTTGTTCAGGATGAAGAGCCGCTGGTCGGCATCAGCCAGGTGTCAAACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCATCCCGTTGTGTCAAAATTCATGCGTCATCATCACAGGACTGTTTAAGAAAAGAAAAGTTAACCTTGTGTGTGTGCTCGTAAGGTGGTGGACGTGTTCATGGAGGGGAATCTAGTACAACAGTGTACTTCGTTCTTATTGGACGCTCTGAAGAGCAACAGG
<210> 8
<211> 259
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda036
<400> 8
TTCATCATACTCACAGCGACGGTGTTGAGAGAGCCGCTCAGCTCCACCAGAGCATCATGAGCCGCCAGAGCCTCAAACTTATTGGCCGCAGTCACGAACGGCAGACCTGAGAAGTGAGCGGCGACACTTCTTACACACGTTAATGCGATTCACACGTGTGTGTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGCGACACCTGTCAGTGCGGAAACTTTATCTGCCACTTTCTCAGCAAACCCAATGCGTGTGTTGAGT
<210> 9
<211> 256
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda041
<400> 9
TGCAGTTAATACTGCATATTAAAACGGTTCATACTGTGCATTGGGCAAAGGGCATTCAGCGCAGGCTTGTTATGCCTGCACCAGACAGCCAGCAGAGCAACCTCTCTATACGCGCACGCGCGCGCGCACACACACACACACACACACAGTGTTATTCATATTTATAAACTGTTCATTGCTCTTTTTTAGACACAAAACCAAAAAAAGCGAATAAGAGAAAATCGAGACGGTCCCTAAAATGAGCGTGAACAAGAAA
<210> 10
<211> 248
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda049
<400> 10
ATACAAGATTCACCCCCACGCTCACTTAGTAAATTATTCACTGACACCTAATACTGACATGAATAGGTCTGACCTGTGTCTCTGTGTTTATTTTAATAAAGGAAATAGGCTGCATGTCTTTTTCTTTTTAGGTCAGAATATTGGTGCTTCTTTAATCACGATTGCTCATTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTCTTTCTCTCAGATGCCCCATGCTCCAGCATGTTGGGAATGGTTT
<210> 11
<211> 244
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda053
<400> 11
ACATCTTTACTCTGTATTATAGTATAAGTATATAGTACATCATTTTGCTGTAAACCTATGTGCGTGTAAAGTGGAAAATATAAGATGGGCAGGAAAAGAAAAGCCACTTTTCGCACAAACCATTCACACCTCTCAAACACACACACACACACACACACACACAACACATCAATAGACAAACACACAGTCATGTCCACCAGCAGAACAAAACCACATCTCTTTCCACCCTGACACAATGATGTCA
<210> 12
<211> 240
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda058
<400> 12
AAGCAGTCAAAGGCATTGCTGTAAAACTAGAGAGACTCTTAGAAGGACTGTATAAAATATTGCCTCTAGCAGCAGCAGCCAATGGGTCTTTAGCAGGGAGGGAGGTGAGCGCGCGCGCGAGCGAGCGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGGCTGGCTGCTGCTGCGCTGAATGGAAGTTGCTGTAAGTGCGCTGGATTTGTACACAGTTTTACTTGCTTTTAA
<210> 13
<211> 240
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda059
<400> 13
AAAAGCCACATTCATGATGTCACATCCTGTTTAGAGAGAAACATTCTGTTTGAAAAATGGCTGCATTGTCAGTCGTACTGGGAGTTTATGTTCACTTAATCACACAAACAAACACACACACACACACACACACAAAGACACACACCGAAATAAGAAAAAAAGCCAGTCACCTTAAGAAAGTTTGCCATGGTGCTCACATGGTTTGCACACTGTCCTTTTCTGGCATCTTTAACACCCTCC
<210> 14
<211> 235
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda061
<400> 14
TCTTTTCAGCTGTCTGGGTAAATATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTCTGCCATTTATTGTTTCTGTACAGCCTCAATGAGAGAACTCTACACAACACACAGTTGTGATGTGCTACGGCCCTTAACACTAACATGAACTAGTCTAGAGAGCTCTATTTGAAACCCCAATCGCACAACCGAACGAGTTTATGGCGTCCAAAAACACTGTCTAGCAAGACAGCAC
<210> 15
<211> 218
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda072
<400> 15
AAACATTAAATTTGTGAATAAATGACAATCATTTCTACAGTGCATGTGTGTGTGCATGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTCTCCGTACTACAGCGAACACACGTTCCCAACATTAGAGAAGGAGACCAGTCACTTCCAGGCCCAGGGAAATGTGCTCATCTGTGGGGACCTGAACGCCAGAACAGCACTACAG
<210> 16
<211> 212
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda073
<400> 16
AGACCCAGCCCAGAAGATTCGTACTGTGGGAGACAGCAGAACACACACCGTGAGGAACAGACGTGTTTTTATAAATCAAACAAACACAGACACAGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTGAGCGTAAACCCCAAAGCCTCAGACTGCAAACGCTACCGCTTTCCAGGAATTTTCACTTCTAACATACAGTTCCCA
<210> 17
<211> 278
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda077
<400> 17
ACTTGAAACACTCAAAAACTGCCAACAGTGGTTACTAATGCATGAAAATGAAATATGCAATGAAATACAACACAAAAATAACAAACATCACGATTCCTCCATCCTGACTCATTACAATCTCCTATGAGAACATCACAAAGCATTGGCCCCACCTCCAGCCCCTCACTCAGAGGACCTGTAGAGGTCTAGCCATATGTGAGAGCCTTTGTTGGAAAGGACACACACACACACACGTACAGCACAAATCTGAGAAGCAGTGGGAGGCTGCGGCTCTAGGG
<210> 18
<211> 277
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda082
<400> 18
AGCTCGCATCTCTCTCTCTTTCGCTCATCGAGACACGGGAGTTGACGGGAGGTAATCCCCTCCATGTGAGGAGGCGGCACGAGCGCGGAGGCGTGTTGTTTTCCATTCAAATCCTTACTAGTCCTATAAAAAGCTGGAGAGAGAGAAAGATAAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGTGTCTGTGTATGTGTATGTATATATCCAGTACGCGGTCGTGCACACGCGTTCATCCATCACAGCGCTGCTGCCGCCGCTGCCGCTGCT
<210> 19
<211> 277
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda083
<400> 19
AAAGCAAACAGATGCCTCAACACAAGCACACACACACACACACACACAGAGTAAAGCAGGAAGGGGTGTAAATTGTAGTAAATGTGAAAAATGTTCTCTGATACCACACGCACACACACCCACACTGAGACACGCACACACAGAGTAAAGCACTTGAGGAAGGGGTGTAAATTGTAGTAAATGTGGAAAATGTTCTCCGATAGCACACGCACACACACTGAGACACACACACAGTCGAGGCATTCTCAGCAGCTCGATGTGAACGTGTTTAAAGAGA
<210> 20
<211> 276
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda086
<400> 20
CTCCTAAAGATAGCGGTGGTTCAGATGTGACGAAGTATGTGGTGGAGATGTCTGCTGATTTAAGTGGTACGTTTCAGTGACATTTTCACCTTTCTGTATACTCTCATGTTAATGATGTCATTATTATGGTAGTTCATTGATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTCAGGTTGCACATGGAGTCGAGTGTACAGCGGTTTAGGAACGGAGTGTGCTTGTGATGGTCTGAGTCCAGGAGGTTCATACCAGGCCAGAGTCCACTGCATCAGCG
<210> 21
<211> 276
<212> DNA
<213> 戴氏山鳅鱼类微卫星分子标记Cda088
<400> 21
ACACACAACTGTCTGCTCTTTTACATTTACACAAAAGTTTATTCTGTGTGATTTATAAGCTTGTTTCCTCATGGGGACAAAAAATGAATATGGGACATTTTGTCCCCATACCGTAGGGTTTACCCTTCCACACCCTCACACACAGAGGCACTCACGCACACACACACACACACACACACATTTTGTGAATGAATGCACATTCTATAGAAGGCTTCAAAGCAACAACATGAACAAACGTTACTGCGCATGCATGCTTTTGTGACCCCAGCTTAACTT
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda005-F
<400> 22
AACCTGCAGCCAACACACTA
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda005-R
<400> 23
CTCAGCGCTGTTTGTCTCTG
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda017-F
<400> 24
ATAGACGGACAAGCCAAAGG
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda017-R
<400> 25
ACCTGACGTGTGCTGAACTG
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda019-F
<400> 26
TGCCTCCCTGATAACCTTTG
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda019-R
<400> 27
GCAGGCTCTCAATTGGATGT
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda022-F
<400> 28
AGTGTCCCCGTTAACCATGT
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda022-R
<400> 29
GAGGCGTGAGTTTCTCCGTA
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda028-F
<400> 30
TGTAACCCGCCTCTTATTGG
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda028-R
<400> 31
CCTGATGCTATTCACAGCCA
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda030-F
<400> 32
GTCGGCTGCTTGTATGGAAT
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda030-R
<400> 33
CCATGCACACACAATGAACA
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda035-F
<400> 34
GCACAGATGCTTGTTCAGGA
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda035-R
<400> 35
TGAACACGTCCACCACCTTA
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda036-F
<400> 36
AACTTATTGGCCGCAGTCAC
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda036-R
<400> 37
AAGTTTCCGCACTGACAGGT
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 微卫星引物序列Cda041-F
<400> 38
CGGTTCATACTGTGCATTGG
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda041-R
<400> 39
TCATTTTAGGGACCGTCTCG
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda049-F
<400> 40
ATACAAGATTCACCCCCACG
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda049-R
<400> 41
CATGGGGCATCTGAGAGAAA
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda053-F
<400> 42
AAGCCACTTTTCGCACAAAC
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda053-R
<400> 43
TCATTGTGTCAGGGTGGAAA
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda058-F
<400> 44
CAATGGGTCTTTAGCAGGGA
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda058-R
<400> 45
CGCACTTACAGCAACTTCCA
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda059-F
<400> 46
TTTGAAAAATGGCTGCATTG
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda059-R
<400> 47
GGAGGGTGTTAAAGATGCCA
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda061-F
<400> 48
TCTTTTCAGCTGTCTGGGTAAA
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda061-R
<400> 49
AGACAGTGTTTTTGGACGCC
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda072-F
<400> 50
CTACAGTGCATGTGTGTGTGC
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda072-R
<400> 51
AGATGAGCACATTTCCCTGG
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda073-F
<400> 52
CTGTGGGAGACAGCAGAACA
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda073-R
<400> 53
AGTCTGAGGCTTTGGGGTTT
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda077-F
<400> 54
ATCACGATTCCTCCATCCTG
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda077-R
<400> 55
CCTCCCACTGCTTCTCAGAT
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda082-F
<400> 56
GGAGGTAATCCCCTCCATGT
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda082-R
<400> 57
AGCGCTGTGATGGATGAAC
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda083-F
<400> 58
AGCAAACAGATGCCTCAACA
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda083-R
<400> 59
ACCCCTTCCTCAAGTGCTTT
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda086-F
<400> 60
GGTGGTTCAGATGTGACGAA
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda086-R
<400> 61
TCTGGCCTGGTATGAACCTC
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda088-F
<400> 62
GACATTTTGTCCCCATACCG
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213>微卫星引物序列Cda088-R
<400> 63
CATGCGCAGTAACGTTTGTT
Claims (5)
1.一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记组，其特征在于，所述微卫星标记组的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-21所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述的戴氏山鳅鱼类多态性微卫星标记组的引物对组，其特征在于，所述引物对组为：
上下游序列分别为SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQID NO：1所示的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：2的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：3的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：4的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：5的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：6的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：7的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：8的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：9的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：10的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：11的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：12的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：13的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：14的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：15的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：16的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：17的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：18的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：19的微卫星标记；
上下游序列分别为SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：20的微卫星标记；和
上下游序列分别为SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID NO：21的微卫星标记。
3.一种权利要求1所述的戴氏山鳅鱼类微卫星标记组或权利要求2所述的扩增所述微卫星标记组的引物对组在检测戴氏山鳅鱼类种群遗传多样性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
(1)提取戴氏山鳅鱼类基因组DNA；
(2)微卫星PCR扩增：将序列为SEQ ID NO：22-63的引物对分别进行荧光标记后，以步骤(1)所得戴氏山鳅鱼类基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；
(3)测序仪检测扩增产物：将步骤(2)所得扩增产物避光保存，进行毛细管电泳和STR分析；
(4)遗传多样性分析：根据每个戴氏山鳅鱼类个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，计算遗传多样性参数。
5.一种权利要求1所述的戴氏山鳅鱼类微卫星标记组或权利要求2所述的扩增所述微卫星标记组的引物对组在辅助鉴定戴氏山鳅种类、保护戴氏山鳅鱼类物种资源方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210079733.3A CN114438223B (zh) | 2022-01-24 | 2022-01-24 | 一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210079733.3A CN114438223B (zh) | 2022-01-24 | 2022-01-24 | 一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN114438223A CN114438223A (zh) | 2022-05-06 |
| CN114438223B true CN114438223B (zh) | 2023-07-18 |
Family
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Family Applications (1)
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| CN202210079733.3A Active CN114438223B (zh) | 2022-01-24 | 2022-01-24 | 一种戴氏山鳅鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用 |
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2022
- 2022-01-24 CN CN202210079733.3A patent/CN114438223B/zh active Active
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