CN105861713A - 紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法 - Google Patents

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CN105861713A CN201610344905.XA CN201610344905A CN105861713A CN 105861713 A CN105861713 A CN 105861713A CN 201610344905 A CN201610344905 A CN 201610344905A CN 105861713 A CN105861713 A CN 105861713A
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许国绿
吴欣
沈和定
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Abstract

本发明公开了一种紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法；包括：构建紫色疣石磺转录组测序文库，进行Illumina HiseqTM2000双末端测序；基于测序获得的序列，经MISA对微卫星位点进行分析、筛选；利用SSRHunter1.3进行再次筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物；使用SSR引物对紫色疣石磺群体的基因组DNA进行PCR扩增；聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物的不同迁移距离确定每个位点在进行群体检测时的基因型。共获得7个多态性的微卫星标记，从而获得紫色疣石磺遗传变异的多态性图谱，本发明简单、快捷、结果真实可靠，开发的SSR标记可用于紫色疣石磺群体遗传学和石磺科贝类间的系统发生研究。

Description

紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法
技术领域
本发明属于微卫星分子标记领域，具体涉及一种紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法。
背景技术
生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列和散布重复序列。其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、成串排列而成的。目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成的(如rRNA和组蛋白基因)；另一类是由无功能的序列组成的。根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。
研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site，简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
作为海洋无脊椎动物向陆地延伸的过渡物种，石磺科贝类被认为是研究海洋贝类向陆地辐射生活的最好代表，但是在紫色疣石磺的研究中，未见利用分子标记研究其遗传多样性的报道，本发明中利用高通量测序技术开发的7个微卫星标记位点，不仅为研究紫色疣石磺的遗传多样性提供了基础数据，也可用于石磺科贝类间种系发生关系的研究中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法。本发明利用Illumina HiseqTM2000高通量测序技术、MISA和SSR Hunter1.3软件针对现有的分子标记研究紫色疣石磺遗传多样性的缺乏，对紫色疣石磺进行微卫星序列的查找，开发的SSR标记可用于紫色疣石磺群体遗传学和石磺科贝类间的系统发生研究，并为紫色疣石磺的群体种质保护提供技术支持。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，所述方法包括如下步骤：
S1、构建紫色疣石磺转录组测序文库，进行Illumina HiseqTM2000双末端测序；
S2、基于所述测序获得的序列，经MISA对微卫星位点进行分析、筛选；
S3、利用SSRHunter1.3对经MISA筛选过的含有微卫星位点的序列进行再次筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物；
S4、SSR引物设计与合成；
S5、使用SSR引物对紫色疣石磺群体的基因组DNA进行PCR扩增；
S6、使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物的不同迁移距离确定每个微卫星位点在进行群体检测时的基因型；根据结果，使用Cervus3.0软件计算每个微卫星位点的等位基因数(number of allele，Na)，观测杂合度(observedheterozygosity，Ho)，期望杂合度(expected heterozygosity，He)，多态性信息含量(polymorphic information content，PIC)，使用Genepop4.2进行每个位点的Hardy-Weinberg平衡的检测。
优选的，步骤S2中，经MISA对微卫星位点进行分析、筛选时，对于非混合型位点筛选时，设置条件为单碱基重复至少10次，2碱基重复至少6次，3-6碱基重复至少5次，在此基础上，如同一序列中两个SSR位点间离小于50bp，则认为这两个SSR位点组成一个混合型SSR位点。
优选的，步骤S3再次筛选出的含有微卫星位点的序列如SEQ ID NO：1～7所示。具体包括：PV6(SEQ ID NO：1)、PV9(SEQ ID NO：2)、PV13(SEQ ID NO：3)、PV25(SEQ ID NO：4)、PV26(SEQ ID NO：5)、PV30(SEQ ID NO：6)、PV32(SEQID NO：7)序列。
优选的，步骤S4中，SSR引物设计是利用Primer Premier5.0进行引物设计，引物长度为19～26bp，GC含量在40％～60％之间，引物Tm值小于72℃，且上下游引物Tm值差别不能大于2℃，扩增引物长度在100～300bp，所设计引物长度在100～300bp，所设计引物在侧翼保守序列内。
优选的，步骤S4中，SSR引物设计后还包括筛选SSR引物的步骤，包括：随机选取5个紫色疣石磺个体，提取其DNA并将其混合作为引物特异性和最适退火温度筛选时的模板DNA，根据每对引物的Tm值设置间隔为1.5℃的温度梯度，共设置8个温度梯度，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出扩增清晰条带单一的引物留用。
优选的，步骤S5中，所述SSR引物序列如SEQ ID NO：8～21所示。具体包括：PV6标记的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：8所示，下游引物序列如SEQ ID NO：9所示；PV9标记的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：10所示，下游引物序列如SEQ ID NO：11所示；PV13标记的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：12所示，下游引物序列如SEQ IDNO：13所示；PV25标记的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：14所示，下游引物序列如SEQ ID NO：15所示；PV26标记的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：16所示，下游引物序列如SEQ ID NO：17所示；PV30标记的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：18所示，下游引物序列如SEQ ID NO：19所示；PV32标记的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQID NO：20所示，下游引物序列如SEQ ID NO：21所示。
优选的，步骤S5中，PCR扩增采用的PCR反应体系为10μL，包括上下游SSR引物各0.3μL，2×Taq PCR Master Mix5μL，ddH2O 4μL，DNA模板0.4μL。
优选的，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，退火30s，72℃30s，共40个循环；72℃延伸10min。
优选的，步骤S6中，PCR扩增产物是用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
优选的，步骤S6中，确定基因型之后还包括根据结果，使用Cervus3.0软件设计每个微卫星位点的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态性信息含量，使用Genepop4.2进行每个位点的Hardy-Weinberg平衡检测的步骤。
本发明还涉及一种紫色疣石磺微卫星标记，其序列如SEQ ID NO：1～7所示。
优选的，与上述紫色疣石磺微卫星标记相对应的特意引物序列，如SEQ IDNO：8～21所示。其中，与SEQ ID NO：1所示序列标记相对应的上游引物序列如SEQ ID NO：8所示，下游引物序列如SEQ ID NO：9所示；与SEQ ID NO：2所示序列标记相对应的上游引物序列如SEQ ID NO：10所示，下游引物序列如SEQ IDNO：11所示；与SEQ ID NO：3所示序列标记相对应的上游引物序列如SEQ ID NO：12所示，下游引物序列如SEQ ID NO：13所示；与SEQ ID NO：4所示序列标记相对应的上游引物序列如SEQ ID NO：14所示，下游引物序列如SEQ ID NO：15所示；与SEQ ID NO：5所示序列标记相对应的上游引物序列如SEQ ID NO：16所示，下游引物序列如SEQ ID NO：17所示；与SEQ ID NO：6所示序列标记相对应的上游引物序列如SEQ ID NO：18所示，下游引物序列如SEQ ID NO：19所示；与SEQ IDNO：7所示序列标记相对应的上游引物序列如SEQ ID NO：20所示，下游引物序列如SEQ ID NO：21所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明利用高通量测序技术对紫色疣石磺进行微卫星分子标记的开发不仅比传统方法更为快捷，花费更少，而且在获得微卫星位点的同时可以查找对应EST序列的功能性状，与基因关联性较强。
2)相比于基因组SSR，基于转录组EST序列开发的SSR多态性较低，本实验获得的具有多态性的微卫星位点表明湛江紫色疣石磺野生群体的遗传多态性处于中度多态性水平。
3)本发明开发出的微卫星位点，不仅为研究紫色疣石磺的遗传多样性提供了基础数据，也可用于石磺科贝类间种系发生关系的研究中。
附图说明
图1为PV6(SEQ ID NO：1)紫色疣石磺微卫星标记的电泳图，其中，a为33个样本中第一批进行电泳实验的21个样本的电泳图，b为第二批进行电泳实验的12个样本的电泳图；
图2为PV9(SEQ ID NO：2)紫色疣石磺微卫星标记的电泳图，其中，a为34个样本中第一批进行电泳实验的21个样本的电泳图，b为第二批进行电泳实验的13个样本的电泳图；
图3为PV13(SEQ ID NO：3)紫色疣石磺微卫星标记的电泳图，其中，a为32个样本中第一批进行电泳实验的20个样本的电泳图，b为第二批进行电泳实验的12个样本的电泳图；
图4为PV25(SEQ ID NO：4)紫色疣石磺微卫星标记的电泳图，其中，a为32个样本中第一批进行电泳实验的26个样本的电泳图，b为第二批进行电泳实验的6个样本的电泳图；
图5为PV26(SEQ ID NO：5)紫色疣石磺微卫星标记的电泳图，其中，a为34个样本中第一批进行电泳实验的22个样本的电泳图，b为第二批进行电泳实验的12个样本的电泳图；
图6为PV30(SEQ ID NO：6)紫色疣石磺微卫星标记的电泳图，其中，a为34个样本中第一批进行电泳实验的20个样本的电泳图，b为第二批进行电泳实验的14个样本的电泳图；
图7为PV32(SEQ ID NO：7)紫色疣石磺微卫星标记的电泳图，其中，a为32个样本中第一批进行电泳实验的19个样本的电泳图，b为第二批进行电泳实验的13个样本的电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例
1.1实验材料
实验材料于采自广东湛江海滩，样本经鉴定后均保存于95％无水乙醇并置于-20℃冰箱中备用。
1.2实验方法
1.2.1紫色疣石磺转录组测序结果
随机挑选6只采自湛江的紫色疣石磺个体进行活体解剖将解剖得到的不同组织保存于RNAlater中用于构建转录组测序文库并送晶能公司(GenergyBiotechnology)进行Illumina HiseqTM2000双末端测序。
1.2.2微卫星序列的来源
根据晶能公司(Genergy Biotechnology)基于Illumina HiseqTM2000测序平台所得的拼接序列，经MISA(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对微卫星位点进行分析，对于非混合型位点筛选时，设置条件为单碱基重复至少10次，2碱基重复至少6次，3-6碱基重复至少5次，在此基础上，如同一序列中两个SSR位点间离小于50bp，则认为这两个SSR位点组成一个混合型SSR位点，在设计引物前利用SSRHunter1.3对经MISA筛选过的含有微卫星位点的序列进行再次筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物，筛选条件和第一次一样，最终筛选出7条含有微卫星位点并适合设计引物的序列：PV6、PV9、PV13、PV25、PV26、PV30、PV32序列，依次如SEQ ID NO：1～7所示。
1.2.3SSR引物设计与合成
利用Primer Premier5.0软件对上一步所得的拼接序列进行引物设计，引物长度为19-26bp，GC含量在40％-60％之间，也可放宽至30％-70％，引物Tm值小于72℃，且上下游引物Tm值差别不能大于2℃，扩增引物长度在100-300bp，所设计引物长度在100-300bp，所设计引物在侧翼保守序列内，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2.4样品DNA的提取
取出之前保存于-20℃冰箱样品，根据天根生化科技(北京)有限公司的海洋动物基因组提取试剂盒(DP324)的要求，在每只样品腹足处各取30mg组织块用于DNA提取，提取后的DNA置于-20℃冰箱暂存备用。
1.2.5PCR扩增及产物检测
PCR反应体系为10μL，包括上下游引物，有：PV6标记(SEQ ID NO：1)的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：8所示，下游引物序列如SEQID NO：9所示；PV9标记(SEQ ID NO：2)的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：10所示，下游引物序列如SEQ ID NO：11所示；PV13标记(SEQ IDNO：3)的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：12所示，下游引物序列如SEQ ID NO：13所示；PV25标记(SEQ ID NO：4)的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：14所示，下游引物序列如SEQ ID NO：15所示；PV26标记(SEQ ID NO：5)的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：16所示，下游引物序列如SEQ ID NO：17所示；PV30标记(SEQ ID NO：6)的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：18所示，下游引物序列如SEQ IDNO：19所示；PV32标记(SEQ ID NO：7)的特异引物序列，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：20所示，下游引物序列如SEQ ID NO：21所示。
上述上下游引物各0.3μL，2×Taq PCR Master Mix5μL，ddH2O 4μL，DNA模板0.4μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，退火30s，72℃30s，共40个循环；72℃延伸10min。产品保存于4℃。引物初筛PCR产物使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，God view染色，电泳条件为：115V，35min，电泳缓冲液为1×TAE，凝胶成像系统拍照。引物进行群体检测时，PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电泳条件为：电压110V，电泳时间6h，电泳缓冲液为1×TBE；电泳结束后用硝酸银对凝胶染色并使用相机进行拍照。
1.2.6紫色疣石磺SSR引物的筛选及群体检测
随机选取5个紫色疣石磺个体，提取其DNA并将其混合作为引物特异性和最适退火温度筛选时的模板DNA，根据每对引物的Tm值设置间隔为1.5℃的温度梯度，共设置8个温度梯度，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，将扩增清晰条带单一的引物留用，确定每对引物的最适退火温度，以便进行后续检测。
选取32、33或34个湛江群体的紫色疣石磺个体，提取DNA，并作为模板，使用初筛后留用的引物，即SEQ ID NO：8～21所示序列的引物进行PCR扩增，PCR反应条件及检测方法遵照上述方法，并对产物进行拍照留存。同时，因为实验用电泳槽每次只能上26个样本，所以分两次实验。其结果如图1～7所示；引物筛选结果统计如下：
35对引物在经过琼脂糖凝胶电泳的初筛之后有13对扩增出清晰单一的条带，扩增率为37％。将这13对引物在湛江群体34(33或32)(因DNA有被氧化现象)个个体中做进一步的聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选，有7个位点表现为多态性，其余位点表现为单态性。在表现出多态性的7个位点中，2个位点的等位基因为3，5个位点表现为2等位基因。7个位点中，2个位点为四碱基重复，5个位点为三碱基重复，且四碱基重复的次数均为5，三碱基的重复次数(除PV25重复次数为7外)均为6。7对引物中最低退火温度为55℃，最高退火温度为63℃，扩增片段的长度在90～290bp之间。
里氏拟石磺湛江群体遗传多样性分析如下：
对7对SSR引物在取自湛江群体的34(33或32)个个体扩增片段进行统计分析，下表中的统计结果显示：7个位点的等位基因数在2～3之间，其中Ho和He分别在0.0667～0.4667和0.0313～0.5266之间，多态性信息含量(PIC)在0.1638～0.4513之间，其中5个位点表现为中度多态性(0.5＞PIC＞0.25)，2个位点表现为低度多态性(PIC＜0.25)。经Sequential Bonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡检验，4个位点不偏离平衡(P＞0.05)，其余3个位点均显著偏离平衡(0.05＞P)。
对SSR引物在7个微卫星位点的特征性描述如下表：
Locus：位点；Ta：退火温度，Annealing temperature；Na：等位基因数numbersof alleles；Ho：观测杂合度observed heterozygosity；He：期望杂合度expected heterozygosity；PIC：多态性信息含量polymorphic informationcontent；Pvalue：P值the test for deviation from HWE
1.2.7数据统计与分析
对湛江群体紫色疣石磺的PCR扩增结果进行统计时，将每个位点的扩增条带按从小到大的顺序标记为A，B，C…，并统计出每个位点在进行群体检测时的基因型，根据结果，使用Cervus3.0软件设计每个微卫星位点的等位基因数，观测杂合度，期望杂合度，多态性信息含量，使用Genepop4.2进行每个位点的Hardy-Weinberg平衡检测。
2结果分析
2.1转录组中SSR位点的软件分析结果
利用MISA软件在紫色疣石磺转录组中查找SSR位点的结果。
2.2紫色疣石磺SSR筛选结果
对经过琼脂糖凝胶电泳初筛之后扩增出来的清晰单一的条带做进一步聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选。
综上所述，本发明利用高通量测序技术对紫色疣石磺进行微卫星分子标记的开发不仅比传统方法更为快捷，花费更少，而且在获得微卫星位点的同时可以查找对应EST序列的功能性状，与基因关联性较强。而相比于基因组SSR，基于转录组EST序列开发的SSR多态性较低，本实验获得的具有多态性的微卫星位点表明湛江紫色疣石磺野生群体的遗传多态性处于中度多态性水平。此外，本发明开发出的微卫星位点，不仅为研究紫色疣石磺的遗传多样性提供了基础数据，也可用于石磺科贝类间种系发生关系的研究中。

Claims (10)

1.一种紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、构建紫色疣石磺转录组测序文库，进行Illumina HiseqTM2000双末端测序；
S2、基于所述测序获得的序列，经MISA对微卫星位点进行分析、筛选；
S3、利用SSRHunter1.3对经MISA筛选过的含有微卫星位点的序列进行再次筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物；
S4、SSR引物设计与合成；
S5、使用SSR引物对紫色疣石磺群体的基因组DNA进行PCR扩增；
S6、使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物的不同迁移距离确定每个微卫星位点在进行群体检测时的基因型；根据结果，使用Cervus3.0软件计算每个微卫星位点的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度和多态性信息含量，使用Genepop4.2进行每个位点的Hardy-Weinberg平衡的检测。
2.根据权利要求1所述的紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，步骤S2中，经MISA对微卫星位点进行分析、筛选时，对于非混合型位点筛选时，设置条件为单碱基重复至少10次，2碱基重复至少6次，3-6碱基重复至少5次，在此基础上，如同一序列中两个SSR位点间离小于50bp，则认为这两个SSR位点组成一个混合型SSR位点。
3.根据权利要求1所述的紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，步骤S3再次筛选出的含有微卫星位点的序列如SEQ ID NO：1～7所示。
4.根据权利要求1所述的紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，步骤S4中，SSR引物设计是利用Primer Premier5.0进行引物设计，引物长度为19～26bp，GC含量在40％～60％之间，引物Tm值小于72℃，且上下游引物Tm值差别不能大于2℃，扩增引物长度在100～300bp，所设计引物长度在100～300bp，所设计引物在侧翼保守序列内。
5.根据权利要求1或4所述的紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，步骤S4中，SSR引物设计后还包括筛选SSR引物的步骤，包括：随机选取5个紫色疣石磺个体，提取其DNA并将其混合作为引物特异性和最适退火温度筛选时的模板DNA，根据每对引物的Tm值设置间隔为1.5℃的温度梯度，共设置8个温度梯度，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出扩增清晰条带单一的引物留用。
6.根据权利要求1所述的紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，步骤S5中，所述SSR引物序列如SEQ ID NO：8～21所示。
7.根据权利要求1所述的紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，步骤S5中，PCR扩增采用的PCR反应体系为10μL，包括上下游SSR引物各0.3μL，2×Taq PCR Master Mix5μL，ddH2O 4μL，DNA模板0.4μL；PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，退火30s，72℃30s，共40个循环；72℃延伸10min。
8.根据权利要求1所述的紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，步骤S6中，PCR扩增产物是用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
9.根据权利要求1所述的紫色疣石磺微卫星标记及筛选方法，其特征在于，步骤S6中，确定基因型之后还包括根据结果，使用Cervus3.0软件设计每个微卫星位点的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态性信息含量，使用Genepop4.2进行每个位点的Hardy-Weinberg平衡检测的步骤。
10.一种紫色疣石磺微卫星标记，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：1～7所示。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106367498A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 四川好医生攀西药业有限责任公司 美洲大蠊微卫星位点及其应用
CN107604047A (zh) * 2017-11-06 2018-01-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种提高无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1793358A (zh) * 2005-09-23 2006-06-28 中国海洋大学 海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1793358A (zh) * 2005-09-23 2006-06-28 中国海洋大学 海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴欣等: "基于Illumina HiseqTM 2000 高通量转录组测序的里氏拟石磺SSR 标记开发", 《海洋科学》 *
王成暖: "两种石磺的ISSR遗传多样性分析及SSR标记开发", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
祝红钗: "里氏拟石磺线粒体基因组及石磺科四属种贝类转录组分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106367498A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 四川好医生攀西药业有限责任公司 美洲大蠊微卫星位点及其应用
CN106367498B (zh) * 2016-08-30 2020-11-03 四川好医生攀西药业有限责任公司 美洲大蠊微卫星位点及其应用
CN107604047A (zh) * 2017-11-06 2018-01-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种提高无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法
CN107604047B (zh) * 2017-11-06 2020-12-22 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种提高无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法

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